本發(fā)明涉及免疫技術領域，具體的涉及一種雙特異性納米抗體的制備方法以及雙特異性納米抗體。

背景技術：

雙特異性抗體是含有兩種特異性抗原結合位點的人工抗體，能在靶細胞和功能分子(細胞)之間架起橋梁，激發(fā)具有導向性的免疫反應，是基因工程抗體的一種，現(xiàn)已成為抗體工程領域的熱點，在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應用前景。其特點是雙特異性抗體能夠同時結合腫瘤相關抗原和免疫效應細胞上的靶分子，直接觸發(fā)免疫效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。

納米抗體是存在于駝類外周血里面的天然缺失輕鏈的重鏈抗體的的可變區(qū)片段。是目前已知的能夠結合抗原的最小結構單位。納米抗體具有免疫原性低、分子量小，可溶性高的優(yōu)點。目前國內還沒有針對腫瘤治療的雙特異性納米抗體藥物的臨床治療數(shù)據(jù)。

以下針對所研究的免疫效應細胞抗原和腫瘤細胞抗原做簡單介紹，并介紹相關背景技術的發(fā)展。

1.cd3

在免疫學中，cd3分子由四個不同的亞基組成。分別是γ，δ，ε，ζ。cd3僅存在于t細胞表面，由6條肽鏈組成，常與tcr緊密結合形成含有8條肽鏈的tcr-cd3復合體。，具體示意圖見圖一。cd3胞質段含免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,itam)，tcr識別并結合由mhc(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肽，導致cd3的itam的保守序列的酪氨酸殘基被t細胞內的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有sh2(scrhomology2)結構域的酪氨酸蛋白激酶(如zap-70)。itam的磷酸化和與zap-70的結合是t細胞活化信號傳導過程早期階段的重要生化反應之一。因此，cd3分子的功能是轉導tcr識別抗原所產生的活化信號。cd3ε或γ鏈基因缺陷可致t細胞信號傳導缺陷。

2.cd19

cd19表達于b系細胞(不包括成熟漿細胞)及濾泡樹突狀細胞上，cd19是一種重要的信號傳導分子，調節(jié)b淋巴細胞的生長激活和活化，在調節(jié)b淋巴細胞抗原受體或其他表面受體的信號閾值中起重要作用，是與b淋巴細胞分化、活化、增殖及抗體產生有關的重要膜抗原，是診斷b淋巴細胞系腫瘤和鑒定b淋巴細胞的最好標志。

3.雙特異性抗體制備方法

制備雙特異抗體有化學偶聯(lián)法、雜交瘤方法和基因工程方法等三種方法。化學偶聯(lián)法可快速、大量制備雙特異抗體,但這種雙特異抗體用于體內時易被清除,影響其應用；雜交瘤方法制備的雙特異抗體生物活性高,但制備時要經過融合、篩選等繁瑣的步驟,耗時長,所得雙特異抗體不易與同時產生的其它單抗分離；基因工程方法制備的雙特異抗體分子量小,易于大量制備,具有廣闊的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

術語和縮略語：

vhh：重鏈可變區(qū)

rna：核糖核苷酸

cdna：互補脫氧核糖核酸

pcr：聚合酶鏈反應

nanobite:雙特異性納米抗體

tumorcell:腫瘤細胞

tcell：t細胞

pbmc：外周血單個核細胞

本發(fā)明提供了一種雙特異性納米抗體，針對常規(guī)單克隆抗體或者單克隆納米抗體的缺點以及人工改造的雙克隆抗體的缺點進行研發(fā)的雙特異性納米抗體，所述的雙特異性納米抗體具有穩(wěn)定性高，可溶性好，抗原結合力強的特點。該雙特異性納米抗體通過介導特異性t細胞殺傷作用，大大提高了腫瘤的殺傷功效。具體地，本發(fā)明提供了以下的技術方案：

在一種實施方式中，一種雙特異性納米抗體，其特征在于：所述雙特異性納米抗體包含3部分，a)一種抗cd19的納米抗體，針對腫瘤細胞表面抗原具有特異性結合能力，優(yōu)選的該腫瘤細胞表面抗原是cd19，cd20，cd30和cd133，更優(yōu)選地，是該腫瘤細胞表面抗原是cd19；b)一種抗cd3ε納米抗體，針對的免疫細胞選自t細胞，nkt細胞或者cik細胞，優(yōu)選的，對免疫細胞表面抗原cd3具有特異性結合能力；c)連接短肽，連接兩種納米抗體。

在一種實施方式中，所述雙特異性納米抗體取自駝類體內。

在一種實施方式中，所述雙特異性納米抗體是抗人源抗原的抗體。

在一種實施方式中，所述的雙特異性納米抗體的連接短肽序列為ggggsggggsggggs。

在一種實施方式中，所述的抗cd19的納米抗體的氨基酸序列是序列號1所示的序列。

在一種實施方式中，所述的抗cd3的納米抗體的氨基酸序列是序列號2所示的序列。

在一種實施方式中，所述的雙特異性納米抗體的制備方法包括如下步驟：

1)羊駝外周血單個核細胞(pbmc)的分離的過程

2)流式細胞分選抗體陽性克隆的過程

3)提取陽性細胞rna,反轉錄成cdna的過程

4)抗人cd3ε和cd19納米抗體序列的擴增過程

5)cd3εvhh－cd19vhh雙特異性抗體原核表達載體的構建鑒定過程

6)pet32a-cd3εvhh-cd19vhh的原核表達及鑒定過程

在一種實施方式中，所述的雙特異性納米抗體的制備方法中，所用的連接載體是pet32a(+)。

在一種實施方式中，所述的雙特異性納米抗體的制備方法中，把兩個納米抗體連接起來的方法是重疊pcr方法。

在一種實施方式中，所述的雙特異性納米抗體或者按照權利要求7制備雙特異性納米抗體的方法制備的雙特異性納米抗體在制備藥物中的用途，所述的藥物用于治療cd19特異性表達所引起的腫瘤，或者特異性殺傷表達cd19的細胞。

本發(fā)明的技術方案的有益效果有：

1本發(fā)明提供了一種雙特異性納米抗體以及制備方法，相對于現(xiàn)有的雙特異性抗體來說，其分子量小，可溶性好，高表達性以及高抗原結合特性。

2本發(fā)明結合流式細胞分選技術加高通量篩選的方法來制備雙特異性納米抗體，制作周期短，抗體得率高。

附圖說明

圖1.cd3分子結構示意圖。

圖2.雙特異性納米抗體作用機制示意圖。

圖3.第一步cd3ε片段獲得

1.陰性對照；2.cd3ε第一步pcr擴增；3.dl2000marker

圖4.第一步cd19片段獲得

4.陰性對照；5，6.cd19第一步pcr擴增；7.dl2000marker

圖5.第二步cd3ε和cd19片段獲得

7.空白對照；8.dl2000marker；9.cd3ε第二步pcr擴增；10.cd19第二步pcr擴增。

圖6.cd3εvhh與cd19你vhh的瓊脂糖凝膠電泳

11.cd3ε-vhh與cd19-vhh的連接產物12.dl2000dnamarker13.陰性對照

圖7.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh重組載體的構建

14.dl2000dnamarker15.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh的pcr擴增產物16.陰性對照

圖8.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh重組蛋白的獲得

17.蛋白分子量marker18.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh誘導表達19.菌液對照

圖9.cd3ε蛋白與雙特異性納米抗體的結合趨勢圖

圖10.cd19蛋白與雙特異性納米抗體的結合趨勢圖

具體實施方式

實施例1.羊駝外周血單個核細胞(pbmc)的分離的過程

整個實驗過程無菌操作：

1.用cd3ε和cd19免疫羊駝后，使用15ml的離心管進行采血，將血液帶回實驗室后直接將離心管放入離心機中離心，整個過程室溫即可。根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長。

2.吸取上層血清，血清800μl每管分裝標記，保存在-80℃冰箱備用。

3.將吸取上清后的血液吸到一個50ml的離心管內，用2-3ml的滅菌的pbs洗凈原15ml離心管，吸到50ml離心管。再加入5ml的pbs稀釋。另取一個無菌的50ml離心管，倒入15ml的ficoll分離液，將稀釋好的血液緩慢平穩(wěn)的平鋪在ficoll分離液上，離心。

4.離心后此時離心管中由上至下分為四層。第一層為血漿層，第二層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層，第三層為分離液層，第四層為紅細胞層。

5.用吸頭小心吸取上層的血漿層棄去(因為血清已經分出，所以血漿層液體不多)，收集中間第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到一個50ml離心管中，在離心管中加pbs到45ml，混勻，離心10分鐘。

6.在超凈臺內快速倒掉pbs，將離心管底部pbmc輕輕敲起，再加入pbs至45ml，混勻，離心10分鐘。7.加2ml的細胞凍存液，取10μl混勻細胞的細胞凍存液加入10μl臺盼藍混勻在顯微鏡下用細胞計數(shù)板計數(shù)。用細胞凍存液調節(jié)pbmc濃度，保存濃度為2×10⁶/ml。

8.將調好濃度的pbmc分裝在細胞凍存管內，放于緩凍盒內-80℃過夜，第二天放入液氮中保存。

9.陰性對照的獲取

購買羊駝并進行標記，在免疫前頸脈取血30ml，放入預先準備好的加有抗凝劑的50ml離心管內。(抗凝劑用量20-50u/ml)分離外周血單個核細胞(pbmc)，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2.流式細胞分選抗體陽性克隆的過程

所需原料為生物素標記的cd19蛋白即cd19-biotin儲備液，分子量為56.3kda，sds-page結果顯示糖基化后分子量為56-66kda，在100μl體系中每百萬個細胞加入藻紅蛋白-鏈霉親和素即pe-streptavidin的量為0.015μg，陰性對照為不標記任何熒光素偶聯(lián)抗體cd19免疫后的細胞，空白對照為未免疫的天然羊駝pbmc。

實施例3.提取陽性細胞rna,反轉錄成cdna的過程

整個實驗過程所用到的試劑，槍頭，離心管均無核糖核酸酶。

1.第一次流式分選后得到50000個陽性細胞，分選后從收集管中將收集液轉移到1.5ml的離心管中，12000r/分鐘，離心5分鐘棄上清。

2.向步驟1中的陽性細胞中加入1ml的trizol液，用槍來回吹打幾次使細胞充分裂解。加200μl氯仿后劇烈震蕩30s，靜置5分鐘，12000r/分鐘，離心10分鐘，分層，吸取上層液體相到另一1.5ml管中，加入等體積的異丙醇，混勻，-20℃沉淀20分鐘。

3將沉淀液體轉移到rna提取柱中，靜置3分鐘，用700μlbufferw2洗兩遍，再用60μl無核糖核酸酶水洗脫，得到陽性細胞rna。

4rna反轉錄成cdna

取0.2ml的pcr管，加入模板rna8μl，oligodt1μl，rnase-freewater1.45μl，混勻后瞬時離心，放入pcr儀內，65℃孵育5分鐘，然后將樣品取出冰浴3分鐘，瞬時離心，加入5×reactionbuffer4μl，rnaseinhibitor(20u/μl)0.55μl，10mmdntp4μl，revert-m-mμlvrt1μl，放入pcr儀中，42℃反應60分鐘。反應完成后，將得到的cdna轉移到已滅菌的1.5mlep管中，-80℃保存?zhèn)溆?/p>

實施例4.抗人cd3ε和cd19納米抗體序列的擴增

通過兩步pcr擴增獲得羊駝抗人cd3ε和cd19納米抗體

1.第一步pcr的引物為vhh-fp-f(caggtgaaggtcatcgartc)，vhh-fp-r(gatgctcttgtgactcaggaatc)。按表1中的反應體系進行第一步pcr擴增，反應程序為預變性94℃，4分鐘；變性94℃，30s；退火53℃，30s；延伸72℃，40s；反應循環(huán)完成后延伸72℃，10分鐘；4℃，∞，共30循環(huán)。

表1：第一步pcr擴增獲得羊駝單鏈和雙鏈抗體體系

2.第二步pcr的上游引物為flag-vhh-f(gattataaagatgatgatgacaagcgcagagacagtgaccagagt)，下游引物為vhh-07r(ttaatccagctgactcagcc)，vhh-08r(ttaattgttctcwcccagtc)。按表2中的反應體系進行第二步pcr擴增。反應程序為預變性94℃，4分鐘；變性94℃，30s；退火53℃，30s；延伸72℃，40s；反應循環(huán)完成后延伸72℃，10分鐘；4℃，∞，共30循環(huán)。

表2第二步pcr擴增獲得羊駝單鏈抗體反應體系

實施例5.cd3ε-vhh－cd19-vhh雙特異性抗體原核表達載體的構建鑒定過程

1.cd3ε-vhh與cd19-vhh的連接

以ggggsggggsggggs為連接肽，利用overlappcr方法連接cd3ε-vhh與cd19-vhh序列。overlappcr引物序列如表3所示，以步驟五中第二步pcr產物為模板進行分步pcr，反應體系如表4，表5所示，反應程序為預變性94℃，4分鐘；變性94℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，1分鐘；反應循環(huán)完成后延伸72℃，10分鐘；4℃，∞，共30循環(huán)。將cd3ε-vhh和cd19-vhh的pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳并膠回收后，作為模板進行overlappcr，反應體系如表6所示，反應程序為預變性94℃，4分鐘；變性94℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，2分鐘；反應循環(huán)完成后延伸72℃，10分鐘；4℃，∞，共30循環(huán)。將overlappcr后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳并膠回收，保存進行下一步實驗。

表3overlappcr引物名稱及序列

表4cd3ε-vhh序列的pcr擴增體系

表5cd19-vhh序列的pcr擴增體系

表6overlappcr的反應體系

2.cd3ε-vhh和cd19-vhh的連接產物與pet32a(+)進行連接

將上述overlappcr獲得的cd3εvhh-cd19vhh連接產物和pet32a(+)用限制性內切酶ecorⅰ和salⅰ進行雙酶切，酶切體系如表7、表8所示。膠回收后，用t4dna連接酶連接pet32a(+)和cd3εvhh-cd19vhh，連接體系如表9所示。連接后，將連接產物轉化如bl21(de3)感受態(tài)細胞中，挑菌、搖菌進行pcr鑒定，結果如圖所示。取300μl菌液送測序公司進行測序，結果顯示，cd3ε-vhh-cd19-vhh序列未發(fā)生突變、缺失，并且插入載體方向正確，表明h-cd3ε-vhh－cd19-vhh雙特異性抗體原核表達載體構建成功。

表7h-cd3εvhh-cd19vhh酶切體系

表8pet32a(+)酶切體系

表9pet32a(+)和cd3εvhh-cd19vhh的連接體系

3.重組原核表達載體的pcr鑒定

將重組的pet32a-cd3εvhh-cd19vhh原核表達載體利用t7(taatacgactcactataggg)和t7ter(tgctagttattgctcagcgg)引物進行pcr擴增，反應體系20μl(見表10)，pcr反應程序為95℃，5分鐘；95℃，30s，58℃，30s，72℃，45s(30個循環(huán))；72℃，8分鐘；4℃，∞。

將pcr擴增后的產物進行dna電泳實驗，結果如圖所示。條帶大小與預期大小一致，將鑒定后的樣品進行測序。測序結果顯示，目的序列未發(fā)生基因突變、缺失，序列插入方向正確，pet32a-cd3εvhh-cd19vhh重組原核表達載體構建成功。

表10pet32a-cd3εvhh-cd19vhh原核表達載體的pcr鑒定體系

實施例6.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh的原核表達及鑒定

1.pet32a-cd3εvhh-cd19vhh的原核表達

取構建成功的pet32a-cd3εvhh-cd19vhh菌液2ml于200ml的2yt培養(yǎng)基中，37℃搖菌至菌液od600nm為0.55～0.65時，加入iptg，終濃度為0.5μm，放入37℃搖菌誘導3h。取出少量菌液，離心加入適量的pbs，吹打混勻，取出20μl，加入20μl2×上樣緩沖液，沸水浴3分鐘，進行sds-page實驗檢測表達，結果如圖。

2.cd3ε抗原和cd19抗原的elisa鑒定

cd3ε抗原和cd19抗原用包被液(ph9.6)稀釋到2ng/μl濃度，按每孔100μl加入到酶標板中，放置于4℃冰箱中過夜，第二天進行elisa實驗，elisa步驟如下：

步驟1、按每孔200μl的pbs-t加入包被后的酶標板進行清洗，清洗5次，每次3min，甩掉清洗液，于紙巾上拍板確保洗液全部被吸干；

步驟2、按每孔200μl向酶標板中加入5％的脫脂奶粉，室溫封閉1h；

步驟3、按步驟1中清洗步驟進行清洗，然后，依次將100μl的空白對照液、陰性對照、純化后的cd3e抗體加入到酶標板中，室溫孵育2h；

步驟4、按步驟1中清洗步驟進行清洗，然后，按每孔100μl向酶標板加入hrp標記的標簽抗體，室溫孵育1h；

步驟5按步驟1中清洗步驟進行清洗，然后向每孔加入100μl的tmb，避光放置10min；

步驟6、向每孔加入50μl的2mol/l的硫酸溶液，終止反應，將酶標板放于酶標儀中，于450nm條件下讀數(shù)。

結果如下：

結果顯示：當用elisa方法檢測cd3ε-cd19雙特異性納米抗體結合cd3ε和cd19蛋白，結合率較高，均為陽性結果。說明抗體的抗原結合律高。具體線性圖見圖9和圖10。

最后應說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本申請所作的舉例，是優(yōu)選的實施例。而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本申請型的保護范圍之中。

sequencelisting

<110>康眾（北京）生物科技有限公司

<120>一種cd3ε×cd19雙特異性納米抗體及其制備方法

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