本發(fā)明設(shè)計一種溶菌酶標(biāo)記的工程化噬菌體快速檢測微生物。

背景技術(shù)：

在海洋環(huán)境中，病原微生物污染、水體富營養(yǎng)化、微生物腐蝕、微生物污損等都是微生物威脅人類生產(chǎn)生活的表觀形式，也是快速微生物檢測技術(shù)需求的客觀條件?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，病原微生物污染的損失與微生物鑒定種類快慢密切相關(guān)，鑒定確定時間越長，損失也就越大。這是因為，一方面微生物增長和傳播的速度快，使環(huán)境污染和人類疾病加??；另一方面無法明確微生物種類導(dǎo)致無法實施針對性防護(hù)方案，進(jìn)而導(dǎo)致某些藥物或抗菌劑的濫用。在iso4883-2003標(biāo)準(zhǔn)中，微生物鑒定時間被認(rèn)定為微生物檢測技術(shù)等級劃分的重要參數(shù)。因此，采取有效的方法快速檢測微生物是降低海洋環(huán)境中微生物病害和污損有效的手段。

微生物檢測和鑒定的理論廣泛依賴于微生物特征產(chǎn)物響應(yīng)（如atp響應(yīng)熒光素酶、大腸桿菌分泌的β-半乳糖苷酶響應(yīng)5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d半乳糖苷和h2s響應(yīng)fe2+等）、微生物細(xì)胞表面抗原特異性識別(如抗體-微生物細(xì)胞、凝集素-微生物表面糖原、抗生素-微生物表面特異位點和適配體-微生物表面識別位點等)、和微生物基因分析（dna和16srna）。對特征產(chǎn)物響應(yīng)檢測微生物來說，其只測定水樣中的微生物數(shù)，其特異性很弱。通過在水樣中加入三羥甲氨基甲烷，使微生物細(xì)胞中atp釋放出來，再加入熒光素酶，這種酶能夠與atp作用引起光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生定量光強。對微生物表面抗原特異性識別來說，其以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)來識別和檢測微生物，該方法得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，但無法作為一種在線活體的檢測工具，易受外界因素影響。我們課題組在微生物檢測方面開展了一系列的工作：探索了基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)的無信號標(biāo)記和納米材料信號標(biāo)記的電化學(xué)免疫生物傳感器來快速檢測海洋微生物。這兩個方面工作的展開和對比研究，為微生物檢測技術(shù)發(fā)展提供新思路。對微生物基因分析技術(shù)來說，其被廣泛應(yīng)用于微生物鑒定中，所用靶點引物是通常依據(jù)微生物的16srrna基因特征性序列而設(shè)計的，其檢測限可達(dá)到1cfuml-1，不足之處是需要特殊的樣品處理和純化，操作步驟繁瑣，有較高的技術(shù)要求。本項目從上述微生物檢測技術(shù)的不足之處出發(fā)，研發(fā)便攜式微生物即時診斷儀器。

溶菌酶（lysozyme）又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase）或n-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶（n-acetylmuramideglycanohydrlase），是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶。主要通過破壞細(xì)胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與dna、rna、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。最近，我們實驗室發(fā)現(xiàn)溶菌酶具有信號標(biāo)記和檢測功能。

微生物檢測技術(shù)并非完美，還需要持續(xù)發(fā)展和創(chuàng)新。微生物檢測領(lǐng)域創(chuàng)新點可能基于以下四個方面：一是利用微納新型電子器件和光電器件在微生物檢測上的應(yīng)用。二是多功能器件集成系統(tǒng)對微生物進(jìn)行分離、篩選以及檢測分析。三是多樣品的分析系統(tǒng)結(jié)合多通道數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)對微生物進(jìn)行分析或進(jìn)行同步多模檢測系統(tǒng)。四是基于智能手機的便攜式即時檢驗(point-of-caretesting，poct)技術(shù)，使個性化的便攜式器件與移動互聯(lián)網(wǎng)結(jié)合。這些都是創(chuàng)新發(fā)展微生物檢測研究的方向。本工作利用生物分子功能化微米孔來鑒定和分析微生物，其檢測的信號主要來自于生物分子與靶點微生物檢測會延長微生物通過微米孔的時間，進(jìn)而獲得相關(guān)的微生物標(biāo)準(zhǔn)曲線。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種溶菌酶標(biāo)記的工程化噬菌體快速檢測微生物，其特征在于：包括特異性的噬菌體、功能化的溶菌酶基因。

如權(quán)利1中特異性微生物的噬菌體，特異性微生物包括針對大腸桿菌的噬菌體、金黃色葡萄球菌的噬菌體，沙門桿菌的噬菌體，弧菌的噬菌體，阪崎腸桿菌的噬菌體，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的噬菌體，產(chǎn)氣莢膜梭菌的噬菌體、肉毒梭菌的噬菌體、厭氧菌的噬菌體，蠟樣芽孢桿菌的噬菌體。

如權(quán)利2中溶菌酶功能化的噬菌體：其特征包括：t4噬菌體、t7噬菌體、p2噬菌體、p22噬菌體、λ噬菌體、φ29噬菌體。

如權(quán)利3中溶菌酶功能化的噬菌體，其特征包括在gp10b蛋白基因末端融合溶菌酶基因。

附圖說明

圖1:溶菌酶功能化的噬菌體

（1）工程化噬菌體；（2）頭部；（3）包衣gp-10b蛋白；（4）內(nèi)核蛋白；（5）gp16蛋白；（6）gp15蛋白；（7）gp14蛋白；（8）連接體gp8；（9）gp10b-溶菌酶融合蛋白；（10）gp6和gp7蛋白；（11）gp11和gp12蛋白；（12）尾部蛋白線gp17；（13）尾部；（14）針對特定微生物宿主結(jié)合蛋白（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門桿菌等）。

圖2：基于溶菌酶功能化噬菌體的微生物分析系統(tǒng)。

圖3：硫酸鹽還原菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4：大腸桿菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5：金黃色葡萄球菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6：沙門桿菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實施例1：

硫酸鹽還原菌的檢測：

實驗中用到的微生物利用溶菌肉湯（蛋白胨1%，氯化鈉1%，酵母膏0.5%，水100ml）懸浮培養(yǎng)，單個菌落于30℃，200轉(zhuǎn)搖床條件下過夜培養(yǎng)后4500轉(zhuǎn)/分離心十分鐘，并用pbs緩沖溶液稀釋到不同濃度。

將100μl濃度（10cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10²cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10³cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁴cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁵cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁶cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁷cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁸cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

綜合上述的數(shù)據(jù)，繪制不同濃度下微生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實施例2：

大腸桿菌檢測

實驗中用到的微生物利用溶菌肉湯（蛋白胨1%，氯化鈉1%，酵母膏0.5%，水100ml）懸浮培養(yǎng)，單個菌落于30℃，200轉(zhuǎn)搖床條件下過夜培養(yǎng)后4500轉(zhuǎn)/分離心十分鐘，并用pbs緩沖溶液稀釋到不同濃度。

將100μl濃度（10cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10²cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10³cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁴cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁵cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁶cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁷cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁸cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

綜合上述的數(shù)據(jù)，繪制不同濃度下微生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實施例3：

金黃色葡萄球菌檢測

實驗中用到的微生物利用溶菌肉湯（蛋白胨1%，氯化鈉1%，酵母膏0.5%，水100ml）懸浮培養(yǎng)，單個菌落于30℃，200轉(zhuǎn)搖床條件下過夜培養(yǎng)后4500轉(zhuǎn)/分離心十分鐘，并用pbs緩沖溶液稀釋到不同濃度。

將100μl濃度（10cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10²cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10³cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁴cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁵cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁶cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁷cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁸cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

綜合上述的數(shù)據(jù)，繪制不同濃度下微生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實施例4：

沙門桿菌檢測檢測

實驗中用到的微生物利用溶菌肉湯（蛋白胨1%，氯化鈉1%，酵母膏0.5%，水100ml）懸浮培養(yǎng)，單個菌落于30℃，200轉(zhuǎn)搖床條件下過夜培養(yǎng)后4500轉(zhuǎn)/分離心十分鐘，并用pbs緩沖溶液稀釋到不同濃度。

將100μl濃度（10cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10²cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10³cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁴cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁵cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁶cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁷cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

將100μl濃度（10⁸cfuml^-1）菌液和溶菌酶標(biāo)記的噬菌體加入到一次性培養(yǎng)基,并于37°c反應(yīng)8小時。再加入溶菌酶響應(yīng)的香豆素標(biāo)記的寡糖熒光素分子，培育30分鐘，用微生物診斷儀的激發(fā)光源激發(fā)傳感器平臺，產(chǎn)生光信號，測量得到該濃度下的微生物信號。

綜合上述的數(shù)據(jù)，繪制不同濃度下微生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。