本發(fā)明涉及一種天然抗氧化劑灰喇叭菌多糖ccpp-1及其制備方法和用途，屬于食品加工領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

真菌多糖是通過對其子實體或者經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲體、發(fā)酵液中分離得到的一種活性多糖。近年來，真菌多糖因其廣泛的生物活性和天然無副作用的功效受到越來越多的關(guān)注和研究。多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤方面具有重要的生物或活性。大量的研究表明多糖具有抗氧化活性，如平菇多糖，靈芝多糖等。因此，多糖在食品、醫(yī)藥方面具有巨大的開發(fā)價值廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、食品營養(yǎng)健康等領(lǐng)域。

灰喇叭菌是一種菌體灰黑色的大型真菌，是蘑菇目、雞油菌科、喇叭菌屬的一個成員?；依染a(chǎn)于四川及云南的深山老林中，可食用，是一種非常受歡迎的野生食用菌。目前這種食用菌深受歐洲的喜愛，被他們稱為“美味佳肴”。

灰喇叭菌營養(yǎng)豐富，據(jù)文獻報道，每百克干品中總脂肪占4.88％，粗蛋白占69.45％，灰分占12.22％，碳水化合物占13.44％，主要含有甘露糖，海藻糖等，具有很高的營養(yǎng)價值。目前研究大多集中于灰喇叭粗提取的抗菌活性、免疫活性、對癌細胞的抗癌活性和營養(yǎng)方面，對灰喇叭菌多糖的提取分離及生物活性的研究未見有文獻報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種天然抗氧化劑灰喇叭菌多糖ccpp-1及其制備方法和用途，目的是從灰喇叭菌中分離純化一種高抗氧化性的活性多糖，命名為ccpp-1，可作為一種天然的抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。

本發(fā)明是從灰喇叭菌多糖中分離純化抗氧化性的活性多糖組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灰喇叭菌多糖ccpp-1在400ug/ml對dpph和羥基的清除能力幾乎與vc相當(dāng)，具有很高的研究價值和開發(fā)應(yīng)用前景。

經(jīng)過hplc測定，本發(fā)明ccpp-1的分子量為1.85×10⁶da，其單糖組成按摩爾比構(gòu)成為葡萄糖：鼠李糖：甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸＝0.47：0.05：1：0.86：0.006。

本發(fā)明天然抗氧化劑灰喇叭菌多糖ccpp-1的制備方法，包括提取和分離純化各單元過程：

所述提取過程包括如下步驟：

1、稱取100g灰喇叭菌子實體烘干粉碎并過80目篩得到粉料；

2、將步驟1得到的粉料加入雙蒸水中，75-85℃下浸提4h，料液比1g：30ml，提取三次，合并提取液并濃縮至100ml，濃縮液經(jīng)4000r/min離心10分鐘，取上清液；

3、將步驟2得到的上清液加入95％的乙醇中，4℃靜置8-12h，4000r/min下離心20min，收集沉淀物；

4、將步驟3得到的沉淀物用雙蒸水溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸除去殘留的乙醇，得到粗多糖溶液；向粗多糖溶液中加入sevage試劑，體積比為3:1，磁力攪拌1小時，4000r/min離心10分鐘，保留上清液；sevage試劑重復(fù)除蛋白5次，合并上清液，濃縮后于-80℃冷凍2h，冷凍后放入凍干機中于-56℃、0.10mbar下凍干2天，得到灰喇叭菌粗多糖；

所述分離純化過程包括如下步驟：

1、將灰喇叭菌粗多糖用雙蒸水配成10％的溶液，用deae-sephorasef.f凝膠柱分離，上樣量為10ml，0-1.5mol/lnacl溶液梯度洗脫，流速為1ml/min，用akta儀器實時監(jiān)測，經(jīng)過3500da的透析袋透析后，濃縮，-80℃冷凍2h，隨后放入凍干機中于-56℃、0.10mbar下凍干2天，得到組分1；

2、將所得組分1用雙蒸水配成0.1％的溶液，過0.22μm的過濾膜，用superdex-75柱層析分離，雙蒸水洗脫，流速1ml/min，用akta儀器實時監(jiān)測，收集得到均一的灰喇叭菌多糖ccpp-1。

對分離純化得到的ccpp-1進行體外抗氧化活性實驗，結(jié)果表明：本發(fā)明提取的ccpp-1對dpph、羥基自由基具有很高的自由基清除作用。

經(jīng)hplc分析測定，ccpp-1的分子量為1.85×10⁶da，單糖組成按摩爾比構(gòu)成為葡萄糖：鼠李糖：甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸＝0.47：0.05：1：0.86：0.006。

本發(fā)明灰喇叭菌多糖ccpp-1的用途，是在食品、藥品或化妝品領(lǐng)域作為抗氧化劑使用，對dpph、羥基自由基具有顯著的清除作用。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明灰喇叭菌ccpp-1提取、分離純化簡便，是一種天然的高抗氧化劑，提取獲得的ccpp-1對dpph、羥基自由基都有明顯的清除作用，當(dāng)濃度為400ug/ml時，清除率都達到與vc相當(dāng)，可作為天然高效抗氧化劑，應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1是ccpp-1分子量測定hplc色譜圖。從圖1b中可以看出，灰喇叭菌多糖ccpp-1為純品，ccpp-1的保留時間為4.518min；從圖1a標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出ccpp-1的分子量為1.85×10⁶da。

圖2是處理次數(shù)對蛋白去除率和多糖損失率的影響。從圖2中可以看出，隨著處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率都隨之增加。前5次蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率都增加的很快，5次以后增加速度變緩慢。綜合考慮選擇處理次數(shù)為5次，此時蛋白去除率為72％，多糖損失率為36％。

圖3是樣液比對蛋白去除率和多糖損失率的影響。從圖3中可以看出，隨著樣液比的增大，蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率都逐漸降低。蛋白去除率在5∶1時最小，在3∶1到4∶1過程中，去除率降低的最多，在3∶1到5∶1時多糖損失率的減少比較緩慢，在3∶1時為30.2％。綜上所述選擇3∶1的樣液比最為適合。

圖4是ccpp-1水解物的hplc色譜圖(1溶劑峰；2glca；3rha；4man；5xyl)。從圖4中可以定性定量分析出ccpp-1的單糖組成和單糖比例?？梢钥吹綇淖蟮接遥?代表溶劑峰，ccpp-1共有五種單糖，其摩爾比分別為葡萄糖：鼠李糖：甘露糖：木糖：葡萄糖醛酸＝0.47：0.05：1：0.86：0.006。

圖5是灰喇叭菌多糖ccpp-1對dpph的清除能力。從圖5中可以看出灰喇叭菌多糖ccpp-1從25μg/ml至400μg/ml范圍內(nèi)，dpph自由基的清除能力隨著濃度的增大而增強，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。在400μg/ml時清除率高達81.2％，與vc的清除率86.32％非常接近，由此可以看出ccpp-1對dpph的清除能力顯著，與vc相當(dāng)。

圖6是灰喇叭菌多糖ccpp-1對羥基自由基清除能力。從圖6中可以看出，在25μg/ml至500μg/ml對·oh的清除能力均呈現(xiàn)上升趨勢，存在一定的濃度依賴性。在500μg/ml時ccpp-1以及vc的清除率分別為73.74％和84.4％，表現(xiàn)出ccpp-1對·oh具有很高的清除能力。

圖7是灰喇叭菌多糖ccpp-1紅外光譜圖。經(jīng)紅外光譜(ft-ir)圖可以看出灰喇叭菌多糖ccpp-1有五個典型的吸收峰在3396、2923、1643、1043cm^-1附近位置。其中，在3396cm^-1電話的強而寬的吸收峰，為o-h伸縮振動引起的，另一弱吸收峰2923cm^-1處，是c-h伸縮振動引起的。在1643的吸收峰是由于o-h的變角振動引起的，1043處表明有吡喃環(huán)，說明ccpp-1是吡喃糖。在854cm^-1和891cm^-1處的吸收峰表明ccpp-1既有α構(gòu)型也有β構(gòu)型。

具體實施方式

實施例1：sevage法除蛋白最佳去除工藝

(一)sevage試劑萃取次數(shù)

1、稱取灰喇叭菌子實體100g烘干粉碎并過80目篩得到粉料；

2、將步驟1得到的粉料加入雙蒸水中，75-85℃下浸提4h，料液比1g：30ml，提取三次，合并提取液并濃縮到100ml，濃縮液經(jīng)4000r/min離心10分鐘，取上清液；

3、將步驟2得到的上清液后加入三倍體積的95％的乙醇，4℃靜置8-12h，4000r/min下離心20min，收集沉淀物；

4、將步驟3得到的沉淀物用雙蒸水溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸除去殘留的乙醇，得到粗多糖溶液；向粗多糖溶液中加入sevage試劑，體積比為3:1磁力攪拌1小時，用sevage試劑萃取7次，記錄蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率見圖2。

由圖2可知，隨著處理次數(shù)的增加，蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率都隨之增加。前5次蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率都增加的很快，5次以后增加速度變緩慢。綜合考慮選擇處理次數(shù)為5次，此時蛋白去除率為72％，多糖損失率為36％。

(二)樣液比對蛋白去除率和多糖損失率的影響

樣品與sevage試劑的體積比即為樣液比。分別采用1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1的樣液比，用sevage試劑處理多糖溶液5次，記錄5次的蛋白去除率和多糖損失率，見圖3。

由圖3可知，隨著樣液比的增大，蛋白質(zhì)去除率和多糖損失率都逐漸降低。蛋白去除率在5∶1時最小，在3∶1到4∶1過程中，去除率降低的最多，在3∶1到5∶1時多糖損失率的減少比較緩慢，在3∶1時為30.2％。綜上所述選擇3∶1的樣液比最為適合。

實施例2：分離純化

1、將實施例1制備的灰喇叭菌粗多糖配成10％(w/w)溶液，進行陰離子交換柱層析，凝膠柱為deae-sephorasef.f，上樣量為10ml，0-1.5mol/lnacl溶液梯度洗脫，流速為1ml/min，用akta儀器實時監(jiān)測，經(jīng)過3500da的透析袋透析后，濃縮，-80℃下冷凍2h，冷凍后放入凍干機中于-56℃、0.10mbar下凍干2天，得到灰喇叭組分1。

2、將上述所得組分1用雙蒸水配成0.1％的溶液，過0.22um的過濾膜，用superdex75柱層析分離，雙蒸水洗脫，流速1ml/min，用akta儀器實時監(jiān)測，收集得到灰喇叭多糖ccpp-1。

實施例3：體外抗氧化活性測定

1、dpph自由基清除率的測定

精密稱取dpph10mg，用甲醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得濃度為0.3mmol/l的dpph溶液，避光保存，備用。

分別取不同濃度的ccpp-1溶液(25、50、100、200、300、400ug/ml)2ml，置15ml離心管中，加入2mldpph，室溫避光反應(yīng)30min，于517nm波長處測定吸光值。按下列公式計算dpph自由基清除率。

dpph自由基清除率(％)＝a0-(as-ac)/a0×100％

公式中，a0—2mldpph溶液+2ml蒸餾水的吸光值

as—2ml樣品溶液+2mldpph溶液的吸光值

ac—2ml樣品溶液+2ml甲醇溶液的吸光值

將實驗重復(fù)三次，求得清除率的平均值。結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出灰喇叭菌多糖ccpp-1從25μg/ml至400μg/ml范圍內(nèi)，dpph自由基的清除能力隨著濃度的增大而增強，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。在400μg/ml時清除率高達81.2％，與vc的清除率86.32％非常接近，由此可以看出ccpp-1對dpph的清除能力顯著，與vc相當(dāng)。

2、羥自由基清除率的測定

fenton反應(yīng)是生物體內(nèi)存在的oh體外模式反應(yīng)。參照fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型，利用h2o2與fe²⁺混合產(chǎn)生oh(反應(yīng)式h2o2+fe²⁺→fe³⁺+oh+oh^-)。fe²⁺與1，10-菲羅啉在ph2-9的范圍內(nèi)可形成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物，在510nm處有最大吸收。當(dāng)加入灰喇叭菌多糖ccpp-1時，ccpp-1能清除溶液中游離的oh，因而可以通過測量a值間接計算出樣品灰喇叭菌多糖ccpp-1對oh的清除率。

清除率(％)＝(a2-a1)/(a0-a1)×100％

公式中：a0—不加h2o2，而加入樣品時的a值。

a1—加入h2o2，但不加樣品時的a值。

a2—加入h2o2和樣品時的a值。

采用fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，在10ml具比色管中依次加入0.2ml1，10-菲羅啉(5mmol/l)，1mltris-hcl緩沖溶液(50mmol/l，ph6.0)，0.2ml硫酸亞鐵(7.5mmol/l)，0.2mlh2o2(1％)和不同體積的灰喇叭菌多糖ccpp-1，無水乙醇定容至10ml，然后于37℃超級恒溫水浴中反應(yīng)60min，在510nm處測量a值，平行3次，結(jié)果見圖6。從圖6中可以看出，在25μg/ml至500μg/ml對·oh的清除能力均呈現(xiàn)上升趨勢，存在一定的濃度依賴性。在500μg/ml時ccpp-1以及vc的清除率分別為73.74％和84.4％，表現(xiàn)出ccpp-1對·oh具有很高的清除能力。