本申請是申請日為2013年4月29日，申請?zhí)枮?01380035058.3(pct/us2013/038637)，發(fā)明名稱為“st2l拮抗劑及使用方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。相關申請的交叉引用本申請要求2013年3月13日提交的美國申請序列號13/798,204、2013年3月13日提交的美國申請序列號13/798,226、2012年4月30日提交的美國臨時申請?zhí)?1/640,407以及2012年4月30日提交的美國臨時申請?zhí)?1/640,238的權益，所述申請的全部內容以引用方式并入本文。本發(fā)明涉及st2l拮抗劑、編碼所述拮抗劑或其片段的多核苷酸以及制備并使用前述物質的方法。
背景技術：
：st2l(il-1rl1或il-33rα)是toll/il-1受體家族成員，在多種免疫細胞的細胞表面上表達，所述免疫細胞包括t細胞、nk/nkt細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞及新發(fā)現(xiàn)的非b/非t的2型先天性淋巴細胞、nuocytes和自然輔助細胞。也可在樹突狀細胞(dc)、巨噬細胞和嗜中性粒細胞上誘導st2l表達。st2l能夠下調toll樣受體tlr2、tlr4和tlr9的響應性，但也能經由被其配體il-33活化及與輔助蛋白il-1racp締合而誘導2型細胞因子釋放。il-33已被描述為“警報素”，因為在內穩(wěn)態(tài)過程中其以全長形式存在于上皮細胞和內皮細胞的細胞核中，但在細胞壞死過程中可被裂解并釋放。st2l信號傳導需要輔助蛋白il-1racp締合于預先形成的st2l/il-33復合物。il-1α/β信號傳導復合物也共用輔助蛋白il-1racp。已提出了st2l、il-33和il-1racp相互作用以及il-1r1與il-1racp之間相互作用的模型(lingel等人，cell17：1398-1410,2009；wang等人，natimmunol11：905-11,2010)。近來發(fā)現(xiàn)，st2l/il-33/il-1racp與肥大細胞上的c-kit(干細胞因子(scf)的受體)形成信號傳導復合物。il-33以scf依賴方式在原代肥大細胞中誘導細胞因子產生(drube等人，blood115：3899-906，2010)。st2l的活化導致過度的2型細胞因子響應(尤其是il-5和il-13)、肥大細胞和嗜酸性粒細胞活化，以及氣道過度反應，并且據報道還可通過誘導來自nkt細胞的ifnγ和來自肥大細胞的il-1β及il-6放大th1和th17響應。st2l/il-33途徑失調已表明與多種免疫介導的疾病有關，包括哮喘、類風濕性關節(jié)炎、炎性腸病、特應性皮炎、過敏性鼻炎、鼻息肉以及全身性硬化癥(綜述于palmer和gabay，natrevrheumatol7：321-9，2011和lloyd，curropinimmunol22：800-6，2010；shimizu等人，hummolecgen14：2919-27，2005，kamekura等人，clinexpallergy42：218-28，2012；manetti等人，annrheumdis69：598-605，2010)。因此，需要適合用于治療st2l介導的疾病和失調的st2l拮抗劑。附圖說明圖1示出在與同種型對照cnto5516相比時，在經鼻內施用il-33而誘導的肺炎癥模型中，通過st2l域i結合單克隆抗體cnto3914抑制氣道過度響應。當乙酰甲膽堿(mch)以升高的劑量(mg/ml)施用時，測量到氣道阻力的峰值。cnto3914/il-33相對于cnto5516/il-33，**p＜0.05；以及cnto3914/il-33相對于經il-33處理的pbs組，***p＜0.001。圖2示出在與同種型對照cnto5516相比時，在經鼻內施用il-33而誘導的肺炎癥模型中，通過st2l域i結合單克隆抗體cnto3914抑制支氣管肺泡灌洗(bal)細胞募集。***p＜0.001。圖3示出在經鼻內施用il-33而誘導的肺炎癥模型中，通過st2l域i結合單克隆抗體cnto3914在無細胞的bal液中劑量依賴性抑制小鼠肥大細胞蛋白酶1(mmcp-1)的釋放。相對于經il-33處理的cnto5516(同種型對照)，**p＜0.01，***p＜0.001。圖4示出在體外通過st2l域i結合單克隆抗體cnto3914，抑制小鼠骨髓源性肥大細胞的il-33誘導的gm-csf(圖4a)、il-5(圖4b)和tnfα(圖4c)釋放。在括號中，所使用的cnto3914濃度示出為μg/ml，并且il-33濃度示出為ng/ml。圖5示出在指定il-33和c2494濃度，通過st2l域i結合單克隆抗體c2494(stlm62)，抑制il-33所誘導的人臍帶血源性肥大細胞的前列腺素d2(pgd2)釋放。mox-pdg2：甲氧胺-pgd2。圖6示出在stempro-34培養(yǎng)基中的1ng/mlil-33+100ng/mlscf(干細胞因子)存在下，通過指定濃度(μg/ml)的st2l域i結合單克隆抗體c2244和c2494，抑制人臍帶血源性肥大細胞(hcbmc)中的gm-csf(圖6a)、il-8(圖6b)、il-5(圖6c)、il-13(圖6d)和il-10(圖6e)釋放。圖7示出在stempro-34培養(yǎng)基中的1ng/mlil-33+100ng/mlscf存在下，通過指定濃度(μg/ml)的st2l域iii結合單克隆抗體c2519或c2521，對人臍帶血源性肥大細胞中的gm-csf(圖7a)、il-8(圖7b)、il-5(圖7c)、il-13(圖7d)和il-10(圖7e)釋放的影響。圖8示出在rpmi/10％fcs培養(yǎng)基中3ng/mlil-33+100ng/mlscf存在下，通過st2l域i結合單克隆抗體c2494和st2l域iii結合單克隆抗體st2m48(m48)、st2m49(m49)、st2m50(m50)和st2m51(m51)，對人臍帶血源性肥大細胞(hcbmc)中的a)gm-csf；b)il-8；c)il-5；d)il-13以及e)il-10釋放的影響。圖9示出結合st2l的域i(d1)或域iii(d3)的抗-st2l抗體，如所指示使用50μg/ml或2μg/ml的每種被測抗體時，抑制人臍帶血源性肥大細胞在受il-33和scf誘導時的gm-csf、il-5、il-8、il-10和il-13釋放的平均百分比(％)。負值指示活化％。圖10示出抗-st2l抗體的重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈cdr序列，其來源于噬菌體展示文庫，且后續(xù)經親和力成熟篩選(affinity-maturationcampaign)。圖11示出抗-st2l抗體的輕鏈可變區(qū)(vl)和輕鏈cdr序列，其來源于噬菌體展示文庫，且后續(xù)經親和力成熟篩選。圖12示出抗-st2l抗體stlm208vhst2h257hcdr3變體的vh和vl區(qū)，以及重鏈cdr的序列。圖13示出抗-st2l抗體的a)vh和b)vl序列，其來源于噬菌體展示文庫，且后續(xù)經親和力成熟篩選。圖14示出轉移到人框架(被轉移部分標記為hfa“humanframeworkadaptation”(人框架適應性))的c2494vh和vl抗原結合位點的劃分。kabatcdr帶有下劃線，并且chothiahv在所示轉移hfa區(qū)的上方以虛線指示。vh和vl殘基的編號根據chothia。vh中以灰色突出顯示的殘基在一些hfa變體中未被轉移。c2494vh：seqidno：48；c2494vh：seqidno：52。圖15示出來源于c2494的人框架適應性(hfa)抗體的cdr序列。圖16a)抗-st2l抗體cnto3914的血清水平；b)支氣管肺泡灌洗(bal)細胞募集的抑制；c)被il-33刺激的全血細胞的il-6分泌的抑制；d)在經鼻內施用il-33而誘導肺炎癥6小時模型中，給藥后24小時通過cnto3914抑制用il-33刺激的全血細胞的mcp1分泌。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；nq＝低于檢出限；@＝一個數據點低于檢出限。圖17各種抗-st2l抗體之間的競爭。a)30nm經標記的c2244fab與指定抗體競爭結合涂布在微孔上的st2l-ecd。c2244與c2494競爭，但不與c2539競爭。b)10nm經標記的c2494與指定抗體競爭結合涂布在微孔上的st2l-ecd。c2494與stlm208和stlm213競爭，但不與c2539競爭。圖18示出與c2244fab復合的人st2-ecd(seqidno：119)的簡化h/d交換圖。被抗體保護的區(qū)域以所示不同的灰度顯示。包含第18-31位殘基(虛線方框內)(對應seqidno：1的全長st2l的第35-48位殘基)的片段由fab保護。包含第71-100位殘基(實線方框內)(對應seqidno：1的第88-117位殘基)的區(qū)域被重度糖基化且未被肽覆蓋。圖19示出st2l域i結合抗體對圖中所示st2l變體的動力學和親和力常數。圖20示出抗-st2l抗體stlm208對原代人肺肥大細胞的a)gm-csf；b)il-5；c)il-8；d)il-13分泌的抑制。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種分離的人或人適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人st2l的域i(seqidno：9)。本發(fā)明還提供特異性結合具有下列序列的人st2l的人適應性抗體拮抗劑：特定輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，或特定重鏈和輕鏈互補決定序列。本發(fā)明還提供在限定表位區(qū)特異性結合人st2l和/或具有如本文所述特定特征的人或人適應性抗體拮抗劑。本發(fā)明還提供一種分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的重鏈可變區(qū)(vh)或輕鏈可變區(qū)(vl)。本發(fā)明還提供一種載體，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸。本發(fā)明還提供一種宿主細胞，其包含本發(fā)明的載體。本發(fā)明還提供一種制備本發(fā)明的抗體的方法，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞以及從所述細胞回收抗體。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的分離抗體以及配藥學上可接受的媒介物。本發(fā)明還提供一種治療或預防st2l介導的病癥的方法，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明的分離抗體向對其有需求的患者施用足以治療或預防st2l介導的病癥的時間。本發(fā)明還提供一種抑制患者體內肥大細胞響應的方法，該方法包括將治療有效量的本發(fā)明的分離抗體向對其有需求的患者施用足以抑制肥大細胞響應的時間。本發(fā)明還提供一種在受治療者中抑制il-33和st2l的相互作用的方法，該方法包括以足以抑制il-33和st2l的相互作用的量向該受治療者施用特異性結合st2l的域i的抗體。具體實施方式本說明書中所引用的所有出版物(包括但不限于專利和專利申請)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整給出。應當理解，本文所用的術語只是為了描述具體實施例，并非旨在進行限制。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語的含義與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解的含義相同。雖然與本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于檢驗本發(fā)明的實踐中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保護本發(fā)明時，將使用以下術語。如本文所用，術語“拮抗劑”意指通過任何機制部分或完全抑制st2l生物活性的分子。示例性拮抗劑是抗體、融合蛋白質、肽、模擬肽、核酸、寡核苷酸和小分子。拮抗劑可使用下述st2l生物活性測定法鑒定。st2l拮抗劑可使所測量的st2l生物活性抑制20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。術語“st2l”或“hust2l”或“人st2l”是指具有基因庫登錄號np_057316中所示的氨基酸序列的人st2l多肽。seqidno：1示出全長人st2l的氨基酸序列。如本文所用，“st2l胞外域”、“st2l-ecd”或“hust2l-ecd”意指具有seqidno：1的第19-328位氨基酸的多肽。hust2l-ecd具有三個ig樣c2型域，其跨越seqidno：1的第19-122位殘基(域i，seqidno：9)、第123-202位殘基(域ii，seqidno：10)以及第209-324位殘基(域iii，seqidno：11)?！坝騣”或“st2l域i”或“hust2l域i”或“d1”是指人st2l上的第一免疫球蛋白樣域，其具有seqidno：9中所示的序列?！坝騣ii”或“st2l域iii”是指人st2l上的第三免疫球蛋白樣域，其具有seqidno：11中所示的序列。如本文所用，術語“il-33”包括全長il-33(基因庫登錄號np_254274seqidno：3)及其變體和活性形式。il-33變體包括具有基因庫登錄號np_001186569和基因庫登錄號np_001186570中所示的氨基酸序列的蛋白質。il-33活性形式包括“成熟il-33”，其具有seqidno：3的第112-270位殘基。另外的活性形式包括il-33片段，其具有seqidno：3的第11-270位、第115-270位、第95-270位、第99-270位或第109-270位殘基(lefrancais等人，procnatlacadsci(usa)109：1673-8，2012)，或從內源性表達il-33的細胞分離的任何形式或形式的組合?！癷l-33活性形式”是誘導st2l生物活性的seqidno：3的il-33的片段或變體。如本文所用，術語“抗體”含義廣泛且包括：免疫球蛋白分子，包括多克隆抗體；單克隆抗體，包括鼠、人、人適應性、人源化和嵌合單克隆抗體；抗體片段；由至少兩個完整抗體或抗體片段所形成的雙特異性或多特異性抗體；二聚體、四聚體或多聚體抗體；以及單鏈抗體。免疫球蛋白可根據重鏈恒定域氨基酸序列被指定為五種主要種類，即iga、igd、ige、igg和igm。iga和igg進一步亞分類為同種型iga1、iga2、igg1、igg2、igg3和igg4。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可基于其恒定結構域的氨基酸序列被指定至兩種明顯不同類型中的之一，即κ(κ)和λ(λ)。術語“抗體片段”是指免疫球蛋白分子的一部分，其保留重鏈和/或輕鏈抗原結合位點，諸如重鏈互補決定區(qū)(hcdr)1、2和3，輕鏈互補決定區(qū)(lcdr)1、2和3，重鏈可變區(qū)(vh)或輕鏈可變區(qū)(vl)?？贵w片段包括熟知的fab、f(ab′)2、fd和fv片段以及由一個vh域組成的域抗體(dab)。vh和vl域可經由合成接頭連接在一起以形成各種類型的單鏈抗體設計，其中在vh和vl域由單獨的單鏈抗體構建體表達的情況下，vh/vl域在分子內或分子間配對，以形成單價抗原結合位點，諸如單鏈fv(scfv)或雙價抗體(diabody)；例如在國際專利公開wo98/44001、國際專利公開wo88/01649、國際專利公開wo94/13804、國際專利公開wo92/01047中所描述的?？贵w可變區(qū)由插入有三個“抗原結合位點”的“框架”區(qū)組成。使用不同術語來定義抗原結合位點：(i)三個在vh(hcdr1、hcdr2、hcdr3)中且三個在vl(lcdr1、lcdr2、lcdr3)中的互補決定區(qū)(cdr)，是基于序列變異性(wu和kabat，jexpmed132：211-50，1970；kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第5版，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.，1991)。(ii)三個在vh(h1、h2、h3)中且三個在vl(l1、l2、l3)中的“超變區(qū)”、“hvr”或“hv”，是指抗體可變域中的在結構上超變的區(qū)域，如chothia和lesk所定義(chothia和lesk，molbiol196：901-17，1987)。其他術語包括“imgt-cdr”(lefranc等人，devcomparatimmunol27：55-77，2003)和“特異性決定殘基用途”(sdru)(almagro，molrecognit17：132-43，2004)。internationalimmunogenetics(imgt)數據庫(http：//www_imgt_org)提供了抗原結合位點的標準化編號和定義。cdr、hv與imgt劃分之間的對應性描述于lefranc等人，devcomparatimmunol27：55-77，2003。如本文所用，“chothia殘基”是抗體vl和vh殘基，其根據al-lazikani來編號(al-lazikani等人，jmolbiol273：927-48，1997)?！翱蚣堋被颉翱蚣苄蛄小笔强勺儏^(qū)的除了被定義為抗原結合位點的那些序列之外的其余序列。因為抗原結合位點可以由如上所述的不同術語定義，所以框架的精確氨基酸序列取決于如何定義抗原結合位點?！叭丝贵w”或“完全人抗體”是指包含來源于人免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)序列的抗體。本發(fā)明的人抗體可包括置換，因此其可能不是表達的人免疫球蛋白或種系基因序列的精確拷貝。然而，“人抗體”的定義并不包括抗原結合位點來源于非人物種的抗體?！叭诉m應性”抗體或“人框架適應性(hfa)”抗體是指根據美國專利公開no.us2009/0118127中所描述的方法適應化的抗體，并且也指將來源于非人物種的抗原結合位點序列移植到人框架的抗體。“人源化抗體”是指其中抗原結合位點來源于非人物種且可變區(qū)框架來源于人免疫球蛋白序列的抗體。人源化抗體在框架區(qū)中可包括置換，因此該框架可能不是表達的人免疫球蛋白或種系基因序列的精確拷貝。如本文所用，術語“基本上相同”意指所比較的兩個抗體可變區(qū)氨基酸序列是相同的或具有“非實質差異”。非實質差異是在抗體或抗體可變區(qū)序列中不會不利地影響抗體特性的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個氨基酸的置換。與本文所公開的可變區(qū)序列基本上相同的氨基酸序列在本申請范圍內。在一些實施例中，所述序列同一性可以為約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高?？墒褂胿ectorntiv.9.0.0(invitrogen，carslbad，ca)的alignx模塊的默認設置，例如通過逐對比對來測定百分比同一性。本發(fā)明的蛋白質序列可用作執(zhí)行公共或專利數據庫檢索的查詢序列，以例如識別相關序列。用于執(zhí)行此類檢索的示例性程序為使用默認設置的xblast或blastp程序(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)、或genomequesttm(genomequest，westborough，ma)套件。如本文所用，術語“表位”是指抗體特異性結合的抗原的一部分。表位通常由化學活性的(諸如極性、非極性或疏水性)表面部分組而組成，諸如氨基酸或多糖側鏈，并且可具有特定的三維結構特征，以及特定的電荷特征。表位可由形成構象空間單元的連續(xù)和/或不連續(xù)氨基酸構成。對于不連續(xù)表位而言，抗原線性序列不同部分的氨基酸，通過蛋白質分子的折疊，在三維空間中緊密靠近。示例性表位是以seqidno：9示出的hust2l的域i。如本文所用，術語“互補位”意指抗原特異性結合的抗體的一部分。互補位可以是線狀特征的或可以是不連續(xù)的，通過抗體的非連續(xù)性氨基酸之間的空間關系所形成，而非氨基酸的線型系列。“輕鏈互補位”和“重鏈互補位”或“輕鏈互補位氨基酸殘基”和“重鏈互補位氨基酸殘基”分別是指與抗原相接觸的抗體輕鏈和重鏈殘基。如本文所用，術語“特異性結合”或“特異性地結合”是指抗體以比針對其他抗原或蛋白質更高的親和力結合于預定的抗原。通常，抗體以1×10-7m或更小的解離常數(kd)結合于預定的抗原，例如1×10-8m或更小、1×10-9m或更小、1×10-10m或更小、1×10-11m或更小、或1×10-12m或更小，通常kd為其結合于非特異性抗原(例如bsa、酪蛋白或任何其他特定多肽)的kd的至少十倍。可以使用標準程序來測量解離常數。然而，特異性結合于預定抗原的抗體可能對其他相關的抗原具有交叉反應性，例如對于來自其他物種(同源)的相同預定抗原，諸如人或猴，例如食蟹猴(macacafascicularis)(食蟹獼猴(cynomolgus))。如本文所用，“雙特異性”是指結合兩個不同抗原或抗原內的兩個不同表位的抗體。如本文所用，“單特異性”是指結合一個抗原或一個表位的抗體。如本文所用，術語“進行組合”是指所描述藥劑可以在混合物中、作為單一藥劑同時地或作為單一藥劑以任何順序先后地共同向動物施用。如本文所用，“炎性病癥”是指對于有害刺激諸如病原體、受損細胞、物理傷害或刺激物的急性或慢性局部或全身性響應，所述響應部分由細胞因子、趨化因子或炎性細胞(如，嗜中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞)的活性介導，并且所述炎性病癥在多數情況下的特征在于疼痛、發(fā)紅、腫脹和組織功能損傷。如本文所用，術語“st2l介導的炎性病癥”是指至少部分由于不適當的st2l信號傳導途徑活化而造成的炎性病癥。示例性st2l介導的炎性病癥是哮喘和過敏。如本文所用，術語“st2l介導的病癥”涵蓋st2l在疾病和醫(yī)學病癥中直接或間接發(fā)揮作用的所有疾病和醫(yī)學病癥，包括疾病或病癥的引發(fā)、發(fā)展、進程、持續(xù)或病變。如本文所用，術語“st2l生物活性”是指由于st2l配體il-33結合于st2l所出現(xiàn)的任何活性。示例性st2l生物活性導致nf-κb響應于il-33而活化。nf-κb活化可在用il-33誘導st2l時使用報告基因測定法測定(fursov等人，hybridoma30：153-62，2011)。其他示例性st2l生物活性導致th2細胞的增殖，或促炎性細胞因子和趨化因子的分泌，例如il-5、gm-csf、il-8、il-10或il-13。細胞因子和趨化因子從細胞、組織中或在循環(huán)中的釋放可使用熟知的免疫測定法來測量，諸如elisa免疫測定法。術語“載體”是指能夠在生物系統(tǒng)內復制或可以在此類系統(tǒng)間移動的多核苷酸。載體多核苷酸通常含有諸如復制起點、聚腺苷酸化信號或選擇標記之類的元件，其功能是促進這些多核苷酸在生物系統(tǒng)中的復制或保持。此類生物系統(tǒng)的例子可包括細胞、病毒、動物、植物和用能夠復制載體的生物組分再造的生物系統(tǒng)。包含載體的多核苷酸可以是dna或rna分子或這些分子的雜交體。術語“表達載體”是指可用于在生物系統(tǒng)或再造生物系統(tǒng)中指導由存在于表達載體中的多核苷酸序列所編碼的多肽的翻譯的載體。術語“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主鏈或其它等同的共價化學方式所共價連接的核苷酸鏈的分子。雙鏈dna和單鏈dna以及雙鏈rna和單鏈rna是多核苷酸的典型例子。術語“多肽”或“蛋白質”是指包含至少兩個由肽鍵連接以形成多肽的氨基酸殘基的分子。少于50個氨基酸的小多肽可以稱作“肽”。本文使用如下的常規(guī)單字母和三字母氨基酸代碼：物質的組成本發(fā)明提供特異性結合st2l并抑制st2l生物活性的抗體，及此類抗體的用途。本發(fā)明人已得出令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，結合于人st2l的域i(seqidno：9)的抗體阻斷il-33/st2l相互作用并抑制一系列的st2l生物活性，包括il-33誘導的肥大細胞響應，然而結合人st2l的域iii(seqidno：11)的抗體并不會阻斷il-33/st2l相互作用，雖然其對于一系列的st2l生物活性具有抑制性。然而，域iii結合抗體對于il-33誘導的肥大細胞響應具有降低的抑制作用或沒有抑制作用，或在一些情況下刺激il-33誘導的肥大細胞響應。在本文所述的一些實施例中，阻斷il-33/st2l相互作用并抑制包括il-33誘導的肥大細胞響應的一系列st2l生物活性的抗體，結合人st2l域i內的表位(rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)和任選的st2l氨基酸殘基t93和f94(殘基編號根據seqidno：1)。術語“肥大細胞響應”或“肥大細胞活性”是指il-33誘導的細胞因子諸如gm-csf、il-8、il-5、il-13和il-10以及過敏介質諸如前列腺素d2從肥大細胞的釋放。本發(fā)明提供新型的抗原結合位點，其結合如本文所述的人st2l的域i。用于攜帶抗原結合位點的結構通常為抗體vh或vl。如本文所述的本發(fā)明抗體可為分離的人或人適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人st2l的域i(seqidno：9)。結合人st2l的域i(seqidno：9)的示例性抗體是抗體stlm15(c2244)，其包含分別為seqidno：23、27和31的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列以及分別為seqidno：35、39和43的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列；或抗體c2494(stlm62)，其包含分別為seqidno：24、28和32的hcdr1、hcdr2和hcdr3序列以及分別為seqidno：36、40和44的lcdr1、lcdr2和lcdr3序列(表3)。結合人st2l的域i的另外示例性抗體是表16和圖13中所示的抗體，例如抗體stlm103、stlm107、stlm108、stlm123、stlm124、stlm208、stlm209、stlm210、stlm211、stlm212和stlm213。示例性人抗體拮抗劑示于圖12和圖13中。示例性人適應性拮抗劑示于表14中。在本文所述的一些實施例中，特異性結合人st2l的域i(seqidno：9)的分離的人或人適應性抗體拮抗劑或其片段阻斷il-33/st2l相互作用。可通過標準elisa測試抗體阻斷il-33/st2l相互作用的能力。例如，將平板用人st2l的胞外域(hust2l-ecd)涂布，并與抗體一起溫育，之后測量平板上生物素?；痠l-33的結合。“阻斷il-33/st2l相互作用”或“抑制il-33/st2l相互作用”的抗體，是在使用hust2l-ecd涂布的平板的elisa測定法中，在50μg/ml抗體濃度下，當與抗體不存在的情況下的il-33結合相比時，使來源于結合平板的生物素?；痠l-33的信號降低至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的抗體?？赏ㄟ^使用標準方法及下文所示例的方法，評估抗體對于例如由人臍帶血源性肥大細胞或原代人肺肥大細胞的gm-csf、il-5、il-10或il-13釋放的抑制活性，而測試抗體對肥大細胞響應的抑制。如本文所述的“抑制肥大細胞響應”或“抑制肥大細胞活性”的抗體，是在10μg/ml濃度下，當與未經抗體處理的肥大細胞相比時，使1-3ng/mlil-33誘導的gm-csf、il-5、il-13或il-10分泌降低至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的抗體。通常，肥大細胞可通過熟知的方法及如下文示例而來源于人臍帶血或肺實質以及小氣道cd34+祖細胞。肥大細胞培養(yǎng)條件可影響抗體的抑制％的量度，因此培養(yǎng)和測試條件在6-10周長的分化過程中，可使用例如stempro-34培養(yǎng)基保持標準。在細胞因子釋放測定之前的4天，每天以10ng/mlil-4、10ng/mlil-6和100ng/mlscf刺激肥大細胞。對于細胞因子釋放測定而言，肥大細胞可重懸于新鮮的stempro-34培養(yǎng)基中，或含有10％無抗生素的fcs及100ng/mlscf的rpmi中。適合測定的接種密度為65,000至75,000個細胞/0.16ml/孔。如本文所述的抑制肥大細胞響應的本發(fā)明示例性抗體是抗體stlm15、stlm62和stlm208。抗體cnto3914結合小鼠st2l域i，而無對于人st2l的交叉反應性，并在小鼠細胞中抑制肥大細胞響應。本領域的技術人員將會知道，肥大細胞響應也包括如下物質的釋放：il-1和il-32，以及趨化因子(諸如ccl1、ccl4、ccl5、ccl18和ccl23)，以及過敏介質(諸如半胱氨酰白三烯、組胺)，以及多種肥大細胞蛋白酶(包括類胰蛋白酶、糜酶、羧肽酶和組織蛋白酶g)。如本文所述的本發(fā)明抗體可使用標準方法測試其抑制這些另外的肥大細胞響應的能力。如本文所述的結合st2l的域i并阻斷il-33/st2l相互作用的本發(fā)明的抗體，當在這些條件下，以10μg/ml的最小濃度測試時，可預期使這些另外的肥大細胞響應抑制至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。如本文所述的本發(fā)明的抗體以下列常數結合人st2l：介于約5×10-12m至約7×10-10m之間的解離常數(kd)，介于約2×106m-1s-1至約1×108m-1s-1之間的對人st2l的結合速率常數(kon)，或介于約1×10-6s-1至約1×10-2s-1之間的對人st2l的解離速率常數(koff)。例如，如本文所述的本發(fā)明的抗體以小于約7×10-10m、小于約1×10-10m、小于約5×10-11m、小于約1×10-11m或小于約5×10-12m的kd結合人st2l。如本文所述的本發(fā)明的抗體可與食蟹猴(cyno)st2l(seqidno：2)交叉反應，并以下列常數結合于cynost2l：介于約3×10-12m至約2×10-9m之間的解離常數(kd)，介于約4×106m-1s-1至約1×108m-1s-1之間的對cynost2l的結合速率常數(kon)，或介于約7×10-5s-1至約1×10-1s-1之間的對cynost2l的解離速率常數(koff)。例如，如本文所述的本發(fā)明的抗體以小于約2×10-9m、小于約1×10-9m、小于約1×10-10m、小于約1×10-11m或小于約3×10-12m的kd結合cynost2l。抗體對st2l的親和力可使用任何合適的方法通過實驗測定。此類方法可利用本領域技術人員已知的proteonxpr36、biacore3000或kinexa儀器、elisa或競爭性結合測定。如果在不同條件下(例如滲透壓、ph)測量，則所測得的特定抗體/st2l相互作用的親和力可不同。因此，親和力和其他結合參數(如，kd、kon、koff)的測量優(yōu)選地用標準化條件和標準化緩沖液諸如本文所述的緩沖液進行。本領域技術人員將會知道，使用例如biacore3000或proteon進行親和力測量的內部誤差(測量為標準偏差，sd)通?？稍诘湫蜋z出限內的測量值的5-33％內。因此術語“約”反映測定中的典型標準偏差。例如，1×10-9m的kd的典型sd為至多±0.33×10-9m。以所需親和力結合人st2l并任選地與cynost2l交叉反應的抗體，可通過用人和/或cynost2l淘選，并任選地通過進一步抗體親和力成熟，從變體或片段的文庫中選擇?？贵w可根據其對st2l生物活性的抑制使用任何合適的方法來鑒定。此類方法可使用報告基因測定法或測量細胞因子制備的測定法，使用所熟知的方法并如本發(fā)明中所描述來進行。本發(fā)明的一個實施例是特異性結合人st2l的分離抗體拮抗劑，其包含：seqidno：160(x1x2x3mx4)的重鏈互補決定區(qū)(hcdr)1(hcdr1)；其中x1為s、f、d、i、g或v；x2為y或d；x3為a、d或s；并且x4為s、f或i；seqidno：161(x5ix6gx7ggx8tx9yadsvkg)的hcdr2(hcdr2)；其中x5為a、s、t、y或d；x6為s、r、e、k、g或a；x7為s、e或n；x8為s、r、e、g、t、d或a；并且x9為y、d、n、a或s；以及seqidno：162(x10x11wstegsffvldy)的hcdr3(hcdr3)；其中x10為d、a、r、n、q、p、e、i、h、s、t或y；并且x11為p、a、h、y、e、q、l、s、n、t、v、或i。本發(fā)明的另一個實施例是特異性結合人st2l的分離抗體拮抗劑，其包含：seqidno：163(rasqsvddx12la)的輕鏈互補決定區(qū)(lcdr)1(lcdr1)；其中x12為a或d；seqidno：90(dasnrat)的lcdr2(lcdr2)；以及seqidno：164(qqx13x14x15x16x17x18t)的lcdr3(lcdr3)；其中x13為f或y；x14為y、i或n；x15為n、g、d或t；x16為w或a；x17為p或缺失；并且x18為l或i。分別包含seqidno：160、161、162、163、90和164的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列的本發(fā)明的抗體，可通過熟知的誘變方法，分別使用例如seqidno：78、81、84、87、90和92的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列作為模板來制備。可分別將seqidno：160、161、162、163、90和164的重鏈cdr和輕鏈cdr移植到人框架，諸如下文所述的框架?？墒褂帽疚乃龅姆椒ǚ治鲈摽贵w對st2l的結合，其阻斷il-33/st2l相互作用的能力以及其他特征，諸如對人st2l和/或cynost2l的親和力，以及對肥大細胞響應的抑制。在一個實施例中，如本文所述特異性結合人st2l的分離抗體拮抗劑包含：seqidno：78或95-108的hcdr1；seqidno：81，109-118或120-129的hcdr2；seqidno：84或165-185的hcdr3；seqidno：87或130的lcdr1；seqidno：90的lcdr2；以及seqidno：92或131-134的lcdr3。在另一個實施例中，特異性結合人st2l的分離抗體拮抗劑包含如圖10、圖11和圖12所示和如本文所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列。在另一個實施例中，如本文所述的特異性結合人st2l的分離抗體拮抗劑包含：seqidno：23或24的hcdr1；seqidno：27或28的hcdr2；seqidno：31或32的hcdr3；seqidno：35或36的lcdr1；seqidno：39或40的lcdr2；以及seqidno：43或44的lcdr3。在另一個實施例中，如本文所述的特異性結合人st2l的分離抗體拮抗劑包含hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列：分別為seqidno：23、27、31、35、39和43；分別為seqidno：24、28、32、36、40和44；(hfacdr)；分別為seqidno：24、28、146、36、40和147；或分別為seqidno：24、28、146、36、40和44。本發(fā)明的另一個實施例為如本文所述的特異性結合人st2l(seqidno：1)的分離的人或人適應性抗體拮抗劑或其片段，其包含具有來源于人ighv3-23(seqidno：158)、ighv1-24*01(seqidno：148)或ighv1-f*01(seqidno：149)框架序列的vh框架的重鏈可變區(qū)(vh)，以及具有來源于人igkv3-11(l6)(seqidno：159)、igkv3-15*01(l2)(seqidno：150)、igkv1-9*01(l8)(seqidno：151)、igkv1-5*01(l12)(seqidno：152)、igkv1-12*01(l5)(seqidno：153)、igkv1-39*01(o12)(seqidno：154)、igkv1-27*01(a20)(seqidno：155)或igkv1-33*01(o18)(seqidno：156)框架序列的vl框架的輕鏈可變區(qū)(vl)。在另一個實施例中，如本文所述特異性結合人st2l的域i的分離抗體包含具有來源于人vh3-23框架序列(seqidno：158)的vh框架的vh；以及具有來源于人vκl6框架序列(seqidno：159)的vl框架的輕鏈可變區(qū)(vl)。人框架序列是熟知的，并且通常包括接合到接合(j)序列的人免疫球蛋白種系可變區(qū)序列。seqidno：158中所示的人vh3-23框架氨基酸序列包括接合到ighj4的人種系vh3-23序列，并且seqidno：159中所示的人vkl6框架氨基酸序列包括接合到igkj1的人vκl6種系序列，如shi等人，jmolbiol397：385-96，2010；國際專利公開wo2009/085462；和美國專利公開us2010/0021477中所述。具有來源于人vh3-23的vh序列和來源于人vκl6的vl序列的示例性抗體為圖12和圖13中所示的那些。包含“來源于”特定框架或種系序列的重鏈或輕鏈可變區(qū)的人或人適應性抗體，是指從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)，諸如從轉基因小鼠或從噬菌體展示文庫得到的抗體，如下文所討論?！皝碓从凇碧囟蚣芑蚍N系序列的抗體，與其所來源的序列相比，由于例如自然發(fā)生的體細胞突變或有意的置換，可含有氨基酸差異。在另一個實施例中，特異性結合如本文所述的人st2l的域i(seqidno：9)的分離的人或人適應性抗體拮抗劑或其片段，與包含seqidno：47的重鏈可變區(qū)(vh)和seqidno：51的輕鏈可變區(qū)(vl)的分離抗體(抗體c2244)，競爭結合于人st2l(seqidno：1)。在另一個實施例中，如本文所述的本發(fā)明的分離抗體在seqidno：1的第35-48位氨基酸殘基(rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)處結合人st2l。如本文所述的抗體還可在seqidno：1的氨基酸殘基t93和f94處結合人st2l。如本文所述包含某些hcdr1、hcdr2和hcdr3以及l(fā)cdr1、lcdr2和lcdr3氨基酸序列、或包含某些vh和vl序列的本發(fā)明抗體之間特異性結合于人st2l的競爭作用，可使用熟知的方法在體外測定。例如，msdsulfo-tagtmnhs酯標記抗體在未標記抗體存在下對人st2l的結合可通過elisa評估，或可使用biacore分析法或流式細胞術證實與本發(fā)明抗體的競爭作用。測試抗體抑制c2244結合于人st2l的能力證實該測試抗體可與這些抗體競爭結合于人st2l。此類示例性抗體為表3和圖13中所示的c2494、stlm208和stlm213。如本文所述的與c2244競爭結合于st2l的域i的抗體，阻斷il-33/st2l相互作用并抑制一系列的st2l生物活性，包括il-33誘導的肥大細胞響應。st2l域i上也存在非中和性的(即非抑制性)表位，作為第二抗體競爭基團(以結合st2l的域i、不與c2244競爭且不抑制st2l信號傳導的抗體c2240表示)。如本文所述的本發(fā)明的結合特定st2l域或表位的抗體，可通過用編碼該表位的肽免疫接種表達人免疫球蛋白基因座的小鼠(lonberg等人，nature368：856-9，1994；fishwild等人，naturebiotechnology14：845-51，1996；mendez等人，naturegenetics15：146-56，1997；美國專利5,770,429、7,041,870和5,939,598)或balb/c小鼠而制備，所述肽例如為具有人st2l的域i的氨基酸序列的肽：kfskqswglenealivrcprqgkpsytvdwyysqtnksiptqernrvfasgqllkflpaavadsgiytcivrsptfnrtgyanvtiykkqsdcnvpdylmystv(seqidno：9)，或具有氨基酸序列rcprqgkpsytvdw(seqidno：210)的肽，并使用kohler等人，nature256：495-97，1975的雜交瘤方法。所得抗體使用標準方法測試其對該表位的結合。例如，當各個組分的結構均已知時，可進行計算機芯片上的(insilico)蛋白質-蛋白質對接，以鑒定相互作用的相容位點?？墒褂盟隹乖涂贵w復合物進行氫-氘(h/d)交換以標測所述抗原上可能受到該抗體結合的區(qū)域?？墒褂盟隹乖钠魏忘c誘變來定位對于抗體結合而言重要的氨基酸。所鑒定的單克隆抗體可進一步通過諸如queen等人，procnatlacadsci(usa)86：10029-32，1989和hodgson等人，bio/technology9：421，1991中所公開的技術，結合經改變的框架支撐殘基而修飾以保留結合親和力。如本文所述的本發(fā)明的抗體可為人抗體或人適應性抗體。如本文所述的本發(fā)明的抗體可為iga、igd、ige、igg或igm型。其抗原結合位點氨基酸序列與圖10、圖11、圖12、圖13、圖15、表3、表9和表12中所示基本上相同的抗體涵蓋在本發(fā)明的范圍之內。通常，這涉及一個或多個用具有相似電荷或疏水性或立體化學特征的氨基酸進行的氨基酸置換，且目的是改善抗體特性，例如穩(wěn)定性或親和力。例如，保守性置換可涉及用非天然殘基進行的天然氨基酸殘基的置換，使得該位置的氨基酸殘基的極性或電荷幾乎無影響或無影響。此外，多肽中的任何天然殘基還可以用丙氨酸來置換，如此前對于丙氨酸掃描誘變所述(maclennan等人，actaphysiolscandsuppl643：55-67，1998；sasaki等人，advbiophys35：1-24，1998)。所期望的氨基酸置換(無論是保守性還是非保守性)可由本領域的技術人員在需要此類置換時來決定。例如，可使用氨基酸置換來鑒定對抗體的功能具有重要性的殘基，諸如影響親和力的殘基，或賦予非期望特性諸如聚集的殘基。示例性氨基酸置換示于圖12和圖13中。與抗原結合位點呈對比，還可產生框架區(qū)內的置換，只要它們不會不利地影響所述抗體的特性?？稍诶鐅ernierzone殘基(美國專利6,649,055)進行框架置換以改善抗體親和力或穩(wěn)定性。也可在抗體中在與同源人種系基因序列相比時序列不同的框架位置進行置換，以降低可能的免疫原性。這些修飾可對例如來源于從頭合成抗體文庫諸如pix文庫的抗體進行。保守性氨基酸置換還涵蓋了非天然存在的氨基酸殘基，其通常通過化學肽合成并入而非通過生物系統(tǒng)中的合成。氨基酸置換可以例如通過pcr誘變來進行(美國專利4,683,195)?？墒褂檬熘椒ㄉ勺凅w文庫，例如使用隨機(nnk)或非隨機密碼子(例如dvk密碼子，其編碼11個氨基酸(acdegknrsyw))，并篩選具有所需特性的文庫或變體。雖然實例中所示的實施例包含一者來自重鏈且一者來自輕鏈的成對可變區(qū)、成對全長抗體鏈、或成對cdr1、cdr2和cdr3區(qū)，但技術人員將認識到替代性實施例可包含來自一條抗體鏈的重鏈或輕鏈中的任一者的單一重鏈可變區(qū)或單一輕鏈可變區(qū)、單一全長抗體鏈、或cdr1、cdr2和cdr3區(qū)?？墒褂靡粭l鏈的單一可變區(qū)、全長抗體鏈或cdr1、cdr2和cdr3區(qū)篩選另一條鏈中的對應域，這兩條鏈能夠形成特異性結合st2l的抗體。所述篩選可以通過噬菌體展示篩選方法并使用例如在pct公開wo1992/01047中所公開的分級雙組合法(hierarchicaldualcombinatorialapproach)來完成。在此方法中，包含h鏈克隆或l鏈克隆的單個菌落被用來感染編碼另一鏈(l或h)的克隆的完全文庫，并且所得的雙鏈特異性抗原結合域根據所描述的噬菌體展示技術來選擇。本發(fā)明提供如本文所述的本發(fā)明抗體的分離vh和vl域，以及包含特定vh和vl域的抗體。如本文所述的本發(fā)明的某些抗體的vh和vl可變區(qū)示于圖13和表12中。本發(fā)明的一個實施例是一種分離的人或人適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人st2l的域i(seqidno：9)，包含與seqidno：191的vh具有至少90％同一性的vh。本發(fā)明的另一個實施例是一種分離的人或人適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人st2l的域i(seqidno：9)，包含與seqidno：209的vl具有至少94％同一性的vl。在本文所述的一些實施例中，本發(fā)明提供一種抗體，其包含seqidno：143、144、145、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204或205的vh。在本文所述的一些實施例中，本發(fā)明提供一種抗體，其包含seqidno：135、136、137、138、139、140、141、142、206、207、208或209的vl。在本文所述的一些實施例中，本發(fā)明提供一種抗體，其包含seqidno：186、187、197、198、199、200、201、202、203、204或205的vh和seqidno：206的vl；seqidno：195或196的vh和seqidno：207的vl；seqidno：188、189或190的vh和seqidno：208的vl；或seqidno：187、191、192、193或194的vh和seqidno：209的yl。本發(fā)明的另一個實施例是一種分離的人或人適應性抗體拮抗劑或其片段，其特異性結合人st2l的域i(seqidno：9)，包含：seqidno：97的hcdr1；seqidno：114的hcdr2；seqidno：84的hcdr3；seqidno：130的lcdr1；seqidno：90的lcdr2；seqidno：134的lcdr3；或seqidno：191的vh和seqidno：209的vl。缺少任何非人序列的人單克隆抗體可通過例如knappik等人，jmolbiol296：57-86，2000；和krebs等人，jimmunolmeth254：67-842001中引用的技術由噬菌體展示文庫制備和優(yōu)化。在示例性方法中，本發(fā)明的抗體分離自將抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)表達為具有噬菌體pix外殼蛋白質的融合蛋白質的文庫。篩選抗體文庫中結合于人st2l-ecd的那些，并進一步表征所得的陽性克隆，從克隆溶解物分離fabs，并表達為全長igg。示例性抗體文庫和篩選方法描述于shi等人，jmolbiol397：385-96，2010；國際專利公開wo2009/085462和美國專利號12/546850；美國專利5,223,409、5,969,108和5,885,793)。所得的單克隆抗體可進一步在其框架區(qū)進行修飾，以將某些框架殘基改變?yōu)橄嗥ヅ涞娜朔N系中存在的殘基。本發(fā)明的抗體的免疫效應子特性可通過本領域技術人員已知的技術經由fc修飾得到增強或沉默。例如，fc效應子功能諸如c1q結合、補體依賴性細胞毒性(cdc)、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)、吞噬作用、細胞表面受體(例如b細胞受體；bcr)的下調等，可通過修飾促成這些活性的fc中的殘基來提供和/或控制。藥代動力學特性還可通過使fc域中延長抗體半衰期的殘基突變得到增強(strohlcurropinbiotechnol20：685-91，2009)。示例性fc修飾是igg4s228p/l234a/l235a、igg2m252y/s254t/t256e(dall’acqua等人，jbiolchem281：23514-24，2006；或igg2v234a/g237a/p238s、v234a/g237a/h268q、h268a/v309l/a330s/p331或igg2上的v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s(國際專利申請wo2011/066501)(根據eu編號進行編號)。另外，如本文所述的本發(fā)明的抗體可通過諸如糖基化、異構化、去糖基化或非天然存在的共價修飾(諸如添加聚乙二醇部分(聚乙二醇化)和脂質化)等過程進行翻譯后修飾。此類修飾可在體內或體外進行。例如，如本文所述的本發(fā)明的抗體可綴合至聚乙二醇(聚乙二醇化的)以改善其藥代動力學特性。綴合可通過本領域技術人員已知的技術來執(zhí)行。治療抗體與peg的綴合已示出增強藥效學，同時不干擾功能(knigh等人，platelets15：409-18，2004；leong等人，cytokine16：106-19，2001；yang等人，proteineng16：761-70，2003)。如本文所述經修飾以改善穩(wěn)定性、選擇性、交叉反應性、親和力、免疫原性或其他所期望的生物或生物物理特性的本發(fā)明抗體或其片段在本發(fā)明的范圍之內。抗體的穩(wěn)定性受許多因素影響，包括(1)影響其內在穩(wěn)定性的單獨域的核心堆疊，(2)對hc和lc配對具有影響的蛋白質/蛋白質界面相互作用，(3)極性和帶電殘基的包埋，(4)極性和帶電殘基的h鍵網絡；以及(5)其他分子內力和分子間力中的表面電荷和極性殘基分布(worn等人，jmolbiol305：989-1010，2001)。潛在的結構不穩(wěn)定殘基可根據該抗體的晶體結構或在某些情況下通過分子建模來鑒定，并且所述殘基對于抗體穩(wěn)定性的影響可通過產生并評估在所鑒定殘基中攜帶突變的變體來測試。用于提高抗體穩(wěn)定性的方法之一是提高熱相變中點(tm)如差示掃描量熱法(dsc)所測定。一般來講，蛋白質的tm與其穩(wěn)定性相關聯(lián)并且與其對溶液中的解折疊和變性以及依賴于該蛋白質解折疊傾向的降解過程的易感性成反向相關(remmele等人，biopharm13：36-46，2000)。大量的研究已經發(fā)現(xiàn)了通過dsc以熱穩(wěn)定性而測量的制劑物理穩(wěn)定性的級別與通過其他方法測量的物理穩(wěn)定性之間的相關性(gupta等人，aapspharmsci5e8，2003；zhang等人，jpharmsci93：3076-89，2004；maa等人，intjpharm140：155-68，1996；bedu-addo等人，pharmres21：1353-61，2004；remmele等人，pharmres15：200-8，1997)。制劑研究提示，fab的tm對于對應單克隆抗體的長期物理穩(wěn)定性有所牽涉?？蚣芑騝dr之內的氨基酸差別對于fab域的熱穩(wěn)定性可具有顯著影響(yasui等人，febslett353：143-6，1994)。如本文所述的特異性結合人st2l域i的本發(fā)明的抗體，可工程改造成雙特異性抗體，其也涵蓋在本發(fā)明的范圍之內。本發(fā)明的抗體的vl區(qū)和/或vh區(qū)，可使用已公布的方法工程改造成結構如設計(國際專利公開wo1999/57150；美國專利公開us2011/0206672)的單鏈雙特異性抗體，或工程改造成結構如公開于美國專利us5869620；國際專利公開wo1995/15388a、國際專利公開wo1997/14719或國際專利公開wo2011/036460中的結構的雙特異性scfv。如本文所述的本發(fā)明的抗體的vl區(qū)和/或vh區(qū)，可工程改造成雙特異性全長抗體，其中每個抗體臂結合不同的抗原或表位。通常通過調節(jié)這二條抗體重鏈之間的ch3相互作用制備此類雙特異性抗體，以使用諸如美國專利us7695936；國際專利公開wo04/111233；美國專利公開us2010/0015133；美國專利公開us2007/0287170；國際專利公開wo2008/119353；美國專利公開us2009/0182127；美國專利公開us2010/0286374；美國專利公開us201i/0123532；國際專利公開wo2011/131746；國際專利公開wo2011/143545；或美國專利公開us2012/0149876中所述的那些技術來形成雙特異性抗體?？稍谄渲薪Y合本發(fā)明的抗體的vl區(qū)和/或vh區(qū)的另外雙特異性結構，是例如雙可變域免疫球蛋白(國際專利公開wo2009/134776)，或包括多種二聚域的結構以連接具有不同特異性的兩個抗體臂，諸如亮氨酸拉鏈或膠原二聚域(國際專利公開wo2012/022811；美國專利us5932448；美國專利us6833441)。本發(fā)明的另一個方面是分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的任何抗體重鏈可變區(qū)或抗體輕鏈可變區(qū)或其片段，或它們的互補序列。本文公開了某些示例性多核苷酸，然而，鑒于在給定表達系統(tǒng)中的給定的遺傳密碼簡并性或密碼子偏倚性而編碼本發(fā)明抗體拮抗劑的其他多核苷酸也在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明的示例性多核苷酸為在seqidno：211、212、213和214中所示的那些。本發(fā)明的另一個實施例是包含本發(fā)明的多核苷酸的載體。此類載體可以是質粒載體、病毒載體、桿狀病毒表達載體、基于轉座子的載體或任何其它適用于通過任何手段將本發(fā)明的多核苷酸引入給定生物體或遺傳背景的載體。本發(fā)明的另一個實施例是包含本發(fā)明多核苷酸的宿主細胞。此類宿主細胞可以是真核細胞、細菌細胞、植物細胞或古菌細胞。示例性的真核細胞可以是哺乳動物、昆蟲、禽類或其他動物來源。哺乳動物真核細胞包括無限增殖化細胞系，諸如雜交瘤或骨髓瘤細胞系，諸如sp2/0(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，manassas，va，crl-1581)、ns0(歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(ecacc)，salisbury，wiltshire，uk，ecaccno.85110503)、fo(atcccrl-1646)和ag653(atcccrl-1580)鼠細胞系。示例性人骨髓瘤細胞系是u266(attccrl-tib-196)。其他可用的細胞系包括來源于中國倉鼠卵巢(cho)細胞的那些細胞系，諸如cho-k1sv(lonzabiologics，walkersville，md)、cho-k1(atcccrl-61)或dg44。本發(fā)明的另一個實施例是制備特異性結合st2l的域i的抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞以及回收由該宿主細胞所產生的抗體。制造抗體并將其純化的方法是本領域所熟知的。本發(fā)明的另一個實施例是在受治療者中抑制st2l與il-33相互作用的方法，其包括以足以抑制st2l和il-33的相互作用的量向該受治療者施用特異性結合st2l的域i的抗體。治療方法如本文所述的本發(fā)明的st2l拮抗劑，例如阻斷il-33/st2l相互作用并結合st2l域i的st2l抗體拮抗劑、與包含seqidno：47的重鏈可變區(qū)和seqidno：51的輕鏈可變區(qū)的分離抗體競爭結合于人st2l(seqidno：1)的抗體、或在seqidno：1的第35-48位氨基酸殘基(rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)處結合人st2l的抗體，可用于調節(jié)免疫系統(tǒng)。如本文所述的本發(fā)明的抗體，當與結合st2l其他域和/或區(qū)的抗體相比時，可更有效地拮抗st2l生物活性，例如本發(fā)明的抗體能夠更有效地降低il-33誘導的肥大細胞響應。本發(fā)明的任何抗體可用于本發(fā)明的方法中?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的示例性抗體是抗體stlm62、stlm15、stlm103、stlm107、stlm108、stlm123、stlm124、stlm206、stlm207、stlm208、stlm209、stlm210、stlm211、stlm212、stlm213。不希望受任何理論的束縛，據推論結合域i并阻斷il-33/st2l相互作用的抗體拮抗劑可抑制肥大細胞上il-1racp/il-33/st2l/ckit復合物形成或下游的信號傳導，然而域iii結合抗體，雖然能夠抑制il-1racp募集到st2l/il-33復合物，但可能無法破壞特異性存在于肥大細胞上的較大il-1racp/il-33/st2l/ckit復合物的形成。進行的芯片分析支持所述推論，因為芯片分析證實抗-st2l域i結合抗體抑制大多數由il-33誘導的肥大細胞信號傳導途徑，而抗-st2l域iii結合抗體僅能抑制這些信號傳導途徑的一小部分?？赡艿氖?，由于在輔助蛋白il-1racp締合之前il-33先結合于st2l，通過域i結合抗體阻礙il-33結合于st2l即可避免任何其他輔助蛋白的締合，包括ckit或尚未鑒別的輔助受體。不會干擾il-33結合于st2l的域iii結合抗體，理論上可阻斷il-1racp締合，但不會阻斷其他輔助受體的締合，包括尚未鑒別的輔助受體。已提出多個模型用于解釋il-1racp如何與il-1/il-1r或st2l/il-33復合物相互作用(lingel等人，structure17：1398-1410，2009；以及綜述于thomas等人，natstruct&molecbiol19：455-457，2012)。這些模型指示，il-1racp可結合于該復合物的一側，但結合于哪一側則尚無定論。因此，可能的是，該復合物的“其他側”或“游離側”可用于與不會被域iii抗體阻斷的替代性輔助受體締合，并且可能出現(xiàn)脫靶效應諸如增加另一輔助受體募集，導致信號傳導增加。在本發(fā)明的方法中，可使用任何特異性結合人st2l域i的抗體拮抗劑、阻斷il-33/st2l相互作用并結合人st2l域i的抗體拮抗劑、與包含seqidno：47的重鏈可變區(qū)和seqidno：51的輕鏈可變區(qū)的分離抗體競爭結合于人st2l(seqidno：1)的抗體、或在seqidno：1的第35-48位氨基酸殘基(rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)處結合人st2l的抗體。此類抗體的另外特征包括該抗體阻斷il-33/st2l相互作用并抑制人肥大細胞響應的能力。因此，本發(fā)明的抗體適用于治療一系列st2l介導的病癥、st2l介導的炎性病癥以及需要抑制肥大細胞響應的病癥。本發(fā)明的方法可用于治療屬于任何分類的動物患者。此類動物的例子包括哺乳動物，諸如人、嚙齒動物、犬類、貓類和農畜。例如，例如，本發(fā)明的抗體可用于預防和治療st2l介導的病癥，諸如炎性疾病，包括哮喘、氣道過度反應、結節(jié)病、慢性阻塞性肺部疾病(copd)、特發(fā)性肺纖維化(ipf)、囊性纖維化、炎性腸病(ibd)、類風濕性關節(jié)炎、嗜酸細胞性食道炎、硬皮病、特應性皮炎、過敏性鼻炎、大皰性類天皰瘡、慢性蕁麻疹、糖尿病性腎病、間質性膀胱炎或移植物抗宿主病(gvhd)。本發(fā)明的抗體可用于預防和治療至少部分由肥大細胞介導的免疫疾病，諸如哮喘、濕疹、瘙癢、過敏性鼻炎、過敏性結膜炎，以及自體免疫疾病，諸如類風濕性關節(jié)炎、大皰性類天皰瘡和多發(fā)性硬化癥。本發(fā)明的抗體也可用于制備用于此類治療的藥物，其中制備所述藥物用于以本文限定的劑量施用。肥大細胞通過釋放多種介質，而在過敏性炎癥和哮喘中起到核心作用(綜述于amin，respirmed106：9-14，2012)。st2l在肥大細胞上高表達，且其活化導致多種促炎細胞因子及其他介質的表達。st2l活性的抑制據推測會干擾肥大細胞介導的炎性細胞募集并調節(jié)慢性炎癥。肥大細胞對于刺激會快速響應，所述刺激包括過敏原、冷空氣、病原體；這些刺激對上皮細胞的損傷可造成il-33的釋放(綜述于zhao和hu，cell&molecimmunol7：260-2，2012)。肥大細胞釋放白三烯、組胺、前列腺素和細胞因子，以提高血管通透性和支氣管收縮，并募集其他免疫細胞，諸如嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和t淋巴細胞到該位點(henderson等人，jem184：1483-94，1996；white等人，jaci86：599-605，1990)。另外，它們通過誘導內皮細胞上的粘附分子上調以增加免疫細胞運輸而增強免疫響應(meng等人，jcellphysiol165：40-53，1995)。肥大細胞在氣道重塑中起到重要作用；在哮喘患者中，在氣道平滑肌(asm)細胞層內發(fā)現(xiàn)增加數量的肥大細胞，這些肥大細胞分泌介質來促進asm增殖(綜述于okayama等人，curropinimmunol19：687-93，2007)。炎性肺部病癥是炎性病癥的一個例子。示例性炎性肺部病癥包括感染誘導的肺部病癥，包括與病毒、細菌、真菌、寄生蟲或朊病毒感染相關聯(lián)的肺部病癥；過敏原誘導的肺部病癥；污染物誘導的肺部病癥，諸如石棉肺、矽肺或鈹肺；胃內容物吸入誘導的肺部病癥、免疫失調、具有遺傳傾向的炎性病癥諸如囊性纖維化，以及物理創(chuàng)傷誘導的肺部病癥，諸如呼吸機肺損傷。這些炎性病癥還包括哮喘、肺氣腫、支氣管炎、慢性阻塞性肺部疾病(copd)、結節(jié)病、組織細胞增多病、淋巴管性肌瘤病、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、慢性肺病、支氣管肺發(fā)育異常、社區(qū)獲得性肺炎、醫(yī)院性肺炎、呼吸機關聯(lián)性肺炎、敗血病、病毒性肺炎、流行性感冒感染、變異流行性感冒病毒感染、輪狀病毒感染、人類偏肺病毒感染、呼吸道合胞病毒感染和曲霉(aspergillus)或其他真菌感染。示例性的感染相關炎性疾病可包括病毒性或細菌性肺炎，包括重癥肺炎、囊性纖維化、支氣管炎、呼吸道急性加重和急性呼吸窘迫綜合征(ards)。此類感染相關病癥可涉及多重感染，諸如原發(fā)性病毒感染和繼發(fā)性細菌感染。失調的st2l信號傳導可能在肺部疾病諸如哮喘和慢性阻塞性肺部疾病(copd)的病變中起作用(綜述于alcorn等人，annurevphysiol72：495-516，2010)。常用的哮喘和氣道炎癥動物模型包括卵清蛋白攻擊模型、乙酰甲膽堿致敏模型以及用煙曲霉(aspergillusfumigatus)致敏(hessel等人，eurjpharmacol293：401-12，1995)。對來自培養(yǎng)的人支氣管上皮細胞、支氣管成纖維細胞或氣道平滑肌細胞的細胞因子和趨化因子的制備的抑制也可用作體外模型。本發(fā)明的拮抗劑對于這些模型中的任一個的施用可用于評估這些拮抗劑改善癥狀和改變哮喘、氣道炎癥、copd等等的病程的用途。哮喘是肺部的炎性疾病，其特征在于氣道高反應性(“ahr”)、支氣管收縮、哮鳴音、嗜酸性或嗜中性炎癥、粘液過分泌、上皮下纖維化以及升高的ige水平?；加邢幕颊呓洑v了“急性加重”(癥狀的惡化)，最常見是因為呼吸道的微生物感染(例如，鼻病毒、流行性感冒病毒、流感嗜血桿菌)。哮喘發(fā)作可由環(huán)境因素所觸發(fā)(例如，蛔蟲、昆蟲、動物(例如，貓、犬、兔、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠和鳥類)、真菌、大氣污染物(例如，煙草煙霧)、刺激性氣體、煙霧、蒸氣、氣溶膠、化學品、花粉、活動或冷空氣。除哮喘外，影響肺的多種慢性炎性疾病的特征在于對氣道的中性粒細胞浸潤，例如慢性阻塞性肺部疾病(copd)、細菌性肺炎和囊性纖維化(linden等人，eurrespirj15：973-7，2000；rahman等人，clinimmunol115：268-76，2005)，并且諸如copd、過敏性鼻炎和囊性纖維化的疾病的特征在于氣道過度響應(fahy和o’byrne，amjrespircritcaremed163：822-3，2001)。常用的哮喘和氣道炎癥動物模型包括卵清蛋白致敏和攻擊之后的乙酰甲膽堿攻擊的模型(hessel等人，eurjpharmacol293：401-12，1995)。對來自培養(yǎng)的人支氣管上皮細胞、支氣管成纖維細胞或氣道平滑肌細胞的細胞因子和趨化因子的制備的抑制也可用作體外模型。本發(fā)明的抗體拮抗劑對于這些模型中的任一個的施用可用于評估這些拮抗劑改善癥狀和改變哮喘、氣道炎癥、copd等等的病程的用途。通過在th2細胞、嗜堿性粒細胞、肥大細胞和新發(fā)現(xiàn)的先天性2型淋巴細胞上的st2l受體進行的il-33信號傳導，造成il-5和il-13(2型細胞因子)分泌(ilc，綜述于spits等人，naturereviewsimmunology13：145-149，2013)。靶向哮喘中的il-5或il-13的治療的有益效果證實這些途徑的相關性。il-5活化嗜酸性粒細胞，并且用中和il-5的單克隆抗體治療患有唾液嗜曙紅細胞過多的重癥哮喘患者的亞組，結果為減少惡化情形(nair等人，nengljmed.2009；360(10)：985-93)。據報道il-13有助于ige合成、粘液分泌和纖維化。用抗-il-13單克隆抗體治療重癥哮喘患者，導致肺功能改善，其中亞組顯示更大的改善(corren等人，n.engl.j.med.，365：1088-1098，2011)。差別性免疫途徑的其他介質也參與哮喘致病機制，并且阻斷除st2l以外的這些介質可提供另外的治療有益效果。靶向多個2型細胞因子或2型細胞因子產生的上游途徑的治療，在重癥疾病中可具有有益效果。本發(fā)明的st2l抗體的vh域和vl域可結合到雙特異性抗體和本文所述的分子中，其中該雙特異性抗體特異性結合st2l的域i及第二抗原，諸如tslp(胸腺基質淋巴生成素(thymicstromallympohpoietin))、il-25、il-17rb或tslpr。il-25和tslp(如il-33)通過不同的信號傳導復合物觸發(fā)2型細胞因子釋放：il-25(il-17e)是il-17家族的成員并通過il-17ra/il-17rb進行信號傳導，而tslp是il-7家族的成員并通過tslpr/il-7rα異源二聚體進行信號傳導(綜述于koyasu等人，immunol132：475-481，2011)。有il-33、st2l、il-25、il-17rb、tslp或tslpr缺陷的動物在多種不同類型的哮喘小鼠模型中的至少一種中證實氣道炎癥較不嚴重；然而在大多數這些動物模型中，可能缺少對氣道炎癥的保護，從而提高了上皮細胞暴露于多種過敏原或病原體時可伴隨觸發(fā)il-33、il-25和tslp的釋放的可能性。hammad等人報道，將屋塵螨提取物施用給小鼠，造成il-25、tslp和il-33(以及il-33下游的il-5和il-13)釋放到氣道中(hammad等人，natmed15：210-216，2009)。這表明，阻斷st2l和tslp和/或il-25可具有有益效果，特別是在重癥氣道疾病中。在本發(fā)明的另一個實施例中，特異性結合人st2l域i的抗體拮抗劑可用于產生結合st2l和tslp、st2l和il-25、st2l和tslpr、st2l和il-17ra、或st2l和il-17rb的雙特異性分子。在本發(fā)明的另一個實施例中，特異性結合人st2l域i的抗體拮抗劑是雙特異性抗體，其中該抗體進一步結合tslp、il-25、tslpr、il-17ra或il-17rb。tslp、il-25、tslpr、il-17ra和il-17rb結合抗體可使用本文所述的方法生成，諸如用相對應的蛋白質或該蛋白質的胞外域或使用如本文所述的噬菌體展示文庫，免疫接種表達人免疫球蛋白基因座的小鼠(lonberg等人，nature368：856-9，1994；fishwild等人，naturebiotechnology14：845-51，1996；mendez等人，naturegenetics15：146-56，1997；美國專利5,770,429、7,041,870和5,939,598)或balb/c小鼠?；蛘撸墒褂胻slp、il-25、tslpr、il-17ra和il-17rb的現(xiàn)有抗體產生雙特異性分子?？墒褂玫氖纠詉l-25抗體是在例如國際專利公開wo2011/123507中所述的那些抗體。關節(jié)炎(包括骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、由損傷引起的關節(jié)炎的關節(jié)等)是可受益于抗炎性蛋白諸如本發(fā)明的拮抗劑的治療性用途的常見炎性病癥。st2l信號傳導的活化可在發(fā)炎關節(jié)中維持炎癥和進一步的組織損傷。多種類風濕性關節(jié)炎的動物模型是已知的。例如，在膠原誘導的關節(jié)炎(cia)模型中，小鼠發(fā)展出了與人風濕性關節(jié)炎高度相似的慢性炎性關節(jié)炎。st2l缺陷(st2ko)小鼠在該模型中所發(fā)展的疾病輕微，且在該模型中的病變依賴于肥大細胞的st2l表達(xu等人，pnas105：10913-8，2008)。在該模型中，st2ko小鼠關節(jié)內的單核細胞和多形核細胞的浸潤以及滑膜增生減少。與膠原(cii)共培養(yǎng)的st2ko小鼠引流淋巴結，顯示出明顯減少的il-17、ifnγ和tnfα產生。在誘導cia之前過繼轉移野生型(wt)骨髓源性肥大細胞(bmmc)的st2l缺陷小鼠，與這些移植st2kobmmc的小鼠相比，發(fā)展出更嚴重的cia。因此肥大細胞的st2l信號傳導，在類似人類風濕性關節(jié)炎的小鼠模型中，對關節(jié)炎的發(fā)展很關鍵。將本發(fā)明的st2l抗體(其抑制肥大細胞響應)施用給cia模型小鼠，可用于評估這些拮抗劑改善癥狀并改變病程的用途。示例性胃腸炎性病癥是炎性腸病(ibd)、潰瘍性結腸炎(uc)和克隆氏病(cd)、環(huán)境損害誘導的結腸炎(例如，治療方案諸如施用化學療法、放射治療等導致的或相關的(例如作為副作用)胃腸炎癥(例如，結腸炎))、感染性結腸炎、缺血性結腸炎、膠原性或淋巴性結腸炎、壞死性小腸結腸炎、諸如慢性肉芽腫疾病或腹腔疾病這樣的病癥下的結腸炎、食品過敏、胃炎、感染性胃炎或小腸結腸炎(例如，幽門螺旋菌(helicobacterpylori)感染性慢性活動性胃炎)以及由于感染物導致的其它形式的胃腸炎癥。存在若干針對胃腸炎性病癥的動物模型。某些最廣泛使用的模型是2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇(tnbs)誘導的結腸炎模型或唑酮模型，其在結腸中誘導了慢性炎癥和潰瘍(neurath等人，internrevimmunol19：51-62，2000)。另一模型使用了硫酸葡聚糖鈉(dss)，其誘導了急性結腸炎，表現(xiàn)為血性腹瀉、體重減輕、結腸縮短和具有中性粒細胞浸潤的粘膜潰瘍。另一模型涉及初始cd45rb高cd4t細胞向rag或scid小鼠的過繼轉移。在該模型中，供體初始t細胞攻擊接受者腸，造成慢性腸炎癥和類似于人炎性腸病的癥狀(read和powrie，currprotocimmunol，第15章，第15.13單元，2001)。本發(fā)明的拮抗劑在這些模型中任一者的施用可用于評估這些拮抗劑改善癥狀和改變與腸炎癥諸如炎性腸病相關的病程的潛在效能。腎纖維化可發(fā)展自急性損害諸如移植物缺血/再灌注(freese等人，nephroldialtransplant16：2401-6，2001)或慢性病癥諸如糖尿病(ritz等人，nephroldialtransplant11suppl9：38-44，1996)。致病機制通常特征在于初始炎性響應，之后是腎小球過濾器和腎小管間質的持續(xù)性纖維發(fā)生(liu，kidneyint69：213-7，2006)。腎小管間質纖維化已表明在腎損傷到末期腎衰竭的致病機制中起關鍵作用，且近端小管細胞已證實為中心介質(phillips和steadman，histolhistopathol17：247-52，2002；phillips，changgungmedj30：2-6，2007)。腎小管間質區(qū)室中的纖維發(fā)生部分由常駐成纖維細胞的活化所介導，該成纖維細胞分泌促炎性細胞因子，刺激近端小管上皮細胞分泌局部炎性介質和纖維發(fā)生介質。另外，趨化性細胞因子由成纖維細胞和上皮細胞分泌，并提供方向性梯度，引導單核細胞/巨噬細胞和t細胞浸潤到腎小管間質中。炎性浸潤產生另外的纖維發(fā)生細胞因子和炎性細胞因子，其進一步活化成纖維細胞和上皮細胞性細胞因子釋放，同時也刺激上皮細胞進行表型轉化，其中該細胞沉積過量的胞外基質組分(simonson，kidneyint71：846-54，2007)。其他示例性的纖維化病癥可包括肝纖維化(包括但不限于酒精誘導的硬化癥、病毒誘導的硬化癥、自體免疫誘導的肝炎)；肺纖維化(包括但不限于硬皮病、特發(fā)性肺纖維化)；腎纖維化(包括但不限于硬皮病、糖尿病腎炎、腎小球腎炎、狼瘡腎炎)；表皮纖維化(包括但不限于硬皮病、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩、燒傷)；骨髓纖維化；神經纖維瘤；纖維瘤；腸纖維化；以及外科手術導致的纖維性粘著。所述纖維化可以是器官特異性纖維化或全身纖維化。所述器官特異性纖維化可關聯(lián)于肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化、心臟纖維化、血管纖維化、皮膚纖維化、眼纖維化或骨髓纖維化。所述肺纖維化可關聯(lián)于特發(fā)性肺纖維化、藥源性肺纖維化、哮喘、結節(jié)病或慢性阻塞性肺部疾病。所述肝纖維化可關聯(lián)于硬化癥、血吸蟲病或膽管炎。所述硬化癥可以是酒精性硬化癥、丙型肝炎后硬化癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化。所述膽管炎可以是硬化性膽管炎。所述腎纖維化可關聯(lián)于糖尿病性腎病或狼瘡腎小球硬化癥。所述心臟纖維化可關聯(lián)于心肌梗塞。所述血管纖維化可關聯(lián)于血管成形術后的動脈再狹窄或動脈粥樣硬化。所述皮膚纖維化可關聯(lián)于燒傷瘢痕、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩或腎源性纖維化皮膚病。所述眼纖維化可關聯(lián)于眼后纖維化、白內障手術或增生性玻璃體視網膜病變。所述骨髓纖維化可關聯(lián)于發(fā)性骨髓纖維化或藥源性骨髓纖維化。所述全身性纖維化可以是全身性硬化癥或移植物抗宿主病?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法來預防或治療的其它炎性病癥和神經病變是由自體免疫疾病導致的那些。這些病癥和神經病變包括多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、以及神經退化性和中樞神經系統(tǒng)(cns)失調(包括阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、雙相性精神障礙和肌萎縮側索硬化癥(als))、肝臟疾病(包括原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、非酒精脂肪肝疾病/脂肪性肝炎、纖維變性、丙型肝炎病毒(hcv)和乙型肝炎病毒(hbv)、糖尿病和胰島素抗性)、心血管疾病(包括動脈粥樣硬化、腦溢血、中風和心肌梗塞)、關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、銀屑病性關節(jié)炎和青少年類風濕性關節(jié)炎(jra)、骨質疏松、骨關節(jié)炎、胰腺炎、纖維變性、腦炎、牛皮癬、巨細胞性動脈炎、強直性脊柱炎、自體免疫肝炎、人免疫缺陷病毒(hiv)、炎性皮膚病癥、移植、癌癥、過敏、內分泌疾病、創(chuàng)傷修復、其它自體免疫疾病、氣道高反應性以及細胞、病毒或朊病毒介導的感染或失調。本發(fā)明的一個實施例是治療或預防st2l介導的病癥的方法，其包括將治療有效量的特異性結合人st2l域i(seqidno：9)、阻斷il-33/st2l相互作用、與包含seqidno：47的重鏈可變區(qū)(vh)和seqidno：51的輕鏈可變區(qū)(vl)的分離抗體競爭結合于人st2l(seqidno：1)和/或在seqidno：1的第35-48位氨基酸殘基(rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)處結合人st2l的分離的人或人適應性抗體拮抗劑向對其有需求的患者施用足以治療或預防st2l介導的病癥的時間。本發(fā)明的另一個實施例是抑制患者體內肥大細胞響應的方法，其包括將治療有效量的特異性結合人st2l域i(seqidno：9)、阻斷il-33/st2l相互作用、與包含seqidno：47的重鏈可變區(qū)(vh)和seqidno：51的輕鏈可變區(qū)(vl)的分離抗體競爭結合于人st2l(seqidno：1)和/或在seqidno：1的第35-48位氨基酸殘基(rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)處結合人st2l的分離的人或人適應性抗體拮抗劑向對其有需求的患者施用足以抑制肥大細胞響應的時間。本發(fā)明的另一個實施例是抑制受治療者體內il-33和st2l的相互作用的方法，其包括以足以抑制il-33和st2l的相互作用的量向受治療者施用特異性結合人st2l域i(seqidno：9)、阻斷il-33/st2l相互作用、與包含seqidno：47的重鏈可變區(qū)(vh)和seqidno：51的輕鏈可變區(qū)(vl)的分離抗體競爭結合于人st2l(seqidno：1)和/或在seqidno：1的第35-48位氨基酸殘基(rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)處結合人st2l的分離的人或人適應性抗體拮抗劑。在另一個實施例中，st2l介導的病癥是哮喘、氣道過度反應、結節(jié)病、慢性阻塞性肺部疾病(copd)、特發(fā)性肺纖維化(ipf)、囊性纖維化、炎性腸病(ibd)、嗜酸細胞性食道炎、硬皮病、特應性皮炎、過敏性鼻炎、大皰性類天皰瘡、慢性蕁麻疹、糖尿病性腎病、類風濕性關節(jié)炎、間質性膀胱炎或移植物抗宿主病(gvhd)。在另一個實施例中，st2l介導的病癥與肺中的炎性細胞募集、杯狀細胞增生或增加的粘液分泌相關聯(lián)。在另一個實施例中，st2l介導的病癥與肥大細胞響應相關聯(lián)。在另一個實施例中，所述抑制肥大細胞響應包括用50μg/ml抗體使人臍帶血源性肥大細胞釋放的gm-csf、il-5、il-8、il-10或il-13的水平抑制至少50％。在另一個實施例中，向對其有需求的患者施用的抗體拮抗劑是特異性結合人st2l域i(seqidno：9)、阻斷il-33/st2l相互作用、與包含seqidno：47的重鏈可變區(qū)(vh)和seqidno：51的輕鏈可變區(qū)(vl)的分離抗體競爭結合于人st2l(seqidno：1)和/或在seqidno：1的第35-48位氨基酸殘基(rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)處結合人st2l并且還結合tslp、il-25、tslpr、il-17ra或il-17rb的雙特異性抗體。給藥/藥物組合物有效治療其中期望調節(jié)st2l生物活性的病癥的抗-st2l抗體的“治療有效量”，可通過標準研究技術確定。例如，將在治療炎性病癥諸如哮喘或類風濕性關節(jié)炎中有效的抗-st2l抗體的劑量，可通過向相關的動物模型諸如本文所述的模型中施用抗-st2l抗體來確定。此外，體外測定法可任選地用于輔助鑒定最佳的劑量范圍。對具體的有效劑量的選擇可由本領域的技術人員根據對多種因素的考量(例如，經由臨床試驗)來確定。此類因素包括待治療或預防的疾病、所涉及的癥狀、患者體重、患者免疫狀態(tài)以及技術人員所知的其它因素。將用于制劑中的精確劑量也將取決于給藥途徑以及疾病嚴重性，并且應根據執(zhí)業(yè)者的判斷以及各個患者的狀況來決定。有效劑量可通過來自體外或動物模型測試體系的劑量響應曲線來推導。本發(fā)明的抗體的治療用途的給藥模式可以是將該藥劑遞送至宿主的任何合適的途經。這些抗體的藥物組合物尤其可用于非腸道給藥，例如，真皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下或鼻內給藥。本發(fā)明的抗體可制備為藥物組合物，其含有有效量的藥劑作為藥學上可接受的載體中的活性成分。術語“載體”是指活性化合物與其一起施用的稀釋劑、輔助劑、賦形劑或媒介物。此類藥學媒介物可以是液體，諸如水和油，包括那些來源于石油、動物、植物的油或合成的油，諸如，花生油、大豆油、礦物油和芝麻油等等。例如，可使用0.4％鹽水溶液和0.3％甘氨酸。這些溶液是無菌的，并且通常不含顆粒物。它們可通過常規(guī)的已知的滅菌技術(例如過濾)進行滅菌。組合物可根據需要含有配藥學上可接受的輔助物質，以接近生理條件，諸如ph調節(jié)劑和緩沖劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、潤滑劑和著色劑等。此類藥物制劑中的本發(fā)明的抗體的濃度可廣泛改變，即小于約0.5％，通常為或至少約1％到多達15或20重量％，且將根據所選擇的具體給藥方式，主要基于所需劑量、流體體積、粘度等進行選擇。因此，本發(fā)明的用于肌內注射的藥物組合物可經制備以包含1ml的無菌緩沖水，以及介于約1ng至約100mg的本發(fā)明的抗-st2l抗體，例如，約50ng至約30mg，或更優(yōu)選地約5mg至約25mg。相似地，本發(fā)明的用于靜脈內輸注的藥物組合物可經制備以包含約250ml的無菌林格氏溶液，以及約1mg至約30mg并且優(yōu)選地5mg至約25mg的本發(fā)明的拮抗劑。用于制備非腸道給藥的組合物的實際方法是眾所周知的，且更詳細地描述在，例如，“remington′spharmaceuticalscience”，第15版，mackpublishingcompany，easton，pa中?？蓪⒈景l(fā)明的抗體低壓凍干用于貯存，并在使用前在合適的載體中重構。已證實此技術對常規(guī)免疫球蛋白和蛋白制備有效，并且可以采用本領域已知的凍干法和復構技術。本發(fā)明現(xiàn)結合以下具體的、非限制性實例進行描述。材料和方法(一般)人和食蟹獼猴(macacafascicularis，cyno)受體-配體結合抑制測定(rlb測定)用50μl在碳酸氫鹽緩沖液中的帶有c端his6標簽的4μg/ml人st2l-ecd(seqidno：1的第19-328位氨基酸)或2μg/mlcynost2l-ecd(seqidno：2的第19-321位氨基酸)在4℃下涂布96孔板16小時。所有后續(xù)步驟均在室溫下進行。將平板用200μl封閉緩沖液封閉，并用300μl的含有pbs+0.05％吐溫的洗滌緩沖液洗滌3次。將30μl各種稀釋度的抗-st2l單克隆抗體添加到孔中并溫育1小時。對于人受體-配體結合測定，以100ng/ml終濃度添加20μl的生物素?；薸l-33(seqidno：3的第112-270位殘基)并溫育30分鐘。對于cyno受體-配體結合測定，以200ng/ml終濃度添加20μl的生物素?；痗ynoil-33(seqidno：4的第112-269位殘基)并溫育30分鐘。將平板用300μl的洗滌緩沖液洗滌3次。添加50μl的0.2μg/ml鏈霉抗生物素蛋白-hrp(jacksonimmunoresearch)并溫育30分鐘。將平板用300μl的含有pbs+0.05％吐溫的洗滌緩沖液洗滌3次。向每孔中添加50μl的tmb底物(emdbiosciences)。添加100μl的0.2n硫酸，使反應終止。使用envision酶標儀(perkinelmer)測量od450。嵌合st2l構建體的生成使用標準分子生物學技術設計并生成特征為人和小鼠st2l域i、ii和iii交換的各種構建體。所述構建體列于表1中。氨基酸編號對應于人st2l(hst2l)(seqidno：1；np_057316)和小鼠st2l(mst2l)(seqidno：5；np_001020773)蛋白質。表1.hst2l：人st2lseqidno：1mst2l：小鼠st2lseqidno：5域結合測定分析。利用標準捕獲elisa測定法使用電致化學發(fā)光檢測格式(meso-scalediscovery(msd)技術)測定結合于st2l域i、ii和iii的抗體。將10μg/ml的每種抗體在室溫下涂布在msdhighbind平板的每個孔上(5μl/孔)2小時。將平板用150μl的5％msd封閉緩沖液在室溫下封閉2小時，并用hepes洗滌緩沖液洗滌3次，然后將25μl的經磺酸基標簽標記的hust2l-ecd或小鼠st2l-ecd(seqidno：5的第28-326位氨基酸)或hhm-st2l(seqidno：6)或hmh-st2l(seqidno：8)嵌合體或hh-st2l(seqidno：1的第19-205位殘基)以5nm至40nm的遞增濃度添加到平板中。將平板用鋁箔覆蓋并在室溫下溫育1小時，同時輕輕搖動。然后將平板用hepes洗滌緩沖液洗滌3次。將msd讀取緩沖液(150μl)添加到每個孔中，然后使用msdsectorimager6000讀取平板。這些與人st2l-ecd、hhm-st2l和hmh-st2l結合但不與小鼠st2l-ecd結合的抗體識別人st2l-ecd的域i。與人st2l-ecd和hmh-st2l結合但不與hhm-st2l和小鼠st2l-ecd結合的抗體識別人st2l-ecd的域iii。與人和小鼠st2l-ecd結合但不與hh-st2l結合的抗體識別人和小鼠的st2l-ecd的域iii?？?st2l單克隆抗體的親和力測量。使用標準方法表達抗-st2l單克隆抗體、hust2l-ecd和cynost2l-ecd。山羊抗-人iggfcγ片段特異性抗體(目錄號109-005-098)可購自jacksonimmunoresearchlaboratories(westgrove，pa)。glc傳感器芯片(bio-rad目錄號176-5011)、cm-5傳感器芯片(gehealthcare目錄號br100014)以及用于制備捕獲表面的試劑可購自biacore(gehealthcare，piscataway，nj)或購自bio-radlifesciences(bio-rad，hercules，ca)。抗-st2l抗體與帶his6標簽的人st2l-ecd和帶his6標簽的cynost2l-ecd的相互作用由proteon使用proteonxpr36在25℃下研究。使用胺偶聯(lián)化學的制造商說明書，通過將山羊抗-人iggfcγ片段特異性抗體(ab)偶聯(lián)到glc傳感器芯片的表面，來制備生物傳感器表面。偶聯(lián)緩沖液是10mm乙酸鈉，ph4.5。將山羊抗-人iggfcγ(約4500個響應單元)以水平取向固定。抗st2l抗體以經純化的或粗上清液的形式提供。在任一種情況下，將這些抗體在prb(pbsph7.4，補充有3mmedta和0.005％吐溫20)中稀釋到約0.5μg/ml的濃度?？贵w以豎直取向捕獲(60-130ru)在抗-人fcγ抗體修飾的glc芯片上?？?st2l單克隆抗體捕獲之后，以水平取向注射溶液形式的hust2lecd(0.024至15nm，5倍稀釋度)或溶液形式的cynost2lecd(0.020-5nm，4倍稀釋度)。在所有實驗中監(jiān)測締合4分鐘(以50μl/min注射200μl)。監(jiān)測解離30分鐘。用10mm甘氨酸(ph1.5)的三次15秒脈沖獲得該傳感器表面的再生。使用proteon軟件并使用具有質量傳遞的1∶1結合模型來擬合數據。biacore實驗使用biacore2000或biacore3000光學生物傳感器(biacoreab)進行。所有實驗均在25℃下在具有或不具有0.1％bsa的情況下在brb(pbsph7.4，補充有3mmedta和0.005％吐溫20)中操作。使用胺偶聯(lián)化學的制造商說明書，通過將山羊抗-人iggfcγ片段特異性抗體偶聯(lián)到cm-5芯片的羧甲基化葡聚糖表面，來制備biacore生物反應器表面。偶聯(lián)緩沖液是10mm乙酸鈉，ph4.5。將抗體的平均6000個響應單元(ru)固定在四個流通池的每個中。抗-st2l單克隆抗體捕獲(約33ru)于抗-人fcγ抗體修飾的傳感器芯片表面上。抗-st2l單克隆抗體捕獲之后，注射溶液形式的hust2lecd(0.2至15nm，3倍稀釋度)或溶液形式的cynost2lecd(0.2至15nm或0.020-5nm，3倍稀釋度)。監(jiān)測締合4分鐘或8分鐘(對于c2521和c2519，以50μl/min或20μl/min注射200μl)。監(jiān)測解離10分鐘或至多2.5小時。通過注射50mmnaoh和/或注射100mmh3po4獲得傳感器表面的再生。使用scrubber軟件版本1.1g(biologicsoftware)處理數據。數據的雙參比差減通過如下方式進行：從分析物注射的參比扣減曲線減去由緩沖液注射產生的曲線以校正緩沖液對信號與儀器噪聲的貢獻(myszka，journalofmolrecogn12：279-84，1999)。數據處理后，針對動力學和親和力測定所生成的數據使用scrubber軟件或biaevaluation軟件版本4.0.1(biacore，ab)分析。動力學數據使用簡單1∶1結合模型(包括質量傳遞的項)分析。抗-小鼠st2lmab(c1999/cnto3914)對鼠st2lecd的親和力測量。使用標準方法表達和純化抗-st2lmab(c1999/cnto3914)和鼠st2l胞外域(must2l-ecd)?？?鼠iggfcγ片段特異性抗體可購自jacksonimmunoresearchlaboratories(westgrove，pa)。傳感器芯片和用于制備捕獲表面的試劑可購自biacore(gehealthcare，piscataway，nj)。實驗的biacore電泳緩沖液(brb)包含加有0.005％吐溫20和0.1mg/mlbsa的pbsph7.4，并在25℃下收集數據。在biacore2000上在25℃下研究抗-st2l抗體與must2l-ecd的相互作用。使用胺偶聯(lián)化學的制造商說明書，通過將抗-小鼠-fc特異性抗體偶聯(lián)到cm4傳感器芯片的表面，來制備生物傳感器表面。將c1999/cnto3914和must2l-ecd稀釋于brb中。使用抗-小鼠fcγ抗體(約85ru)捕獲c1999。捕獲之后，注射溶液形式(以15nm開始，5個濃度，3倍系列稀釋度)的must2lecd(seqidno：5的第28-326位殘基)。監(jiān)測締合8分鐘。監(jiān)測解離最多至6000秒。使用1/100稀釋度的磷酸進行再生。數據使用1∶1結合模型進行擬合。人嗜堿性粒細胞系測定(嗜堿性粒細胞細胞因子釋放測定)將ku812細胞(人嗜堿性粒細胞系；atcc，crl-2099)以25,000或50,000細胞/孔接種于無菌96孔u形底組織培養(yǎng)板中總共40μl的補充有10％fbs和青霉素/鏈霉素的rpmi1640生長培養(yǎng)基(invitrogen)中。以各種濃度(50μl/孔)添加抗-人st2l單克隆抗體和對照，并在37℃下溫育。在溫育1小時后，將重組“成熟”il-33(seqidno：3的第111-270位氨基酸)以10ng/ml的終濃度添加到10μlrpmi生長培養(yǎng)基中。然后將細胞在37℃下溫育18-24小時，以允許il-33介導的il-5和il-6誘導。溫育之后，收獲細胞并收集細胞上清液以用于使用elisa(r&dsystems)或基于小珠的多重分析(millipore)進行il-33誘導的il-5和il-6的后續(xù)檢測。人肥大細胞細胞因子釋放測定和pgd2釋放測定肥大細胞來源于cd34+人臍帶血細胞(lonza)。將＞1.0×106cd34+臍帶血細胞的冷凍小瓶快速解凍并轉移至50ml錐形管。將數滴溫熱或室溫stem-pro34培養(yǎng)基+補充物(總共25ml；invitrogen)緩慢添加到細胞。將細胞在1,000rpm下離心15分鐘，并重懸于培養(yǎng)基(10ml的stempro-34，含如下補充物：30ng/mlil-3、100ng/mlil-6和100ng/mlscf。將細胞接種于6孔板的2個孔中，并培養(yǎng)1周。在第4天，使細胞以1∶3在補充的stempro-34培養(yǎng)基中擴增。在第7天，移除非貼壁細胞，并以0.5×106/ml接種于包含10ng/mlil-6和100ng/mlscf的stempro-34培養(yǎng)基中。細胞每周擴增以保持0.5×106/ml的細胞密度直到肥大細胞在6-10周成熟(通過fcεr1、ckit和類胰蛋白酶的表達來評估)。將成熟肥大細胞以0.5×106/ml培養(yǎng)于stempro-34中，并每天在il-4(10ng/ml；peprotech)、il-6(10ng/ml；r&dsystems)和scf(100ng/ml；invitrogen)中刺激，持續(xù)4天。在測定之前，將細胞收獲，在1,000rpm下離心10分鐘，并重懸于新鮮stempro-34培養(yǎng)基或包含10％fcs的rpmi(不含抗生素，含有100ng/ml人重組scf)中。將細胞以65,000至75,000細胞/0.16ml/孔的密度接種于平底的組織培養(yǎng)處理的96孔板中。在添加il-33之前30分鐘，將抗-st2l單克隆抗體添加到平板至終濃度為50、10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032μg/ml。還在培養(yǎng)基+100ng/mlscf中制備10x(10或30ng/ml)的重組人“成熟”il-33(seqidno：3的第111-270位殘基)。將20μl的10xil-33添加到孔中至終濃度為1(圖6和7a-7e)或3ng/ml(圖8a-8e)，并將平板在37℃、5％co2下溫育過夜。在刺激后18-24小時，收獲培養(yǎng)上層清液。將平板在1,000rpm下離心10分鐘。去除上清液，置于u形底96孔板中，并在測定之前保存在-20℃下。使用得自millipore的人細胞因子試劑盒，利用luminextm技術分析細胞因子水平。使用得自caymanchemicalcompany的前列腺素d2-moxeia試劑盒，根據制造商說明書測量pgd2的水平。為了增強elisa的靈敏度，將肥大細胞培養(yǎng)上層清液中的pgd2通過用甲氧胺鹽酸鹽(mox-hcl)處理，轉化為不可降解的mox-pgd2(甲氧胺-pgd2)。小鼠受體-配體結合抑制測定(小鼠rlb測定)將96孔透明板(vwr)用50μl的2μg/ml山羊抗-人igg，fcγ片段特異性(jacksonimmunoresearch)抗體在4℃下涂布約16小時。其余步驟在室溫下完成。將孔用封閉緩沖液溫育、洗滌并添加50μl的2μg/ml與人fc融合的小鼠st2l-ecd，持續(xù)1小時。洗滌平板，并添加1μg/ml的具有或不具有抗-mst2l抗體的生物素?；痬il-33。洗滌平板，用鏈霉抗生物素蛋白-hrp(jacksonimmuneresearch)完成檢測，并根據制造商說明書用tmb底物(fitzgeraldindustries的rdi分部)顯色信號。小鼠和人報道基因測定(人或小鼠rga測定)將hek293細胞以50,000細胞/孔接種于白色透明底部的組織培養(yǎng)處理的96孔板(nunc)中的dmem，10％fbs，并在37℃、5％co2下在潮濕培養(yǎng)箱中溫育24小時。使用opti-mem培養(yǎng)基(invitrogen)中的lipofectaminetm2000，利用標準方案，將細胞用編碼人或小鼠st2l-ecdcdna的載體、nf-κb-熒光素酶載體(stratagene，agilenttechnologies，santaclara，ca)共轉染。在37℃、5％co2下溫育24小時后，在具有或不具有抗-st2l抗體的情況下，將轉染的細胞用小鼠(r&dsystems，seqidno：5的第109-266位殘基)或人il-33(seqidno：3的第112-270位殘基)在37℃、5％co2下處理16小時。使用試劑(promega)根據制造商說明書測量熒光素酶活性。小鼠t細胞增殖測定將小鼠th2細胞(d10.g4.1，atcc)培養(yǎng)于完全生長培養(yǎng)基：具有2mml-谷氨酰胺的rpmi1640培養(yǎng)基經調整以包含1.5g/l碳酸氫鈉、4.5g/l葡萄糖、10mmhepes和1.0mm丙酮酸鈉，并補充有：0.05mm2-巰基乙醇、10pg/mlil-1α(r&dsystems)、10％胎牛血清、含cona的10％大鼠t-stim因子(可得自bectondickinson的大鼠il-2培養(yǎng)補充物)。將細胞用測定培養(yǎng)基(rpmi，10％fbs，無il-1，無t-stim)洗滌兩次，以1.25x105細胞/ml重懸并接種于白色透明底部的組織培養(yǎng)處理的96孔板(nunc，rochester，ny)中80μl的培養(yǎng)基中。將各種量的小鼠il-33(seqidno：5的第109-266位殘基)添加到細胞中至最終測定體積為100μl。當測試抗體中和時，將對照抗體(加入用過的雜交瘤培養(yǎng)基)或雜交瘤上清液添加到細胞中并溫育1小時，然后添加20pg/mlmil-33。將平板在37℃、5％co2下在潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。使用試劑(promega，madison，wi)實現(xiàn)活細胞的定量；方案根據制造商說明書進行。小鼠骨髓源性肥大細胞測定小鼠肥大細胞來源于balb/c小鼠(6周)的骨髓。將細胞以300，000細胞/孔接種于rpmi培養(yǎng)基(不含內毒素)、10％fbs、10％wehi細胞系條件培養(yǎng)基、10ng/mlil-3(peprotech)、0.1mm必需氨基酸、1％青霉素/鏈霉素(invitrogen)中。將抗-st2l單克隆抗體(100、10、1、0.1或0.01μg/ml)與細胞溫育1小時，之后添加重組小鼠“成熟”il-33(seqidno：215的第109-266位殘基(10ng/ml；r&dsystems)。在約24h時后，收獲上清液并凍存，直到使用luminextm的millipore小鼠22-plex試劑盒根據制造商說明書進行分析。cyno內皮細胞測定將培養(yǎng)于內皮細胞生長培養(yǎng)基-2(lonza)中的食蟹獼猴主動脈內皮細胞以10,000或20,000細胞/孔接種于96孔組織培養(yǎng)板。將50μl的抗-st2l抗體添加到細胞中，開始為100μg/ml而后續(xù)為4或5倍稀釋度，并在37℃下溫育1小時，之后添加重組cyno“成熟”il-33(seqidno：4)。然后將五十微升的20ng/ml食蟹獼猴il-33添加到細胞中，并在37℃下溫育24小時。為評估il-33誘導的細胞因子響應，收獲上清液，并通過luminextm的非人靈長類il-8試劑盒(millipore)根據制造商說明書評估細胞因子水平。小鼠腹膜灌洗測定將6只balb/c小鼠的腹膜用總共3mlpbs洗滌以收集腹膜細胞。已發(fā)現(xiàn)這些細胞中的大多數為淋巴細胞和巨噬細胞，如通過b220和f4/80表達(facs分析)確定的。約1％為ckit+(cd117+)肥大細胞。將細胞離心，并將沉淀物重懸于alphamem培養(yǎng)基+10％fbs+100u/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素(invitrogen)中達到1×106細胞/ml。將細胞以200μl/孔接種于96孔板中，并在37℃下靜置2h。將抗-st2l單克隆抗體添加到細胞中30分鐘，之后添加10ng/ml小鼠“成熟”il-33(r&dsystems；seqidno：215的第109-266位殘基)。在il-33添加后24h收集上清液，保存在-20℃下直到分析，然后使用luminextm的millipore小鼠22-plex試劑盒根據制造商說明書進行分析。實例1：大鼠抗-小鼠st2l抗體的生成用小鼠st2-fc(r&dsystems(seqidno：5的ser27-ser342)經腹膜內使大鼠免疫，并評估特異性igg效價。一旦獲得足夠的效價，分離脾細胞并與fo細胞融合。將所得的雜交瘤接種于96孔板或甲基纖維素中并培養(yǎng)10天。通過標準捕獲elisa鑒別結合于mst2-fc的抗原特異性克隆，并對單獨的fc蛋白質交叉篩選。鼠st2特異性雜交瘤進一步在elisa中測試對il-33結合于st2的抑制，以及測試對il-33誘導的d10.g4.1小鼠th2細胞增殖的抑制。通過限制稀釋以克隆方式選擇在受體-配體結合與基于細胞的增殖測定兩者中表現(xiàn)出中和作用的雜交瘤。對雜交瘤v區(qū)進行測序并克隆到小鼠igg1背景中。st2l-ecd域特異性通過標準免疫吸附測定以電致化學發(fā)光檢測使用各種人-小鼠域交換構建體來處理。將雜交瘤c1999分泌的抗體克隆到小鼠igg1背景中并命名為cnto3914。cnto3914可變區(qū)和cdr的序列示于表2中。cnto3914不與人st2l交叉反應并且結合小鼠st2l-ecd的域i。表2.實例2：小鼠抗-人st2l抗體的生成進行兩種不同的免疫法以生成小鼠抗-人st2單克隆抗體。用可溶性st2-fc(r&dsystems，seqidno：157)經腹膜內使balb/c免疫，并評估特異性igg效價。一旦獲得足夠的效價，分離脾細胞并與fo細胞融合。將所得的雜交瘤接種于96孔板中并培養(yǎng)10天。通過標準捕獲elisa鑒別與c端帶his6標簽的hust2l-ecd結合并與帶his6標簽的cynost2l-ecd交叉反應的抗原特異性克隆。與cynost2l交叉反應的人st2l特異性雜交瘤進一步在elisa測定中測試對il-33結合于hust2l的抑制，以及在報道基因測定中測試對nf-κb活化的抑制。選擇報道基因測定中或者elisa和報道基因測定兩者中抑制的克隆供進一步研究。選擇來自雜交瘤c2494、c2519a和c2521a的抗體供進一步分析。c2519a和c2521a與人st2l結合于域iii，并且c2494與人st2l結合于域i。抗體c2494被克隆到人igg2背景中，并且全長抗體被命名為stlm62。在genovacgmbh通過專有dna免疫技術，使用全長st2l構建體并用被轉染以表達人st2l-ecd的細胞加強免疫來生成抗-人st2l單克隆抗體。通過流式細胞術篩選與人st2l-ecd結合的雜交瘤。證實在該測定中呈現(xiàn)結合的克隆與hst2l-ecd結合，并進一步通過標準捕獲elisa表征與cynost2l-ecd的結合。所選克隆在受體-配體結合抑制elisa和報道基因測定中進行表征。選擇報道基因測定中或者elisa和報道基因測定兩者中抑制的克隆供進一步研究。選擇來自genovac雜交瘤c2244的抗體供進一步分析并克隆到人igg2背景中。全長抗體被命名為stlm15。stlm15與人st2l結合于域i。小鼠抗-人抗體的vh、vl和cdr域的序列示于表3中。表3.實例3：完全人st2l抗體的生成人st2l結合fab選自從頭合成pix噬菌體展示文庫，如shi等人，jmolbiol397：385-96，2010；國際專利公開wo2009/085462；美國專利公開us2010/0021477)所述。簡而言之，通過多樣化人支架生成文庫，其中種系vh基因ighv1-69*01、ighv3-23*01和ighv5-51*01與人ighj-4微小基因經由h3環(huán)重組，并且人種系vlkappa基因o12(igkv1-39*01)、l6(igkv3-11*01)、a27(igkv3-20*01)和b3(igkv4-1*01)與igkj-1微小基因重組以組裝完整vh域和vl域。選擇在圍繞h1、h2、l1、l2和l3環(huán)的重鏈和輕鏈可變區(qū)中的位置用于多樣化，所述位置與被鑒別為經常與蛋白和肽抗原接觸的位置相對應。在選定位置處的序列多樣性限于在各個ighv或iglv基因的ighv或iglv種系基因家族中的每個位置處出現(xiàn)的殘基。通過使用長度為7-14個氨基酸的短至中等大小的合成環(huán)，產生在h3環(huán)處的多樣性。設計在h3處的氨基酸分布，以模仿在人抗體中觀察到的氨基酸變異。文庫設計詳述于shi等人，jmolbiol397：385-96，2010。根據它們的人vh和vl種系基因起源，命名用于生成文庫的支架。將3個重鏈文庫與4個種系輕鏈或種系輕鏈文庫相組合，以產生24個獨特的vh∶vl組合用于篩選。所有24個vh∶vl文庫組合均用于對hust2l-ecd-fc的噬菌體淘選實驗。使用hust2l-ecd(seqidno：1的第19-328位殘基)的fc融合淘選文庫。以2種不同格式即溶液形式的抗原(ag)以及展示的ag完成淘選。對于溶液形式的ag，將涂布鏈霉抗生物素蛋白的磁珠在含3％脫脂奶粉的pbs中封閉。將具有10x較高濃度的人fc蛋白質的生物素?；?bt)抗原h(huán)ust2l-ecd人fc融合(bt-hust2l-ecd-fc)作為競爭者與fab-pix噬菌體文庫混合。將結合于bt-hust2l-ecd-fc的fab-pix噬菌體捕獲于封閉的鏈霉抗生物素蛋白(sa)涂布的磁珠上。進行三輪噬菌體選擇，其中hust2l-ecd-fc濃度從第1輪至第3輪分別改變?yōu)?00nm、10nm、10nm。對于ag展示，將bt-hust2l-ecd-fc涂布于經sa涂布的磁珠上。同時將fab-pix噬菌體文庫及10x過量的人fc蛋白質添加到bt-hust2l-ecd-fc展示的sa磁珠。第1輪至第3輪所使用的bt-ag濃度分別為100nm、10nm、10nm。兩種淘選格式均通過elisa使fab結合于hust2l-ecd-fc蛋白質來完成篩選。由這些選擇分離出總共79個結合于hst2l-fc的fab。通過排序elisa(rankingelisa)測定具有整體最佳結合活性的fabhut2su-39。對79個fab進行基于elisa的il-33結合抑制測定?？偣?2個fab顯示抑制il-33結合于hust2l-ecd-fc。從pix從頭合成篩選(pixdenovocampaign)選擇46個fab用于親和力成熟。實例4：完全人st2l抗體的親和力成熟所選抗體使用shi等人，jmolbiol397：385-96，2010和wo09085462a1中所述的“同步”成熟過程進行親和力成熟。在該技術中，將在第一選擇中獲得的fab克隆的vh區(qū)與對應的vl支架的文庫組合。將來自實例3所鑒別的46個fab的所有vh基因克隆到適當的vl成熟文庫作為根據其初始vl基因家族的庫。使用的vl支架文庫及其多樣化方案示于表4中。人vl支架如下：igkv1-39*01(o12)、igkv3-11(l6)、igkv3-20(a27)、igkv4-1*01(b3)，并且描述于例如美國專利公開us2012/0108795中。對于親和力成熟淘選，先將噬菌體文庫添加到bt-hust2-ecd-fc。溫育后，將成熟文庫噬菌體/bt-hst2l-ecd-fc復合物添加到sa涂布的磁珠。bt-hust2-fc濃度從r1至r3分別改變?yōu)?0nm、1nm和0.1nm。在10nm未標記的hust2l-ecd-fc存在下，在室溫下過夜進行第3輪的最后洗滌以進一步促進親和力改善。表4.由成熟淘選獲得總共161個序列獨特的fab。將表現(xiàn)出與hust2l-ecd最高結合的fab轉換成igg用于進一步表征。選擇單克隆抗體st2m48、st2m49、st2m50和st2m51用于進一步表征，并且其vh、vl和cdr序列示于表5中。單克隆抗體st2m48、st2m49、st2m50和st2m51與人st2l結合于域iii，并且與小鼠st2l交叉反應。表5.實例5：抗-st2l抗體的表征。來源于上述各種篩選(campaign)的抗體進一步對于其阻斷il-33/st2l相互作用的能力、其抑制如nf-κb報道基因測定所測量的il-33誘導的信號傳導、抗體抑制肥大細胞響應的能力、其對人和cynost2l的親和力以及與小鼠st2l的交叉反應進行表征。使用如“材料與方法”中所述的人/小鼠st2l域交換嵌合構建體完成表位作圖。實驗的結果示于表6、7和8中。在表7和8中，“+”指示抗體阻斷il-33/st2l相互作用，并且“-“指示其不會阻斷il-33/st2l相互作用。由于缺乏對人的交叉反應性，使用小鼠細胞和試劑完成cnto3914的實驗。所有其他抗體的測定中則使用人細胞和人試劑。表征的抗體被分組為阻斷il-33/st2l相互作用的抗體(單克隆抗體stlm15、stlm62和cnto3914)和不會阻斷il-33/st2l相互作用的抗體(單克隆抗體c2519、c2521、st2m48、st2m49、st2m50和st2m51)。阻斷il-33/st2l相互作用的抗體結合于st2l域i，而非阻斷抗體結合于st2l域iii。所測試的抗體抑制st2l下游信號傳導，如通過nf-κb報道基因測定和il-33誘導的ku812人嗜堿性粒細胞系釋放細胞因子所評估，或在cnto3914的情況下，由小鼠th2細胞增殖所評估。如通過細胞因子與趨化因子分泌所評估，當與結合st2l域iii的抗-st2l抗體相比時，結合于st2l域i的抗體在較高水平抑制人肥大細胞響應。結合小鼠st2l域i并且不會與人交叉反應的cnto3914也能夠抑制il-33誘導的小鼠肥大細胞響應。表6.表7.*受體-配體結合抑制#報道基因測定hd1＝人st2ld1域md1＝小鼠st2ld1域hd3-人st2ld3域h/md3＝人和小鼠st2ld1和d3域nt＝未測試表8.*受體-配體結合抑制#報道基因測定**骨髓源性實例7：st2l域i結合抗體cnto3914會抑制鼻內il-33誘導的氣道過度響應(ahr)、氣道炎癥和小鼠肥大細胞響應。向雌性balb/c小鼠施用四天連續(xù)的2μg/小鼠“成熟”il-33(r&dsystems)(seqidno：215的第109-266位殘基)的鼻內劑量。在首次il-33鼻內施用前24小時，抗-小鼠st2l抗體cnto3914以20mg/kg(或2mg/kg或0.2mg/kg)經皮下注射預防性給予。對照小鼠則在首次il-33經鼻內施用前24小時接受同種型對照cnto5516或pbs。使用以flexivent系統(tǒng)(scireq，montreal，quebec，canada)進行的強制操縱測量對遞增乙酰甲膽堿劑量的氣道過度響應(ahr)。為測量氣道過度響應(ahr)，將小鼠用100mg/kg戊巴比妥與13mg/kg苯妥英麻醉并在連接至flexivent前切開氣管。用鹽水噴霧小鼠以得出基線讀數，接著用兩種劑量(10和20mg/ml)的乙酰甲膽堿噴霧。對于鹽水和每種乙酰甲膽堿劑量，使用“快照”擾動收集阻力(r)值約2分鐘。僅使用cod(決定系數)0.9以上的這些值計算阻力峰值。處理單獨組的小鼠并分析肺中細胞響應。最后mil-33同種型或pbs施用二十四小時后，通過過量的i.p.處死小鼠。將小鼠的肺用0.7ml的含0.1％bsa的冷pbs灌洗。將產生的支氣管肺泡(bal)液體以1200rpm離心10分鐘，并將無細胞上清液保存在-80℃直到分析細胞因子/趨化因子。bal樣品用于使用血球計進行總計數。對于分類bal計數，用瑞氏吉姆薩(wrightgiemsa)染色后在光學顯微鏡下從細胞離心涂片(cytospinsmear)計數約200個細胞。收集無細胞上清液并保存在-80℃直到用于luminex蛋白質分析。去除肺組織，接著使用5ml冷的無菌pbs經右心室灌注直到適當的灌注量。然后將肺葉置于含1ml的pbs+蛋白酶抑制劑的fast試管中，并凍存于-80℃用于細胞因子/趨化因子表達譜。細胞因子/趨化因子多重分析按照鼠millipore22-plex的制造商方案進行。bal液中的小鼠肥大細胞蛋白酶-1(mmcp-1)通過elisa(moredunscientific)來分析。氣道過度響應在通過鼻內施用il-33所誘導的肺炎癥模型中，cnto3914顯著抑制氣道過度響應(圖1)。在四天連續(xù)鼻內施用2μg/小鼠mil-33之前24小時，經皮下給予cnto3914。如通過flexivent所測定的氣道阻力峰值在20mg/kg的cnto3914劑量時顯著降低。每個誤差條代表每組三(cnto5516，同種型對照抗體)至六只小鼠的平均值±sem。這些結果已在兩個單獨的研究中重復。使用雙因數方差分析與bonferroni事后檢驗測定顯著性，cnto3914/il-33相對于cnto5516/il-33，**p＜0.05；以及相對于經il-33處理的pbs組，***p＜0.001。氣道炎癥在使用的模型中，cnto3914顯著地抑制支氣管肺泡灌洗(bal)細胞募集(圖2)。在四天連續(xù)鼻內施用2mg/小鼠mil-33之前24小時，經皮下給予cnto3914。bal白細胞隨il-33施用而顯著增加，并且被20mg/kg的cnto3914顯著抑制。每個誤差條代表每組三(cnto5516，同種型對照抗體)至六只小鼠的平均值±sem。這些結果已在兩個單獨的研究中重復。使用雙因素方差分析與bonferroni事后檢驗測定顯著性，***p＜0.001。體內肥大細胞響應肥大細胞將蛋白酶(包括類胰蛋白酶與糜酶)儲存在其顆粒中，這些顆粒在肥大細胞活化后快速釋放。小鼠肥大細胞蛋白酶1(mmcp-1)為一種由活化的肥大細胞所釋放的β糜酶，并且已知對寄生蟲感染的控制很重要(knight等人，jexpmed192：1849-56，2000；huntley等人，parasiteimmunol12：85-95，1990)。mmcp-1的測量可用作肥大細胞活化的標記，并且已表明可在氣道炎癥的肥大細胞依賴性模型中被誘導：屋塵螨(yu和chen，jimmunol171：3808-15，2003)。如通過elisa(moredunscientific)所測定的mmcp-1在來自il-33施用的小鼠的bal液中顯著增加，并且被cnto3914劑量依賴性抑制(圖3)。使用單因數方差分析與tukey事后檢驗測定顯著性，相對于il-33處理，**p＜0.01，***p＜0.001。實例8：抗-st2l域i結合抗體抑制體外肥大細胞響應通過小鼠和人肥大細胞釋放的趨化因子和細胞因子以及人肥大細胞中的前列腺素d2來評估肥大細胞響應?？?st2l域i結合抗體cnto3914抑制il-33誘導的小鼠骨髓源性肥大細胞釋放細胞因子，包括gm-csf(圖4a)、il-5(圖4b)和tnfα(圖4c)。在抗體濃度2、10和50μg/ml下，抗-人st2l域i結合單克隆抗體c2494(stlm62)抑制通過3ng/mlil-33誘導的人臍帶血源性肥大細胞的il-33誘導的pgd2釋放(圖5)。在抗體濃度50μg/ml、10μg/ml和2μg/ml下，抗-st2l域i結合抗體c2494和c2244抑制il-33誘導的人臍帶血源性肥大細胞釋放gm-csf、il-5、il-8、il-13和il-10(圖6和8a-8e)。抑制的程度取決于所測量的細胞因子/趨化因子、所測試的抗體和抗體濃度以及所使用的培養(yǎng)基。在抗體濃度2μg/ml下進行的所有測定中所計算的平均抑制百分比(％)介于50.6-100％之間，并且在50μg/ml的抗體濃度下介于62-100％之間(圖9)。在抗體濃度50μg/ml和10μg/ml下，抗-st2l域iii結合抗體c2521、c2519、st2m48、st2m49、st2m50和st2m51表現(xiàn)出對il-33誘導的肥大細胞釋放細胞因子的輕微抑制或無抑制，或刺激il-33誘導的肥大細胞釋放細胞因子(圖7a-7e和8a-8e)。抑制的程度取決于所測量的細胞因子/趨化因子、所測試的抗體以及所使用的培養(yǎng)基。在抗體濃度2μg/ml下進行的所有測定中所計算的平均抑制百分比(％)介于-594.4-31.9％之間，并且在50μg/ml的抗體濃度下介于-481.5-36％之間(圖9)。在一些測定中，在抗體濃度10μg/ml下，抗體st2m50抑制gm-csf、il-5、il-10和il-13分泌(圖8a-8e)。使用下式計算平均抑制％：(1-(在單克隆抗體存在下釋放的細胞因子的濃度)/(在單克隆抗體不存在下響應il-33所釋放的相同細胞因子的濃度))×100。細胞因子濃度以pg/ml計。在一些情況中，抑制％為負值，表示在單克隆抗體存在下細胞因子釋放實際上高于在單克隆抗體不存在下所釋放的。單克隆抗體的效力可能出現(xiàn)細微變化，具體取決于誘導肥大細胞中細胞因子釋放所用的il-33濃度。相似地，單克隆抗體的活性可能有細微變化，具體取決于所用的測定培養(yǎng)基(stempro-34與rpmi/10％fcs)。在2μg/ml、10μg/ml或50μg/ml的濃度下，所有測試的st2l域i結合抗體使所有測量的細胞因子與趨化因子釋放抑制至少50％，如平均抑制％所測量。實例9：st2l域i結合抗體抑制鼻內il-33誘導的氣道重塑。在d1、d3、d5、d7和d9天，用1μg/小鼠“成熟”il-33(或pbs)(seqidno：215的第109-266位殘基)鼻內給予c57bl/6小鼠，并在第10天或第20天分析肺。在首次il-33鼻內施用前6小時以2mg/kg皮下給予抗-小鼠st2l抗體cnto3914或同種型對照(cnto5516)。對照小鼠則在首次il-33鼻內施用前6小時接受同種型對照cnto5516或pbs。充氣的肺在10％經緩沖的福爾馬林中固定用于組織學分析；用于分析的染料包括蘇木素-伊紅(h&e)、馬森氏三色(massontrichrome)和pas。il-33處理誘導中度至明顯的細支氣管上皮肥大和增生，其具有杯狀細胞增生及主要與嗜酸性粒細胞混合的細支氣管周圍浸潤。細支氣管上皮肥大和增生在接受cnto3914的動物中不明顯。馬森氏三色染料用來測定存在的膠原的量；該染色法顯示il-33處理的動物中的杯狀細胞肥大。在用cnto3914處理的動物中，肺泡和細支氣管周圍區(qū)域中的浸潤不存在。實例10：完全人st2l抗體的生成基本上如實例3所述，從從頭合成pix噬菌體展示文庫中選擇另外的人st2l結合fab，不同的是該文庫使用嵌合hhm-st2l構建體(seqidno：6，表1)淘選，其中生物素?；乖东@于鏈霉抗生物素蛋白涂布的磁珠上。將噬菌體文庫在含3％脫脂奶粉的pbs-t中封閉。將競爭者蛋白質mhm-st2l嵌合體(seqidno：7，表1)添加到封閉溶液以促使噬菌體選擇朝向會特異性結合人st2l域i氨基酸序列的fab。進行三輪噬菌體選擇，接著通過elisa篩選出結合于hst2l-fc蛋白質的fab。十九個結合于hst2l-fc的fab分離自這些選擇，并且進一步篩選出結合于嵌合st2l構建體(表1)以及結合于小鼠st2l與人st2l蛋白質以定位特異性的域，并對其阻斷il-33/hst2l相互作用的能力進行表征。fabst2f1、st2f4和st2f6阻斷hil-33/st2l相互作用并結合st2l的域i，并且向前發(fā)展到親和力成熟。表9.實例11：人st2l結合fab的親和力成熟st2f1、st2f4和st2f6使用shi等人，jmolbiol397：385-396，2010和國際專利公開wo2009/085462以及實例4中所述的“同步”成熟過程進行親和力成熟。st2f1、st2f4和st2f6的親和力成熟文庫通過多樣化對應的輕鏈文庫(分別為b3、l6和l6)，并將這些文庫與fabvh區(qū)組合而制成。用于l6和b3親和力成熟文庫的輕鏈殘基的多樣化方案示于表10中。位置編號根據kabat。對于親和力成熟淘選，在第1輪10nm、第2輪1nm和第3輪0.1nm的濃度下，生物素酰化hust2-ecd-fc捕獲于鏈霉抗生物素蛋白(sa)涂布的磁珠上。在10nm未標記的hust2l-ecd-fc存在下，在室溫下過夜進行第3輪的最后洗滌。表10.st2f6輕鏈成熟文庫選擇產生改善的結合物(st2f14、st2f17、st2f31和st2f41)(圖10和圖11)。使用proteon檢查作為fab的這些選擇并證實從2nm至400pm的適度親和力改善。為了進一步改善st2f14、st2f17、st2f31和st2f41的親和力，st2f14、st2f17、st2f31和st2f41中常見的重鏈st2h41使用表11所示的多樣化方案在hcdr1和hcdr2kabat位置31、32、33、35、50、52、53、56和58處隨機化。所得的重鏈文庫與四個親和力改善的輕鏈st2l32、st2l35、st2l49和st2l59配對，并且該文庫按照對于輕鏈成熟文庫所述的方式進行淘選和篩選。分離出相對于st2f14具有改善結合的fab并轉換成igg用于進一步表征。所得抗體(stlm103、stlm107、stlm108、stlm123、stlm124、stlm206、stlm207、stlm208、stlm209、stlm210、stlm211、stlm212、stlm213、stlm214、stlm215、stlm216、stlm217、stlm218、stlm219、stlm220、stlm221、stlm222)(圖10和圖11)具有來源于vh3-23或vκ-l6的框架。所有抗體結合st2l域i并阻斷il-33/st2l相互作用。表11.位置氨基酸31sdntay32sday33sday35sn50sdntay52santkdegr53saney56santkdegr58sdntay設計并表達stlm208vhst2l257的另外變體以在hcdr3的開始處替換dp基序。變體的序列示于圖12中。實例11：c2494的人框架適應(hfa)框架適應過程按照基本上在美國專利公開us2009/0118127和fransson等人，jmolbiol398：214-231，2010中所述的方式完成。簡而言之，將重鏈和輕鏈序列與人種系序列(自2007年10月1起僅“01”等位基因)進行比較，該比較使用對imgt數據庫(kaas等人，nucl.acids.res.32，d208-d210，2004；lefranc等人，nucl.acidres.，33，d593-d597，2005)進行的blast搜索。從該組人種系基因中去除冗余基因(在氨基酸水平100％相同)以及那些具有未配對半胱氨酸殘基的基因。在框架和cdr區(qū)兩者中選擇其余最接近匹配人種系基因作為受體人框架。根據整體序列同源性與cdr長度以及cdr相似性選擇總共9個vl和7個vh種系人框架?；趇ghj/igjk種系基因的序列相似性選擇fr-4，jk2用于vl鏈且jh1用于vh鏈(kaas等人，nucl.acidres.32，d208-d210，2004；lefrancm.-p等人，nucl.acidres.，33，d593-d597，2005)且具有c2494序列)。然后，將c2494的cdr(圖14中下劃線處)轉移至所選擇的受體人框架中以生成hfa變體，除了在對應于vh的cdr-h1的區(qū)域中之外。對于該區(qū)域，cdr和hv的組合、或較短的hcdr2(稱為kabat-7，參見美國專利公開us2009/0118127)從非人抗體轉移至人fr，因為尚未發(fā)現(xiàn)圖14中以灰色突出顯示的hcdr2殘基與已知結構的抗原-抗體復合物接觸(almagro，jmolrecognit.17，132，2004)。c2494的成熟蛋白質序列(vl：seqidno：52；vh：seqidno：48)示于圖14中。在該圖中，cdr殘基(kabat)帶有下劃線，chothiahv環(huán)在cdr下方指示，并且殘基轉移到所選的人框架中的殘基在hv(hfa)之下指示。所有變體中均未轉移以灰色突出顯示的hcdr2殘基。使用moe(ccg，montreal)的抗體建模模塊構建c2494的fv片段的3d同源模型。該模型用于評估可展性傾向(developabilityliabilities)，諸如暴露的甲硫氨酸和色氨酸殘基、可能的n-糖基化和脫酰胺基序。在lcdr3中，根據fv結構模型，有一個可能暴露的met(m94)殘基。為了將其去除，生成具有m94l突變的變體(stll280，o12b)并進行表征。對于重鏈，剛好在hcdr3前的car基序(chothia第92-94位殘基，圖14)中的r殘基可能對一組帶負電的殘基(chothia殘基d31、d32、d96和d101a，圖14)造成負面影響，這些帶負電的殘基可能對結合很重要。生成在chothia第94位殘基(car→cal)處具有精氨酸置換亮氨酸的vh并進行表征。結合設計的重鏈和輕鏈的單克隆抗體與c2494親本一起被表達并對其結合于人st2l進行測定。由生成的hfa單克隆抗體中，具有帶有ighv1-24*01(seqidno：148)和ighv1-f*01(seqidno：149)重鏈框架(stlh195和stlh194)的vh鏈的單克隆抗體在與各種hfa輕鏈組合時，能很好地表達抗體并結合st2l，所述各種hfa輕鏈具有igkv3-15*01(l2)(seqidno：150)、igkv1-9*01(l8)(seqidno：151)、igkv1-5*01(l12)(seqidno：152)、igkv1-12*01(l5)(seqidno：153)、igkv1-39*01(o12)(seqidno：154)、igkv1-27*01(a20)(seqidno：155)或igkv1-33*01(o18)(seqidno：156)框架(stll280、stll278、stll277、stll276、stll275、stll274、stll273、stll272)。hfavh和vl變體的序列示于表12中。轉移的殘基帶有下劃線，并且上述另外的置換以灰色突出顯示。表13示出了每種hfavh和vl的seqidno：以及獨特的pdr(質粒)和cbisid。被選擇供進一步表征的所生成的單克隆抗體的重鏈和輕鏈組合示于表14中。表15示出用于轉移c2494cdr的人框架(組合的v和j區(qū))。表12.框架適應性vl鏈(偶聯(lián)到jk2序列)。cdr帶有下劃線。＞vl2494(親本)(seqidno：52)ettvtqspaslsvatgekvtircitntdiddvihwyqqkpgeppkllisegntlrpgvpsrfsssgygtdfvftientlsedvadyyclqsdnmltfgagtklelk＞vl2494-igkv1-33*01o18(seqidno：135)diqmtqspsslsasvgdrvtitcitntdiddvihwyqqkpgkapklliyegntlrpgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyyclqsdnmltfgqgtkleik＞vl2494-igkv1-27*01a20(seqidno：136)diqmtqspsslsasvgdrvtitcitntdiddvihwyqqkpgkvpklliyegntlrpgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyyclqsdnmltfgqgtkleik＞vl2494-igkv1-39*01o12(seqidno：137)diqmtqspsslsasvgdrvtitcitntdiddvihwyqqkpgkapklliyegntlrpgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyclqsdnmltfgqgtkleik＞vl2494-igkv1-12*01l5(seqidno：138)diqmtqspssvsasvgdrvtitcitntdiddvihwyqqkpgkapklliyegntlrpgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyclqsdnmltfgqgtkleik＞vl2494-igkv1-5*01l12(seqidno：139)diqmtqspstlsasvgdrvtitcitntdiddvihwyqqkpgkapklliyegntlrpgvpsrfsgsgsgteftltisslqpddfatyyclqsdnmltfgqgtkleik＞vl2494-igkv1-9*01l8(seqidno：140)diqltqspsflsasvgdrvtitcitntdiddvihwyqqkpgkapklliyegntlrpgvpsrfsgsgsgteftltisslqpedfatyyclqsdnmltfgqgtkleik＞vl2494-igkv3-15*01l2(seqidno：141)eivmtqspatlsvspgeratlscitntdiddvihwyqqkpgqaprlliyegntlrpgiparfsgsgsgteftltisslqsedfavyyclqsdnmltfgqgtkleik＞vl2494-igkv1-39*01o12b(seqidno：142)diqmtqspsslsasvgdrvtitcitntdiddvihwyqqkpgkapklliyegntlrpgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyclqsdnlltfgqgtkleik偶聯(lián)到jh1的框架適應性vh鏈＞vh2494(親本)(seqidno：48)evqlqqsvaelvrpgasvklsctasafnikddymhwvkqrpeqglewigridpaignteyapkfqdkatmtadtssntaylqlssltsedtavyycalgdfyamdywgqgtsvtvss＞vh2494-ighv1-f*01(seqidno：143)evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsafnikddymhwvqqapgkglewmgridpaignteyaekfqgrvtitadtstdtaymelsslrsedtavyycatgdfyamdywgqgtlvtvss＞vh2494-ighv1-24*01(seqidno：144)qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckvsafnikddymhwvrqapgkglewmgridpaignteyapkfqdrvtmtedtstdtaymelsslrsedtavyycatgdfyamdywgqgtlvtvss表13.表14.*親本＝c2494vh和vl表15.實例12：用于互補位掃描的丙氨酸和人種系突變體的設計進行定點突變以評估單獨cdr殘基以及一些對其他抗體特性具有潛在影響的殘基對結合的貢獻。根據上述c2494fv的分子模型，預測溶劑暴露的cdr殘基的子集參與結合抗原。這些殘基被突變成丙氨酸和/或對應的“類人”殘基，其為最接近匹配的種系基因中對應的殘基。c2494vh中的d101aa(chothia殘基)(seqidno：48中的d104a)置換使koff降低約4倍，從1.43×10-4至3.2×10-5。當d101aa置換降低c2494fab結合于st2l的koff時，可預期相同突變也可改善c2494hfa變體中的解離速率。因此，d101aa(chothia編號)被并入stlh194的vh(＞vh2494-ighv1-f*01，seqidno：143)以生成vhstlh201(seqidno：145)。stlh201與7條輕鏈stll280、stll277、stll276、stll275、stll274、stll273和stll272(表13和表14)配對以生成單克隆抗體stlm226、stlm227、stlm228、stlm229、stlm230、stlm231和stlm232，再對其進一步表征。單克隆抗體stlm226、stlm227、stlm228、stlm229、stlm230、stlm231和stlm232因此在與親本c2494抗體和不同hcdr3(seqidno：146，gdfyamay)相比時，具有相同的lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1和hcdr2序列。另外，抗體stlm266vlstlm280具有獨特的lcdr3：lqsdnllt(seqidno：147)stlh201(seqidno：145)：evqlvqsgaevkkpgatvkisckvsafnikddymhwvqqapgkglewmgridpaignteyaekfqgrvtitadtstdtaymelsslrsedtavyycatgdfyamaywgqgtlvtvsshcdr3并入d101aa(chothia編號)置換：seqidno：146：gdfyamay抗體stlm266vlstlm280具有獨特的lcdr3：lqsdnllt(seqidno：147)實例13：抗-st2l抗體的表征由噬菌體展示、雜交瘤和人框架適應性篩選(humanframeworkadaptationcampaign)獲得的抗體在各種測定中進行表征，這些測定包括結合于hust2l-ecd、cynost2l-ecd、親和力測量、結合于人/小鼠嵌合體以確定域結合、受體-配體抑制測定、報道基因測定和肥大細胞響應測定。來源于噬菌體展示篩選(phagedisplaycampaign)的抗體對人與cynost2l的親和力以及其對人st2l的結合特異性示于表16中。表16中的所有抗體結合人st2l的域i。表16.來自hfa篩選(hfacampaign)的抗-st2l抗體相對于親本(stlm62，c2494)的親和力示于表17中。通過proteon分析親和力。使用proteon的pbs-t-e緩沖液(pbs、0.005％p20和3mmedta)作為電泳緩沖液在25℃下進行實驗。為了進行實驗，通過共價固定山羊抗-人fc(約5800ru)制備glc傳感器芯片，單克隆抗體的122-146個響應單元(ru)被捕獲。單克隆抗體捕獲之后注射0.024至15nm(5倍稀釋度)的st2l-ecd4分鐘(以50μl/min注射200μl)。對于所有反應，監(jiān)測解離30分鐘。使用10mm甘氨酸(ph1.5)的兩次15秒脈沖進行再生。用基線漂移模型將數據擬合到1∶1。樣品的締合速率較快，具有質量傳遞模型的朗繆爾(langmuir)用于曲線擬合和親和力的估計。所有樣品具有比親本克隆和對照單克隆抗體更快的解離速率。當與親本抗體相比較時，解離速率的差異是hfa變體的較低親和力的主要原因。表17.*stlm62＝c2494，親本抗體表18.++強抑制+一定程度抑制-不抑制nt未測試*作為雜交瘤測試rlb＝受體-配體結合抑制rga＝報道基因測定測試所選抗體的肥大細胞響應，測量對3ng/mlil-33誘導的人臍帶血源性肥大細胞釋放il-5、il-13和il-8的抑制，如所述使用rpmi+10％fcs中的100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml或0.01μg/ml抗體。在這些測定條件中，當與用il-33誘導的對照樣品相比時，在抗體濃度100μg/ml下，所有測試的抗體使il-33誘導的il-5、il-13和il-8細胞因子釋放抑制約40％-100％。實例14：抗-st2l抗體抑制人嗜堿性粒細胞中的下游信號傳導途徑測試抗-st2l抗體其抑制人嗜堿性粒細胞中的p38mapk信號傳導的能力。將全血收集于肝素化的試管中，并在測定起始之前置于室溫(rt)。將1ml的血液等分至50ml錐形管中，并添加稀釋于pbs中的抗-st2l抗體(stlb252)或同種型對照(cnto8937)至終濃度為2、20或200μg/ml。輕輕渦漩試管以混合并置于37℃培養(yǎng)箱中30分鐘，在15分鐘后輕輕渦漩。接著將血液用熒光染料標記抗體對細胞表面抗原染色(cd123-fitc、crth2-pcp-cy5.5和cd45-apc-c7)，并將試管在37℃下溫育15分鐘。將1ml的溫熱培養(yǎng)基(rpmi-1640/10％fbs/1％青霉素-鏈霉素)添加到各個試管，再添加稀釋于溫熱培養(yǎng)基中的il-33至終濃度為10ng/ml。將樣品在37℃溫育10分鐘，再將20ml預溫熱的bdphosflow裂解/固定緩沖液添加到各個試管，以同時裂解紅細胞并固定樣品。通過翻轉10次將試管均勻混合，并在37℃下溫育10分鐘。用20ml無菌rtpbs洗滌樣品，重懸于2ml的1xrtbd破膜/洗滌緩沖液中，并在室溫下溫育30分鐘。將樣品用2mlbd破膜/洗滌緩沖液洗滌一次，再重懸于400μlbd破膜/洗滌緩沖液。添加抗細胞內p38-mapk(vcellsignaling，目錄號6908s)的pe標記抗體，并將樣品在室溫下溫育30分鐘，避光處理。將樣品用5ml破膜/洗滌緩沖液洗滌一次，再重懸于100μlfacs緩沖液中，并轉移至96孔圓底平板。使用bdlsrii流式細胞儀利用高通量系統(tǒng)(hts)對每種樣品收集盡可能多的事件來分析樣品。使用flojo軟件分析數據。嗜堿性粒細胞被鑒別為cd45+crth2+cd123+，并評估每種條件下p38mapk陽性嗜堿性粒細胞的百分比。全血與抗-st2l單克隆抗體(stlb252)一起預溫育導致il-33誘導的p38-mapk磷酸化的劑量依賴性抑制，而同種型對照(cnto8937)則未見效果?？?人st2l抗體特異性地阻斷通過全血背景中重組人il-33引起的嗜堿性粒細胞活化。結果表明抗-st2l抗體抑制體內內源性il-33引起的信號傳導。表19.實例15：抗-st2l抗體在體內對靶標的接合bal細胞募集的鼻內mil-336小時體內模型將單劑量的1.2μg/小鼠mil-33(r&dsystems#3626-ml/cf)或pbs施用給雄性balb/c小鼠(6-8周齡，taconic)。在首次mil-33經鼻內施用前24小時，大鼠抗-小鼠st2l抗體cnto3914或為2、0.2、0.06或0.02mg/kg。同種型對照(itc)單克隆抗體cnto5516以2mg/kg經皮下給予。mil-33(或pbs)施用后六小時，將小鼠處死并收集血液用于血清分析。通過注射兩次體積為0.7ml的pbs/0.1％bsa至肺并取出流出物來進行支氣管肺泡灌洗(bal)。將bal離心(1200rpm，10分鐘)并將細胞沉淀物重懸于200μlpbs中，以使用血球計(對瑞氏吉姆薩染色的細胞離心制備物計數)進行總細胞計數和分類細胞計數。小鼠血清中cnto3914的測量將msdsa-std平板用50μl/孔的測定緩沖液封閉5分鐘。將平板倒置以去除測定緩沖液，并在紙巾上輕敲。添加50μl/孔的測定緩沖液中的1.4μg/ml生物素?；亟M小鼠st2l/il1r4/fc嵌合體(r&dsystem)并且在冷藏機中溫育過夜。將150μl的測定緩沖液添加到預涂布平板的每個孔中而不去除該涂布試劑，并溫育30分鐘。將平板用洗滌緩沖液在洗板機上洗滌三次。在紙巾上輕輕敲平板以去除殘留的洗滌緩沖液。將50μl/孔的cnto3914樣品添加到平板的每個孔中。將平板在環(huán)境溫度下輕柔渦旋振蕩溫育一小時。將平板用洗滌緩沖液在洗板機上洗滌三次。將50μl/孔滴度的釕標記小鼠抗-小鼠igg1b(bdbiosciences)添加到平板的每個孔中。將平板在環(huán)境溫度下輕柔渦旋振蕩溫育一小時。將平板用洗滌緩沖液在洗板機上洗滌三次。將150μl的讀取緩沖液添加到平板的每個孔中。立即將平板置于msdsectorimager6000讀板機上讀取發(fā)光水平。全血測定將血液以1∶4稀釋于sarstedt過濾試管中的dmem培養(yǎng)基+1％青霉素+鏈霉素溶液+/-10ng/ml小鼠il-33中。將試管在37℃下溫育過夜，接著使用milliporemilliplex小鼠細胞因子/趨化因子試劑盒根據制造商的說明書測量上清液的細胞因子和趨化因子水平。結果給予0.2或2mg/kgcnto3914后24小時，小鼠血清中可檢測到抗-st2l抗體(圖16a)。經鼻內施用il-33在6小時誘導細胞募集至氣道(圖16b)。施用抗-st2l單克隆抗體降低bal細胞募集；0.2mg/kg為觀察到顯著抑制bal細胞募集所需的最小劑量(圖16b)。使用單因素方差分析計算統(tǒng)計顯著性。用小鼠il-33刺激全血顯示在24小時后，細胞因子和趨化因子的水平增加，包括il-6(圖16c)和mcp-1(圖16d)。在給予20mg/kg或2mg/kg抗-st2l單克隆抗體cnto3914的小鼠中，與cnto5516(同種型對照抗-小鼠igg1)相比，il-6和mcp-1水平降低，表明與靶標接合。與全血測定中抑制相關的最小劑量2mg/kg，也抑制bal細胞募集(圖16b)。綜上所述，該數據證實抗-st2l單克隆抗體到達作用位點并實現(xiàn)預期的藥理作用(表明與靶標接合)。實例16：抗-st2l抗體的表位進行表位作圖和競爭研究以選擇抗-st2l抗體。競爭結合測定進行競爭結合測定以評估抗-st2l單克隆抗體的不同結合表位組。將每孔5μl(10μg/ml)的st2l-ecd蛋白質涂布在msdhighbind平板(mesoscalediscovery，gaithersburg，md)上，室溫下進行2小時。將一百五十毫升的5％msdblockera緩沖液(mesoscalediscovery，gaithersburg，md)添加到每孔中并在室溫下溫育2小時。用0.1mhepes緩沖液(ph7.4)洗滌平板三次，接著添加msd熒光染料(磺酸基標簽，nhs酯)標記的單獨抗-st2l抗體與不同競爭者的混合物。將10或30nm標記的抗體與1nm至2或5μm遞增濃度的競爭者抗體一起溫育，接著以25μl混合物的體積添加到指定的孔中。在室溫下輕柔振蕩溫育2小時后，使用0.1mhepes緩沖液(ph7.4)洗滌平板3次。使用蒸餾水稀釋msd讀取緩沖液t(4倍)并以150μl/孔的體積分配，并以sectorimager6000進行分析。以下抗體用于競爭測定中：st2l域i結合中和抗體stlm208、stlm213、c2244(stlm15)和c2494(stlm62)、st2l域iii結合抗體c2539、以及結合人st2l的域i的非中和抗-st2l抗體c2240。圖17a和17b示出了競爭實驗。根據該實驗，鑒別的表位倉(epitopebin)是：bina：單克隆抗體c2244、c2494、stlm208或stlm213；binb：單克隆抗體c2240，binc：c2539。阻斷il33/st2l相互作用并抑制肥大細胞響應的抗體被發(fā)現(xiàn)處于相同的表位倉中并且彼此交叉競爭。競爭數據的匯總示于表20中。表20.表位作圖：h/d交換分析對于h/d交換，用于分析抗體擾動的步驟與前述步驟類似(hamuro，y.等人，journalofbiomoleculartechniques，14：171-182，2003；horn，j.r.，等人，biochemistry，45：8488-8498，2006)，但稍作修改。將重組st2-ecd(由帶有c端his標簽的hek293e表達)(seqidno：157的第18-328位殘基)在氘化水溶液中溫育預定的時間，使得氘摻入在可交換的氫原子處。氘化的st2-ecd被捕獲于包含固定抗-st2lc2244fab分子的柱子上，然后用緩沖水溶液洗滌。從柱子上洗脫經回向交換的st2-ecd蛋白并通過蛋白酶消化和質譜分析來測定含氘片段的定位。圖18顯示與c2244fab復合的人st2-ecd(可溶性st2)的簡化h/d交換圖。seqidno：119的st2-ecd的第18-31位殘基(氨基酸殘基rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)由fab(對應于seqidno：1的全長st2l的第35-48位殘基)保護。數據表明，c2244結合于表位rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)并且與c2244(c2494、stlm208或stlm213)競爭的抗體很可能結合相同或重疊的表位。通過誘變進行的表位作圖生成數個在st2l域i具有對應小鼠殘基的置換的st2l突變體。所測試的抗體不會與小鼠st2l交叉反應，因此可預期具有結合能力被破壞和/或降低的st2l變體表示表位殘基在st2l上的置換位置。使用標準方法將變體制成具有seqidno：1的全長st2l的第19-205位殘基的構建體hh-st2l。通過elisa或proteon測試抗體結合于st2l變體。表面等離振子共振使用proteonxpr36蛋白質相互作用陣列系統(tǒng)(bio-rad)進行結合研究(bravmant等人，analbiochem358：281-288，2006)。通過胺偶聯(lián)化學將抗-人/抗-小鼠fc混合物(jacksonimmunoresearch，目錄號109-005-098/115-005-071)固定于glc傳感器芯片上。然后通過流動在含0.5％nonidetp-40和0.5％脫氧膽酸鈉的pbs中制備的(1μg/ml)抗體溶液，捕獲單獨的抗-st2l單克隆抗體。表面中的信號在抗-fc涂布的表面中達到約250共振單位(ru，1ru＝1pg蛋白質/mm2)，證實這些抗體特異性捕獲抗-st2l單克隆抗體。在液體系統(tǒng)旋轉90°后，將st2l-d1d2的野生型或變體蛋白質(0.5mg/ml含0.5％nonidetp-40和0.5％脫氧膽酸鈉的pbs)注射于平行的流道中。所有這些測定均在25℃下進行。表面上的st2l-d1d2依賴性信號通過雙參比、減去單獨在固定抗體的表面上所觀察到的響應以及單獨注射媒介物所觀察到的信號而獲得(其允許校正結合獨立性響應)。將所得的傳感圖通過最簡單的1∶1相互作用模型(proteon分析軟件)擬合以獲得對應的締合和解離速率常數(ka和kd)。圖19示出所制備的st2l變體以及st2b206和st2b252抗-st2l抗體對變體的親和力。變體93nl94(置換93tf94-＞93nl94)使stlm208和stlb252的結合親和力降低約5倍，從約10.8×10-12m至約49.5×10-12m。結合親和力未顯著降低表示在抗體與st2l-d1d2之間的相互作用的結合能為由h/d交換分析鑒別的表位區(qū)(rcprqgkpsytvdw；seqidno：210)和來自該93nl94位點的另外貢獻的總和。殘基編號根據seqidno：1的全長人st2l。實例17：st2l域i結合抗體抑制體外原代人肺肥大細胞響應st2l域i結合抗體以抑制肺肥大細胞響應的能力通過原代人肺肥大細胞中的趨化因子和細胞因子的釋放來評估。原代人肺肥大細胞的分離從得自國際醫(yī)藥促進機構(internationalinstitutefortheadvancementofmedicine)的正常非吸煙者組織分離原代人肺肥大細胞。通過在37℃于膠原酶和透明質酸酶中切碎、洗滌和消化薄壁組織過夜使細胞從肺實質和小氣道分散。收集細胞、洗滌，并使用來自macsmiletnyibiotec的cd117microbead試劑盒(人)進行富集步驟，以從該群體中陽性選擇出肥大細胞。進行實驗之前，將肥大細胞在stempro-34+200ng/ml干細胞因子中培養(yǎng)6周。分離后兩周，使用流式細胞術對細胞進行表型表征以測定肥大細胞純度百分比。用于后續(xù)測定的細胞對于cd117(c-kit或干細胞因子受體)和(高親和力ige受體)為89％雙陽性。此外，它們對于st2l為94.2％陽性；從而確認其肥大細胞表型。原代人肺肥大細胞的細胞因子釋放測定收集已培養(yǎng)于stempro-34+200ng/ml干細胞因子中大約6周的原代人肺部肥大細胞，并通過在rpmi(10％熱失活的fcs)中離心來洗滌。對細胞進行計數并以65,000個細胞的密度接種于96孔板中的rpmi/10％fcs培養(yǎng)基中。將抗-st2l域i結合單克隆抗體添加到原代肺肥大細胞中，并在用il-33刺激之前使之在37℃下結合30分鐘。用3ng/mlil-33刺激細胞24小時以引發(fā)各種介質累積于培養(yǎng)上層清液中。收獲培養(yǎng)上層清液并凍存直到在定制milliplex9-plex試劑盒中進行測定。在抗體濃度100μg/ml、10μg/ml和1μg/ml下，抗-st2l域i結合抗體stlm208抑制原代人肺肥大細胞中il-33誘導的gm-csf(圖20a)、il-5(圖20b)、il-8(圖20c)和il-13(圖20d)釋放。使用臍帶血源性肥大細胞獲得類似的結果(數據未示出)。cpch1760659d序列表<110>janssenbiotech,inc.duffy,karenfursov,nataliehall,leroyhealey,catherinelamb,robertaluo,jinquanmalaviya,ravinaso,michaelpratta,michaeltornetta,markwheeler,johnwu,sheng-jiu<120>st2l拮抗劑及使用方法<130>jbi5003wopct<140>pct/us13/38637<141>2013-04-29<150>us61/640,407<151>2012-04-30<150>us61/640,238<151>2012-04-30<150>us13/798,204<151>2013-03-13<150>us13/798,226<151>2013-03-13<160>215<170>patentln版本3.5<210>1<211>556<212>prt<213>人類(homosapiens)<400>1metglyphetrpileleualaileleuthrileleumettyrserthr151015alaalalyspheserlysglnsertrpglyleugluasnglualaleu202530ilevalargcysproargglnglylysprosertyrthrvalasptrp354045tyrtyrserglnthrasnlysserileprothrglngluargasnarg505560valphealaserglyglnleuleulyspheleuproalaalavalala65707580aspserglyiletyrthrcysilevalargserprothrpheasnarg859095thrglytyralaasnvalthriletyrlyslysglnseraspcysasn100105110valproasptyrleumettyrserthrvalserglyserglulysasn115120125serlysiletyrcysprothrileaspleutyrasntrpthralapro130135140leuglutrpphelysasncysglnalaleuglnglyserargtyrarg145150155160alahislysserpheleuvalileaspasnvalmetthrgluaspala165170175glyasptyrthrcyslyspheilehisasngluasnglyalaasntyr180185190servalthralathrargserphethrvallysaspgluglnglyphe195200205serleupheprovalileglyalaproalaglnasngluilelysglu210215220valgluileglylysasnalaasnleuthrcysseralacysphegly225230235240lysglythrglnpheleualaalavalleutrpglnleuasnglythr245250255lysilethrasppheglygluproargileglnglnglugluglygln260265270asnglnserpheserasnglyleualacysleuaspmetvalleuarg275280285ilealaaspvallysglugluaspleuleuleuglntyraspcysleu290295300alaleuasnleuhisglyleuargarghisthrvalargleuserarg305310315320lysasnproileasphishisseriletyrcysileilealavalcys325330335servalpheleumetleuileasnvalleuvalileileleulysmet340345350phetrpileglualathrleuleutrpargaspilealalysprotyr355360365lysthrargasnaspglylysleutyraspalatyrvalvaltyrpro370375380argasntyrlysserserthraspglyalaserargvalgluhisphe385390395400valhisglnileleuproaspvalleugluasnlyscysglytyrthr405410415leucysiletyrglyargaspmetleuproglygluaspvalvalthr420425430alavalgluthrasnilearglysserargarghisilepheileleu435440445thrproglnilethrhisasnlysgluphealatyrgluglngluval450455460alaleuhiscysalaleuileglnasnaspalalysvalileleuile465470475480glumetglualaleusergluleuaspmetleuglnalaglualaleu485490495glnaspserleuglnhisleumetlysvalglnglythrilelystrp500505510arggluasphisilealaasnlysargserleuasnserlysphetrp515520525lyshisvalargtyrglnmetprovalproserlysileproarglys530535540alaserserleuthrproleualaalaglnlysgln545550555<210>2<211>556<212>prt<213>食蟹猴(macacafascicularis)<400>2metglyleutrpileleualaileleuthrileleuvaltyrserthr151015alaalalyspheserlysglnsertrpglyleugluasnglualaleu202530ilevalargcysproargglnglylyssersertyrilevalasptrp354045tyrtyrserglnthrasnlysserileprothrglngluargasnarg505560valphealaserglyglnleul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