本發(fā)明涉及生物技術診斷領域，特別是涉及一種診斷骨性關節(jié)炎的mirna分子標志物及一種骨性關節(jié)炎檢測試劑盒。
背景技術：
：骨關節(jié)炎(osteoarthritis，oa)是一種慢性退行性關節(jié)病變，本病發(fā)病率隨年齡的增長而增加，是一種中老年人常見的關節(jié)疾病。oa的發(fā)病因素眾多，發(fā)病機制十分復雜，其中oa特征性的表現(xiàn)是軟骨細胞基質合成不足、關節(jié)軟骨退變、骨贅形成和滑膜病變。雖然目前有很多學說通過解釋oa的形成機理，建立了一些診斷和治療oa的方法，但這些診斷oa的手段主要還是以影像學檢查為基礎。目前在臨床影像學輔助檢查(x線、mri及超聲等)確診oa時，關節(jié)軟骨已經出現(xiàn)了不可逆性損傷,這就使得臨床在對oa進行早期干預或治療時沒有一種良好的改變或延緩病情的治療措施。如何早期診斷oa成為延緩及控制骨關節(jié)炎進展的關鍵。mirna是廣泛存在于真核生物中的單鏈小分子rna，其不編碼蛋白質，但可在轉錄后調控基因表達，影響蛋白質的翻譯，參與機體各種重要的生理和病理過程。隨著科學界對mirna在調控細胞功能方面的研究日漸加深以及新的mirna作用靶標的發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究證實，mirna可在多方面調控oa軟骨相關基因的表達。其中，mir-140是在正常軟骨中特異性表達的少數(shù)幾個mirna之一，敲除小鼠體內的mir-140基因后，小鼠表現(xiàn)出與oa類似的病理過程，表現(xiàn)出軟骨蛋白多糖的減少和關節(jié)軟骨的纖維化。關節(jié)軟骨的營養(yǎng)來源于滑液的滲透，關節(jié)軟骨與關節(jié)滑液之間存在一定的物質交換；與血液和尿液相比，關節(jié)液成分及量的變化更能反映關節(jié)內組織病變的發(fā)生和發(fā)展。因此，找尋一種mirna分子標志物，通過檢測關節(jié)液中的該分子標志物的表達量來診斷oa的嚴重程度，可為骨關節(jié)炎的早期診斷和治療提供重要依據(jù)。技術實現(xiàn)要素：鑒于此，本發(fā)明提供了一種診斷骨性關節(jié)炎的mirna分子標志物，通過檢測該分子標志物在關節(jié)液中的表達量，可獲知骨關節(jié)炎病程的進展，從而為骨關節(jié)炎的早期診斷和治療提供依據(jù)。具體地，第一方面，本發(fā)明提供了一種診斷骨性關節(jié)炎的mirna分子標志物，所述mirna分子標志物包括mirna140-3p。所述mirna140-3p的序列為：uaccacaggguagaaccacgg。本發(fā)明第一方面提供的mirna分子標志物為骨關節(jié)炎的診斷提供了新的生物標志物，通過檢測關節(jié)液中mirna140-3p的表達量，可初步判斷骨關節(jié)液的嚴重程度，靈敏度和特異性高。通過采用本發(fā)明的mirna分子標志物進行骨性關節(jié)炎的診斷，具體具有如下優(yōu)勢：(一)無創(chuàng)：對病人的損傷較小，能夠克服創(chuàng)傷性檢測帶來的風險；(二)穩(wěn)定：在臨床血清、血漿、關節(jié)液樣本中，microrna以抵抗rna酶的形式穩(wěn)定存在；(三)早期：microrna在疾病早期階段就已經表現(xiàn)出異常，因此可以用于高危人群的預警或者早期檢測；(四)簡便：采用qpcr進行檢測，操作簡單、靈敏度高、樣本需求量少，檢測周期短，僅需數(shù)小時便可獲取結果，價格低廉。相應地，本發(fā)明第二方面提供了一種骨性關節(jié)炎檢測試劑盒，包括：(1)mirna分子標志物，所述mirna分子標志物包括mirna140-3p；(2)提取rna試劑：trizol裂解液、氯仿、sio2吸附液、乙醇、depch2o；(3)逆轉錄試劑：5×buffer、10mmol/l脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)、m-mlv逆轉錄酶、rnaseinhibitor(rnase抑制劑)、microrna140-3p逆轉錄引物、內參u6逆轉錄引物、depch2o；(4)熒光定量pcr試劑：sybrgreenqpcrsupermix、microrna140-3p特異性前向引物、microrna140-3p特異性后向通用引物、內參u6擴增引物、depch2o。其中，所述microrna140-3p特異性前向引物(forwardprimer)的基因序列為5’-acactccagctgggaggcggggcgccgcggga-3’。所述microrna140-3p特異性后向引物(reverseprimer)的基因序列為5’-ctcaactggtgtcgtgga-3’。所述內參u6逆轉錄引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列為：5’-ctcgcttcggcagcaca-3’，所述下游引物的基因序列為：5’-aacgcttcacgaatttgcgt-3’。本發(fā)明通過在mirna的3’端加上一特異性的莖環(huán)引物，通過逆轉錄和熒光定量pcr的方法檢測被檢膝骨關節(jié)液樣本中microrna-3p的表達量，并與正常人microrna-3p的水平相比較來診斷oa，其靈敏度和特異性高。本發(fā)明第二方面提供的骨性關節(jié)炎檢測試劑盒，用于診斷骨關節(jié)炎的特異性和靈敏度高，可從分子標志物mirna140-3p的表達量初步判斷骨關節(jié)炎的嚴重程度。本發(fā)明的優(yōu)點將會在下面的說明書中部分闡明，一部分根據(jù)說明書是顯而易見的，或者可以通過本發(fā)明實施例的實施而獲知。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例中mir-140-3p擴增曲線圖；圖2為本發(fā)明實施例中mir-140-3p在各試驗組膝關節(jié)液中的相對表達量；圖3為本發(fā)明實施例中各研究對象年齡與其mir-140-3p相對表達量散點圖。具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明上述技術方案的實施例進行具體說明。本發(fā)明實施例提供一種骨性關節(jié)炎檢測試劑盒，包括：(1)mirna分子標志物，所述mirna分子標志物包括mirna140-3p；(2)提取rna試劑：trizol裂解液、氯仿、sio2吸附液、體積分數(shù)75％的乙醇、depch2o；depc水是指經depc(焦碳酸二乙酯)處理過并經高溫高壓消毒的純水；(3)逆轉錄試劑：5×buffer、10mmol/l脫氧核糖核苷三磷酸(dntp)、m-mlv逆轉錄酶、rnaseinhibitor、microrna140-3p逆轉錄引物、內參u6逆轉錄引物、depch2o；(4)熒光定量pcr試劑：sybrgreenqpcrsupermix、microrna140-3p特異性前向引物、microrna140-3p特異性后向引物、內參u6擴增引物、depch2o。本發(fā)明實施例收集到10例健康志愿者、10例痛風性關節(jié)炎患者、10例類風濕關節(jié)炎患者、45例膝骨關節(jié)炎患者關節(jié)液作為研究對象進行檢測，其中骨關節(jié)炎早期、中期、晚期各15例。經患者或健康志愿者知情同意后，經關節(jié)腔穿刺抽取關節(jié)液置于無菌、無酶的凍存管，保存于液氮中。采用本發(fā)明實施例的檢測試劑盒對上述受試者進行骨性關節(jié)炎診斷的具體操作為：(1)總rna抽提：本發(fā)明實施例采用trizol一步法提取總rna，具體方法如下：取300μl關節(jié)液，加入4倍體積trizol溶液，再加入200μl氯仿，強烈振蕩20s后靜置3min；使用珠海黑馬tgl-16r高速冷凍離心機10000×g離心15min；小心將上層水層移至另一個新的無rnase的ep管(離心管)中；加入10μlsio2吸附液，混勻，8000×g離心1min；吸棄上清，加入體積分數(shù)為75％的乙醇400μl，8000×g離心1min；吸棄上清，風干15min，加入30μldepc水溶解rna。(2)逆轉錄合成cdna采用莖環(huán)法進行逆轉錄，具體步驟為：取10μl總rna置于無rnase的pcr管中混勻，85℃孵育5min，以打開rna二級結構。隨后立即置于冰上，以防止rna復性再次恢復二級結構；在另一去rnase的pcr管中配置含10mmol/ldntp2.0μl，rnaseinhibitor0.5μl，mir-140-3p逆轉錄引物0.5μl，u6逆轉錄引物0.5μl，5×buffer4.0μl，m-mlv0.5μl，depc水1.5μl的溶液，將配置好的溶液加入至上述含10μl總rna的pcr管中，混勻后42℃溫度條件下孵育60min；然后85m孵育10min滅活逆轉錄酶，獲得cdna。(3)定量pcr檢測序列片段大?。簝葏⑵蝩6為94bp，目的片段hsa-mir-140-3p為71bp(mimat0004597)，見表1。pcr反應總體積為20μl，其中cdna(1︰20)5.0μl，hsa-microrna140-3p特異性前向引物(hsa-mir-140-3pf)0.5μl，hsa-microrna140-3p特異性后向引物(hsa-mir-140-3pr)0.5μl，2×sybrgreenqpcrsupermix10μl，dh2o(超純水)4.0μl。反應條件為50℃2min；95℃2min；95℃15s，60℃32s讀板，40個循環(huán)，熔解曲線分析：溫度60-95℃，每個樣重復3次。表1hsa-mir-140-3pf：5’acactccagctgggaggcggggcgccgcgggahsa-mir-140-3pr：5’ctcaactggtgtcgtggau6-f(u6上游引物)：5’ctcgcttcggcagcacau6-r(u6下游引物)：5’aacgcttcacgaatttgcgt本發(fā)明實施例采用檢測試劑盒對各研究對象進行檢測的各組實驗的結果如下：1、mir-140-3p在各組膝關節(jié)液中相對表達量的分析(1)在健康對照組，類風濕關節(jié)炎組，痛風性關節(jié)炎組及骨關節(jié)炎早、中、晚期組患者膝關節(jié)液中均能檢測到mir-140-3p的表達，擴增曲線如圖1所示，經正態(tài)分布檢驗(k-s檢驗)表明：mir-140-3p在各組膝關節(jié)液中的相對表達量2-δδct均服從正態(tài)分布。(2)對健康對照組，類風濕關節(jié)炎組，痛風性關節(jié)炎組及骨關節(jié)炎早、中、晚期組患者膝關節(jié)液中mir-140-3p的相對表達量進行l(wèi)evene法方差齊性檢驗，結果如表2所示，結果顯示各組方差不齊(levenestatistic＝13.4，p<0.05)。表2表注：δct＝(目的基因ct-內參ct)；δδct＝(待測樣品中目的基因δct-參照樣品中目的基因δct)，選擇正常對照組δct的均數(shù)作為參照進行計算；相對表達量＝2-δδct。(3)進一步對mir-140-3p在各組關節(jié)液中的相對表達量進行tamhane’st2檢驗，結果如表3所示，表3結果顯示：mir-140-3p表達量在健康對照組、痛風性關節(jié)炎組與類風濕關節(jié)炎組間差異無顯著性意義(p>0.05)；非骨關節(jié)炎組與骨關節(jié)炎組間相對表達量差異有顯著性意義(p<0.05)，且mir-140-3p在非骨關節(jié)炎組中的表達量是骨關節(jié)炎組的9.6倍，健康對照組的表達量是骨關節(jié)炎組的11.4倍。mir-140-3p在骨關節(jié)炎早期、中期、晚期組間相對表達量差異均有顯著性意義，且隨骨關節(jié)炎嚴重程度的增加mir-140-3p表達量呈相對減少的趨勢(如圖2所示)。表3表注：表中數(shù)值為mir-140-3p在各組關節(jié)液中相對表達量差異比較的p值，因相對表達量δδct在各組間方差不齊，故使用tamhane’st2檢驗，檢驗水準α＝0.05。(4)將mir-140-3p在健康對照組，骨關節(jié)炎早、中、晚期組間的相對表達量進一步進行spearman等級相關分析，結果顯示spearman等級相關系數(shù)r＝-0.87，p＝0.00。按α＝0.05水準，可以認為mir-140-3p的表達量與骨關節(jié)炎的嚴重程度間存在負相關關系。2、mir-140-3p相對表達量與受試者年齡的相關性分析繪制mir-140-3p在健康對照組、膝骨關節(jié)炎早、中、晚期組中的相對表達量與年齡的散點圖(圖3)。由散點圖可見，mir-140-3p在膝關節(jié)液中的相對表達量與年齡間并無明顯的直線相關關系；將mir-140-3p在健康對照組、膝骨關節(jié)炎早、中、晚期組中相對表達量與年齡的相關性進一步行pearson相關分析，結果顯示：mir-140-3p與年齡的pearson相關系數(shù)r＝-0.144，p＝0.293，按α＝0.05檢驗水準，可以認為mir-140-3p在各膝關節(jié)液中的相對表達量與年齡之間無直線相關關系。需要說明的是，根據(jù)上述說明書的揭示和和闡述，本發(fā)明所屬領域的技術人員還可以對上述實施方式進行變更和修改。因此，本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對本發(fā)明的一些等同修改和變更也應當在本發(fā)明的權利要求的保護范圍之內。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術語，但這些術語只是為了方便說明，并不對本發(fā)明構成任何限制。當前第1頁12