本發(fā)明涉及一種線粒體熒光探針，具體涉及一種具有線粒體直接靶向效應的熒光探針及其合成方法和應用。

背景技術：

線粒體作為細胞內關鍵的細胞器，不僅具有為細胞供給能量、參與代謝等重要功能，而且參與細胞信號傳導和細胞凋亡等重要的生物過程。大量研究表明，線粒體的數量、分布、結構、功能變化與神經退行性病變(如帕金森癥、阿爾茲海默癥)、代謝型疾病(如ii型糖尿病、肥胖癥)、癌癥及心血管疾病等病癥密切相關。線粒體被冠以“細胞信號傳導細胞器”和“細胞死亡之馬達”等稱號，與之相關的“線粒體學”已經成為生命科學和醫(yī)學等領域的研究熱點。在藥物作用機制研究中，藥物通過與靶點相互作用來發(fā)揮藥物作用，而線粒體通常是主要靶細胞器，因此合成開發(fā)一種可直接靶向線粒體的小分子熒光探針尤為重要。

技術實現要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種具有線粒體直接靶向效應的熒光探針，以及它的合成方法和應用。

本發(fā)明所述的具有線粒體直接靶向效應的熒光探針具有如下式(i)所示結構：

上述式(i)所示化合物的合成方法為：取如下式(ii)所示化合物和甘氨酸乙酯(c4h9no2)，溶于二甲基亞砜或n,n-二甲基甲酰胺中，于加熱條件下反應，所得反應物倒入冰水中，過濾，得到目標物粗品；

上述合成方法的合成路線如下：

上述合成方法中所涉及的式(ii)所示化合物作為反應物參與反應，其化學名稱為4-溴-n-(3,4-亞甲二氧基苯乙基)-1,8-萘二甲酰亞胺(4-bromo-n-(3,4-methylenedioxy-phenethylamin)-1,8-naphthalimide)，在本申請中簡稱na-1a。該化合物可參照公開號為cn104557887a的發(fā)明專利中公開的方法進行合成，也可自行設計合成路線進行合成。

本發(fā)明所述合成方法中，式(ii)所示化合物和甘氨酸乙酯的物質的量之比通常為1：1～1：1.2，優(yōu)選甘氨酸乙酯的摩爾量稍大于式(ii)所示化合物的物質的量，便于反應充分進行。

本發(fā)明所述合成方法中，在反應之前還可以加入適量的三乙胺作為縛酸劑，以提高目標物的產率。通常情況下，三乙胺和甘氨酸乙酯的物質的量之比為1：1～3：1。

本發(fā)明所述合成方法中，反應優(yōu)選是在80～150℃條件下進行，更優(yōu)選是在100～135℃條件下進行。反應是否完全可以通過tlc跟蹤檢測。

上述合成方法制得的是式(i)化合物的粗品，可采用現有常規(guī)的純化方法(如萃取、硅膠柱層析等)對其進行純化以提高式(i)化合物的純度。通常采用硅膠柱層析來進行純化，具體是將制得的目標物粗品經硅膠柱層析，用由體積比為100：1～1：1的石油醚和乙酸乙酯組成的洗脫劑洗脫，洗脫液蒸除溶劑，得到純化后的目標產物。所述組成洗脫劑的石油醚和乙酸乙酯的體積比優(yōu)選為20：1～5：1。優(yōu)選在進行硅膠柱層析之前先對粗產物進行萃取以減少硅膠的負擔，具體可用如乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿等萃取劑進行萃取，收集有機相，除去溶劑后再進行硅膠柱層析。

本發(fā)明還包括上述熒光探針在細胞內線粒體的熒光顯微成像中的應用。所述的細胞具體為非小細胞肺癌細胞株nci-h460。

與現有技術相比，本發(fā)明提供了一種新的具有線粒體直接靶向效應的熒光探針及它的合成方法。申請人的實驗表明該熒光探針對線粒體具有直接靶向效應但對細胞無明顯抑制作用，具有較好的潛在價值，有望作為直接靶向線粒體的熒光探針。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例6制得的最終產物的電噴霧質譜譜圖；

圖2為本發(fā)明實驗例1中細胞孵育化合物na-2a后5h胞漿蛋白的質譜分析結果；

圖3為本發(fā)明實驗例1中細胞孵育化合物na-2a后5h線粒體蛋白的質譜分析結果；

圖4為本發(fā)明實驗例1中細胞未孵育化合物na-2a胞漿蛋白的質譜分析結果；

圖5為本發(fā)明實驗例1中細胞未孵育化合物na-2a線粒體蛋白的質譜分析結果；

圖6為本發(fā)明實驗例1中未經給藥處理提取線粒體單獨孵育化合物na-2a后5h線粒體蛋白質譜分析結果；

圖7為本發(fā)明實驗例2中陰性對照細胞熒光檢測結果；

圖8為本發(fā)明實驗例2中細胞孵育5h時熒光檢測結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳述,以更好地理解本發(fā)明的內容,但本發(fā)明并不限于以下實施例。

實施例1：na-1a即式(ii)所示化合物的合成

稱取4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于150ml乙醇中，攪拌并加入3,4-亞甲二氧苯乙胺(4-溴-1,8-萘二甲酸酐和3,4-亞甲二氧苯乙胺的摩爾比為1：1.5)，反應溫度70℃，反應進程使用薄層色譜進行跟蹤監(jiān)測。反應結束后，將反應體系冷卻至室溫，過濾并保留濾餅，使用乙醇淋洗濾餅，即得黃色固體(產率約為90％)。

對所得黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，具體波譜特性如下：

(1)核磁共振氫譜，其譜圖如圖1所示。

¹hnmr(500mhz,dmso-d6)δ:8.53(ddd,j＝9.5,7.9,1.0hz,2h),8.31(d,j＝7.9hz,1h),8.20(d,j＝7.9hz,1h),7.99–7.96(m,1h),6.85(d,j＝1.6hz,1h),6.80(s,1h),6.69(dd,j＝7.9,1.7hz,1h),5.97(s,2h),4.20–4.15(m,2h),2.84(t,j＝7.5hz,2h)。

(2)核磁共振碳譜，其譜圖如圖2所示。

¹³cnmr(126mhz,dmso-d6)δ:162.86,162.82,147.36,145.78,132.78,132.54,131.72,131.50,131.11,129.90,129.30,128.94,128.36,122.79,122.01,121.61,109.09,108.33,100.82,41.39,33.19。

因此，可確定上述黃色固體產物即為4-溴-n-(3,4-亞甲二氧基苯乙基)-1,8-萘二甲酰亞胺，其化學結構式如下式(ii)所示：

實施例2：na-1a的合成

重復實施例1，不同的是：

反應溫度改為60℃，其余反應條件不變(產率約為75％)。

對所得黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，確定其為目標產物。

實施例3：na-1a的合成

重復實施例1，不同的是：

反應溫度改為80℃，其余反應條件不變(產率約為85％)。

對所得黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，確定其為目標產物。

實施例4：na-1a的合成

重復實施例1，不同的是：

反應溶劑改為甲醇，其余反應條件不變(產率約為85％)。

對所得黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，確定其為目標產物。

實施例5：na-1a的合成

重復實施例1，不同的條件是：

反應原料4-溴-1,8-萘二甲酸酐和3,4-亞甲二氧苯乙胺的物質的量之比改為1:1，其余反應條件不變(產率約為65％)。

對所得黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜分析，確定其為目標產物。

實施例6：式(i)所示化合物即4-(乙氧羰基甲氨基)-n-(3，4-亞甲二氧苯乙基)-1，8-萘二甲酰亞胺(以下簡稱na-2a)的合成

稱取na-1a溶于二甲基亞砜中，加入甘氨酸乙酯和三乙胺(na-1a、甘氨酸乙酯和三乙胺的摩爾比為1：1.2：2)，反應溫度135℃，反應進程使用薄層色譜進行跟蹤監(jiān)測。反應結束后，反應體系冷卻至室溫，倒入冰水中，有黃色固體析出，使用乙酸乙酯萃取三次，收集合并酯層并用無水mgso4干燥，減壓除去溶劑，所得粗產物進行硅膠柱層析分離純化(v石油醚：v乙酸乙酯＝20：1～5：1)，得到亮黃色固體(產率為65％)。

對所得亮黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質譜分析，具體波譜特性如下：

(1)核磁共振氫譜，其譜圖數據如下所示。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.66(d,j＝8.4hz,1h),8.46(d,j＝7.2hz,1h),8.26(d,j＝8.5hz,1h),8.14(s,1h),7.74(t,j＝7.8hz,1h),6.90–6.75(m,2h),6.67(dd,j＝10.7,9.0hz,2h),5.97(s,2h),4.29(d,j＝5.5hz,2h),4.17(q,j＝7.1hz,4h),2.90–2.74(m,2h),1.23(s,3h)。

(2)核磁共振碳譜，其譜圖數據如下所示。

¹³cnmr(101mhz,dmso-d6)δ:170.38,164.07,163.26,150.81,147.72,146.10,134.38,133.18,131.25,130.11,129.68,128.86,125.23,122.45,121.93,120.68,109.44,109.31,108.66,104.88,101.16,61.26,40.63,40.42,40.21,40.00,39.79,39.58,39.37,33.84,14.59。

(3)電噴霧質譜，其譜圖如圖1所示，esi-msm/z：445.14[m-h]^-

因此，可確定上述亮黃色固體產物即為4-(乙氧羰基甲氨基)-n-(3，4-亞甲二氧苯乙基)-1，8-萘二甲酰亞胺，其化學結構式如下式(i)所示：

實施例7：na-2a的合成

重復實施例6，不同的是：

反應溫度改為80℃，其余反應條件不變(產率為25％)。

對所得亮黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質譜分析，確定其為目標產物。

實施例8：na-2a的合成

重復實施例6，不同的是：

反應溫度改為100℃，其余反應條件不變(產率為38％)。

對所得亮黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質譜分析，確定其為目標產物。

實施例9：na-2a的合成

重復實施例6，不同的是：

反應原料na-2a和甘氨酸乙酯的物質的量之比改為1:1，其余反應條件不變(產率為40％)。

對所得亮黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質譜分析，確定其為目標產物。

實施例10：na-2a的合成

重復實施例6，不同的是：

反應原料甘氨酸乙酯和三乙胺的物質的量之比改為1:1，其余反應條件不變(產率為20％)。

對所得亮黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質譜分析，確定其為目標產物。

實施例11：na-2a的合成

重復實施例6，不同的是：

反應溶劑改為n,n-二甲基甲酰胺，其余反應條件不變(產率為60％)。

對所得亮黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質譜分析，確定其為目標產物。

實施例12：na-2a的合成

重復實施例6，不同的是：

反應溶劑改為乙二醇單甲醚，其余反應條件不變，未生成目標化合物。

實施例13：na-2a的合成

重復實施例6，不同的是：

合成方法不加入三乙胺，其余反應條件不變(產率為15％)。

對所得亮黃色固體進行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、電噴霧質譜分析，確定其為目標產物。

為充分說明本發(fā)明所述熒光探針具有直接靶向作用于線粒體的特性，申請人對其進行了下述試驗：

實驗例1：在細胞原位水平檢測化合物na-2a是否直接靶向線粒體

a)化合物孵育

(1)選取非小細胞肺癌細胞株nci-h460接種于70mm培養(yǎng)皿中，細胞生長至對數生長期(細胞貼壁面積約為70％～75％)時，小心移去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，使用pbs清洗兩次，加入5ml新dmem培養(yǎng)液。

(2)稱取適量化合物na-2a儲液(-20℃)，加入培養(yǎng)皿中使其終濃度為5μm，作用5h，同時設置不加藥的對照組。

b)線粒體的分離

(1)作用5h后，小心移去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，使用pbs清洗兩次，用濃度為0.25％胰蛋白酶消化貼壁細胞。加入5mldmem培養(yǎng)基，吹散并收集貼壁細胞，在離心機上以2000rpm離心10min；

(2)棄去上清液，加1ml冰浴預冷的pbs，清洗細胞一次，2000rpm離心1min；

(3)棄去上清pbs，加入適量含pmsf的線粒體分離試劑，冰上孵育30min，定時吹散細胞，防止細胞沉淀；

(4)將細胞懸液轉移到適當大小的玻璃勻漿器中，勻漿40次左右；

(5)將細胞勻漿轉移至離心管中，在4℃，1000g離心10min；

(6)小心將上清液轉移到另一離心管中，在4℃，3500g離心10min；

(7)收集部分上清，在收集時注意勿觸及沉淀。小心除去剩余上清，沉淀即為分離得到的線粒體。

c)na-2a與線粒體孵育

(1)將上述步驟(b)中對照組提取的線粒體分為2份，取其中1份與5μm的na-2a充分混勻后于37℃恒溫水浴中孵育5h；

(2)孵育結束后于4℃，9000g離心10min；

(3)小心除去上清液，加入100μl線粒體儲存液混勻，4℃9000g離心10min；

(4)完全去除上清，沉淀即為孵育na-2a后得到的線粒體；

d)線粒體和胞漿蛋白質的提取

(1)依據細胞胞漿的量加入100-200μlripa裂解液和pmsf混勻，冰上超聲裂解30min，每10min振蕩混勻細胞裂解液，使其充分裂解。ripa裂解液與pmsf的比例為100:1；

(2)依據線粒體量加入40～80μl線粒體裂解液和pmfs(線粒體裂解液:pmsf＝100:1)，混勻，冰上超聲裂解20min，每5min震蕩混勻細胞裂解液，使線粒體充分裂解。

(3)將胞漿和線粒體的裂解液分別移至1.5mlep管中，4℃12000rpm，離心10min；

(4)小心收集上清液，即為裂解后所得蛋白樣品，用于質譜檢測。

e)na-2a孵育提取的胞漿和線粒體蛋白質的質譜檢測

將經步驟(d)處理所得樣品隨即進行質譜檢測分析，結果如圖1～6所示。其中，圖1為實施例6制得的最終產物na-2a溶解在dmso中的質譜分析結果；圖2為細胞孵育化合物na-2a后5h胞漿蛋白的質譜分析結果；圖3為細胞孵育化合物na-2a后5h線粒體蛋白的質譜分析結果；圖4為細胞未孵育化合物na-2a胞漿蛋白的質譜分析結果；圖5為細胞未孵育化合物na-2a線粒體蛋白的質譜分析結果；圖6為未經給藥處理提取線粒體單獨孵育化合物na-2a后5h的線粒體蛋白質譜分析結果。分析結果顯示，在非小細胞肺癌細胞株nci-h460中na-2a可以直接進入線粒體中。

實驗例2：na-2a與線粒體共定位分析

1)用75％(體積濃度)酒精浸泡處理細胞爬片專用玻璃片，將處理好的玻片置于6孔板的每個孔內，備用。

2)選取非小細胞肺癌細胞株nci-h460除去原有培養(yǎng)液后，使用pbs清洗貼壁細胞，移除pbs緩沖液，加入1ml0.25％胰蛋白酶，靜置半分鐘，移除胰酶后，將培養(yǎng)置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)消化1min，加入新鮮培養(yǎng)液吹打貼壁細胞至細胞懸浮。

3)按每孔500μl細胞懸浮液分別加入6孔板各孔中，將孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數日，待細胞完全貼壁生長。

4)使用na-2a稀釋液(5μm)加入各孔中與細胞孵育5h，同時設置陰性對照。

5)移除培養(yǎng)液，用pbs清洗2次，每次5min。

6)每孔加入500μl預先37℃孵育30min的redcmxros線粒體紅色熒光探針儲液于室溫再次孵育45min。

7)除去孔中液體，用pbs清洗2次，每次5min。

8)在載玻片上滴加一滴抗熒光猝滅封片液，蓋上貼有細胞的玻片，避免出現氣泡，用快干膠固定封片。

9)使用激光共聚焦顯微鏡進行熒光檢測。結果如圖7～8所示，其中圖7為陰性對照細胞熒光檢測結果；圖8為細胞孵育5h時熒光檢測結果。分析結果顯示，在非小細胞肺癌細胞株nci-h460中na-2a同redcmxros線粒體紅色熒光探針在細胞中位置相同，說明na-2a可以直接靶向線粒體。