本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和感染病學(xué)領(lǐng)域，涉及多種乙型肝炎病毒的抗原表位肽序列。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus,hbv)感染是最常見感染性疾病之一，嚴(yán)重危及人類的健康。世界衛(wèi)生組織2015年7月統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，預(yù)計(jì)全球1/3的人口感染過hbv，約2.48億hbv攜帶者，后期可發(fā)展為肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。每年約78萬hbv感染的患者因疾病進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭或是肝癌而導(dǎo)致死亡。流行病學(xué)調(diào)查顯示在中國大陸地區(qū)約8億人感染過hbv，乙肝表面抗原(hepatitisbsurfaceantigen,hbsag)攜帶率高達(dá)10.34％，即我國目前約有1.2億人為hbv攜帶者，占全球慢性感染人數(shù)的一半。另外，我國也是一個(gè)肝癌大國，約占全球肝癌人數(shù)的55％以上。
hbv基因組由不完全雙鏈環(huán)狀dna組成，長的為負(fù)鏈，含3020-3320個(gè)堿基，短的為正鏈，含1700-2800個(gè)堿基。包括四個(gè)開放閱讀框(orf)，分別稱為c、x、p和s編碼區(qū)。c區(qū)由pre-c和c基因組成，分別由不同的起始密碼子調(diào)控，在相同的終止密碼子處結(jié)束，pre-c和c基因共同編碼pre-c蛋白，pre-c蛋白再經(jīng)過切割加工后形成核心抗原(hbeag)。s區(qū)由s基因、pres1和pres2基因組成，由3個(gè)不同的起始密碼子啟動(dòng)翻譯，在同一個(gè)終止密碼子處終止翻譯，分別編碼表面抗原(hbsag)蛋白、pres1蛋白和pres2蛋白。p區(qū)基因編碼的hbv的聚合酶蛋白(hbpol)。x區(qū)的基因編碼x蛋白(hbx)，包含154個(gè)氨基酸，是最小的一個(gè)開放閱讀框。
細(xì)胞毒性t細(xì)胞(cytotoxictlymphocyte,ctl)是介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞，在抗感染、抗腫瘤以及超敏反應(yīng)和自身免疫病的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，其細(xì)胞膜上的t細(xì)胞受體(tcellreceptor,tcr)能夠特異性識(shí)別并結(jié)合抗原遞呈細(xì)胞表面mhci類分子與抗原肽的復(fù)合物，即mhc/抗原肽復(fù)合體分子。ctl表位是指與mhci類分子結(jié)合的抗原肽，是抗原分子中能被tcr特異性識(shí)別的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)，是引起免疫應(yīng)答反應(yīng)的基本抗原單位，在ctl活化過程中扮演著關(guān)鍵角色。
mhc系統(tǒng)指主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex,mhc)，是脊椎動(dòng)物基因組中一組緊密連鎖的基因群，編碼表達(dá)mhci類和ii類蛋白分子。hla(humanleukocyteantigen)是人類的mhc系統(tǒng)，是人體最復(fù)雜的基因群，在人群中具有高度多態(tài)性。hla在抗原識(shí)別、抗原呈遞等機(jī)體免疫過程中發(fā)揮重要作用，是影響人體免疫反應(yīng)的主要因素。hlai類分子主要負(fù)責(zé)將內(nèi)源性hbv抗原呈遞給cd8+ctl，活化的ctls通過分泌穿孔素和顆粒酶等使病毒感染的肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)分泌特定的細(xì)胞因子抑制hbv的復(fù)制。因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測hbv抗原特異性cd8+t細(xì)胞的數(shù)量和功能可以準(zhǔn)確反映乙肝感染者針對(duì)hbv的特異性免疫功能狀態(tài)。由于不同人的hla分子型別不同，其對(duì)hbv不同抗原的加工、處理和提呈能力也不相同，從而引起不同程度的hbv抗原特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。根據(jù)乙肝患者不同的hla分子型別，選擇其所提呈的hbv特異性抗原肽，動(dòng)態(tài)監(jiān)測該hbv抗原肽特異性的cd8+t細(xì)胞的數(shù)量和功能，對(duì)hbv感染者的疾病進(jìn)程監(jiān)測、診斷與治療方案的制定、療效觀察和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的判斷等都有重要意義，是實(shí)現(xiàn)乙肝精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)治療的重要技術(shù)手段。同時(shí)，利用這些hla-a分子高親和力結(jié)合的hbv特異性抗原肽，還可以制備多肽疫苗或基因疫苗，預(yù)防和治療hbv感染。
目前，國內(nèi)外報(bào)道的與hla-a分子呈高親和力結(jié)合的hbv特異性抗原肽中，hla-a*0201、a*0203、a*0206、a*1101和a*2402等分子限制性的抗原肽序列被報(bào)道和鑒定的較多。而中國人群中頻率相對(duì)較高的hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等分子的限制性hbv抗原肽則較少報(bào)道。本專利通過生物信息學(xué)方法，利用六種在線表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫對(duì)hla-a等位基因型限制的hbv特異性抗原表位肽進(jìn)行預(yù)測，獲得一組分別與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等hla-a分子呈高親和力結(jié)合的hbv特異性抗原肽序列，為制備hbv感染的治療和預(yù)防性疫苗以及檢測hbv抗原特異性t細(xì)胞的試劑等提供候選抗原表位肽。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種能制備hbv感染的治療和預(yù)防性疫苗以及研制hbv抗原特異性t細(xì)胞檢測試劑的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列。
技術(shù)方案：本發(fā)明的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列，為如下所示序列中的任一種：
進(jìn)一步的，本發(fā)明中，該序列為乙肝病毒核心抗原h(huán)bcag、表面抗原h(huán)bsag、聚合酶蛋白hbpol或x蛋白hbx的抗原肽序列。
進(jìn)一步的，本發(fā)明中，該序列能分別hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303、a*6801分子呈高親和力結(jié)合。
進(jìn)一步的，本發(fā)明中，序列通過以下步驟制備：
1.1通過genebank數(shù)據(jù)庫或uniprot全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫檢索獲得乙肝病毒蛋白氨基酸序列；
1.2利用六種表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫syfpeithi、bimas、svmhc、iedb、netmhc和epijen分別預(yù)測步驟1.1所得乙型肝炎病毒抗原中能分別與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303、a*6801分子呈高親和力結(jié)合的多肽序列；
1.3對(duì)步驟1.2所得六種在線表位預(yù)測網(wǎng)站的預(yù)測結(jié)果，選擇同一hla-a分子至少有兩種及以上方法都預(yù)測獲得高親和力結(jié)果的某一多肽序列作為乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列。
本發(fā)明的一種將上述的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列在制備多肽疫苗或基因疫苗中的應(yīng)用，是將與hla-a分子呈高親和力結(jié)合的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽制備成多肽疫苗或基因疫苗。
本發(fā)明的一種將上述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列在檢測乙型肝炎病毒抗原特異性t細(xì)胞中的應(yīng)用，是以與hla-a分子呈高親和力結(jié)合的乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽作為試劑，檢測乙型肝炎病毒抗原表位肽特異性胸腺依賴性淋巴細(xì)胞。
本發(fā)明的上述乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列在檢測乙型肝炎病毒抗原特異性t細(xì)胞中的應(yīng)用，所述試劑為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法試劑、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑、人類白細(xì)胞抗原多聚體熒光染色或流式細(xì)胞分析法試劑。
本發(fā)明利用六種在線表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測6種hla-a等位基因型限制性的hbv特異性抗原表位肽序列，獲得一組能分別與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等hla-a分子呈高親和力結(jié)合的hbv特異性抗原表位肽序列，為制備hbv感染的治療和預(yù)防性疫苗以及研制hbv抗原特異性t細(xì)胞的檢測試劑等提供了候選抗原表位肽。
1.選擇乙肝病毒核心抗原(hbcag)、表面抗原(hbsag)、聚合酶蛋白(hbpol)和x蛋白(hbx)氨基酸序列為靶向序列；
2.選擇預(yù)測結(jié)果獲得研究者的公認(rèn)、具有較高準(zhǔn)確性的、常用的六種表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫：syfpeithi、bimas、svmhc、iedb、netmhc和epijen預(yù)測上述6種hla-a分子限制性的hbv特異性抗原表位肽序列；
3.根據(jù)一定的預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)六個(gè)在線表位預(yù)測網(wǎng)站的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行整合分析，獲得六個(gè)網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果較一致的候選抗原肽序列。
本發(fā)明為乙肝病毒核心抗原(hbcag)、表面抗原(hbsag)、聚合酶蛋白(hbpol)和x蛋白(hbx)中能分別與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等蛋白分子呈高親和力結(jié)合的抗原肽序列；還涉及到以上述抗原肽為基礎(chǔ)的乙型肝炎多肽疫苗、基因疫苗、乙型肝炎的治療與預(yù)防方法，以及以上述抗原肽為基礎(chǔ)的檢測乙型肝炎病毒抗原特異性t細(xì)胞的試劑和方法。
有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
預(yù)測獲得的hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等hla-a分子限制性的hbv特異性抗原表位肽以前也沒有被報(bào)道過。這些hla-a分子以前也沒有被報(bào)道有限制性的hbv抗原肽。因此這些新的抗原表位肽序列將為研制針對(duì)乙型肝炎治療性和預(yù)防性多肽疫苗和基因疫苗、設(shè)計(jì)檢測乙型肝炎病毒抗原特異性t細(xì)胞的試劑和方法等提供所需的關(guān)鍵抗原組分，即抗原表位肽序列；同時(shí)這些抗原表位肽也為針對(duì)這些特定hla-a等位基因的乙型肝炎患者進(jìn)行個(gè)體化檢測和精準(zhǔn)醫(yī)療提供了關(guān)鍵的抗原組分。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的hla-a分子限制性hbv特異性抗原肽，包括以下步驟：
1.通過genebank數(shù)據(jù)庫和uniprot全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫檢索獲得hbv蛋白氨基酸序列，選擇研究最多的蛋白序列，最終選定的蛋白序列為hbsag(p03138)、hbcag(p03146)、hbpol(p03156)和hbx(p03165)。
2.利用六種常用表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫syfpeithi、bimas、svmhc、iedb、netmhc和epijen(http://www.syfpeithi.de/、http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/、ttp://www.sbc.su.se/～pierre/svmhc/、http://www.immuneepitope.org/tools.do/、http://www.cbs.dtu.dk/services/netmhc/、http://www.ddg-pharmfac.net/epijen/epijen/epijen.htm/)分別將上述乙肝病毒抗原h(huán)bsag(p03138)、hbcag(p03146)、hbpol(p03156)和hbx(p03165)的氨基酸序列與hla-a*0101、a*0301、a*3001、a*3101、a*3201、a*3303和a*6801等hla-a分子中的每一種進(jìn)行親和力和空間構(gòu)象的吻合度分析，根據(jù)一定的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測篩選每種hla-a分子限制性的抗原表位肽序列，分別選擇長度為9和10個(gè)氨基酸的結(jié)合肽作為候選抗原表位肽。具體的篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：syfpeithi預(yù)測選取評(píng)分>20或者排名在前10的肽序列；bimas預(yù)測選取評(píng)分>10或者排名在前10的肽序列；svmhc預(yù)測選取評(píng)分>0.5或者排名在前10的肽序列；iedb預(yù)測選取評(píng)ic50<500nm或者排名在前10的肽序列；netmhc預(yù)測選取rankthreshold<2.0rankthreshold<2.0或者排名在前10的肽序列；epijen預(yù)測選取ic50<500nm或者排名在前10的肽序列。
3.針對(duì)每一種hla-a分子，經(jīng)不同數(shù)據(jù)庫預(yù)測出的表位肽再根據(jù)親和力從高到低進(jìn)行排列，選取高親和力的肽序列作為該種hla-a分子限制性的hbv候選抗原表位肽。同時(shí)對(duì)六種在線表位預(yù)測網(wǎng)站的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行整合分析，對(duì)每一種hla-a分子，篩選至少達(dá)到兩種及以上方法篩選標(biāo)準(zhǔn)的某一表位肽作為該hla-a分子限制性的候選抗原表位肽。
表1是通過上述六個(gè)在線表位預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測并最終篩選出的hla-a限制性hbv特異性抗原表位肽序列。
四種被用來預(yù)測抗原表位的乙型肝炎病毒抗原的氨基酸序列如下：
seqidno1：
hbsag(p03138)：
seqidno2：
hbcag(p03146)：
表1hla-a限制性hbv相關(guān)抗原表位的預(yù)測結(jié)果
---：該預(yù)測網(wǎng)站沒有針對(duì)該mhc分子的預(yù)測方法；
ns：沒有獲得該表位的計(jì)算數(shù)據(jù)。
seqidno3：
hbpol(p03156)：
seqidno4：
hbx(p03165)：
上述實(shí)施例僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和等同替換，這些對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求進(jìn)行改進(jìn)和等同替換后的技術(shù)方案，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
sequencelisting
<110>東南大學(xué)
<120>乙型肝炎病毒抗原的胸腺依賴性淋巴細(xì)胞抗原表位肽序列
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