本發(fā)明屬于核酸標記領域，特別涉及一種細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針及其制備方法與應用。

背景技術：

在生命科學研究領域，具有熒光響應的核酸標記技術在研究核酸分子結構以及其在細胞內的合成過程具有非常重要的價值和意義。尤其是利用生物正交反應觸發(fā)的熒光響應標記方法經(jīng)成為一種生物分子標記的重要工具，這種標記方法可以在溫和的條件下選擇性標記和追蹤生物分子，并進行靈敏的可視化熒光成像。最初的標記方法有熒光響應的合成后標記，模板介導的連接和dna或rna的代謝標記，這些方法是基于一價銅離子催化的疊氮和炔烴的環(huán)化加成反應[gierlich,j.；burley,g.a.；gramlich,p.m.；hammond,d.m.；carell,t.org.lett.2006,8,3639–3642]。為了打破銅離子催化的高毒性[kennedy,d.c.；mckay,c.s.；legault,m.c.b.；danielson,d.c.；blake,j.a.；pegoraro,a.f.；stolow,a.；mester,z.；pezacki,j.p.j.am.chem.soc.2011,133,17993-18001]熒光響應標記核酸進一步發(fā)展為基于非銅催化的生物正交反應，非銅催化的生物正交反應包括張力促進的1，3-兩極環(huán)化加成反應，狄爾斯-阿爾德反應和親核加成反應[domnick,c.；eggert,f.；kath-schorr,s.chem.commun.2015,51,8253–8256]。但是即便如此，由于非銅催化的反應基團的尺寸的限制，到目前為止還沒有報道過在細胞內有熒光響應的dna快速標記和成像的方法。在細胞環(huán)境內熒光響應標記核酸對于探究核酸的復制及轉運過程是非常重要的。

光誘導的疊氮-炔烴環(huán)化加成反應即光點擊反應是一種非金屬催化的具有熒光響應的生物正交反應。光點擊反應已經(jīng)作為一種有效的蛋白定點修飾方法，近年來這種反應引起了很多人的關注。光點擊反應已經(jīng)成功地被證明可以用可見光405nm[an,p.；yu,z.；lin,q.chem.commun.2013,49,9920-9922.]和近紅外光700nm激發(fā)[yu,z.；ohulchanskyy,t.y.；an,p.；prasad,p.n.；lin,q.j.am.chem.soc.2013,135,16766–16769]。通過改變四唑化合物的結構來減少紫外光的限制。鑒于這一優(yōu)勢，近期光點擊化學反應已經(jīng)開始被應用于在體外對核酸的修飾[(a)holstein,j.m.；stummer,d.；rentmeister,a.chem.sci.2015,6,1362–1369.(b)arndt,s.；wagenknecht,h.-a.angew.chem.int.ed.2014,53,14580–14582]。但是，有的文獻報道的四唑化合物通過光點擊反應標記核酸后的產(chǎn)物熒光較弱或者無光，有的文獻則用四唑化合物可以熒光響應標記rna[li,j.；huang,l.；xiao,x.；chen,y.；wang,x.；zhou,z.；zhang,y.j.am.chem.soc.2016,138,15943-15949]。在光點擊反應標記核酸的過程中，這種不明確的熒光響應行為成為其首要問題。因此，解決光點擊反應標記核酸中的熒光響應問題及探究可以用于活體內代謝標記核酸的具有熒光響應能力的探針具有非常重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針。該探針具有光點擊反應的特征性優(yōu)點如：反應速度快，反應基團分子為小且易修飾具有烯烴基團的化合物，并且該探針具有細胞核靶向性，適合應用于活細胞內核酸的快速代謝標記。

本發(fā)明的另一目的在于提供了所述細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針，為香豆素四唑化合物w1和w2中的至少一種；所述的w1和w2的結構式如式i和式ii所示：

其中，r為c1-c2烷基、烷基衍生物取代基，含酯基衍生物取代基或芳香烴衍生物取代基。

所述的c1-c2烷基、烷基衍生物取代基優(yōu)選為甲基、乙基或三氟甲基；

所述的含酯基衍生物取代基優(yōu)選為乙酸乙酯取代基

所述的芳香烴衍生物取代基優(yōu)選為苯甲基對三氟甲基苯甲基對甲氧基苯甲基或2,5-二甲氧基苯甲基

所述的細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針的制備方法，包括如下步驟：

(1)將香豆素衍生物加入乙醇水溶液中，接著加入濃鹽酸，然后在5℃條件下加入nano2(亞硝酸鈉)水溶液，再在-15℃的條件下滴加到4-甲基((2-(苯磺酰)亞肼基)甲基)苯甲酸鹽的吡啶中，恢復室溫進行反應，萃取、減壓蒸餾、得到香豆素四唑化合物(w1)；

(2)將步驟(1)中得到的香豆素四唑化合物(w1)和氫氧化鋰在四氫呋喃、甲醇和水的混溶液中加熱攪拌反應，反應終止后再調節(jié)溶液的ph值至出現(xiàn)紫色沉淀，得到中間體a；

(3)將步驟(2)中得到的中間體a、nhs(n-羥基丁二酰亞胺)和edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)在dmf(n,n-二甲基甲酰胺)中攪拌反應(用于活化香豆素四唑化合物)，反應終止后再加入飽和食鹽水析出沉淀，得到四唑化合物b；

(4)將步驟(3)中得到的四唑化合物b加入到含有三乙胺的dcm(二氯甲烷)和dmso(二甲基亞砜)溶液中，然后加入?；撬崴芤簲嚢璺磻瑴p壓蒸餾，加甲醇稀釋沉淀過濾后，調ph值至中性，再加入乙醚、過濾、取沉淀，得到w2，即為細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針。

步驟(1)中所述的香豆素衍生物和4-甲基((2-(苯磺酰)亞肼基)甲基)苯甲酸鹽優(yōu)選為按摩爾比10:9配比計算。

步驟(1)中所述的乙醇水溶液為乙醇和水按體積比1:1配比得到。

步驟(1)中所述的反應的條件為攪拌過夜進行反應。

步驟(1)中所述的乙醇水溶液的用量為按乙醇水溶液和濃鹽酸的體積比6:1配比計算。

步驟(1)中所述的濃鹽酸的濃度優(yōu)選為體積百分比37％。

步驟(1)中所述的萃取為采用dcm(二氯甲烷)進行萃取。

所述的具有熒光響應的dna光點擊探針的制備方法，還包括將步驟(1)中得到的香豆素四唑化合物經(jīng)硅膠柱進一步純化。

步驟(2)中所述的香豆素四唑化合物和氫氧化鋰優(yōu)選為按摩爾比1:20配比計算。

步驟(2)中所述的四氫呋喃的用量為按四氫呋喃、甲醇和水體積比2:1:1配比計算。

步驟(3)中所述的中間體a、nhs和edc優(yōu)選為按摩爾比1:2:2配比計算。

步驟(3)中所述的反應的時間優(yōu)選為12h。

步驟(4)所述的四唑化合物b、三乙胺和牛磺酸優(yōu)選為按摩爾比1：2：2配比計算。

步驟(4)中所述的dcm的用量為按dcm和dmso體積比4～6:1配比計算；優(yōu)選為按體積比5：1配比計算。

步驟(4)中所述的調ph值優(yōu)選為用氫氧化鈉的甲醇溶液進行調ph值。

所述的氫氧化鈉的濃度優(yōu)選為0.5mol/l。

步驟(4)中所述的反應優(yōu)選為在氮氣保護下進行反應。

所述的細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針在核酸標記領域中的應用。

所述的細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針在核酸標記領域中的應用，通過如下方法實現(xiàn)：

(i)將細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針與具有氨基的核酸序列在硼酸鈉緩沖液中避光孵育進行縮合反應，用預冷的無水乙醇將核酸沉降出來，得到香豆素四唑修飾的核酸；

(ii)將步驟(i)得到的香豆素四唑修飾的核酸分別與異丙基丙烯酰胺和n-(2-羥乙基)馬來酰亞胺在磷酸鹽緩沖液中、紫外光照射下發(fā)生光點擊反應，得到具有熒光響應的核酸。

步驟(i)中所述的細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針和核酸序列優(yōu)選為按摩爾比(8～12)：1配比計算；更優(yōu)選為按10:1配比計算。

步驟(i)中所述的核酸序列優(yōu)選為5’端氨基標記。

步驟(i)中所述的硼酸鈉緩沖液的ph優(yōu)選為8.0。

步驟(i)中所述的縮合反應的時間優(yōu)選為14小時。

步驟(ii)中所述的紫外光的波長優(yōu)選為350nm。

步驟(ii)中所述的紫外光的照射時間優(yōu)選為10分鐘。

步驟(ii)中所述的磷酸鹽緩沖液的ph值為5.5～7.5，優(yōu)選為7.5。

所述的細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針在核酸標記領域中的應用，還可以通過如下方法實現(xiàn)：

①將細胞傳代到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁后，加入5-乙烯基-2’-脫氧尿苷(vdu)進行培養(yǎng)；

②換成新的dmem培養(yǎng)液孵育后，再加入細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針繼續(xù)培養(yǎng)；

③加入新的dmem培養(yǎng)液孵育后，再用紫外光照射進行反應。

步驟①中所述的細胞優(yōu)選為腫瘤細胞。

步驟①中所述的細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針優(yōu)選為ctz-so3。

步驟①中所述的加入vdu為加入終濃度為30～50μm的vdu；優(yōu)選為加入終濃度為30μm的vdu。

步驟①中所述的培養(yǎng)的時間為12～20小時；優(yōu)選為16小時。

步驟②中所述的加入細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針為加入終濃度為10～20μm的細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針，優(yōu)選為加入終濃度為10μm的細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針。

步驟②中所述的孵育的時間為3～6小時；優(yōu)選為4小時。

步驟②中所述的繼續(xù)培養(yǎng)的時間為3～6小時；優(yōu)選為4小時。

步驟③中所述的孵育的時間優(yōu)選為2小時。

步驟③中所述的紫外光波長優(yōu)選為350nm。

步驟③中所述的紫外光的照射時間為8～14分鐘；優(yōu)選為10分鐘。

本發(fā)明中細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針標記核酸的發(fā)光原理是：標記核酸后產(chǎn)物發(fā)光部分由兩部分組成，熒光探針香豆素衍生物部分和吡唑啉部分，吡唑啉部分發(fā)光可以被核酸引起的光誘導的電子轉移效應淬滅，但是香豆素部分的熒光不受影響，因此，香豆素四唑在紫外光的照射下可以熒光響應的標記核酸。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本文中光點擊探針具有細胞核靶向性適用于活體內的核酸代謝標記。

(2)反應基團分子小，不干擾細胞內核酸正常的代謝過程。

(3)反應速度快，可以快速標記細胞內的核酸。

(4)反應中用350nm的紫外光照射減少對細胞及核酸的損傷。

(5)反應過程中有熒光響應，反應完后不需要清洗步驟即可，核酸標記成像不需要將細胞固定或核酸變性。

(6)反應原料容易獲得，反應產(chǎn)物合成簡單，操作簡單，易于普及。

(7)本發(fā)明中具有熒光響應的dna光點擊探針，香豆素的ehomo值在-0.324hartree以下時香豆素的熒光可以被四氮唑淬滅，隨著香豆素的ehomo值逐漸降低，標記核酸產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率會逐漸升高，同時香豆素四唑化合物的熒光量子產(chǎn)率也會有所增加。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針的合成路線圖與實施1中產(chǎn)物1～7的結構圖，其中，圖a為合成路線圖；圖b為產(chǎn)物1～7的結構圖。

圖2是實施例2中計算的香豆素衍生物的最高占據(jù)分子軌道能量值(ehomo)和熒光量子產(chǎn)率關系圖(圖中uv表示350nm紫外光)。

圖3是實施例3中香豆素四唑修飾的核酸和不同帶烯烴的化合物光點擊反應后的熒光圖；其中，圖a為香豆素四唑修飾的核酸分別與異丙基丙烯酰胺和n-(2-羥乙基)馬來酰亞胺反應產(chǎn)物的熒光光譜圖；圖b為在不同ph值的緩沖液中香豆素四唑修飾的核酸與n，n-二甲基乙基丙烯酰胺反應產(chǎn)物的熒光光譜圖。

圖4是實施例4中細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針ctz-so3和vdu光點擊反應后的熒光圖和吸收圖；其中，圖a為ctz-so3和vdu反應前后的熒光光譜圖；圖b為ctz-so3和vdu反應前后的吸收譜圖。

圖5是實施例4中光點擊速率數(shù)據(jù)分析圖。

圖6是實施例5中細胞內熒光響應標記dna的光點擊探針ctz-so3標記細胞核酸圖(圖中uv表示350nm紫外光)；其中圖a為ctz-so3標記細胞dna的原理示意圖；圖b為ctz-so3標記細胞dna的共聚焦顯微成像圖。

圖7是實施例6中驗證活細胞內胞內熒光響應標記dna的光點擊探針ctz-so3具有細胞核靶向性的共聚焦顯微成像圖。

具體實施方式

下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

1、實施例中所涉及的化學試劑均由阿拉丁購買；所涉及的dna產(chǎn)品和dmem細胞培養(yǎng)液均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；細胞來源于atcc細胞庫；3k超濾管購自頗爾公司；熒光光譜儀(ls55)，紫外吸收光譜儀(lambada35；perkinelmer，beaconsweld，bucks，uk)；激光共聚焦掃描顯微鏡(lsm510/con-focor2，carl-zeiss，jena，germany)。

2、實施例中4-甲基((2-(苯磺酰)亞肼基)甲基)苯甲酸鹽的合成參考：li,z.,qian,l.,li,l.,bernhammer,j.c.,huynh,h.v.,lee,j.s.,&yao,s.q.(2016).angewandtechemieinternationaledition,55(6),2002-2006。

實施例1一系列種基于光點擊反應且具有熒光響應的dna探針的制備

(1)將香豆素衍生物1′(1mmol)加入6ml的乙醇/水(etoh/h2o，體積比1:1)中然后加入1ml濃度為37％(v/v)的濃鹽酸攪拌，并在5℃的條件下慢慢加入到1.5mlnano2(1mmol)的水溶液中并攪拌；然后在-15℃的條件下將這些混合物逐滴的滴加到4-甲基((2-(苯磺酰)亞肼基)甲基)苯甲酸鹽((e)-methyl4-((2-(phenylsulfonyl)hydrazono)methyl)benzoate，0.9mmol)的干燥吡啶(8ml)中恢復室溫攪拌過夜，反應完全后，反應混合物用dcm(二氯甲烷)萃取，減壓蒸餾，然后用硅膠柱進一步提純(洗脫劑為甲醇：二氯甲烷、體積比1:5；硅膠柱規(guī)格為300目)，得到純品產(chǎn)物(香豆素四唑化合物1)，如圖1所示；

(2)參考上述制備方法，分別用香豆素衍生物2′～7′替換上述香豆素衍生物1′，得到香豆素四唑化合物2～7(如圖1所示)；

上述香豆素衍生物1′～7′的結構式如下所示：

產(chǎn)率及表征數(shù)據(jù)：

1:yield:52％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.35(m,2h),8.23(m,4h),7.81(m,1h),6.39(d,j＝1.0hz,1h),3.96(s,3h),2.50(d,j＝1.5hz,3h)；

2:yield:50％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.37(d,j＝4.0hz,2h),8.30(d,j＝8.0hz,2h),8.24(d,j＝8.0hz,2h),7.98(d,j＝8.0hz,1h),6.92(s,1h),3.98(s,3h)；ms(esi)calcdforc19h11f3n4o4,416.32[m⁺],found417.04.

3:yield:48％.¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ＝8.34(d,j＝8.0hz,2h),8.22(d,j＝8.0hz,2h),8.17(s,1h),8.01(d,j＝4.0hz,1h),7.94(d,j＝4.0hz,1h),6.64(s,1h),4.16(m,j＝4.0hz,2h),4.06(s,2h),3.92(s,3h),1.22(t,j＝6.0hz,3h)；ms(esi)calcdforc22h18n4o6,434.40[m⁺],found434.60.

4:yield:45％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.36(d,j＝8.0hz,2h),8.22(d,j＝4.0hz,3h),8.16(d,j＝4.0hz,1h),7.87(d,j＝8.0hz,1h),7.39(d,j＝8.0hz,2h),7.34(d,j＝8.0hz,1h),7.27(d,j＝8.0hz,2h),6.24(s,1h),4.18(s,2h),3.97(s,3h)；ms(esi)calcdforc25h18n4o4,438.44[m⁺],found439.10.

5:yield:41％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.36(d,j＝8.0hz,2h),8.24(d,j＝4.0hz,1h),8.22(d,j＝4.0hz,2h),8.19(d,j＝8.0hz,1h),7.83(d,j＝8.0hz,1h),7.62(d,j＝8.0hz,1h),7.55(t,j＝8.0hz,2h),7.46(d,j＝4.0hz,1h),6.18(s,1h),4.24(s,2h),3.97(s,3h)；ms(esi)calcdforc26h17f3n4o4,506.44[m^-],found505.16.

6:yield:42.％¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.36(d,j＝8.0hz,2h),8.23(d,j＝8.0hz,3h),8.16(d,j＝4.0hz,2h),7.87(d,j＝4.0hz,2h),7.18(d,j＝4.0hz,2h),6.92(d,j＝8.0hz,2h),4.12(s,2h),3.98(s,3h),3.82(s,3h)；ms(esi)calcdforc26h20n4o5,468.47[m⁺],found468.70.

7:yield:40％.¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.36(d,j＝8.0hz,2h),8.22(d,j＝4.0hz,2h),8.20(d,j＝4.0hz,2h),7.95(d,j＝8.0hz,1h),6.89(d,j＝8.0hz,1h),6.84(d,j＝8.0hz,1h),6.72(d,j＝4.0hz,1h),6.14(s,1h),4.12(s,2h),3.97(s,3h)，3.81(s,3h)，3.75(s,3h)；ms(esi)calcdforc27h22n4o6,498.50[m^-],found497.10.

(2)ctz-so3的制備

將上述得到的香豆素四唑化合物1(362mg，1.0mmol)與氫氧化鋰(840mg，20.0mmol)在四氫呋喃、甲醇和水的混合液(體積比2:1:1)中加熱攪拌反應，反應終止后調節(jié)溶液的ph值至出現(xiàn)紫色沉淀；得到中間體8；稱取中間體8(240mg，0.69mmol)放入25ml單頸燒瓶中，加入4ml的dmf(二甲基甲酰胺)使攪拌其溶解，得到中間體8溶液；稱取nhs(208mg，1.38mmol)和edc(264mg，1.38mmol)放入25ml單頸燒瓶中，加入3mldmf攪拌使其溶解，得到nhs(n-羥基丁二酰亞胺)/edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)溶液；將中間體8溶液緩慢地滴入到nhs/edc溶液中，攪拌過夜(12h)，tlc(薄層色譜)跟蹤檢測反應；反應完全后，向反應液中加入飽和食鹽水，沉淀析出；過濾收集沉淀，用水沖洗沉淀；將沉淀烘干，得到四唑化合物9。

將四唑化合物9(200mg，0.45mmol)和三乙胺(125μl，0.9mmol)加入到含有三乙胺的dcm(二氯甲烷)/dmso(二甲基亞砜)體積比為5:1的溶液中，然后再加?；撬?112.5mg，0.9mmol)的水溶液2ml，氮氣保護進行反應。反應完全后減壓蒸餾，加甲醇稀釋沉淀過濾后，濾液用0.5m氫氧化鈉的甲醇溶液調至中性，然后加乙醚，過濾沉淀得到183mgctz-so3(結構式如式iii所示)，產(chǎn)率78％，即為具有細胞核靶向性熒光響應的dna探針。

其中，r為甲基。

數(shù)據(jù)表征：¹hnmr(400mhz,dmso-d6):δ＝8.70(t,j＝4.0hz,1h),8.28(d,j＝8.0hz,2h),8.17(t,j＝4.0hz,2h),8.09(d,j＝8.0hz,1h),8.02(d,j＝8.0hz,2h),6.56(s,1h),3.55(t,j＝4.0hz,2h),2.71(t,j＝4.0hz,2h),2.48(s,3h)；ms(esi)calcdforc20h16n5o6s,454.08[m^-],found453.94.

(3)ctz-el的制備

將三乙胺(138μl，1.0mmol)加入10ml的二氯甲烷中，然后加入上述制得的四唑化合物9(45mg，0.1mmol)，然后加入乙胺(65μl，1.0mmol)，混合物在氮氣保護下攪拌1小時，反應完后減壓蒸餾，然后經(jīng)過硅膠柱提純得最終產(chǎn)物ctz-el，其結構式如式iv所示：

其中，r為甲基。

數(shù)據(jù)表征：¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.33(d,j＝4.0hz,2h),8.19(d,j＝4.0hz,2h),7.93(t,j＝4.0hz,2h),7.81(d,j＝8.0hz,1h),6.40(s,1h),6.23(s,1h),3.53(m,2h),2.52(s,3h),1.29(t,j＝4.0hz,3h)；ms(esi)calcdforc20h17n5o3,375.13,[m⁺h⁺],found376.15.

實施例2：香豆素四唑1-7和標記dna產(chǎn)物的光動力學特性

將實施例1中得到的香豆素四唑化合物1-7分別與修飾烯烴的dna結構如式iii反應，香豆素四唑化合物1-7的濃度是100μm，修飾烯烴的dna的濃度是10μm，在350nm紫外燈下照射10分鐘，反應完后用超濾管提純產(chǎn)物。測7種反應產(chǎn)物的熒光并計算反應產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率，結果見表1。圖2是實施例1中計算的香豆素衍生物的ehomo(最高占據(jù)分子軌道能量值，根據(jù)wb97xd/6-311+g(d,p)方法計算，)和熒光量子產(chǎn)率關系圖。從表1和圖2中反應前除香豆素四唑2外其它香豆素四唑幾乎沒有熒光，光點擊反應后可以產(chǎn)生明顯熒光響應。從表2中可以看出在計算的香豆素的ehomo值在-0.324hartree以下時香豆素的熒光可以被四氮唑淬滅，隨著香豆素的ehomo值逐漸降低，標記核酸產(chǎn)物的熒光量子產(chǎn)率會逐漸升高從0.129升至0.389，同時香豆素四唑化合物的熒光量子產(chǎn)率也會有所增加。

表1四唑化合物1-7和標記dna產(chǎn)物的光學特性

實施例3：香豆素四唑標記核酸后發(fā)光原理的探究

取香豆素四唑1作為實施案例中的樣品，將其活化后的四唑化合物9(方法同實施例1)，取一管5’端氨基標記的核酸序列離心(12000rpm，20min)；將離心管蓋打開，快速加入55μl0.1m硼酸鈉緩沖液(ph8.0)迅速蓋上管蓋；在漩渦儀上充分振蕩10min；加入30μl50mm的四唑化合物9(提前用二甲基亞砜配置成50mm的溶液)；將離心管纏上錫箔紙，放在離心管加上振蕩孵育14小時；往離心管中加入1ml預冷訂的無水乙醇，上下振蕩1min；然后放入超低溫冰箱靜置2小時；4℃、12000rpm離心20min；吸去上層澄清溶液，加入1ml預冷1ml預冷訂的無水乙醇，上下振蕩1min；然后放入超低溫冰箱靜置2小時；4℃、12000rpm離心20min；吸去上層澄清溶液，靜置30min，加55μl無菌水，充分振蕩5min；12000rpm離心10min；吸去上層澄清溶液放入離心管中-20℃保存，得到香豆素四唑修飾的核酸，結構式如式vi所示；然后將香豆素四唑修飾的核酸分別與異丙基丙烯酰胺和n-(2-羥乙基)馬來酰亞胺在ph7.5的磷酸鹽緩沖液中在350nm紫外光下照射10分鐘，反應后用超濾管提純，然后用熒光光譜儀測熒光，實驗結果圖3a所示，從圖中可以看出，香豆素四唑修飾的核酸與異丙基丙烯酰胺反應后產(chǎn)生熒光在490nm，n-(2-羥乙基)馬來酰亞胺反應產(chǎn)物熒光在450nm，這些發(fā)現(xiàn)表明反應產(chǎn)物的淬滅效應可能是由于烯烴化合物的光誘導的電子轉移。為了驗證這個觀點將香豆素四唑修飾的核酸與n，n-二甲基乙基丙烯酰胺在350nm的紫外光下分別在ph5.5～7.5的磷酸鹽緩沖液中反應，反應后用超濾管提純，然后用熒光光譜儀測測熒光。實驗結果如圖3b所示，從圖中可已看出隨著ph從5.5增加到7.5，在490nm處的熒光逐漸減弱并在450nm處出現(xiàn)一個新的發(fā)射峰。這些實驗結果近一步證明帶有香豆素的四唑化合物的環(huán)化加成反應產(chǎn)物的發(fā)射峰在450nm和490nm分別來自于香豆素和吡唑啉部分。更重要的是基于這些發(fā)現(xiàn)我們可以預測以及監(jiān)測一些烯烴化合物和帶香豆素四唑化合物反應產(chǎn)物的發(fā)射峰。

實施例4：光點擊反應速率的測定

5μm的vdu(5-乙烯基-2’-脫氧尿苷)分別和25μm、50μm的四唑化合物ctz-so3(實施例1制得)在350nm紫外燈下分別照射1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘后，用高效液相色譜(hplc)檢測反應產(chǎn)物，并計算反應產(chǎn)率，再通過公式計算反應速度，其中，

公式是；ln(vdu/(vdu-[product]t))＝kobserved*t；kobserved＝kcycloaddition*[ctz-so3]

式中：product表示產(chǎn)物濃度；kobserved表示實驗中觀察到的反應速率；kcycloaddition表示實際點擊反應速率；t表示時間；vdu表示vdu的濃度；ctz-so3表示ctz-so3的濃度。

實驗結果如圖4所示，圖4是具有細胞核靶向的四唑香豆素和vdu光點擊反應后的熒光和吸收圖；從圖4a中可以看出光照后450nm處熒光明顯增強，圖4b中光照后330nm處吸收降低395nm處吸收增強，表明產(chǎn)物生成。

光點擊反應符合準一階反應，在vdu相同濃度，四唑化合物不同濃度的條件下用350nm紫外燈照射不同的時間，然后用高效液相色譜(hplc)分析生成產(chǎn)物的濃度及產(chǎn)率，實驗結果如表2所示，表2表示反應產(chǎn)物和時間的關系，從表2中可以看出隨著光照時間的增加生成的產(chǎn)物不斷增加，并且香豆素四唑濃度大的組產(chǎn)物生成的速度比濃度小的組要快。數(shù)據(jù)分析如圖5所示，圖5是表中的數(shù)據(jù)分析后線性擬合的結果，通過公式計算光點擊反應速率為k(5.0equiv.)＝14.8m^-1s^-1；k(10equiv.)＝19.8m^-1s^-1，相比反電子需求的diels-alde的vdu和四唑化合物連接反應的速率(0.02m^-1s^-1)明顯增加。

擬合的線性部分的結果：kobserved，5.0eq＝3.71205e-4；kobserved,10eq＝9.89344e-4.

根據(jù)公式計算的反應速度是:k(5.0equiv.)＝14.8m^-1s^-1；k(10equiv.)＝19.8m^-1s^-1.

實驗結果表明本文中光點擊速率最快可達到20m^-1s^-1，表明可以通過光點擊反應可以快速的代謝標記細胞內的dna，這種光誘導的生物正交反應區(qū)別于其他正交反應的優(yōu)勢是可以快速追蹤細胞內dna或rna的合成和轉錄過程。

表2光點擊反應速率條件

實施例5細胞內代謝標記dna

(一)活細胞內的核酸代謝標記

將a549細胞傳代到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁后，實驗組加入30μm的vdu，對照組加入同樣體積的pbs(ph7.4)培養(yǎng)16小時，然后換成新的dmem培養(yǎng)液孵育4小時后都加入10μm的香豆素四唑ctz-so3(實施例1制得)孵育4小時，然后加入新的dmem細胞培養(yǎng)液孵育2小時后，分別用350nm紫外光(uv)照射10分鐘后，激光共聚焦顯微鏡成像。

(二)固定細胞內的核酸代謝標記

將a549細胞傳代到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁后，實驗組加入30μm的vdu，對照組加入同樣體積的pbs(ph7.4)培養(yǎng)16小時，然后換成新的dmem培養(yǎng)液孵育4小時，棄掉培養(yǎng)液，用3.7％(v/v)多聚甲醛溶液固定細胞10分鐘后用0.2％(v/v)tritonx-100通透細胞，然后分別加入10μm的香豆素四唑ctz-so3避光孵育2小時，用350nm紫外燈照射10分鐘，用激光共聚焦顯微鏡成像。

實驗結果如實驗圖6所示，從圖中可以看出活細胞中加vdu孵育的實驗組產(chǎn)生明顯的熒光信號，沒有加vdu孵育的對照組中的熒光非常微弱。固定細胞中加vdu孵育的實驗組產(chǎn)生明顯的熒光信號，活細胞標記和固定細胞標記結果無明顯差別，并且重要的是在活細胞標記dna實驗過程是在免洗的條件下，不需要使dna變性。該實驗結果表明我們成功的在活細胞中基于光點擊反應熒光響應的標記細胞dna。

實施例6探針具有細胞核靶向性

香豆素四唑ctz-so3具有細胞核靶向性的驗證：

將a549細胞傳代到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)貼壁后，實驗組加入100μm的香豆素四唑ctz-so3，對照組加入100μm的香豆素四唑ctz-el(實施例1制得)，孵育過夜，再加入新的培養(yǎng)液孵育2h后，分別用350nm紫外光照射10分鐘后，激光共聚焦顯微鏡成像。實驗結果如圖7所示，從圖中可以看出實驗組熒光部位主要集中在細胞核，而加入ctz-el的對照組的熒光部位主要集中在細胞質，該實驗結果表明帶陰離子的香豆素四唑ctz-so3具有良好的細胞核靶向性。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。