本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更特別地，涉及一種可抑制nf-κb蛋白活化的多肽及其dna編碼片段，還涉及一種用于檢測(cè)sorf的dna構(gòu)建體系統(tǒng)及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

小開放性閱讀框(sorfs)是一類廣泛存在于各種生物細(xì)胞中具有編碼潛能的核酸序列，且在多種生物組織中具有高度的保守性，因此推測(cè)該類序列編碼產(chǎn)物具有重要的生物學(xué)功能。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，人們?cè)诓煌锝M織中發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的sorfs，并且部分sorfs編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能也逐步被揭示。2003年，guo團(tuán)隊(duì)在研究阿爾茲海默病時(shí)證實(shí)了一條由24個(gè)氨基酸組成的多肽(humannin)具有神經(jīng)保護(hù)性作用；2007年，galindo團(tuán)隊(duì)在果蠅體內(nèi)證實(shí)一段11個(gè)氨基酸的多肽能促進(jìn)上皮細(xì)胞分化；2010年，maki團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌體內(nèi)證實(shí)一段由sorf編碼的43個(gè)氨基酸的短肽能影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，由于這些短肽的分子量小，且易受到體內(nèi)大分子蛋白的干擾，致使常規(guī)方法檢測(cè)短肽表達(dá)困難，其生物學(xué)功能的研究進(jìn)展緩慢。

近年來(lái)，有研究者對(duì)短肽檢測(cè)及其生物學(xué)功能研究的方法進(jìn)行探索。2016年，shelley團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種t細(xì)胞翻譯示蹤方法，即運(yùn)用免疫反應(yīng)抗原呈遞的方法間接證明sorf在體內(nèi)可以編碼產(chǎn)物。該方法利用已知的t細(xì)胞表面抗原肽活化t細(xì)胞，然后將該抗原肽的dna序列與sorf的編碼序列構(gòu)建至載體，并將轉(zhuǎn)染該表達(dá)載體的細(xì)胞與活化的t細(xì)胞共孵育，最終通過(guò)復(fù)雜的化學(xué)顯色反應(yīng)，證實(shí)sorf在體內(nèi)能夠表達(dá)。該方法雖具有一定的可行性，但是由于實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性及示蹤肽設(shè)計(jì)的困難，限制了其廣泛應(yīng)用。

nf-κb是一種轉(zhuǎn)錄因子，nf-κb調(diào)控的熒光素酶表達(dá)載體是本領(lǐng)域常用的熒光素酶表達(dá)載體。2000年，michael團(tuán)隊(duì)闡明nf-κb的活化需要ikkα/β與nemo形成κb激酶復(fù)合體，并且證實(shí)了ikkα/β與nemo相互結(jié)合的核心區(qū)域(nbd)，合成nbd多肽能抑制nf-κb活性。nf-κb作為生物體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，能夠被多種炎癥因子所活化，從而上調(diào)多種基因的表達(dá)。正常生理情況下，nf-κb在機(jī)體內(nèi)始終保持一定活性和較高的豐度。

因此，為了促進(jìn)生物體內(nèi)活性小肽的研究，我們需要設(shè)計(jì)一種基于報(bào)告基因系統(tǒng)的方法，用來(lái)檢測(cè)sorf編碼多肽表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，nf-κb蛋白活化必須使ikkα/β與nemo形成κb激酶復(fù)合體，并且其結(jié)合的核心氨基酸序列為taldwswlqte(seqidno:1)，其對(duì)應(yīng)的dna序列為5’-acggccctagactggagctggttacagacggaa-3’(seqidno:2)。

基于以上研究，本發(fā)明提供了一種可抑制nf-κb蛋白活化的多肽，其包含如seqidno:1所示的氨基酸序列。

本發(fā)明還提供了上述可抑制nf-κb蛋白活化的多肽的dna編碼片段，其包含如seqidno:2所示核苷酸序列或其同義突變體序列。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)sorf的dna構(gòu)建體系統(tǒng)，其包括nf-κb抑制多肽表達(dá)構(gòu)建體和nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)載體；

所述nf-κb抑制多肽表達(dá)構(gòu)建體包含啟動(dòng)子和連接于所述啟動(dòng)子下游的上述dna編碼片段并且所述dna編碼片段的3’末端連接有終止密碼子；

所述nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)構(gòu)建體包含nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)框。

優(yōu)選地，所述nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)載體含有nf-κb調(diào)控的熒光素酶i表達(dá)框，并且dna構(gòu)建體系統(tǒng)還包括對(duì)照?qǐng)?bào)告基因表達(dá)載體，所述對(duì)照?qǐng)?bào)告基因表達(dá)載體包含不受nf-κb調(diào)控的熒光素酶ii表達(dá)框，并且熒光素酶i和熒光酶ii激發(fā)產(chǎn)生的熒光波長(zhǎng)不同。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)序列中是否有sorf的方法，其包括以下步驟：

s1：將待檢測(cè)序列插入權(quán)利要求3或4所述的dna構(gòu)建體系統(tǒng)中nf-κb抑制多肽表達(dá)構(gòu)建體上，所述待檢測(cè)序列連接于所述dna編碼片段的5’末端，并且保證從所述待檢測(cè)序列的第一個(gè)atg開始至所述dna編碼片段之間的核苷酸個(gè)數(shù)為3的倍數(shù)；

s2：將s1得到的含有所述待檢測(cè)序列的nf-κb抑制多肽表達(dá)構(gòu)建體和所述nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入于同一個(gè)表達(dá)宿主中；

s3：檢測(cè)所述nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)框所表達(dá)的報(bào)告基因的強(qiáng)度，如果nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度顯著降低，則指示所述待檢測(cè)序列中的sorf被表達(dá),如果nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度沒(méi)有顯著變化，則指示所述待檢測(cè)序列中的sorf未被表達(dá)。

優(yōu)選地，所述nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)載體含有nf-κb調(diào)控的熒光素酶i表達(dá)框，并且dna構(gòu)建體系統(tǒng)還包括對(duì)照?qǐng)?bào)告基因表達(dá)載體，所述對(duì)照?qǐng)?bào)告基因表達(dá)載體包含不受nf-κb調(diào)控的熒光素酶ii表達(dá)框，并且熒光素酶i和熒光酶ii激發(fā)產(chǎn)生的熒光波長(zhǎng)不同。

優(yōu)選地，待檢測(cè)序列的nf-κb抑制多肽表達(dá)構(gòu)建體通過(guò)將所述待檢測(cè)序列連接于所述編碼dna片段的5’末端，并插入至質(zhì)粒pcmv-3tag-1a的xhoi與hindiii位點(diǎn)之間得到，所述nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)載體為pnf-κbluc，并且對(duì)照?qǐng)?bào)告基因表達(dá)載體為phrl-tk。

優(yōu)選地，s1具體包括：

s11：將所述細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁，并恢復(fù)形態(tài)；

s12：將所述nf-κb抑制多肽表達(dá)構(gòu)建體、所述nf-κb調(diào)控的報(bào)告基因表達(dá)載體和對(duì)照?qǐng)?bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

優(yōu)選地，s2具體包括：

s21：轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時(shí)，洗滌細(xì)胞；

s22：分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的熒光素酶i和熒光素酶ii的活性；

s23：根據(jù)熒光素酶ii活性歸一化熒光素酶i活性得到的值判斷所述待檢測(cè)序列中sorf是否表達(dá)，如果所述值顯著降低，則指示所述待檢測(cè)序列中的sorf被,如果所述值沒(méi)有顯著變化，則指示所述待檢測(cè)序列中的sorf未被表達(dá)。

通過(guò)使用本發(fā)明的多肽、dna片段、dna構(gòu)建體系統(tǒng)和方法，首次以簡(jiǎn)單可靠的方式實(shí)現(xiàn)了利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)sorfs體內(nèi)表達(dá)的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為xhoi與hindiii對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳照片；

圖2為分別轉(zhuǎn)染有pcmv-3tag-1a空載體和pcmv-sorfx-nbd的293t細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性(nf-κb的熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值)的統(tǒng)計(jì)圖；

圖3為分別轉(zhuǎn)染有pcmv-3tag-1a空載體和pcmv-sorf1-nbd的pc-3細(xì)胞中的相對(duì)熒光素酶活性(nf-κb的熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值)的統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.構(gòu)建可抑制nf-κb蛋白活化的多肽的dna編碼片段與待檢測(cè)序列的融合片段

發(fā)明人通過(guò)研究分析，發(fā)現(xiàn)一種可抑制nf-κb蛋白活化的多肽，其序列為taldwswlqte(seqidno:1)，對(duì)應(yīng)的dna編碼序列為5’-acggccctagactggagctggttacagacggaa-3’(seqidno:2)，該dna序列僅為實(shí)例之一，其同義突變體也具有與其同等的效力和用途。

設(shè)計(jì)合成待檢測(cè)的sorf引物時(shí)，將nf-κb抑制肽編碼序列及終止密碼子(tga)直接合成在下游引物的5’端，且在pcr產(chǎn)物末端加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，本例在5’端加入帶保護(hù)堿基的hindⅲ酶切位點(diǎn)(cccaagctt)，在3’端加入帶保護(hù)堿基的xhoⅰ酶切位點(diǎn)(gccgctcgag)。pcr反應(yīng)得到包含待檢測(cè)sorf及nbd的dna序列(包含xhoⅰ酶切位點(diǎn)和hindiii酶切位點(diǎn))如seqidno:3(下文中稱為sorf1-nbd)，經(jīng)xhoⅰ和hindiii雙酶切即可得到包含這兩種酶粘性末端的產(chǎn)物。上述引物序列由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。

2.將sorf1-nbd插入熒光素酶表達(dá)載體

選用的表達(dá)載體為pcmv-3tag-1a，用內(nèi)切酶xhoi和hindiii(購(gòu)自takara公司，xhoi貨號(hào)為1635，hindiii貨號(hào)為1615)對(duì)上述pcmv-3tag-1a空載體和之前得到的pcr產(chǎn)物分別進(jìn)行雙酶切，20μl酶切體系如下：10xquickcutgreenbuffer2μl，kpni1μl，hindiii1μl，pcmv-3tag-1a空載體/sorf1-nbd1μg，余下為ddh2o。

充分混勻后，37℃酶切反應(yīng)90分鐘，用2％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒雙酶切后的情況，然后切膠回收(dna膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，貨號(hào)為dp209)，回收結(jié)束后測(cè)樣品濃度，置冰上備用。

將酶切后的sorf1-nbd和pcmv-3tag-1a進(jìn)行連接。10μl連接體系如下：dna連接酶(購(gòu)自takara公司，貨號(hào)為6022)5μl，分別經(jīng)雙酶切的sorf1-nbd與pcmv-3tag-1a載體共5μl。為促進(jìn)酶連成功率，將dna片段與載體的摩爾比控制在8:1左右。充分混勻后，將酶連體系置于pcr儀中，16℃反應(yīng)1小時(shí)，連接反應(yīng)結(jié)束后得到重組質(zhì)粒，置于冰上備用。

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。按照經(jīng)典的熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體方法如下：從-80℃冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞dh5α置于冰上解凍2-3分鐘，加入上述連接好的重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰上孵育20分鐘后42℃熱激60秒，迅速放至冰上靜置2分鐘，然后加入450μl不含抗生素的無(wú)菌lb液體培養(yǎng)基，放置于恒溫?fù)u床中復(fù)蘇1小時(shí)，復(fù)蘇條件為37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘。取復(fù)蘇后的菌液100μl均勻涂布于直徑為3.5厘米含卡那霉素的lb固體選擇培養(yǎng)基中。吸收10分鐘后，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜。次日挑取單菌落至5-7ml含卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，200轉(zhuǎn)/分鐘，搖菌繁殖12小時(shí)后提取質(zhì)粒，2％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

用內(nèi)切酶xhoi和hindiii(購(gòu)自takara公司，kpni貨號(hào)為1618，hindiii貨號(hào)為1615)對(duì)上述提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，本發(fā)明實(shí)施例雙酶切鑒定如圖1所示(泳道4為marker，泳道1-3顯示為pcmv-sorf2-nbd陽(yáng)性克隆，泳道5-7顯示為pcmv-sorf1-nbd陽(yáng)性克隆)。陽(yáng)性組送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，確認(rèn)dna片段已整合至pcmv-3tag-1a載體上。至此，含有待檢測(cè)序列和nf-κb抑制肽(nbd)的pcmv-3tag-1a表達(dá)載體(以下均表示為pcmv-sorf1-nbd)構(gòu)建成功。

3.pcmv-sorf1-nbd轉(zhuǎn)染細(xì)胞

本發(fā)明實(shí)施例采用人腎上皮細(xì)胞系293t、人前列腺癌細(xì)胞系pc-3細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。分別將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞均勻種植在24孔板內(nèi)，每孔5-10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，用10％胎牛血清，高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞貼壁并恢復(fù)形態(tài)后，將報(bào)告基因系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中(轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度約為60-80％為宜)。使用的轉(zhuǎn)染試劑為neofect(購(gòu)自零客創(chuàng)智生物科技有限公司，貨號(hào)為tf20121201)。50μl轉(zhuǎn)染體系如下：質(zhì)粒0.5μg，neofect轉(zhuǎn)染試劑0.5μl，余下為無(wú)血清培養(yǎng)基。

本實(shí)驗(yàn)中使用的質(zhì)粒分別為：pgl3-basic空載體、pnf-κbluc(含有nf-κb的熒光素酶報(bào)告基因載體)、phrl-tk(攜帶海腎熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒)，pcmv-3tag-1a空載體(均購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司)，以及上述構(gòu)建的pcmv-sorf1-nbd表達(dá)載體。

4.nf-κb活性抑制率的計(jì)算

轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞培養(yǎng)24-36小時(shí)后，棄培養(yǎng)基上清，用1xpbs清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，清洗細(xì)胞時(shí)注意操作輕柔，避免正面吹打細(xì)胞。

采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自蓋寧生物科技有新公司，貨號(hào)為gn201-01)進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果如圖2和3所示，在轉(zhuǎn)染有pnf-κb-luc的細(xì)胞中，其相對(duì)熒光素酶活性為10-14左右，而轉(zhuǎn)染有pcmv-sorf-nbd的細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性僅為2左右，顯著低于前者，因此，待檢測(cè)序列sorf能表達(dá)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

<120>一種可抑制nf-κb蛋白活化的多肽以及檢測(cè)sorf的方法

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

thralaleuasptrpsertrpleuglnthrglu

1510

<210>2

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

acggccctagactggagctggttacagacggaa33

<210>3

<211>154

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cccaagcttatgccgacgcacggattcgaggcggggagcatgggaagaagcggccaggag60

tatgacctgatcattgcgaccaccgctaggggaagggaggagagggtgacggccctagac120

tggagctggttacagacggaatgactcgaggccg154