本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種棕櫚酰化七肽、及其在抗腫瘤制劑、化妝品或食品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)統(tǒng)計(jì)，全世界有3/5的人死于癌癥、糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系統(tǒng)疾病這4大類疾病，而癌癥則是最主要的死因之一。2008年全球死于癌癥的患者達(dá)760萬人，占全球死亡人數(shù)的13％，其中超過70％的癌癥死亡案例發(fā)生在中低收入國家，預(yù)測至2030年，全球?qū)⒂谐^110萬人死于癌癥。目前，對于癌癥的治療，藥物治療仍然是重要手段之一。因此，研究開發(fā)具有抗腫瘤活性的物質(zhì)或制劑也一直是本領(lǐng)域技術(shù)人員的研究熱點(diǎn)之一。

小分子肽是一類具有高活性的肽類物質(zhì)，小分子肽可以以完整的形式被機(jī)體吸收；主動吸收、低耗或不需消耗能量的特點(diǎn)；能夠直接進(jìn)入血液循環(huán)并送到人體各個部位，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。由于具有親水性，蛋白質(zhì)通常難以跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，提高其膜滲透性改善其細(xì)胞內(nèi)化率是重要的科學(xué)問題。通過對小分子肽進(jìn)行修飾使其性能得以改善，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員的研究方向之一。而開發(fā)具備抗腫瘤活性的小分子肽更是備受關(guān)注。

棕櫚?；堑鞍踪|(zhì)翻譯后脂質(zhì)修飾的重要形式之一，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝、凋亡、疾病的發(fā)生、發(fā)展等過程中都起著重要的作用。根據(jù)連接方式不同，棕櫚?；煞譃閚型(棕櫚酸鹽通過酰胺鍵連接到gly/cys殘基上)和s型(棕櫚酸鹽通過硫酯鍵共價(jià)修飾到cys的巰基上)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種經(jīng)棕櫚酰化的七肽(palm-eyfdala)，本發(fā)明的棕櫚酰化七肽相比于未經(jīng)棕櫚?；钠唠木哂忻黠@增強(qiáng)的抗腫瘤活性，而且具有很好的抗氧化活性，可應(yīng)用于生物制藥和化妝品領(lǐng)域。

本發(fā)明提供的棕櫚?；唠模s寫為palm-eyfdala，分子量1066.34da，序列為palm-glu-tyr-phe-asp-ala-leu-ala，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

其中，前文序列中的palm表示英文名稱為palmitoyl，中文名稱為棕櫚?；?；glu表示英文名稱為glutamicacid，中文名稱為谷氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；tyr表示英文名稱為tyrosine，中文名稱為酪氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；phe表示英文名稱為phenylalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；asp表示英文名稱為asparticacid，中文名稱為天冬氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；ala表示英文名稱為alanine，中文名稱為丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基；leu表示英文名稱為leucine，中文名稱為亮氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。

本發(fā)明還提供上文所述的棕櫚?；唠牡募兓椒ǎ赏ㄟ^該方法來純化通過多肽固相合成的棕櫚?；唠?，從而獲得純度大于95％的多肽。該方法包括如下步驟：

將待純化的棕櫚?；唠纳蠘又辽V柱；

以流動相a和流動相b為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，其中流動相a為含有0.08～0.12％三氟乙酸的乙腈溶液，流動相b為含有0.08～0.12％三氟乙酸的水；梯度洗脫程序?yàn)椋毫鲃酉郺的初始體積比例為22～28％，在上樣后的第0.01min到第25min內(nèi)，流動相a的體積比例上升到62～67％，在第25min到第25.1min內(nèi)，流動相a的體積比例上升為100％，保持100％運(yùn)行至第30min停止，檢測波長為220nm；收集目標(biāo)峰的多肽溶液。

進(jìn)一步的，所述色譜柱為c18色譜柱。

優(yōu)選的，流動相a為含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，流動相b為含有0.1％三氟乙酸的水；和/或，梯度洗脫過程中，流動相a的初始體積比例為25％，在上樣后的第0.01min到第25min內(nèi)，流動相a的體積比例上升到64％。

本發(fā)明提供的棕櫚酰化七肽還可在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述棕櫚?；唠目稍谥苽鋸V譜抗腫瘤藥物中應(yīng)用。所述腫瘤包括肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌。

進(jìn)一步的，所述棕櫚?；唠膶epg2、a549、sgc-7901、mcf-7、ht-29的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到70％以上。

本發(fā)明提供的棕櫚?；唠倪€可應(yīng)用于化妝品或食品中。所述棕櫚?；唠淖鳛榭寡趸钚猿煞趾?或抗衰老活性成分應(yīng)用于化妝品或食品中。

本發(fā)明還提供一種組合物，所述組合物中含有如權(quán)利要求1所述的棕櫚酰化七肽。進(jìn)一步的，所述組合物可為抗腫瘤藥物、化妝品或食品。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的經(jīng)棕櫚?；钠唠模c修飾前的七肽相比，抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)，且表現(xiàn)出廣譜抗癌活性。對hepg2、a549、sgc-7901、mcf-7、ht-29等癌細(xì)胞的增殖抑制作用均超過70％。另外，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的七肽還具有較強(qiáng)的abts自由基清除活性。

本發(fā)明提供的經(jīng)棕櫚?；目鼓[瘤七肽可應(yīng)用于抗腫瘤藥物的制備，更進(jìn)一步的，可以應(yīng)用于廣譜抗腫瘤藥物的制備。所述腫瘤包括但不限于肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等。本發(fā)明提供的經(jīng)棕櫚?；目鼓[瘤七肽還可作為抗氧化活性成分和/或抗衰老活性成分應(yīng)用于化妝品中，即，可以用于制備抗氧化功能和/或抗皮膚衰老功能的化妝品。

附圖說明

圖1為棕櫚?；唠?palm-eyfdala)的純度鑒定hplc圖。

圖2為棕櫚?；唠?palm-eyfdala)的esi-ms圖譜。其中橫坐標(biāo)為m/z(質(zhì)荷比值)、縱坐標(biāo)為intensity(信號強(qiáng)度)。

圖3為七肽(eyfdala)與棕櫚酰化七肽(palm-eyfdala)抗腫瘤活性比較圖。其中橫坐標(biāo)為測試樣品、縱坐標(biāo)為腫瘤抑制率。

圖4為棕櫚?；唠牡目寡趸钚詧D。其中，a為棕櫚?；唠脑?-40min范圍內(nèi)對abts自由基清除活性的動力學(xué)過程；b為不同濃度的棕櫚酰化七肽在反應(yīng)40min時(shí)測得的abts自由基清除活性。注：小寫字母a-c表示不同峰之間的顯著性差異，按照字母表的順利由大到小排列，相鄰字母間p＜0.05，差異顯著。

圖5為棕櫚酰化七肽對黑色素瘤細(xì)胞a375的增殖抑制活性評價(jià)，在化妝品中應(yīng)用廣泛的五勝肽matrixyl為陽性對照。注：a-c表示不同峰之間的顯著性差異，按照字母表的順利由大到小排列，相鄰字母間p＜0.05，差異顯著。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于此。以下實(shí)施例中所用細(xì)胞或試劑若未特別說明，均為商業(yè)渠道購買獲得。下文實(shí)施例中所述七肽均為eyfdala，棕櫚?；唠木鶠閜alm-eyfdala。

通過多肽固相合成法合成palm-eyfdala，采用本領(lǐng)域常規(guī)多肽固相合成方法，具體可以通過商業(yè)生物合成公司來完成該多肽的合成。氨基酸序列采用本領(lǐng)域常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)fmoc方案，下面對多肽固相合成進(jìn)行介紹以供參考。

多肽固相合成：選用二氯三苯甲基樹脂(上海杰肽生物科技有限公司)，按照氨基酸序列g(shù)lu-tyr-phe-asp-ala-leu-ala的特征，先將ala的羧基以共價(jià)鍵的形式與一個樹脂相連，然后ala的氨基和leu的羧基縮水反應(yīng)，處理后，再添加ala，leu的氨基和ala的羧基反應(yīng)，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個glu氨基酸后，再切除樹脂即得到七肽eyfdala。氨基酸鏈合成完畢后，將活化好的棕櫚酸在苯并三氮唑-n，n，n′，n′-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)的催化下與肽鏈n端氨基反應(yīng)，使用比例根據(jù)前面氨基酸的整體酸堿性更改。整個過程把棕櫚酸當(dāng)做一個氨基酸來參與正常反應(yīng)，后面不再鏈接氨基酸，同時(shí)不需要洗脫步驟的脫fmoc。

棕櫚酰化七肽的純化：

采用高效液相色譜純化通過多肽固相合成得到最后的產(chǎn)品，純化過程使用kromasilc18-5(4.6*250mm)色譜柱，流速為1.0ml/min。液相系統(tǒng)使用兩個通道，溶劑a(流動相a)：含有0.1％(體積)三氟乙酸的乙腈；溶劑b(流動相b)：含有0.1％(體積)三氟乙酸的水。梯度洗脫如下：a+b的體積百分比之和為100％，a初始比例為25％，在0.01min到25min內(nèi)，a的比例上升到64％，在25min到25.1min內(nèi)，a的比例上升為100％，保持100％運(yùn)行至30min停止，檢測波長220nm。收集多肽溶液，液氮速冷，然后凍干。得到純度95％以上的產(chǎn)品，純度鑒定hplc結(jié)果見圖1，并經(jīng)esi-ms鑒定結(jié)構(gòu)(如圖2所示)。經(jīng)鑒定，多肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

對棕櫚酰化前的七肽eyfdala和棕櫚?；蟮钠唠膒alm-eyfdala進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如下表1所示：

表1七肽及其棕櫚?；苌锏亩壗Y(jié)構(gòu)分析

注：小寫字母a-b表示同一樣品不同二級結(jié)構(gòu)含量之間的顯者性差異，按照字母表的順利由大到小排列，相鄰字母間p＜0.05，差異顯著。

由結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可見，經(jīng)過棕櫚酰化后，d-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)顯著增加(p＜0.05)，β-折疊比例顯著降低(p＜0.05)。

多肽對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

hepg2、a549、sgc-7901、mcf-7、ht-29等癌細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中，完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基高糖dmem，10％胎牛血清(v/v)，以及1％雙抗(由青霉素和鏈霉素組成，v/v)組成。用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來，離心，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為100μg/ml的七肽和棕櫚酰化七肽溶液，每孔加入200μl樣品溶液(正常對照組，則用完全培養(yǎng)基替代；陽性對照組，用5-氟尿嘧啶替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測細(xì)胞存活率。

多肽的抗氧化活性評價(jià)

abts自由基清除活性測定：用pbs(ph7.4)配置5mmol/l的abts溶液，加入過量的mno2制備自由基，30℃放置12h，隨后在4500r/min條件下離心10min，收集上層清液，用0.2μm尼龍膜過濾。置于-20℃?zhèn)溆茫鳛閍bts⁺儲備液。用于測試前，需用pbs溶液將abts⁺儲備液稀釋至所需濃度。

采用96孔板測定abts自由基的清除活性：加入20μl水+180μlabts溶液，進(jìn)行全波掃描，掃描確定最大吸收波長為736nm(酶標(biāo)儀程序：振蕩30s，測定波長范圍500-800nm)。測試樣品的abts自由基清除活性時(shí)，調(diào)節(jié)體系吸光度值至0.70±0.02得到工作液。樣品的測定：加入20μl不同濃度的樣品(1-100μg/ml)和180μlabts工作液，每5min采集一次數(shù)據(jù)，一共反應(yīng)40min。樣品的吸光度值記為a樣品，模型組的吸光度值(20μl蒸餾水+180μlabts工作液)記為a模型，設(shè)定空白組，吸光度值記為a空白。

根據(jù)下式計(jì)算abts自由基清除率：abts自由基清除率＝(a模型-a樣品)/(a模型-a空白)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖4。結(jié)果表明：本發(fā)明的棕櫚酰化七肽與修飾前的七肽相比，abts自由基清除活性雖然稍有降低，但是其自由基半數(shù)清除率仍小于50μg/ml，即，棕櫚?；唠娜跃邆漭^強(qiáng)的abts自由基清除活性。且該反應(yīng)中液體發(fā)生了由綠色到紫色的轉(zhuǎn)變，反應(yīng)完畢后體系終點(diǎn)顏色為紫色，即可能發(fā)生了某種絡(luò)合反應(yīng)，并可進(jìn)行合理預(yù)測，體系中的自由基可能完全清除，或已經(jīng)完全絡(luò)合，反應(yīng)終點(diǎn)的吸光度值由產(chǎn)物的顏色干擾導(dǎo)致，該反應(yīng)機(jī)理值得進(jìn)一步探究。

實(shí)施例1

取肝癌細(xì)胞hepg2一瓶，用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來，離心，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為100μg/ml的七肽和棕櫚酰化七肽溶液，每孔加入200μl樣品溶液(正常對照組，則用完全培養(yǎng)基替代；陽性對照組，用5-氟尿嘧啶替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測細(xì)胞存活率。

實(shí)施例2

取肺癌細(xì)胞a549一瓶，用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來，離心，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為100μg/ml的七肽和棕櫚?；唠娜芤?，每孔加入200μl樣品溶液(正常對照組，則用完全培養(yǎng)基替代；陽性對照組，用5-氟尿嘧啶替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測細(xì)胞存活率。

實(shí)施例3

取胃癌細(xì)胞sgc-7901一瓶，用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來，離心，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為100μg/ml的七肽和棕櫚酰化七肽溶液，每孔加入200μl樣品溶液(正常對照組，則用完全培養(yǎng)基替代；陽性對照組，用5-氟尿嘧啶替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測細(xì)胞存活率。

實(shí)施例4

取乳腺癌細(xì)胞mcf-7一瓶，用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來，離心，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為100μg/ml的七肽和棕櫚酰化七肽溶液，每孔加入200μl樣品溶液(正常對照組，則用完全培養(yǎng)基替代；陽性對照組，用5-氟尿嘧啶替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測細(xì)胞存活率。

實(shí)施例5

取結(jié)腸癌細(xì)胞ht-29一瓶，用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來，離心，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為100μg/ml的七肽和棕櫚?；唠娜芤海靠准尤?00μl樣品溶液(正常對照組，則用完全培養(yǎng)基替代；陽性對照組，用5-氟尿嘧啶替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測細(xì)胞存活率。

實(shí)施例1-5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖3，從圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，經(jīng)過棕櫚酰化修飾之后，本發(fā)明的棕櫚?；唠牡目鼓[瘤活性顯著增強(qiáng)，且表現(xiàn)出廣譜抗癌活性。對hepg2、a549、sgc-7901、mcf-7、ht-29等癌細(xì)胞的增殖抑制作用均超過70％。

實(shí)施例6

取黑色素瘤細(xì)胞a375一瓶，用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來，離心，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為50μg/ml的陽性對照五勝肽(matrixyl，palm-kttks)和棕櫚?；唠娜芤?，每孔加入200μl樣品溶液(正常對照組，則用完全培養(yǎng)基替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見圖5，結(jié)果表明，同樣都是棕櫚酰化多肽，棕櫚酰化七肽對人黑色素瘤a375細(xì)胞的抑制作用顯著強(qiáng)于五勝肽。由于皮膚癌變也是皮膚老化的一種形式，從而說明，棕櫚?；唠木邆湓诳顾ダ匣瘖y品中應(yīng)用的潛力。

實(shí)施例7

取人表皮永生化細(xì)胞hacat一瓶，用含有0.25％edta的胰酶將其消化下來，離心，用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，配成濃度為5×10⁴cells/ml細(xì)胞懸液，取96孔板一塊，每孔100μl，即每孔5000個細(xì)胞。在37℃、co2體積分?jǐn)?shù)為5％的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。同時(shí)，分別配制濃度為100μg/ml的陽性對照五勝肽(matrixyl，palm-kttks)和棕櫚?；唠娜芤?，每孔加入200μl樣品溶液(正常對照組，則用完全培養(yǎng)基替代)，孵育48h，吸棄樣品，用pbs洗1遍后，采用mtt法檢測細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2所示。

表2棕櫚?；唠膶acat存活率的影響

注：小寫字母a-c表示不同樣品細(xì)胞存活率之間的顯著性差異，按照字母表的順利由大到小排列，相鄰字母間p＜0.05，差異顯著。

本實(shí)驗(yàn)測試了棕櫚?；唠膶θ吮砥び郎?xì)胞(hacat)存活率的影響，以五勝肽作為陽性對照，結(jié)果表明，棕櫚?；唠膶acat的毒性顯著弱于陽性對照五勝肽，棕櫚酰化七肽具備在化妝品中應(yīng)用的潛力。

綜上可見，本發(fā)明提供的經(jīng)棕櫚?；揎椀目鼓[瘤七肽，與修飾前的七肽相比，抗腫瘤活性顯著增強(qiáng)，且表現(xiàn)出廣譜抗癌活性。對hepg2、a549、sgc-7901、mcf-7、ht-29等癌細(xì)胞的增殖抑制作用均超過70％。另外，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的七肽還具有較強(qiáng)的abts自由基清除活性，同時(shí)在抗衰老化妝品中具有應(yīng)用潛力。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，故凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。