本發(fā)明涉及抗菌肽mytichitin-a首次通過基因工程的方法成功表達(dá)于畢赤酵母中且具有較強(qiáng)抑菌活性，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

抗菌肽是在誘導(dǎo)條件下，由機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生的用于對抗外源性致病菌的一種活性多肽。近些年，對抗菌肽的研究越來越多，不僅僅因?yàn)槠湓跉缂?xì)菌和真菌、抗病毒、抗腫瘤等多方面的作用，更因?yàn)槠湓谌梭w內(nèi)易消化、無毒副作用、熱穩(wěn)定性好、無藥物殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其被世界公認(rèn)為最具潛力的抗生素和食品防腐保鮮劑替代品，具備巨大的開發(fā)潛力。mytichitin-a是從厚殼貽貝(mytiluscoruscus)的血清中分離純化得到，是一種十分典型的陽離子抗菌肽，由55個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為6261.55da，包含三對二硫鍵，同源的抗菌肽結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，其序列中第17到第55個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成了幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽mytichitin-a對革蘭氏陽性菌有明顯的抑菌活性，特別是對金黃色葡萄球菌極其敏感。這使得mytichitin-a在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥上都具有巨大應(yīng)用潛力。

畢赤酵母(pichiapastoris)作為一種新的酵母表達(dá)系統(tǒng)被人們發(fā)現(xiàn)。由于畢赤酵母與釀酒酵母的分子及遺傳操作方式相似，并且畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的水平比釀酒酵母高出好多倍，這使得畢赤酵母成為目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)。這個(gè)新的表達(dá)系統(tǒng)有很多優(yōu)點(diǎn)1、產(chǎn)生的蛋白來源于自身的非常少，且培養(yǎng)畢赤酵母的培養(yǎng)基只含有少量的蛋白，這使得分泌的外源蛋白成為酵母培養(yǎng)液中蛋白的主要組成部分，可作為蛋白純化的第一步。2、畢赤酵母擁有可嚴(yán)格調(diào)控的乙醇氧化酶基因啟動(dòng)子，這是目前啟動(dòng)能力最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一，能夠以甲醇作為唯一碳源，驅(qū)動(dòng)外源基因在畢赤酵母中表達(dá)。3、整合到畢赤酵母基因組上的外源基因，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，可穩(wěn)定遺傳。4、ph適應(yīng)范圍廣，可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph值來抑制蛋白水解酶的活性，從而降低蛋白酶對目的蛋白的水解。

以畢赤酵母為表達(dá)載體，利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，首次獲得了抗菌肽mytichitin-a的高表達(dá)菌株，并經(jīng)抑菌試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，確定其對致病菌金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑菌作用。經(jīng)檢索本發(fā)明在國內(nèi)外未見公開報(bào)道，在國內(nèi)外未見公開使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種新型重組抗菌肽mytichitin-a在畢赤酵母中高效制備的方法。技術(shù)方案概述如下：以畢赤酵母為宿主細(xì)胞，將新型抗菌肽mytichitin-a的基因序列插入到ppiczαa載體，并成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母gs115中，利用甲醇就行誘導(dǎo)表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化及活性鑒定。終產(chǎn)品是新型重組抗菌肽mytichitin-a的高表達(dá)菌株，發(fā)酵液上清中抗菌肽產(chǎn)量達(dá)45.5μg/ml。所制備重組抗菌肽對多種病原菌均具有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果格外突出。

本發(fā)明的另一目的是提供一種新型重組抗菌肽mytichitin-a，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供一種包含上述重組抗菌肽mytichitin-a的克隆載體、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。

更進(jìn)一步地，所述克隆載體為puc19，所述表達(dá)載體為ppiczαa，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母gs115。

所述新型重組抗菌肽mytichitin-a在畢赤酵母中高效制備的方法，具體包括如下步驟：

(1)按照seqidno：2合成抗菌肽mytichitin-a目的基因并插入到載體puc19，獲得重組質(zhì)粒puc-mytichitin-a，采用表達(dá)載體ppiczαa以及ecori和kpni兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒ppiczα-mytichitin-a；

(2)通過電轉(zhuǎn)化的方法，將saci酶線性化的重組質(zhì)粒ppiczαa-mytichitin-a轉(zhuǎn)入畢赤酵母gs115細(xì)胞，構(gòu)建基因工程重組菌；

(3)篩選ppiczαa-mytichitin-a的陽性克隆子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得存在于酵母發(fā)酵液上清中的目的蛋白。

進(jìn)一步的，采用ppiczαa這一外分泌型表達(dá)載體，載體上有可嚴(yán)格調(diào)控的乙醇氧化酶基因(aox1)啟動(dòng)子及α-因子分泌信號(hào)(α-factor)，促進(jìn)外源蛋白分泌表達(dá)。

進(jìn)一步地，誘導(dǎo)表達(dá)的條件為，當(dāng)用bmgy培養(yǎng)基培養(yǎng)ppiczαa-mytichitin-a陽性克隆子的od值為6.0-8.0時(shí)，換成bmmy培養(yǎng)基，并用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

更進(jìn)一步地，經(jīng)1.0％甲醇誘導(dǎo)96h，目的蛋白產(chǎn)量達(dá)45.5μg/ml。

進(jìn)一步地，對目的蛋白進(jìn)行純化，純化方法為一步鎳柱親和純化，分別用20、40、60mm低濃度咪唑進(jìn)行梯度漂洗去除雜蛋白，500mm高濃度咪唑進(jìn)行洗脫。純化后每毫升可獲得目的蛋白為18.2μg，且純度達(dá)97.8％。

進(jìn)一步地，最小抑制濃度(mic)測定中，金黃色葡萄球菌mic為30.7μg/ml，枯草芽孢桿菌151-1mic為48.0μg/ml。

本發(fā)明的有益效果在于：作為一種新型抗菌肽，在畢赤酵母系統(tǒng)中成功高效表達(dá)。在活性鑒定中，發(fā)現(xiàn)其對多種菌具有抑菌作用，其中對致病菌金黃色葡萄球菌的作用極其突出，mic僅30.7μg/ml。金黃色葡萄球菌是人類的一種重要病原菌，可引起許多嚴(yán)重感染。其廣泛存在于空氣，水，土壤中，很容易污染食品。鑒于此抗菌肽mytichitin-a在醫(yī)藥、食品中均具有廣闊的市場前景。

附圖說明

圖1為重組抗菌肽mytichitin-a的表達(dá)、純化、活性鑒定的技術(shù)路線圖。

圖2為重組抗菌肽mytichitin-a在144h發(fā)酵周期內(nèi)(1.0％甲醇誘導(dǎo))的表達(dá)水平結(jié)果。

圖3為重組抗菌肽mytichitin-a對金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果，其中1號(hào)為陰性對照，2號(hào)為陽性對照(慶大霉素50μg/ml)，3號(hào)為抗菌肽mytichitin-a(30μg/ml)，4號(hào)為抗菌肽mytichitin-a(10μg/ml)。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：

表達(dá)載體的構(gòu)建——于目的基因mytichitin-a的5'端加上6×his標(biāo)簽、腸激酶基因序列、ecori酶切位點(diǎn)及起始密碼子；3'引入終止密碼子、kpni酶切位點(diǎn)，按照seqidno：2進(jìn)行全基因合成，插入到載體puc19，獲得重組質(zhì)粒puc-mytichitin-a。對重組puc-mytichitin-a及ppiczαa空載體分別進(jìn)行雙酶切(ecori、kpni)，37℃，3h。酶切體系為10×buffer1μl，puc-mytichitin-a/ppiczαa1.5μg，ecori0.8μl，kpni0.8μl，總體系10μl；回收連接，目的基因mytichitin-a片段和載體ppiczαa片段室溫連接2h或者4℃過夜連接，連接體系為：ppiczαa20ng，mytichitin-a8ng，t4連接酶0.8μl，總體系10μl。成功構(gòu)建ppiczα-mytichitin-a重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒ppiczα-mytichitin-a轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增。利用限制性內(nèi)切酶ecori和kpni進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證正確株進(jìn)行測序分析，以期獲得序列正確重組質(zhì)粒ppiczα-mytichitin-a。

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母gs115中——將重組質(zhì)粒用saci酶線性化酶切，酶切體系為：10×buffer10μl；saci酶2μl；ppiczα-mytichitin-a1μg；ddh2o補(bǔ)至總體積100μl，37℃，2h。用dna產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。將線性化質(zhì)粒(1-2μg)電轉(zhuǎn)化入gs115感受態(tài)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)參數(shù)：電轉(zhuǎn)杯2mm，電壓1500kv，電容25μf，電阻200ω。涂至含有zeocin(100μg/ml)的ypds板，30℃恒溫箱培育2-3d至單菌落長出。

重組酵母ppiczα-mytichitin-a/gs115的pcr鑒定——在ypds板上挑取6-10個(gè)長勢較好的的陽性克隆于30μl0.2％的sds中，沸水浴10min，12000g離心10min，置于冰上備用。pcr驗(yàn)證體系為10×buffer2μl，mgcl2(25mm)1.2μl，dntps(2.5mm)2μl，上引(5mm)0.5μl，下引(5mm)0.5μl，25％tritonx-1000.8μl，模板1μl，dna聚合酶0.4μl，無菌水補(bǔ)至總體系20ul；pcr反應(yīng)條件為：95℃8min，95℃45s，57℃30s、57℃30s、72℃40s、72℃10min(35個(gè)循環(huán))，16℃90min，凝膠電泳驗(yàn)證，以期獲得陽性克隆菌株。

重組酵母的誘導(dǎo)表達(dá)——參考jinetal.(2006)、lietal.(2005)和tangetal.(2012)中的方法進(jìn)行。挑取pcr鑒定成功的陽性克隆于5mlbmgy培養(yǎng)基中，30℃220rpm培養(yǎng)24h，之后按5％的接種量轉(zhuǎn)接50ml(250ml搖瓶)bmgy培養(yǎng)基，30℃220rpm/min培養(yǎng)至od600＝4.0-6.0。待od600到達(dá)6.0-8.0時(shí)，換bmmy培養(yǎng)基。先3000g離心5min，棄去培養(yǎng)基，用無菌水洗一次菌體，再用bmmy培養(yǎng)基重懸菌體，置于28℃220rpm/min搖床上誘導(dǎo)表達(dá)。每24h取一次樣，并加入過濾膜除菌的100％甲醇，使其終濃度分別為0.5％、1％、1.5％、2％，連續(xù)培養(yǎng)144h。將誘導(dǎo)前和每24h取的樣品跑tricine-sds-page蛋白電泳，檢測目的蛋白是否表達(dá)。以期獲得最佳誘導(dǎo)時(shí)間、濃度的高表達(dá)菌株。最優(yōu)選的誘導(dǎo)表達(dá)條件為，1.0％甲醇誘導(dǎo)96h，目的蛋白產(chǎn)量達(dá)45.5μg/ml。

重組抗菌肽mytichitin-a的活性鑒定——參考fanetal.(2010)中的瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行。分別挑取受試菌單菌落于5ml的lb液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜，至菌體密度約為10⁵cfu/ml。取200μl稀釋后的菌液均勻涂布于lb平板上，用直徑為6mm的金屬打孔器在平板合適的位置打孔。每孔滴加50μl的待測樣品。并設(shè)置陰性對照為同體積空載ppiczαa轉(zhuǎn)化的gs115培養(yǎng)后上清，陽性對照為amp+(25μg/ml)。培養(yǎng)過夜后觀察并測量抑菌圈的直徑。

重組抗菌肽mytichitin-a的鎳柱親和純化——將1％甲醇誘導(dǎo)、第96h酵母培養(yǎng)液12000g，4℃離心20min，過0.45μm濾膜。用超濾管將酵母上清液置換到結(jié)合緩沖液(20mm磷酸鹽，300mm氯化鈉，10mm咪唑，ph7.4)。將蛋白樣品加入ni柱，置于4℃，水平搖床結(jié)合過夜。用漂洗液1(20mm磷酸鹽，300mm氯化鈉，20mm咪唑，ph7.4)、漂洗液2(20mm磷酸鹽，300mm氯化鈉，40mm咪唑，ph7.4)，漂洗液3(20mm磷酸鹽，300mm氯化鈉，60mm咪唑，ph7.4)進(jìn)行梯度漂洗，去除雜蛋白。用1ml高咪唑濃度洗脫液洗脫(20mm磷酸鹽，300mm氯化鈉，500mm咪唑，ph7.4)，洗脫5次。后用tricine-sds-page及銀染對目的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證分析。一步鎳柱親和純化后每毫升可獲得目的蛋白為18.2μg，且純度達(dá)97.8％。

最小抑制濃度mic的測定——參考zhaoetal.(2015)中的方法進(jìn)行。將受試菌首先分別挑于lb液體培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)4-6h后，稀釋受試菌至濃度為2-5×10⁷cfu/ml待用。然后將抗菌肽干粉用不同體積的pbs將其稀釋到不同的濃度后，各取20μl不同稀釋濃度的樣品加入96孔板中，再向每孔中各加入100μl稀釋好的受試菌液。陰性對照中加入100μllb培養(yǎng)基并補(bǔ)以20μl的pbs，陽性對照為100μl的菌液再補(bǔ)以20μl的pbs。全部加完后將該96孔板封好37℃搖床培養(yǎng)約12-16h。取出96孔板，使用酶標(biāo)儀檢測加樣孔中od600值情況，并與每種菌的陽性對照和陰性對照對比，加抗菌肽組的od600值與陰性對照無明顯變化的樣品濃度即為最小抑菌濃度的mic值。結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌mic為30.7μg/ml，枯草芽孢桿菌151-1mic為48.0μg/ml。

本發(fā)明不僅首次構(gòu)建了ppiczαa-mytichitin-a載體，提供了新型抗菌肽在畢赤酵母中成功高效表達(dá)的方法，還發(fā)現(xiàn)了抗菌肽mytichitin-a對金黃色葡萄球菌的強(qiáng)抑菌活性。金黃色葡萄球菌是一種危害人類非常強(qiáng)的病原菌，可引起許多嚴(yán)重感染。美國疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌且金黃色葡萄球菌腸毒素也是個(gè)世界性衛(wèi)生問題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33％，加拿大則更多，占45％，中國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。因此，對金黃色葡萄球菌的強(qiáng)抑菌活性的抗菌肽mytichitin-a在醫(yī)藥、食品中著實(shí)具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的一些實(shí)施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行改變。上述實(shí)施例只是實(shí)例性的，不應(yīng)以本文的實(shí)施例作為本發(fā)明權(quán)利范圍的限定。

sequencelisting

<110>天津科技大學(xué)

<120>一種新型抗菌肽mytichitin-a在畢赤酵母中的高效制備

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>73

<212>prt

<213>人工合成

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<213>人工合成

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aatggtaaaatgccgtgtaaacatggtgcattttataccgatacctgtgataaaaatgtt120

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