本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種線粒體dnag7444a突變及線粒體dnaa7445g突變的聯(lián)合檢測(cè)方案。

背景技術(shù)：

線粒體dna(mtdna)突變是致聾的重要誘因，與環(huán)境因素一起影響耳聾發(fā)生。線粒體trna^ser(ucn)7444g＞a繼發(fā)突變位于mtdna環(huán)的輕鏈上trna^ser(ucn)前體3’端核酸外切酶的作用位點(diǎn)(圖一)附近，該突變通過(guò)更改重鏈上coi基因終止密碼子序列，使coi基因編碼的多肽在羧基末端增加3個(gè)氨基酸殘基，從而可能對(duì)trna的加工修飾產(chǎn)生影響。與mtdna7444g＞a突變位點(diǎn)相鄰的7445a＞g突變可引起trna前體的加工缺陷，致使trna的穩(wěn)定性和nd6mrna的產(chǎn)量顯著下降。在基因檢測(cè)中，血液是人類dna的良好來(lái)源，但采集血液對(duì)會(huì)損傷人的皮膚，并產(chǎn)生疼痛感，因此有研究者提出人類唾液中的口腔細(xì)胞可以作為另一個(gè)dna的良好來(lái)源。目前，已有相關(guān)研究開發(fā)出了口腔細(xì)胞的提取方法及口腔細(xì)胞dna的眾多應(yīng)用。

目前對(duì)于突變檢測(cè)最常用方法為第一代測(cè)序測(cè)序技術(shù)，但此技術(shù)對(duì)儀器要求高，操作繁瑣且成本昂貴，結(jié)果誤差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；pcr-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(pcr-rflp)是目前應(yīng)用較廣泛、相對(duì)成熟的檢測(cè)方法，但操作繁瑣，操作過(guò)程中影響結(jié)果的不確定因素太多；近年來(lái)，變性高效液相色譜(dhplc)和基因芯片的應(yīng)用為點(diǎn)突變檢測(cè)提供了思路，檢測(cè)技術(shù)靈敏度和特異度均較高，自動(dòng)化程度高，適合高通量檢測(cè)，但涉及儀器昂貴，需專人操作，不適合廣泛推廣。因此，迫切需要一種快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)易的突變篩查方法應(yīng)用與臨床突變篩查。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有方法耗時(shí)長(zhǎng)、操作難、成本高等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種線粒體dnag7444a突變及線粒體dnaa7445g突變的聯(lián)合檢測(cè)方案，利用口腔細(xì)胞的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)為基礎(chǔ)提出一種針對(duì)mtdnag7444a突變和a7445g突變進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)的新方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是：一種線粒體dnag7444a突變及線粒體dnaa7445g突變的聯(lián)合檢測(cè)方案，所述的檢測(cè)方案包括以下步驟：

(1)提取樣本全基因組dna；

(2)特異性pcr擴(kuò)增：根據(jù)人類線粒體基因劍橋參考序列特異性設(shè)計(jì)一對(duì)引物，通過(guò)正鏈引物5’-gtagaagaaccctccataaac-3’和負(fù)鏈引物5’-taggaagcagataaggaaaat-3’來(lái)擴(kuò)增7356位點(diǎn)和7696位點(diǎn)之間的核酸序列，最終得pcr產(chǎn)物；

(3)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)：將獲得的pcr產(chǎn)物分別通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶xbai、bfai和ddei進(jìn)行特異性識(shí)別切割，根據(jù)pcr產(chǎn)物分別經(jīng)過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶xbai識(shí)別tctaga回文結(jié)構(gòu)，限制性核酸內(nèi)切酶bfai識(shí)別ctag回文結(jié)構(gòu)，限制性核酸內(nèi)切酶ddei識(shí)別ctnag回文結(jié)構(gòu)進(jìn)行內(nèi)切，然后電泳以識(shí)別其突變位點(diǎn)，最終根據(jù)電泳獲得的條帶結(jié)果判斷樣本線粒體dnag7444a突變和線粒體dnaa7445g突變的結(jié)果。

所述的全基因組dna從細(xì)胞、血液以及組織樣本中提取。

所述的提取樣本全基因組dna通過(guò)以下方法獲得：使用鑷子提取口腔組織樣本，并轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管，用600μl細(xì)胞裂解緩沖液和3μl蛋白酶k混合55℃12小時(shí)，孵育后，混入600μl預(yù)冷的乙酸鉀，混合物在4℃保持10分鐘，然后將混合物在12000rpm下離心10分鐘4℃，將上清液轉(zhuǎn)移至新的2ml無(wú)菌離心管用600μl預(yù)冷異丙醇醇，混合后，將混合物離心12000rpm，4℃，10分鐘，傾出上清液，將沉淀物重懸浮于600μl無(wú)水乙醇中，并在室內(nèi)溫度12000rpm下離心3分鐘，傾出上清液后將dna在室溫下干燥，20μlddh20加入到2ml無(wú)菌離心管中以溶解dna獲得樣本全基因組dna。

所述的步驟(2)特異性pcr擴(kuò)增步驟如下：在1uldna提取液，2uldntp，0.2ul正鏈引物，0.2ul負(fù)鏈引物，2ulprcbuffer，0.1ultaqdna聚合酶，1.5ul氯化鎂溶液和18ul雙蒸水的反應(yīng)體系下，在94℃變性解鏈5min后，進(jìn)行35次擴(kuò)增循環(huán)，得到的pcr產(chǎn)物片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與修正劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)照組對(duì)比。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種線粒體dnag7444a突變及線粒體dnaa7445g突變的聯(lián)合檢測(cè)方案，其利用口頰細(xì)胞作為dna的來(lái)源，通過(guò)三種限制性核酸內(nèi)切酶xbai、bfai和ddei進(jìn)行特異性識(shí)別切割，然后又進(jìn)行電泳以識(shí)別其突變位點(diǎn)，根據(jù)電泳獲得的條帶結(jié)果判斷樣本線粒體dnag7444a突變和線粒體dnaa7445g突變的結(jié)果，該方法經(jīng)濟(jì)節(jié)約，操作簡(jiǎn)單且快速有效，為耳聾的預(yù)防、分子診斷和基因治療提供必要的技術(shù)支持，同時(shí)也為其他耳聾突變位點(diǎn)的針對(duì)性診斷提供了新方法新思路，具有重要科學(xué)意義和社會(huì)價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為母系遺傳相關(guān)的trna^ser(ucn)g7444aanda7445g突變示意圖。

圖2為pcr反應(yīng)條件。

圖3為pcr產(chǎn)物的確認(rèn)。

圖4為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)驗(yàn)對(duì)象

本論文將研究對(duì)象分為4組，每組選擇三例樣本進(jìn)行檢測(cè)。

表一、樣本表格

(y：yesn：no)

所有患者外周血樣以及口頰細(xì)胞的采集均簽署了溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批的知情協(xié)議書。用無(wú)菌棉簽在其口腔粘膜擦拭，然后將棉簽風(fēng)干30-60分鐘并置于密封的干燥劑塑料袋中。同時(shí)，受試者自愿提供2ml外周血儲(chǔ)存在抗凝血?jiǎng)┲泄?。到達(dá)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，所有樣品，包括口腔細(xì)胞樣品和血液樣品儲(chǔ)存在4℃，以防止dna的降解。

提取樣本全基因組dna

手工法

使用滅菌的鑷子將風(fēng)干的口腔拭子表面上的棉花撕裂，并轉(zhuǎn)移到2ml無(wú)菌離心管，用600μl細(xì)胞裂解緩沖液和3μl蛋白酶k混合55℃12小時(shí)。孵育后，混入600μl預(yù)冷的乙酸鉀，混合物在4℃保持10分鐘。然后將混合物在12000rpm下離心10分鐘4℃。將上清液轉(zhuǎn)移至新的2ml無(wú)菌離心管用600μl預(yù)冷異丙醇醇。混合后，將混合物離心12000rpm，4℃，10分鐘。傾出上清液，將沉淀物重懸浮于600μl無(wú)水乙醇中，并在室內(nèi)溫度12000rpm下離心3分鐘。傾出上清液后將dna在室溫下干燥，20μlddh2o加入到2ml無(wú)菌離心管中以溶解dna。

試劑盒法

使用qiaampdnaminikits(50)根據(jù)口腔拭子的規(guī)格提取口腔細(xì)胞dna。根據(jù)血液和體液的說(shuō)明書，使用hipuretissuednaminikits提取血液dna。通過(guò)分光光度法在260nm和280nm測(cè)定總dna濃度和純度，通過(guò)將dna濃度乘以dna樣品的最終體積計(jì)算dna產(chǎn)量。

特異性pcr擴(kuò)增

通過(guò)pcr擴(kuò)增獲得12srrna的dna片段，并進(jìn)行dna測(cè)序分析。我們使用正鏈引物5’-gtagaagaaccctccataaac-3’和負(fù)鏈引物5’-taggaagcagataaggaaaat-3’來(lái)擴(kuò)增7356位點(diǎn)和7696位點(diǎn)之間的核酸序列，反應(yīng)體系為：1uldna提取液，2uldntp，0.2ul正鏈引物，0.2ul負(fù)鏈引物，2ulprcbuffer，0.1ultaqdna聚合酶，1.5ul氯化鎂溶液和18ul雙蒸水。首先94℃5min變性解鏈后，進(jìn)行35次擴(kuò)增循環(huán)(94℃30s，51℃45s，72℃60s)，最后為72℃6min的延伸過(guò)程，如圖二所示。pcr產(chǎn)物片段送測(cè)，測(cè)序結(jié)果與修正劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列(genbankaccessionno.nc_001807)/對(duì)照組對(duì)比。產(chǎn)物純化后電泳檢測(cè)得到，如圖三所示。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)

pcr產(chǎn)物總長(zhǎng)341bp，可以被限制性核酸內(nèi)切酶xbai、bfai和ddei特異性識(shí)別切割。我們分別按次序使用這三種酶對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切電泳以識(shí)別其突變位點(diǎn)。使用10％聚丙烯酰胺凝膠在100v下電泳分離1h來(lái)分析酶消化產(chǎn)物，使用凝膠配比方案為2.4ml5×tbe，88ul10％過(guò)硫酸銨，4ml30％聚丙烯酰胺，8ultemed。電泳完成后的凝膠塊用gelred(1∶10000in1xtbe)熒光核酸凝膠染色試劑染色10min，然后在成像系統(tǒng)上觀察拍攝。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本發(fā)明對(duì)象分為4組，每組選擇三例樣本，現(xiàn)選取每組的第一例樣本進(jìn)行說(shuō)明，限制性內(nèi)切酶有其特定的識(shí)別序列，識(shí)別序列中的任何一個(gè)堿基的改變都將導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的消失。第一種限制酶作用時(shí)極可能切除了第二種限制酶的作用位點(diǎn)，使得酶切反應(yīng)無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行，因此需要嚴(yán)格分步進(jìn)行酶切操作。

第一步，選擇xbai進(jìn)行檢測(cè)。d組(對(duì)照組)獲得一條341bp的條帶，而其他突變組則獲得85bp和256bp的條帶。(圖4)我們以此可識(shí)別無(wú)突變的dna樣本。

第二步，選擇bfai進(jìn)行檢測(cè)。c組(攜帶mtdnaa7445g突變的樣本)獲得86bp和255bp的條帶，而a組與b組則只獲得一條341bp的條帶。(圖4)通過(guò)第二步我們可識(shí)別mtdna7445a＞g突變。

第三步，選擇ddei進(jìn)行檢測(cè)。b組(攜帶mtdnag7444a突變的樣本)可獲得一條341pb的特異條帶，而a組(同時(shí)攜帶mtdnag7444a突變及mtdnaa7445g突變)則獲得86bp和255bp的條帶。(圖4)

諸如上述，則根據(jù)相應(yīng)的條帶結(jié)果即可準(zhǔn)確判斷該樣本的突變情況。此外，提取所得血液dna和口腔上皮細(xì)胞dna的檢測(cè)結(jié)果均沒(méi)有顯著差異。最后，我們以此方案對(duì)各個(gè)樣本重新進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均符合實(shí)際。