本發(fā)明屬于分子病理學與免疫學技術領域，具體涉及豬瘟病毒配體表位多肽SE241及其應用。

背景技術：

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。是豬最嚴重的傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織列為烈性傳染病，也是我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的一類傳染病。CSFV屬于黃病毒科、瘟病毒屬成員之一，其基因組為線狀單股正鏈RNA，可以編碼12種成熟病毒蛋白，其中C、Erns、E1和E2為結構蛋白，其余為非結構蛋白。結構蛋白Erns、E1和E2在病毒對宿主細胞的識別、吸附及病毒抗原性上具有重要作用。因此，對CSFV結構蛋白的研究主要集中在此三種蛋白上。

病毒配體通常是指與病毒受體發(fā)生特異性結合的病毒表面分子，即病毒的吸附蛋白。病毒受體是指位于宿主細胞表面能夠識別病毒配體并與之發(fā)生特異性結合的分子復合物。病毒配體與靶細胞表面病毒受體的特異性結合是病毒感染的關鍵環(huán)節(jié)，所以阻斷這兩者的結合可以有效抑制病毒性疾病感染的發(fā)生。近年來，以病毒受體或病毒配體作為抗病毒藥物的靶點，篩選抗病毒的多肽藥物和疫苗成為研究的熱點。

中國專利公開了豬瘟病毒CSFV E2蛋白配體表位多肽及其應用(CN2011101126535)，其公開的多肽氨基酸序列為VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYF，其分子量為5.73kDa；并以PK-15細胞為靶細胞，通過CSFV的感染、收獲，測定了CSFV的TCID₅₀和感染比，進行合成多肽與靶細胞的結合試驗、病毒阻斷試驗和多肽阻斷CSFV感染靶細胞的試驗，篩選了特異性結合靶細胞的能夠抑制病毒感染的配體表位多肽，對CSFV E2蛋白配體表位進行了初步定位。但是由于上述專利的多肽氨基酸序列較長，配體定位不夠精確，在實際應用過程中合成成本過高，其應用推廣受到很大的限制，因此對配體表位多肽的精確定位顯得尤為重要。目前，尚未見E2蛋白配體表位精確定位的相關報道。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供豬瘟病毒配體表位多肽SE241及其應用，該多肽可以有效結合PK-15細胞，并且SE241和PK-15細胞的結合可以被CSFV阻斷，確定SE241為CSFV結合靶細胞的配體表位。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：

豬瘟病毒配體表位多肽SE241，所述的多肽SE241的氨基酸序列為：VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSC。

一種豬瘟病毒配體表位多肽SE241結合PK-15細胞和CFSV阻斷SE241結合PK-15細胞試驗中的應用。

一種豬瘟病毒配體表位多肽SE241在抑制CFSV感染PK-15細胞中的應用。

一種豬瘟病毒配體表位多肽SE241在研制抑制CSFV感染靶細胞的藥物或疫苗中的應用。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明設計合成位于SE24多肽上的短肽，得到了多肽SE241。多肽SE241與PK-15細胞的結合和阻斷試驗顯示，多肽SE241結合PK-15細胞的平均熒光強度顯著高于FITC對照組，CSFV阻斷SE241結合PK-15細胞的平均熒光強度明顯低于結合試驗，證實多肽SE241能夠有效結合PK-15細胞，并且SE241和PK-15細胞的結合可以被CSFV阻斷，確定SE241為CSFV結合靶細胞的配體表位。同時，本發(fā)明SE241結合PK-15細胞平均熒光強度高于SE24，被CSFV阻斷效果顯著高于SE24，證明配體表位SE241特異性比SE24強。

2、本發(fā)明公開的多肽氨基酸序列較短，對豬瘟病毒結合靶細胞的配體表位進一步精確定位，在實際應用中比現(xiàn)有技術公開的多肽成本大幅降低。

3、本發(fā)明通過結合試驗和阻斷試驗相互印證，CSFV與PK-15細胞的病毒受體結合后，阻止了多肽與病毒受體的結合，進而證明多肽SE241和CSFV結合在同類細胞受體。提示該多肽是預防和治療豬瘟的理想藥物靶標，為進一步開發(fā)和研制新型抗病毒藥物和疫苗奠定基礎。同時為豬瘟的防治提供了新的途徑。

附圖說明

圖1為細胞免疫化學染色技術檢測培養(yǎng)繁殖的CSFV(200×)。圖中，A為感染CSFV的PK-15細胞；B為空白對照細胞。

圖2為多肽SE241的LC-MS/MS圖譜。橫坐標表示離子的質(zhì)荷比值(m/z)，縱坐標表示離子流的強度(最強離子流強度為100％)。

圖3為多肽SE241與PK-15細胞結合與阻斷試驗結果。圖中，A為FITC對照；B為多肽SE241與PK-15細胞結合；C為CSFV阻斷多肽SE241與PK-15細胞的結合。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1

本發(fā)明對所用的豬瘟病毒石門株(細胞毒)進行多項指標測定，以確定該株石門株(細胞毒)CSFV能夠滿足本發(fā)明的使用要求。

1、CSFV的ELISA效價測定

將豬瘟病毒石門株(細胞毒)感染培養(yǎng)好的單層PK-15細胞，37℃經(jīng)48-56h培養(yǎng)后收獲病毒，反復凍融3次破碎細胞裂解出病毒，4℃、3000rpm離心10min，棄去沉淀，上清即為繁殖病毒液。用豬瘟病毒抗原檢測試劑盒(SERELISA HCV Ag Mono Indirect產(chǎn)品)檢測收獲的病毒液。將病毒液1:50、1:100、1:200、1:400倍稀釋，每個稀釋度均做6個重復，檢測結果見表1。以與陰性對照OD₄₅₀值的比值為2.2倍且總值≥0.2的稀釋度為病毒的效價，從表中可以看出，病毒液的效價為1:200。

表1檢測豬瘟病毒的效價

注：“+”代表陽性，“－”代表陰性。

2、CSFV的TCID₅₀測定

檢測病毒培養(yǎng)物的感染力，即毒力。病毒毒力的測定有2種方法，一種方法是采用實驗動物測定半數(shù)致死量(LD₅₀)或在雞胚上測定半數(shù)雞胚感染量(ELD₅₀)；另一種方法是在組織細胞上測定半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(TCD₅₀又稱TCID₅₀)。TCID₅₀可以用Reed-Muench兩氏法、內(nèi)插法、Karber法計算。本發(fā)明采用固定PK-15細胞稀釋病毒法計算繁殖病毒的TCID₅₀，結果見表2，在病毒液稀釋度為10^-1、10^-2、10^-3時，接種的4孔細胞全部感染，稀釋度為10^-4是，有2孔感染，稀釋度為10^-5、10^-6時全部不感染，正常細胞作為空白對照全部不感染。按照上述試驗結果利用Reed-Muench兩氏法計算TCID₅₀。

表2固定PK-15細胞稀釋病毒法計算CSFV的TCID₅₀

本試驗中高于50％病毒稀釋度的對數(shù)為–3，距離比例為0.5，稀釋度對數(shù)之間的差為–1。

LogTCID₅₀＝0.5×(–1)+(–3)＝–3.5

TCID₅₀＝10^-3.5，含義為將病毒液稀釋10^3.5倍，每孔接種100μL病毒液，可使半數(shù)細胞發(fā)生感染。

3、CSFV感染復數(shù)(MOI)的測定

感染復數(shù)或感染比(multiplicity of infection)：指在一個系統(tǒng)中感染病毒的細胞數(shù)與細胞總數(shù)之比。將2×TCID₅₀CSFV感染PK-15細胞后，用細胞免疫化學染色技術檢測培養(yǎng)繁殖的CSFV，CSFV感染PK-15細胞后顯棕紅色(圖1A)，正常對照PK-15細胞不顯色(圖1B)。計算MOI時要計數(shù)感染細胞和96孔細胞培養(yǎng)板每孔的細胞總數(shù)，然后分析試驗結果。細胞計數(shù)時，取一滴細胞懸液于細胞計數(shù)板上，在倒置顯微鏡下計算斜對角線上四個大方格里的細胞總數(shù)，計算公式為：

每孔細胞總數(shù)＝n/4×稀釋倍數(shù)×10⁴×細胞液毫升數(shù)(n為四個大方格的細胞總數(shù))。

結果：96孔細胞培養(yǎng)板中感染的每孔細胞平均數(shù)為150個；計數(shù)板四個大方格的細胞總數(shù)為280個，每孔細胞液毫升數(shù)為0.1ml，稀釋倍數(shù)為10^-1倍，經(jīng)計算得知每孔細胞的總數(shù)為7.0×10³個，所以培養(yǎng)繁殖病毒的MOI為：1:47。

4、結論

通過測定CSFV的ELISA效價、TCID₅₀和感染復數(shù)(MOI)，證實了該株石門株(細胞毒)CSFV可以滿足本發(fā)明研究的需要。

實施例2、合成多肽

研究表明，多肽SE24(氨基酸序列：CVHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSCTFNYAKTGKNKYYEPRDSYF)可以有效結合PK-15細胞，可以有效抑制CSFV感染PK-15細胞，且CSFV可以阻斷SE24結合PK-15細胞，因此證實多肽SE24為豬瘟病毒CSFV E2蛋白配體表位多肽。為進一步精確定位多肽SE24上的配體表位信息，設計并合成了位于多肽SE24上的1條短肽，合成肽SE241的LC-MS/MS圖譜見圖2，序列如下：

SE241：VHASDERLGPMPCRPKEIGSSAGPVRKTSC(SEQ ID NO：1)

實施例3、SE241與PK-15細胞的結合和阻斷試驗

取生長良好的PK15細胞，PBS洗3次，用1％胰蛋白酶進行消化細胞，約消化1min，棄掉消化液，加含10％胎牛血清的DMEM進行懸浮，1000rpm離心5min，用適量PBS重懸PK15細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1.0×10⁶個/ml，備用。

SE241與PK-15細胞的結合試驗：

將上述PK15細胞懸液(細胞濃度為1.0×10⁶個/ml)，混合均勻置于EP管中，每管中100μl，即每管中細胞數(shù)達到1.0×10⁵個。于管中加入多肽SE241(已FITC標記)使SE241終濃度達到0.2mg/ml，同時設FITC陽性對照，做三個重復，冰上避光作用2h，PBS洗3次，每次洗1000rpm離心5min，最后一次離心后加800μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測，計數(shù)10000個細胞，判定分析結果。

CSFV阻斷SE241與PK15細胞結合試驗：

取1.0ml上述PK15細胞懸液(細胞濃度為1.0×10⁶個/ml)，加200μl TCID₅₀為10^-3.5的CSFV液，混合均勻，4℃作用40min。離心棄掉CSFV液，再用PBS洗2次，最后用PBS重懸細胞，混合均勻后分裝于EP管中，使每管中細胞數(shù)達到1.0×10⁵個。

于管中加入多肽SE241(已FITC標記)使SE241終濃度達到0.2mg/ml，同時設FITC陽性對照，做三個重復，冰上避光作用2h，PBS洗3次，每次洗1000rpm離心5min，最后一次離心后加800μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測，計數(shù)10000個細胞，判定分析結果。

結合試驗和阻斷試驗結果表明，多肽SE241結合PK-15細胞的平均熒光強度顯著高于FITC陽性對照組，CSFV阻斷SE241結合PK-15細胞的平均熒光強度明顯低于結合試驗(圖3、表3)，證實多肽SE241可以有效結合PK-15細胞，并且SE241和PK-15細胞的結合可以被CSFV阻斷，確定SE241為CSFV結合靶細胞的配體表位。進一步精確了CSFV結合靶細胞的配體表位信息，為研制抑制CSFV感染靶細胞的藥物或疫苗奠定基礎。

表3多肽SE241與PK-15細胞結合和CSFV阻斷多肽結合試驗結果

注：同行數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P＜0.05)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P＞0.05)。

表4 SE24、SE241多肽與PK-15細胞結合和CSFV阻斷多肽結合試驗結果比較

注：同行數(shù)據(jù)肩標不同字母表示差異顯著(P＜0.05)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P＞0.05)。

從表4可以看出SE24、SE241與PK15細胞結合試驗熒光強度差異不顯著，但SE241結合試驗平均熒光強度高于SE24；SE24、SE241被CSFV阻斷試驗熒光強度差異顯著，證明CSFV更有效阻斷SE241和PK15細胞結合。

實施例4、其它短肽的結合驗證

通過以上結合試驗和阻斷試驗結果表明，SE241可以有效結合PK-15細胞，CSFV可以阻斷SE241結合PK-15細胞。為再進一步精確定位SE24多肽上的配體表位信息，設計并合成了位于SE24多肽上的3條短肽，序列如下：

SE24-1：CVHASDERLGPMPCRPKEIG(SEQ ID NO：2)

SE24-2：PKEIGSSAGPVRKTSCTFNYA(SEQ ID NO：3)

SE24-3：TFNYAKTGKNKYYEPRDSYF(SEQ ID NO：4)

上述3條短肽經(jīng)過多次與PK-15細胞的結合試驗，證實此三條短肽不與PK-15細胞結合。

本發(fā)明將SE24多肽設計合成1條短肽SE241后，該短肽仍然與靶細胞結合，且在結合試驗和病毒阻斷結合試驗表明SE241與靶細胞結合和其結合被豬瘟病毒阻斷的效果明顯高于SE24。證明本發(fā)明的多肽SE241具有很好的特異性和精確性。進一步將SE24多肽設計合成3條短肽后，3條短肽均不與靶細胞結合，說明更精確定位CSFV配體表位有待進一步篩選研究。

以上所述僅為本發(fā)明最佳的實施例，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南科技學院

<120> 豬瘟病毒配體表位多肽SE241及其應用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys

1 5 10 15

Glu Ile Gly Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys

20 25 30

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro

1 5 10 15

Lys Glu Ile Gly

20

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Pro Lys Glu Ile Gly Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys

1 5 10 15

Thr Phe Asn Tyr Ala

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Gly Lys Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg

1 5 10 15

Asp Ser Tyr Phe

20