本發(fā)明屬于植物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從煙草中首次提取得到的苯并異呋喃類(lèi)化合物及其提取方法。同時(shí)，本發(fā)明化合物具有較好的抗氧化活性，在卷煙中應(yīng)用能有效的清除卷煙煙氣自由基。

背景技術(shù)：

煙草屬草茄科煙草一年生或有限多年生草本植物，其中以煙草N.tabacum L.栽培最廣，其成熟的葉片是卷煙工業(yè)的重要原料，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的作物。煙草除主要用于吸食外，還有其它較為廣泛的用途。同時(shí)，煙草是世界上化學(xué)成分最為復(fù)雜的植物，次生代謝產(chǎn)物非常豐富，經(jīng)過(guò)幾十年的研究，人們目前從煙草中鑒定出來(lái)的單體化學(xué)物質(zhì)就超過(guò)3000多種，而且還有許多成分尚未鑒定出來(lái)。

研究表明，除蛋白質(zhì)、氨基酸、糖、磷、鈣、鉀等常規(guī)化學(xué)成分外，煙草中還含有大量次生代謝產(chǎn)物，化合物類(lèi)型包括黃酮、香豆素、單寧、呋喃、苯并異呋喃、苯丙素、萜類(lèi)、生物堿等。這些化合物具有多種生物活性，在抗菌、消炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿、抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等多個(gè)方面具有顯著效果。呋喃類(lèi)化合物屬于雜環(huán)類(lèi)，在天然植物中也有廣泛存在該類(lèi)化合物的文獻(xiàn)報(bào)道。除具有廣泛的藥理作用外，呋喃還是一類(lèi)重要的香氣化合物，天然存在于各種水果和香料植物中，該類(lèi)化合物現(xiàn)已廣泛用于各種飲料、焙烤食品等食用香精的配方中。

本發(fā)明從煙草中分離得到了一種苯并異呋喃類(lèi)化合物，活性研究表明該化合物具有較好的抗氧化活性，尤其是將其用作煙草添加劑，具有很好的清除自由基抗氧化活性的效果，對(duì)提高卷煙品質(zhì)具有積極意義。目前煙草中發(fā)現(xiàn)苯并異呋喃類(lèi)化合物的清除卷煙煙氣自由基效果還未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種苯并異呋喃類(lèi)化合物；第二目的在于提供所述苯并異呋喃類(lèi)化合物的制備方法；第三目的在于提供所述苯并異呋喃類(lèi)化合物的應(yīng)用，主要用于清除卷煙主流煙氣中的自由基。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種具有清除自由基效果的苯并異呋喃類(lèi)化合物是從煙草中分離得到，其分子式為C₁₃H₁₄O₂，結(jié)構(gòu)如式(I)所示：

該化合物為淺黃色膠狀物，命名為：6,8-二氫-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯，英文名為：6,8-dihydro-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromene。

本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，上述具有清除自由基效果的苯并異呋喃類(lèi)化合物的制備方法，是以煙草為原料，依次經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、MCI脫色、硅膠柱層析和高效液相色譜分離步驟制得，具體為：

A、浸膏提?。簩煵莘鬯榈?0～40目，用5～10倍煙草重量的溶劑超聲提取2～5次，每次30～60分鐘，合并提取液并過(guò)濾，濾液減壓濃縮至原體積的1/4，靜置，濾除沉淀物，之后將所得濾液減壓濃縮成浸膏a；

B、有機(jī)溶劑萃?。合蚪郺中加入重量是浸膏a重量1～2倍的水，然后用與水等體積的有機(jī)溶劑萃取3～5次，合并有機(jī)溶劑萃取相，之后將合并得到的有機(jī)溶劑萃取相減壓濃縮成浸膏b；

C、MCI脫色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3～5倍的體積濃度為50～100％甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用體積濃度為90％-95％甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，之后將合并后的洗脫液減壓濃縮成浸膏c；

D、硅膠柱層析：將浸膏c上硅膠柱層析，裝柱硅膠為160～200目，用量為浸膏c重量6～10倍量；以體積比為1:0～0:1的氯仿和丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集各梯度的梯度洗脫液并減壓濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測(cè)，合并相同的部分；

E、高效液相色譜分離：將體積比為7:3的氯仿-丙酮洗脫得到的洗脫液，經(jīng)高效液相色譜分離純化，即得所述的苯并異呋喃類(lèi)化合物。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述A步驟的溶劑為體積濃度為70～100％的丙酮水溶液、體積濃度為90～100％的乙醇水溶液或體積濃度為90～100％的甲醇水溶液。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述B步驟的有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚或石油醚。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述D步驟中浸膏c在經(jīng)硅膠柱層析前，先用重量是浸膏c 1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.8～1.2倍的80～100目硅膠拌樣，之后上樣。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述D步驟中，梯度洗脫時(shí)，所使用的氯仿和丙酮混合有機(jī)溶劑的體積比依次為20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每個(gè)梯度洗脫到TLC點(diǎn)板無(wú)點(diǎn)后(即該梯度洗脫不出物質(zhì)后)，更換下一梯度洗脫。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，所述E步驟的高效液相色譜分離純化是以體積濃度為40％的甲醇水溶液為流動(dòng)相，流速15～25ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorba x PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，每次進(jìn)樣10～100μL，收集41.6min的色譜峰，多次累加后蒸干。

以上述方法制備得到的苯并異呋喃類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定：

本發(fā)明化合物為淺黃色膠狀物；

HRESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為225.0898[M+Na]⁺(計(jì)算值225.0891)，結(jié)合¹H NMR和DEPT譜確定其分子式為C₁₃H₁₄O₂，不飽和度為7。

紅外光譜中顯示了芳環(huán)(1610、1561和1472cm^-1)的共振吸收峰。而紫外光譜在210、240、278nm有最大吸收也說(shuō)明了化合物中可能存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。

化合物的¹H和¹³C NMR譜(如表1、圖1和圖2)顯示其含有13個(gè)碳和14個(gè)氫，包括1個(gè)1,2,4,5-四取代的苯環(huán)(C-4～C-7、C-4a和C-7a，H-7)，1個(gè)諧二甲基色烯環(huán)(C-1'～C-5'，H-1'、H-2'和H₆-4',5')，兩個(gè)氧化的亞甲基(C-1和C-3；H₂-1和H₂-3)。進(jìn)一步分析其HMBC相關(guān)信號(hào)，根據(jù)H₂-1和C-3、C-4a、C-7、C-7a；H₂-3和C-1、C-4、C-4a、C-7a；H-4和C-3、C-4a、C-7a；以及H-7和C-1、C-4a、C-7a的HMBC相關(guān)(如圖3)可推測(cè)化合物為苯并異呋喃類(lèi)結(jié)構(gòu)。

化合物的HMBC譜中可觀(guān)察到H-1'和C-4、C-5、C-6；H-2'和C-5，以及H-4和C-1'的遠(yuǎn)程相關(guān)，可推測(cè)諧二甲基色烯環(huán)取代在化合物的C-5和C-6位，并且C-1'位碳連接在苯環(huán)的C-4位。

至此，化合物的結(jié)構(gòu)得到確定，并命名為：6,8-二氫-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯。

化合物的紅外、紫外和質(zhì)譜數(shù)據(jù)：UV(甲醇)，λ_max(logε)278(3.82)、240(3.68)、210(4.05)nm；IR(溴化鉀壓片)：ν_max 3080、2918、1610、1561、1472、1328、1275、1147、1051、864cm^-1；¹H NMR和¹³C NMR數(shù)據(jù)(500和125MHz，CDCl₃)，見(jiàn)表1；正離子模式ESIMS m/z 225[M+Na]⁺；正離子模式HRESIMS m/z 225.0898[M+Na]⁺(計(jì)算值C₁₃H₁₄NaO₂，225.0891)。

表1.本發(fā)明化合物的¹H NMR和¹³C NMR數(shù)據(jù)(CDCl₃)

本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物作為制備抗氧化劑的應(yīng)用。

對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)試，抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL的乙醇溶液為初篩濃度，測(cè)定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一塊costar 96孔板，加入新鮮配制的DPPH乙醇溶液(濃度為6.5×10⁵mol/L)190μL/孔，加入本發(fā)明化合物樣品l0μL/孔，空白孔加l0μL生理鹽水，充分混勻，用封板膜封板后室溫下避光靜置30分鐘，于UV2401分光光度計(jì)上測(cè)定儀上測(cè)定各孔吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)為517nm；樣品對(duì)脂性自由基DPPH清除率按下式計(jì)算:

DPPH清除率(％)＝(A_空白-A_樣品)/A_空白×100％

A_空白：空白對(duì)照組吸光度值；A_樣品：加樣品組吸光度值。

樣品平行5次檢測(cè)，計(jì)算半數(shù)清除濃度IC50測(cè)定結(jié)果為4.36μg/L，表明本發(fā)明化合物具有良好的抗氧化活性和清除自由基活性。

同時(shí)提供本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物在清除卷煙煙氣中的自由基中的應(yīng)用。

對(duì)本發(fā)明化合物進(jìn)行了清除卷煙煙氣自由基效果的測(cè)試：

卷煙的葉組為：上部煙葉為15％，中部煙葉為48％，下部煙葉為23％，膨脹梗絲8％，煙草薄片6％；采用醋酸纖維嘴棒，嘴棒成型紙透氣度為4500CU；卷煙紙克重為50g/m²、透氣度為80CU，水松紙透氣度為200CU。成品卷煙煙支的重量為0.93±0.02g，圓周為24.5mm，長(zhǎng)度為84mm(其中嘴棒長(zhǎng)度為25mm)。

試驗(yàn)化合物(本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物)用香精注射機(jī)均勻添加到卷煙過(guò)濾嘴絲束中，每支卷煙添加量為0.5～5.0mg，并以未添加試驗(yàn)化合物的卷煙為對(duì)照。

卷煙用RM200型20孔道自動(dòng)吸煙機(jī)在標(biāo)準(zhǔn)條件下吸煙，主流煙氣粒相物用44mm劍橋?yàn)V片捕集，氣相部分用采樣管捕集；粒相自由基用0.05mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液為萃取劑從劍橋?yàn)V片溶出，并洗滌劍橋?yàn)V片，定容得粒相自由基測(cè)試液。氣相自由基用自由基采樣管，以0.05mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液為吸收劑采集，卷煙抽吸完后取出氣相自由基采樣管，同時(shí)用少量吸收劑分3次沖洗通氣內(nèi)管外部和采樣管內(nèi)壁，合并吸收液和洗滌液，得氣相自由基樣品液。

用順磁共振儀測(cè)定自由基，ESR分析實(shí)驗(yàn)條件：中心磁場(chǎng)＝3.385T，掃寬＝0.500T，微波頻率＝1.5GHz，掃描時(shí)間＝2min，掃描次數(shù)＝5，放大倍數(shù)＝10³～10⁵(根據(jù)峰高進(jìn)行調(diào)整)，樣品用量20μL；根據(jù)ESR圖譜中峰面積計(jì)算氣相及粒相自由基數(shù)量的變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，和對(duì)照樣相比，添加本發(fā)明化合物的卷煙氣相自由基降低率為16～24％，粒相自由基降低率在18～25％之間，該化合物對(duì)卷煙主流煙氣中的自由基具有確切的清除效果。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物是首次從煙草中被分離出來(lái)的，通過(guò)核磁共振和質(zhì)譜測(cè)定方法確定了為苯并異呋喃類(lèi)化合物，并表征了其具體結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)證明本發(fā)明化合物具有良好的抗氧化活性和清除自由基活性。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物的核磁共振碳譜(¹³C NMR)；

圖2為為本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物的核磁共振氫譜(¹H NMR)；

圖3為本發(fā)明苯并異呋喃類(lèi)化合物的關(guān)鍵HMBC相關(guān)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠(chǎng)商者，均為可以通過(guò)購(gòu)買(mǎi)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明所述的苯并異呋喃類(lèi)化合物，是從煙草中分離得到，其分子式為C₁₃H₁₄O₂，具有下述結(jié)構(gòu)：

化合物命名為：6,8-二氫-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯，英文名為：6,8-dihydro-2,2-dimethyl-2H-furo[3,4-g]chromene。

本發(fā)明所述苯并異呋喃類(lèi)化合物的制備方法，是以煙草原料，經(jīng)浸膏提取、有機(jī)溶劑萃取、MCI脫色、硅膠柱層析和高效液相色譜分離步驟制得，具體為：

A、浸膏提?。簩煵莘鬯榈?0～40目，用5～10倍煙草重量的溶劑超聲提取2～5次，每次30～60分鐘，合并提取液并過(guò)濾，濾液減壓濃縮至原體積的1/4，靜置，濾除沉淀物，之后將所得濾液減壓濃縮成浸膏a；

B、有機(jī)溶劑萃取：向浸膏a中加入重量是浸膏a重量1～2倍的水，然后用與水等體積的有機(jī)溶劑萃取3～5次，合并有機(jī)溶劑萃取相，之后將合并得到的有機(jī)溶劑萃取相減壓濃縮成浸膏b；

C、MCI脫色：向浸膏b中加入是浸膏b重量3～5倍的體積濃度為50～100％甲醇水溶液，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用體積濃度為90％-95％甲醇水溶液進(jìn)行洗脫，合并洗脫液，之后將合并后的洗脫液減壓濃縮成浸膏c；

D、硅膠柱層析：將浸膏c上硅膠柱層析，裝柱硅膠為160～200目，用量為浸膏c重量6～10倍量；以體積比為1:0～0:1的氯仿和丙酮混合有機(jī)溶劑梯度洗脫，收集各梯度的梯度洗脫液并減壓濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測(cè)，合并相同的部分；

E、高效液相色譜分離：將體積比為7:3的氯仿-丙酮洗脫得到的洗脫液，經(jīng)高效液相色譜分離純化，即得所述的苯并異呋喃類(lèi)化合物。

所述A步驟的溶劑為體積濃度為70～100％的丙酮水溶液、體積濃度為90～100％的乙醇水溶液或體積濃度為90～100％的甲醇水溶液。

所述B步驟的有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醚或石油醚。

所述D步驟中浸膏c在經(jīng)硅膠柱層析前，先用重量是浸膏c 1.5～3倍的丙酮或者甲醇溶解，然后用重量是浸膏c 0.8～1.2倍的80～100目硅膠拌樣，之后上樣。

所述D步驟中，梯度洗脫時(shí)，所使用的氯仿和丙酮混合有機(jī)溶劑的體積比依次為20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1。

所述E步驟的高效液相色譜分離純化是以體積濃度為40％的甲醇水溶液為流動(dòng)相，流速15～25ml/min，以21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，每次進(jìn)樣10～100μL，收集41.6min的色譜峰，多次累加后蒸干。

本發(fā)明所述的煙草不受地區(qū)和品種限制，均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

實(shí)施例1

取干燥的煙草4.4kg，粗粉碎至30目，用10倍煙草重量的70％的丙酮水溶液超聲提取4次，每次60分鐘，提取液合并；提取液過(guò)濾，減壓濃縮至原體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，減壓濃縮成120g的浸膏a；

在浸膏a中加入240g水，用與水等體積的氯仿萃取5次，合并有機(jī)溶劑萃取相，減壓濃縮成80g浸膏b；

在浸膏b中加入240g的甲醇溶解，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用6升體積濃度為90％甲醇水溶液洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮得到62g浸膏c；

在浸膏c中加入93g的丙酮溶解，然后加入100目硅膠62g拌樣，拌樣后，用200目硅膠372g裝柱；所使用的氯仿和丙酮混合有機(jī)溶劑的體積比依次為20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每個(gè)梯度洗脫到TLC點(diǎn)板無(wú)點(diǎn)后，更換下一梯度洗脫，收集梯度洗脫液、減壓濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測(cè)，合并相同的部分，得到6個(gè)部分A-F，其中，對(duì)收集到的樣品D(7:3)部分12g，再以40％的甲醇為流動(dòng)相，流速25ml/min，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT GF反相制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，每次進(jìn)樣10μL，收集41.6min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述苯并異呋喃類(lèi)化合物。

實(shí)施例2

取干燥的煙草10kg，粗粉碎至40目，用5倍煙草重量的的甲醇超聲提取5次，每次30分鐘，提取液合并；提取液過(guò)濾，減壓濃縮至原體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，減壓濃縮成300g浸膏a；

在浸膏a中加入350g水，用與水等體積的二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)溶劑萃取相，減壓濃縮成210g浸膏b；

在浸膏b中加入630g的體積濃度為50％甲醇水溶液溶解，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用10升體積濃度為95％甲醇水溶液洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮得到150g浸膏c；

浸膏c中加入300g的丙酮溶解，然后加入80目硅膠180g拌樣，用180目硅膠1500kg裝柱，拌樣后上柱；所使用的氯仿和丙酮混合有機(jī)溶劑的體積比依次為20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每個(gè)梯度洗脫到TLC點(diǎn)板無(wú)點(diǎn)后，更換下一梯度洗脫，收集梯度洗脫液、減壓濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測(cè)，合并相同的部分，得到6個(gè)部分A-F，其中，對(duì)收集到的樣品D(7:3)部分32g，再以40％的甲醇為流動(dòng)相，流速15ml/min，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT G F反相制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，每次進(jìn)樣80μL，收集41.6min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述苯并異呋喃類(lèi)化合物。

實(shí)施例3

取干燥的煙草15kg，粗粉碎至20目，用8倍煙草重量的90％的甲醇水溶液超聲提取2次，每次45分鐘，提取液合并；提取液過(guò)濾，減壓濃縮至原體積的1/4；靜置，濾除沉淀物，減壓濃縮成460g浸膏a；

在浸膏a中加入460g水，用與水等體積的乙酸乙酯萃取4次，合并有機(jī)溶劑萃取相，減壓濃縮成300g浸膏b；

在浸膏b中加入1500g的體積濃度為85％甲醇水溶液溶解，待浸膏b完全溶解后，上MCI柱，用15升體積濃度為93％甲醇水溶液洗脫，合并洗脫液，減壓濃縮得到150g浸膏c；

浸膏c中加入450g的甲醇溶解，然后加入100目硅膠120g拌樣，用160目硅膠1.2kg裝柱，拌樣后上柱；所使用的氯仿和丙酮混合有機(jī)溶劑的體積比依次為20:1、9:1、8:2、7:3、6:4和1:1，每個(gè)梯度洗脫到TLC點(diǎn)板無(wú)點(diǎn)后，更換下一梯度洗脫，收集梯度洗脫液、減壓濃縮，經(jīng)TLC監(jiān)測(cè)，合并相同的部分，得到6個(gè)部分A-F，其中，對(duì)收集到的樣品D(7:3)部分32g，再以40％的甲醇為流動(dòng)相，流速20ml/min，21.2×250mm，5μm的Zorbax PrepHT G F反相制備柱為固定相，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為278nm，每次進(jìn)樣100μL，收集41.6min的色譜峰，多次累加后蒸干，即得所述苯并異呋喃類(lèi)化合物。

實(shí)施例4

實(shí)施例4與實(shí)施例3的區(qū)別在于，超聲提取時(shí)，所用溶劑為95％乙醇水溶液。萃取時(shí)，采用的有機(jī)溶劑為乙醚。

實(shí)施例5

實(shí)施例5與實(shí)施例3的區(qū)別在于，超聲提取時(shí)，所用溶劑為90％丙酮水溶液。萃取時(shí)，采用的有機(jī)溶劑為石油醚。

實(shí)施例6

實(shí)施例1制備得到的苯并異呋喃類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)以下方法進(jìn)行測(cè)定；本發(fā)明化合物為淺黃色膠狀物；HRESI-MS顯示其準(zhǔn)分子離子峰為225.0898[M+Na]⁺(計(jì)算值225.0891),結(jié)合¹H NMR和DEPT譜確定其分子式為C₁₃H₁₄O₂，不飽和度為7。紅外光譜中顯示了芳環(huán)(1610、1561和1472cm^-1)的共振吸收峰。而紫外光譜在210、240、278nm有最大吸收也說(shuō)明了化合物中可能存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)?；衔锏?sup>1H和¹³C NMR譜(表1、圖1和圖2)顯示其含有13個(gè)碳和14個(gè)氫，包括1個(gè)1,2,4,5-四取代的苯環(huán)(C-4～C-7、C-4a和C-7a，H-7)，1個(gè)諧二甲基色烯環(huán)(C-1'～C-5'，H-1'、H-2'和H₆-4',5')，兩個(gè)氧化的亞甲基(C-1和C-3；H₂-1和H₂-3)。進(jìn)一步分析其HMBC相關(guān)信號(hào)，根據(jù)H₂-1和C-3、C-4a、C-7、C-7a；H₂-3和C-1、C-4、C-4a、C-7a；H-4和C-3、C-4a、C-7a；以及H-7和C-1、C-4a、C-7a的HMBC相關(guān)(圖3)可推測(cè)化合物為苯并異呋喃類(lèi)結(jié)構(gòu)。化合物的HMBC譜中可觀(guān)察到H-1'和C-4、C-5、C-6；H-2'和C-5，以及H-4和C-1'的遠(yuǎn)程相關(guān)，可推測(cè)諧二甲基色烯環(huán)取代在化合物的C-5和C-6位，并且C-1'位碳連接在苯環(huán)的C-4位。至此，化合物的結(jié)構(gòu)得到確定，并命名為化合物命名為：6,8-二氫-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯。

實(shí)施例7

取實(shí)施例2-5制備的化合物，為淺黃色膠狀物。測(cè)定與實(shí)施例6相同，確認(rèn)實(shí)施2-5制備的化合物為所述苯并異呋喃類(lèi)化合物——6,8-二氫-2,2-二甲基-2H-呋喃[3,4-g]色烯。

實(shí)施例8

對(duì)化合物進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)試，抗氧化活性以清除DPPH自由基能力的大小表示；以50μg/mL的乙醇溶液為初篩濃度，測(cè)定其清除脂性自由基DPPH的活性。取一塊costar 96孔板，加入新鮮配制的DPPH乙醇溶液(6.5×10⁵mol/L)190μL/孔，加入本發(fā)明化合物樣品l0μL/孔，空白孔加l0μL生理鹽水，充分混勻，用封板膜封板后室溫下避光靜置30分鐘，于UV2401分光光度計(jì)上測(cè)定儀上測(cè)定各孔吸光度值，測(cè)定波長(zhǎng)為517nm；樣品對(duì)脂性自由基DPPH清除率按下式計(jì)算:

DPPH清除率(％)＝(A_空白-A_樣品)/A_空白×100％

A_空白：空白對(duì)照組吸光度值；A_樣品：加樣品組吸光度值。

樣品平行5次檢測(cè)，計(jì)算半數(shù)清除濃度IC50測(cè)定結(jié)果為4.36μg/L，表明化合物具有良好的抗氧化活性和清除自由基活性。

實(shí)施例9

化合物的清除卷煙煙氣自由基效果測(cè)試：

(1)卷煙的葉組為：上部煙葉為15％，中部煙葉為48％，下部煙葉為23％，膨脹梗絲8％，煙草薄片6％；采用醋酸纖維嘴棒，嘴棒成型紙透氣度為4500CU；卷煙紙克重為50g/m²、透氣度為80CU的，水松紙透氣度為200CU。成品卷煙煙支的重量為0.93±0.02g，圓周為24.5mm，長(zhǎng)度為84mm(其中嘴棒長(zhǎng)度為25mm)。

試驗(yàn)化合物用香精注射機(jī)均勻添加到卷煙過(guò)濾嘴絲束中，每支卷煙添加量為0.5～5.0mg，并以未添加試驗(yàn)化合物的卷煙為對(duì)照。

(2)卷煙用RM200型20孔道自動(dòng)吸煙機(jī)在標(biāo)準(zhǔn)條件下吸煙，主流煙氣粒相物用44mm劍橋?yàn)V片捕集，氣相部分用采樣管捕集；粒相自由基用含0.05mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液為萃取劑從劍橋?yàn)V片溶出，并洗滌劍橋?yàn)V片，定容得粒相自由基測(cè)試液。氣相自由基用自由基采樣管，以0.05mol/L N-特丁基-α-苯基氮硐的苯溶液為吸收劑采集，卷煙抽吸完后取出氣相自由基采樣管，同時(shí)用少量吸收劑分3次沖洗通氣內(nèi)管外部和采樣管內(nèi)壁，合并吸收液和洗滌液，得氣相自由基樣品液。

(3)用順磁共振儀測(cè)定自由基，ESR分析實(shí)驗(yàn)條件：中心磁場(chǎng)＝3.385T，掃寬＝0.500T，微波頻率＝1.5GHz，掃描時(shí)間＝2min，掃描次數(shù)＝5，放大倍數(shù)＝10³～10⁵(根據(jù)峰高進(jìn)行調(diào)整)，樣品用量20μL；根據(jù)ESR圖譜中峰面積計(jì)算氣相及粒相自由基數(shù)量的變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，和對(duì)照樣相比，添加本發(fā)明化合物的卷煙氣相自由基降低率為16～24％，粒相自由基降低率在18～25％之間，該化合物對(duì)卷煙主流煙氣中的自由基具有確切的清除效果。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。