本發(fā)明涉及核酸檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種腹瀉相關(guān)病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

病原體感染引發(fā)的腹瀉是臨床上的多發(fā)性常見病，每年全世界大約有20億腹瀉病例，其中220萬人因此死亡，包括180萬兒童，是造成嬰幼兒死亡的重要病因。腹瀉一年四季都可以發(fā)病，其中夏秋季較為集中，感染原因多是由于食物或水源污染經(jīng)由糞口傳播造成的，可引起群體性發(fā)病和傳染病暴發(fā)流行等突發(fā)性公共衛(wèi)生事件，直接危害公眾健康和社會經(jīng)濟發(fā)展。腹瀉性疾病常見感染病原體包括病毒、細菌、寄生蟲等，所引起疾病和疫情的病原學復雜，因此快速準確多指標的病原體檢測將為疾病的診治提供充足的依據(jù)，并為疫情的控制提供基礎(chǔ)。

目前，常用的腹瀉相關(guān)病原體檢測技術(shù)包括病原體抗原檢測和核酸檢測兩個方面。酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)和免疫試紙條等方法是目前主要的基于蛋白的檢測方法，該類方法使用方便、快速，但缺點是檢測靈敏度相對較低，并且隨著抗原蛋白的變異，容易出現(xiàn)假陰性；同時抗原檢測易受到多種因素的影響，造成假陽性。而基于核酸的檢測方法是目前最普遍、最準確的病原體檢測技術(shù)，檢測方法主要包括pcr(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)和基于分子雜交的基因芯片技術(shù)。目前仍以pcr技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，其常用的技術(shù)方法包括普通定性pcr、巢式pcr、多重pcr、熒光定量pcr等方法。普通定性pcr方法檢測效率低，尤其檢測多基因?qū)ο髸r更加費時費力；巢式pcr雖然提高了檢測的靈敏度，但同樣存在檢測效率的問題；熒光定量pcr方法靈敏度高，但其成本高，并且需要特殊檢測儀器，同時單管的檢測指標數(shù)也很有限。多重pcr方法可以在一個反應(yīng)中同時檢測多個基因，可以實現(xiàn)多重擴增與檢測，其技術(shù)難點是要避免pcr過程中多條引物間的交聯(lián)反應(yīng)，并且各擴增子的最佳反應(yīng)條件要一致，目前常規(guī)設(shè)計的多重pcr檢測能力大概是10個指標左右，更優(yōu)的多重引物設(shè)計方案會顯著提高方法的多指標檢測能力。基因芯片是目前非常實用的病原體檢測技術(shù)，它可以和多重pcr技術(shù)配合使用，從而實現(xiàn)對目標病原體的多重擴增和多指標檢測，該技術(shù)對多重引物和探針的靈敏度和特異性要求很高，合理的引物和探針設(shè)置是關(guān)鍵。

目前腹瀉相關(guān)病原體檢測需要解決如下幾方面的問題：一是病原體種類多樣，已發(fā)現(xiàn)的常見病原體有幾十種，包括多種rna病毒、dna病毒、致病性大腸桿菌、其他致病性細菌和寄生蟲等。復雜的病原學要求檢測技術(shù)可以實現(xiàn)多達20個指標以上的平行檢測，并且具有同時檢測核酸rna和核酸dna的能力。二是很大一部分腹瀉相關(guān)病原體具有快速進化的特點，同一類病原體對應(yīng)的是一大組不同的變異基因，并且有能力在短時間內(nèi)突變出新的變異基因。這種特點給臨床檢測帶來了非常大的挑戰(zhàn)，要求檢測技術(shù)對一大組變異基因具有很好的覆蓋度，并且具有容忍基因變異的能力。三是腹瀉疾病是臨床多發(fā)性常見病，發(fā)病快，并且有集中爆發(fā)的特點，這要求檢測技術(shù)在短時間內(nèi)可以同時處理多個臨床樣本，具備快速檢測和高通量檢測的能力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過使用多重特異性保守簡并引物組合和探針組合解決常規(guī)引物和探針對高突變病原體檢測覆蓋率低的問題，解決多達20種以上腹瀉相關(guān)病原體單反應(yīng)體系平行檢測的問題，同時解決多重引物和探針之間非特異性交叉反應(yīng)的問題，克服現(xiàn)有技術(shù)單反應(yīng)體系檢測指標較少，費時費力的缺陷，提供一種操作簡單，快速靈敏，檢測通量大的腹瀉相關(guān)病原體基因檢測試劑盒。

本發(fā)明腹瀉相關(guān)病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測試劑盒，該試劑盒用于檢測以下病原體中的一種或多種：腺病毒，星狀病毒，諾如病毒gi型，諾如病毒gii型，輪狀病毒，沙波病毒，沙門氏菌，志賀氏桿菌，彎曲桿菌，艱難梭狀芽胞桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭桿菌，腸毒素性大腸桿菌，腸出血性大腸桿菌，腸致病性大腸桿菌，腸侵襲性大腸桿菌，腸聚集性大腸桿菌，霍亂弧菌，副溶血弧菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，嗜水氣單胞菌，單核細胞增多性李斯特氏菌，阪崎腸桿菌，金黃色葡萄球菌，隱孢子蟲，腸賈第蟲和痢疾阿米巴蟲；

試劑盒內(nèi)設(shè)有腹瀉相關(guān)病原體的引物組合和探針組合，同時設(shè)有人gapdh基因內(nèi)源對照以及陽性對照和陰性對照；

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明的腹瀉相關(guān)病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測試劑盒由引物組合、探針組合、基因芯片、輔料和配液構(gòu)成。

本發(fā)明特征在于引物組合為一組或多組多重特異性保守區(qū)簡并引物(multiplexspecificconserveddegenerateprimer，其中簡并位點的核苷酸表示為r＝a/g，y＝c/t，m＝a/c，k＝g/t，s＝c/g，w＝a/t，h＝a/c/t，b＝c/g/t，v＝a/c/g，d＝a/g/t，n＝a/c/g/t)，各對引物的堿基序列5’-3’如下，其中反向引物5’端帶cy5熒光基團標志：腺病毒，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：cagacaggtcrcagcgactg，

反向引物：cy5-5’-aagtaggtgctggccatgtc；

星狀病毒，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：trgarcactgcctntcdcggac，

反向引物：cy5-5’-yrgrcttrctagccatcrcac；

諾如病毒gi型，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：gcargccatgttccgytgga，

反向引物：cy5-5’-gcgtcyttagacgccatcatcat；

諾如病毒gii型，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：ctggctcccagyttygtgaa，

反向引物：cy5-5’-caatrgcrgcaccrrcwacg；

輪狀病毒，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：ccatctwcacatgaccctctatgagc，

反向引物：cy5-5’-acgsccctatagccatttaggt；

沙波病毒，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：ccctccatytcaaacacta，

反向引物：cy5-5’-vaaytwygayywggcyctcg；

沙門氏菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：gyacgatattcagtgcgatcagga，

反向引物：cy5-5’-ttaacagtgctcgtttacgacctg；

志賀氏桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：ggccttccagaccatgctcg，

反向引物：cy5-5’-cagtgcggaggtcatttgct；

彎曲桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：tgagtgctattaaaggyattgatktrggt，

反向引物：cy5-5’-ccataatgkccaaatccwccrctt；

艱難梭狀芽胞桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：gcaccatcaaiaacatatagagagccac，

反向引物：cy5-5’-ccaagcaaatactctatttggagcattagg；

產(chǎn)氣莢膜梭桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：ccagycataaartcatttcctgggt，

反向引物：cy5-5’-tcaactagtggtgaraaagatgctgg；

腸毒素性大腸桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：acagaaatctgaatatagctccggca，

反向引物：cy5-5’-ggtgcatgatgaatccagggt；

腸出血性大腸桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：caaagacgtatgtagattcgctgaatgtc，

反向引物：cy5-5’-actatcaatcatcagtaaagacgtacctcc；

腸致病性大腸桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：ggatttttctggtgataatacccgyttagg，

反向引物：cy5-5’-agtctttcttrttgtatgactcatgcca；

腸侵襲性大腸桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：gtagacataggttcttctgtt，

反向引物：cy5-5’-gttgccccacgctggttgtc；

腸聚集性大腸桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：ccatttatcgcaatcagattaarcagcga，

反向引物：cy5-5’-gctacaattattccttttgaccaattcgga；

霍亂弧菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：ggcccaacgtccaaacgagg，

反向引物：cy5-5’-tcgaaatggcttgggttaagct；

副溶血弧菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：cgaagttgtacgattaggaagcaacg，

反向引物：cy5-5’-acgccaaacaaactcgtgaagct；

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：tyagtgagaaccagtattccgct，

反向引物：cy5-5’-ctggtcgcggcacaattggt；

嗜水氣單胞菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：mgagctctacaaggcygayatctc，

反向引物：cy5-5’-tracgaaggtgtggytccagttcg；

單核細胞增多性李斯特氏菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：cagcatctccgcctgcaagtc，

反向引物：cy5-5’-ttcttggcggcacatttgtc；

阪崎腸桿菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：aagtmttcgkgctgcgagtt，

反向引物：cy5-5’-ttgctctytaacaatccggaacaagct；

金黃色葡萄球菌，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：tktttygaaagrrcaatacrc，

反向引物：cy5-5’-gtgatgcatytgctgagctac；

隱孢子蟲，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：gctgaattagaatcgacatgccca，

反向引物：cy5-5’-ggtggrcattcytttgcagga；

腸賈第蟲，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：cagacgtggagtctgcggct，

反向引物：cy5-5’-gcycgttgtcgcartggagc；

痢疾阿米巴蟲，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：gggagctttacagatggctacca，

反向引物：cy5-5’-gccctccaattgatttcgtaggagaa；

內(nèi)源對照gapdh基因，反向引物5’端帶cy5標志：

正向引物：atcttccaggagcgagatcc，

反向引物：cy5-5’-agggggcagagatgatgac；

并且，探針組合為順序固定于基因芯片表面的一條或多條核酸探針，包括腹瀉相關(guān)病原體特異性保守簡并探針、gapdh內(nèi)源對照探針，陽性雜交點探針和陰性雜交點探針，其中簡并位點的核苷酸表示為r＝a/g，y＝c/t，m＝a/c，k＝g/t，s＝c/g，w＝a/t，h＝a/c/t，b＝c/g/t，v＝a/c/g，d＝a/g/t，n＝a/c/g/t)，各探針的5’端做氨基標志(nh2)，各條探針的堿基序列5’-3’如下：

腺病毒探針：

nh2-5’-gamaccgcytaytcttacaaagtgcgctttacgctggccgtgggcgacaaccgggtktt；

星狀病毒探針：

nh2-5’-tgydaagcagcttcgtgantctgghytnccdgcyagrctcacwgaagagcaactycatc；

諾如病毒gi型探針：

nh2-5’-gcgnttccaygayytnrgnytdtggacaggrgaycgcratctbytrcccgawtwygtra；

諾如病毒gii型探針：

nh2-5’-gaagatggcgtcgartgacgccarcccatctgatgggtccrcrgccarcctygtcccag；

輪狀病毒探針：

nh2-5’-ccatctwcacatgaccctctatgagcrcaatagttaaaagctaacactgtcaaaaacct；

沙波病毒探針：

nh2-5’-tttgkkdgyhycttcabtgkrrcbvhctkgvhcnrknvctgyaccrcctatraaccadg；

沙門氏菌：

探針：

nh2-5’-aatcaaccagawaggtaggtaatggratgacgaacatagaaatgatcatcaccattagt；

志賀氏桿菌探針：

nh2-5’-gaaacttcagctctcyactgccgtgaaggaaatgcgtttctatggcgtgtcgggagtga；

彎曲桿菌探針：

nh2-5’-ttytatggtttagcwggtgkrggatatgargatttttcwaawgsygcttwtgataataa；

艱難梭狀芽胞桿菌探針：

nh2-5’-atgacgtattggaagtacaaaaagaagaacttgatttgtcaaaagatttaatggtatta；

產(chǎn)氣莢膜梭桿菌探針：

nh2-5’-cccattcttgagtttttccatcctttgttttgattccaaartacatgtagtcatctgtt；

腸毒素性大腸桿菌探針：

nh2-5’-gaggatggttacagattagcaggtttcccaccggatcaccaagcttggagagaagaacc；

腸出血性大腸桿菌探針：

nh2-5’-tagattcgctgaatgtcattcgctctgcaataggtactccattacagactatttcatca；

腸致病性大腸桿菌探針：

nh2-5’-tggsgaatactggcgagactatttcaaaagtagygtkaacggctatttccgcatgagcg；

腸侵襲性大腸桿菌探針：

nh2-5’-ttatttccttatgttcaaggaaataattgttggcctccttctctctttttgcttgtctc；

腸聚集性大腸桿菌探針：

nh2-5’-cgcctaaaggatgccctratgataatatacggaatatcaaaagtagatgcttgyagttg；

霍亂弧菌探針：

nh2-5’-ctcgcaatgatttgcatgactttgtttggcgagagcaaggttttgaagtcgatgattcc；

副溶血弧菌探針：

nh2-5’-aaagccgtatactcctgatgttggcggagagaccaaacgaagttttaacccgtaacgag；

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌探針：

nh2-5’-caccaaaacctttcactgatatgtagttgagtaaaaacatcagggcgaggaacarcgca；

嗜水氣單胞菌探針：

nh2-5’-vctgagyggyttcctgcgytggggyggcaaygcctggtayacccayccggacaaycgyc；

單核細胞增多性李斯特氏菌探針：

nh2-5’-ccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggrttggaytayaa；

阪崎腸桿菌探針：

nh2-5’-cayaccgcgmathcctkwttacsgarraatrcrgcagcrtgtctgtttcaattttcagc；

金黃色葡萄球菌探針：

nh2-5’-agaggtttttcwwwttcrctactagttgyttagtgttaaytttagttgtagyttcaagt；

隱孢子蟲探針：

nh2-5’-attcratatttgaaaatggaaaatgtaaagtgattaaaastattgatatggtctgccca；

腸賈第蟲探針：

nh2-5’-tgactcaacgcgygcacctcaccaggcccrgacgcgcggaggaccgacagccgggygcg；

痢疾阿米巴蟲探針：

nh2-5’-cgacacataactctagagttgagtaaaatcaattcttgaaggaatgagtaggaggtaaa；

內(nèi)源對照gapdh基因探針：

nh2-5’-tccaaaatcaagtggggcgatgctggcgctgagtacgtcgtggagtccactggcgtctt；

陽性雜交點探針：

nh2-5’-ccctcgggttaatgcgcgattgtcaccacacgttgcgagttatgttgctgcggagatgg；

陰性雜交點探針：

nh2-5’-gatcgtcgttgggctttagatttctcttataggctcggtcggcgcctctcgccccgagc；

本發(fā)明中所述基因芯片為表面固定有探針陣列的固相支持介質(zhì)，所述固相支持介質(zhì)為玻璃片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。

本發(fā)明中所述腹瀉相關(guān)病原體檢測試劑盒由引物組合、探針組合、基因芯片、輔料和配液組成，輔料為一步法逆轉(zhuǎn)錄擴增試劑(onesteprt-pcrreagent)、超純水(ultrapurewater)和5’端帶cy5標志的陽性寡核苷酸單鏈dna，5’端帶cy5標志的陽性寡核苷酸單鏈dna的堿基順序為cy5-5′-ccatctccgcagcaacataactcgcaacgtgtggtgacaatcgcgcattaacccgaggg-3’。

本發(fā)明中所述腹瀉相關(guān)病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測試劑盒由引物組合、探針組合、基因芯片、輔料和配液組成，配液為芯片點樣液、芯片清洗液、雜交液、清洗液i和清洗液ii。

上述方案中，所述芯片點樣液為50％dmso；芯片清洗液為5xssc(20xssc：3mnacl，0.3mna3citrate·2h2o，ph7.0)，0.2％sds；雜交液為5xssc，0.1％sds；清洗液i為0.5xssc，0.1％sds；清洗液ii為0.05xssc。

本發(fā)明設(shè)計采用經(jīng)特殊設(shè)計的多重特異性保守簡并引物(multiplexspecificconserveddegenerateprimer)進行目標序列擴增。腹瀉相關(guān)病原體種類多樣，已發(fā)現(xiàn)的常見病原體有二十幾種，并且很大一部分是高度易突變的病原體，如諾如病毒、輪狀病毒和沙波病毒等，序列變異大，進化迅速，即使同一類病原體內(nèi)部也存在多種不同變異株。針對腹瀉相關(guān)病原體種類多，變異快的特征，本發(fā)明在多重引物設(shè)計中解決兩方面技術(shù)問題：一是設(shè)計特異性保守簡并引物，保證引物在不同類病原體間的特異性，尤其是在不同亞型病原體間的特異性，同時設(shè)計保證引物在同一類病原體不同變異株間的保守性和檢測覆蓋度，引物采用特異性保守簡并引物，即可以涵蓋同一類病原體的多種變異類型，對目標基因的位點突變具有很強適應(yīng)性，同時又可以有效地避免非特異性擴增，尤其適合檢測高突變多亞型的病原體。二是設(shè)計解決多達20種以上病原體單反應(yīng)體系多重擴增的問題，通過引物間的相互匹配設(shè)計，避免引物間的相互交聯(lián)。

本發(fā)明采用基于多重特異性保守簡并引物的一步法逆轉(zhuǎn)錄多重rt-pcr(one-stepreversetranscriptionpolymerasechainreaction)擴增技術(shù)檢測腹瀉相關(guān)病原體。多重rt-pcr方法是將多對引物放到同一個反應(yīng)管中，并在同一體系中依次進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和pcr擴增反應(yīng)，達到單管反應(yīng)體系同時檢測多種目標rna/dna序列的目的。

本發(fā)明采用一組特異性保守簡并探針檢測多重rt-pcr產(chǎn)物中的目標序列。簡并探針采用長探針設(shè)計，長度為59個核苷酸，相對于短探針，長探針與目標基因的結(jié)合更牢固，檢測靈敏度更高。特異性保守簡并探針5’端帶氨基(nh2)修飾，方便探針與基因芯片的結(jié)合。

本發(fā)明采用基因芯片方面進行腹瀉相關(guān)病原體的分子雜交檢測，基因芯片技術(shù)基于核酸分子雜交原理。其工作過程是首先將針對各個腹瀉相關(guān)病原體的單鏈探針按順序排列固定于固相支持介質(zhì)表面的特定區(qū)域，形成低密度探針陣列，再將待測的多重rt-pcr產(chǎn)物與其雜交，這樣產(chǎn)物中的目標基因序列就會和支持介質(zhì)上的探針雜交，目標序列產(chǎn)物dna上帶有熒光基團標志，結(jié)合了待測dna的探針點就偶聯(lián)上了標志物，在經(jīng)過相應(yīng)洗滌和熒光掃描等步驟就能讀取對應(yīng)的雜交信號，這樣一張芯片上就可以同時檢測多個腹瀉相關(guān)病原體目標序列。

本發(fā)明的有益效果是：

1)提供腹瀉相關(guān)病原體多重pcr引物和檢測探針組合，解決多達20種以上病原體單反應(yīng)體系多重擴增和檢測的問題；2)檢測探針和引物采用特異性保守簡并寡核苷酸設(shè)計，提高了對目標序列的檢測覆蓋度，尤其適合具有高突變特點的腹瀉相關(guān)病原體檢測；3)設(shè)計避免了多重體系中不同引物之間的非特異性交叉反應(yīng)；4)設(shè)計避免了引物與樣本中潛在的非目標序列間的非特異性擴增；5)設(shè)計避免探針與非目標序列產(chǎn)物dna的非特異性雜交；6)操作簡單，經(jīng)過一次樣本前處理，單管rt-pcr擴增，單芯片雜交就可以同步檢測樣本中多種腹瀉相關(guān)病原體，具有平行分析和多重判斷的特點；7)檢驗對象完備，包含了26種常見的腹瀉相關(guān)病原體，并且可以很方便的加入新的檢測序列；8)試劑盒采用了基因芯片的檢測方式，提高了系統(tǒng)的多指標平行檢測能力；9)試劑盒操作簡單，便捷，適用于腹瀉相關(guān)病原體的大規(guī)模檢測。

附圖說明

圖1-3為本發(fā)明用于檢測腹瀉相關(guān)病原體樣本基因芯片雜交結(jié)果，其中：

圖1為芯片探針分布模式圖；

圖2為26份腹瀉樣本檢測結(jié)果圖；

圖3為27份陽性對照(26種病原體標準核酸分子和1種gapdh內(nèi)源對照標準核酸分子)和1份陰性對照(h2o)檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

腹瀉相關(guān)病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測試劑盒，該試劑盒用于檢測以下病原體中的一種或多種：腺病毒，星狀病毒，諾如病毒gi型，諾如病毒gii型，輪狀病毒，沙波病毒，沙門氏菌，志賀氏桿菌，彎曲桿菌，艱難梭狀芽胞桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭桿菌，腸毒素性大腸桿菌，腸出血性大腸桿菌，腸致病性大腸桿菌，腸侵襲性大腸桿菌，腸聚集性大腸桿菌，霍亂弧菌，副溶血弧菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，嗜水氣單胞菌，單核細胞增多性李斯特氏菌，阪崎腸桿菌，金黃色葡萄球菌，隱孢子蟲，腸賈第蟲和痢疾阿米巴蟲；同時設(shè)有人gapdh基因內(nèi)源對照以及陽性對照和陰性對照。除引物和探針組合外，試劑盒中還包含基因芯片、輔料和配液。

實施例一：腹瀉相關(guān)病原體多重rt-pcr聯(lián)合基因芯片檢測試劑盒。

1)多重特異性保守簡并引物和探針的設(shè)計與制備：

從核酸數(shù)據(jù)庫下載各病原體的核酸序列，進行多序列比對(ncbidatabase，clustalw)，根據(jù)比對結(jié)果生成一條簡并序列(python程序)；剔除序列中的高變異區(qū)(python程序)，并經(jīng)引物設(shè)計過程生成多對候選引物(primer3，python程序)，序列比對分析候選引物特異性，以避免與樣品中其他核酸發(fā)生交叉反應(yīng)(blast+)；之后評估不同目標基因間引物兼容性，評估內(nèi)容包括tm值相似性、引物二聚體傾向和3’末端雜交傾向(python程序)，最終生成多重簡并引物組合；再根據(jù)引物擴增區(qū)域，使用相應(yīng)程序設(shè)計特異性保守簡并探針(python程序)，再通過序列比對分析探針的特異性以避免與樣品中其他核酸發(fā)生交叉反應(yīng)(blast+)。內(nèi)源對照gapdh采用相同的設(shè)計方法。陽性對照探針和陰性對照探針為隨機生成的59個核苷酸的寡核苷酸，并且通過序列比對避免與待檢病原體序列發(fā)生非特異性交聯(lián)。根據(jù)陽性對照探針生成陽性寡核苷酸單鏈dna，其序列為陽性對照探針的反向互補序列。采用固相亞磷酰胺三酯法合成得到上述引物和探針組合以及相應(yīng)的對照序列。最后通過實驗方法驗證探針和引物的性能。

2)制備基因芯片：

采用微定量噴點式基因芯片點樣儀，將各個核苷酸探針(探針用芯片點樣液溶解，濃度10μmol/l)分布在光學級氨基芯片上的特定位置區(qū)域。芯片置于80℃烘2小時以固定探針，固定后芯片在清洗液中清洗5分鐘，后無水乙醇洗滌，離心甩干，處理好的芯片室溫保存。芯片表面包被的探針陣列布局如圖1。

3)制備陽性標準核酸分子：

使用基因合成的方法制備各病原體和內(nèi)對照的陽性標準核酸分子，合成區(qū)包括pcr擴增區(qū)及上下游各150個核苷酸的區(qū)域。合成序列插入到pet-30a質(zhì)粒載體，之后經(jīng)過質(zhì)粒提取、純化和定量，并稀釋成10⁵copies/μl，用來作為多重pcr擴增和基因芯片檢測的陽性標準核酸分子。

4)準備pcr反應(yīng)預(yù)混液：使用superrtonesteprt-pcrkit(cwbio)，體系中含有逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶、rna酶抑制劑、dntp等成分。每管反應(yīng)需準備15μl反應(yīng)預(yù)混液，預(yù)混液包含：2×rt-pcr反應(yīng)緩沖液(12.5μl)、酶混合液(0.5μl)、引物混合液(2μl)，其中引物混合液中含有各病原體的擴增引物，其中每條cy5標志的引物濃度為3.75μmol/l，每條非標志引物的濃度為2.5μmol/l。

5)提取樣本核酸：采集待檢臨床樣本，樣本類型可以為糞便、肛門拭子等樣本。之后采用適當?shù)暮怂崽崛〖夹g(shù)(如病毒基因組dna/rna提取試劑盒viraldna/rnakit，cwbio；糞便基因組提取試劑盒，tiangen)從樣本中抽提核酸。

6)多重pcr擴增反應(yīng)：采用25μl擴增體系，組成為：pcr反應(yīng)預(yù)混液(15μl)，樣本提取核酸(5μl)，超純水(5μl)。同時設(shè)置陽性對照(陽性標準核酸分子)和陰性對照(無菌水)，并以相同的體系對陽性對照和陰性對照進行混合操作。隨后將各反應(yīng)管按照如下程序進行多重pcr擴增：45℃保持30分鐘(逆轉(zhuǎn)錄)；95℃保持2分鐘(熱啟動)；之后進入35個熱循環(huán)過程，94℃保持30秒，55℃保持30秒，72℃保持30秒；最后72℃保持5分鐘。

7)基因芯片雜交檢測：將芯片微陣列面朝上放入雜交設(shè)備中，在點陣位置加上配制好的雜交液(使用前配制，500～1000μl雜交液(5xssc，0.1％sds)中加入20μl多重pcr擴增產(chǎn)物，同時加入1μl濃度為2μmol/l陽性寡核苷酸單鏈dna)，小心蓋上雜交盒上蓋，50℃雜交1小時；取出芯片，將芯片放入42℃清洗液i(0.5xssc，0.1％sds)中清洗2分鐘，之后將芯片再放入42℃清洗液ii(0.05xssc)中清洗2分鐘，離心甩干；用合適的熒光掃描儀掃描芯片(如博奧luxscan10k掃描儀)，之后根據(jù)雜交點熒光信號進行結(jié)果判讀。

實施例二：腹瀉相關(guān)病原體陽性樣本檢測。

使用帶有如下病原體的腹瀉陽性樣本，樣本類型為糞便樣本：腺病毒，星狀病毒，諾如病毒gi型，諾如病毒gii型，輪狀病毒，沙波病毒，沙門氏菌，志賀氏桿菌，彎曲桿菌，艱難梭狀芽胞桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭桿菌，腸毒素性大腸桿菌，腸出血性大腸桿菌，腸致病性大腸桿菌，腸侵襲性大腸桿菌，腸聚集性大腸桿菌，霍亂弧菌，副溶血弧菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，嗜水氣單胞菌，單核細胞增多性李斯特氏菌，阪崎腸桿菌，金黃色葡萄球菌，隱孢子蟲，腸賈第蟲和痢疾阿米巴蟲，共26份陽性樣本。同時設(shè)置陽性對照(26種病原體標準核酸分子和1種gapdh內(nèi)源對照標準核酸分子)和陰性對照(無菌水)，并以相同的過程實施檢測。引物和探針組合、輔料、配液以及對照標準質(zhì)粒分子的獲取見實施例一。

利用核酸提取試劑盒(病毒基因組dna/rna提取試劑盒viraldna/rnakit，cwbio；糞便基因組提取試劑盒，tiangen)從樣本中抽提核酸，核酸最后溶于50μl核酸洗脫液。吸取5ul核酸樣本，用于多重pcr擴增。采用25μl擴增體系，組成為：pcr反應(yīng)預(yù)混液(15μl)，樣本提取核酸(5μl)，超純水(5μl)。同時設(shè)置陽性對照(陽性標準核酸分子)和陰性對照(無菌水)，并以相同的體系對陽性對照和陰性對照進行混合操作。隨后將各反應(yīng)管按照如下程序進行多重pcr擴增：45℃保持30分鐘(逆轉(zhuǎn)錄)；95℃保持2分鐘(熱啟動)；之后進入35個熱循環(huán)過程，94℃保持30秒，55℃保持30秒，72℃保持30秒；最后72℃保持5分鐘。

使用基因芯片方法檢測多重pcr產(chǎn)物，具體過程同實施例一，之后根據(jù)雜交點的顯色情況進行結(jié)果判讀。結(jié)果26份樣本中可分別檢測到26中腹瀉相關(guān)病原體的存在，同時27份陽性對照(26種病原體標準核酸分子和1種gapdh內(nèi)源對照標準核酸分子)和1份陰性對照(無菌水)雜交點顯色正確。檢測結(jié)果如圖2和圖3。