本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種可降解環(huán)境激素雙酚a的紅球菌dsh及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在過去半個世紀(jì)，環(huán)境激素對人類和野生動物賴以生存的自然環(huán)境造成了嚴(yán)重的危害，已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)共同亟待解決的環(huán)境污染問題，引起了人們的廣泛關(guān)注。環(huán)境激素作為一種常見的內(nèi)分泌干擾物，與機體正常情況下分泌的雌性激素在結(jié)構(gòu)和功能上類似。一旦進入機體，不僅可以擾亂機體正常的內(nèi)分泌激素的合成與代謝，影響生長發(fā)育和性別分化，還能引起神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫等多系統(tǒng)發(fā)育異常和生殖障礙，甚至致畸和致癌等。

環(huán)境激素能夠利用洋流作用從低緯度地域轉(zhuǎn)移至高緯度地域，乃至能夠到達極地生態(tài)系統(tǒng)。另外，由于環(huán)境激素能通過食物鏈在高等生物體內(nèi)富集和放大，對人類健康和動物生態(tài)安全產(chǎn)生巨大威脅。雙酚a(bisphenola，bpa)，在眾多的外源性內(nèi)分泌干擾物中被公認(rèn)為是對環(huán)境的潛在影響和危害最大的幾種雌激素之一。首先，污染范圍廣，在空氣、土壤以及河流中都檢測到bpa，且濃度達到ng/l級。其次，在人體內(nèi)沒有特定的代謝系統(tǒng)，難以降解，去除上有較大困難，對人類健康危害較大。因此，受到了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。

目前，去除環(huán)境中bpa的方法總體上可以分為物理方法、化學(xué)方法以及生物方法。物理方法主要是采用活性炭等吸附劑對bpa進行吸附去除；化學(xué)方法是采用高級氧化法氧化處理bpa，主要有電化學(xué)氧化法及催化氧化法等；生物方法主要是篩選、分離和馴化bpa降解菌對bpa進行去除。生物方法具有運行成本低、污染物去除徹底等優(yōu)點，同時也是治理污水處理廠以及環(huán)境中受雌激素污染的水體和土壤的主要途徑。關(guān)于用生物方法去除環(huán)境中雌激素的課題，國內(nèi)研究起步相對較晚，而且，研究者對環(huán)境激素的研究也主要集中在雌激素的毒理學(xué)研究、檢測方法探索以及雌激素污染的風(fēng)險評價上，對環(huán)境激素的微生物降解特性及降解機理的研究較少，急需開展廣泛深入的研究。隨著環(huán)境激素污染的日益加劇，探尋一種高效、經(jīng)濟、綠色的環(huán)境激素去除方法，對控制和治理環(huán)境激素污染具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能夠穩(wěn)定、高效的可降解環(huán)境激素雙酚a的紅球菌dsh及其應(yīng)用，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種可降解環(huán)境激素雙酚a的紅球菌dsh，紅球菌屬(rhodococcussp.)，命名為紅球菌dsh，其保藏編號為cgmccno.12392；該紅球菌dsh于2016年4月25日保藏到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

所述紅球菌dsh的16srdna的片段的序列如序列表中seqidno：1所示。

作為本發(fā)明進一步的方案：上述紅球菌dsh，按以下步驟制備：

1)采集藥廠污水處理廠的活性污泥作為微生物源；

2)以雙酚a為唯一碳源，將菌株dsh培養(yǎng)在雙酚a的濃度為5mg/l的無機鹽培養(yǎng)基中，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

3)從每個無機鹽培養(yǎng)基中取200μl菌液置入新鮮的無機鹽培養(yǎng)基中(其中該無機鹽培養(yǎng)基中bpa濃度為10mg/l)，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7d。然后，再從每個無機鹽培養(yǎng)基取200μl菌液置入新鮮的無機鹽培養(yǎng)基(其中該無機鹽培養(yǎng)基中bpa濃度為20mg/l)，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7d。

4)按上述步驟繼續(xù)將菌液接種到含有bpa濃度分別為40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l(重復(fù)三次)的新鮮無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

5)取1ml菌液用無菌水稀釋成梯度為10^-2～10^-8，將經(jīng)過不同梯度稀釋的菌液涂布到lb瓊脂培養(yǎng)基上，經(jīng)過反復(fù)劃線，最終得到純化的紅球菌dsh。

其中，所述無機鹽培養(yǎng)基的成分包括：na2hpo44.260g/l；kh2po42.650g/l；mgso4·7h2o0.200g/l；(nh4)2so41.500g/l；cacl20.020g/l；用0.1mol/lnaoh和0.1mol/lhcl調(diào)ph為7.0；加入1ml的微量元素。

其中，微量元素的成分包括：nicl2·6h2o0.024g/l；cocl2·6h2o0.190g/l；h3bo30.006g/l；zncl20.070g/l；cucl2·2h2o0.002g/l；mnso4·h2o0.061g/l；na2moo4·2h2o0.024g/l。

lb瓊脂培養(yǎng)基的成分包括：胰蛋白胨10g/l；酵母提取物5g/l；nacl10g/l；待lb瓊脂培養(yǎng)基完全溶解后，調(diào)ph為7.4。

本發(fā)明另一目的是提供所述紅球菌dsh在降解環(huán)境激素中的應(yīng)用。

作為本發(fā)明進一步的方案：環(huán)境激素為雙酚a。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過對生產(chǎn)雙酚a的藥廠的活性污泥進行富集馴化、純化分離以及復(fù)篩，得到紅球菌dsh。本發(fā)明篩選出的紅球菌對雙酚a具有很強的降解能力，將紅球菌dsh培養(yǎng)在以雙酚a為唯一碳源的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)7天，能將濃度為100mg/l的雙酚a快速降解，降解率在96％以上，該紅球菌dsh能穩(wěn)定、高效的降解雙酚a，可將其應(yīng)用于處理環(huán)境中雙酚a的生物降解與環(huán)境修復(fù)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh在lb瓊脂培養(yǎng)基上形態(tài)圖。

圖2是本發(fā)明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh革蘭氏染色圖。

圖3是本發(fā)明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh在電子顯微鏡下的形態(tài)圖。

圖4是本發(fā)明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh的系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖5是本發(fā)明的紅球菌(rhodococcussp.)dsh對雙酚a的降解率和od值的結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明所提供的紅球菌dsh來源于藥廠的污水處理廠活性污泥中，經(jīng)過富集馴化、純化分離及復(fù)篩所得。紅球菌dsh在lb瓊脂培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，表面圓潤，邊緣完整，呈淺粉色，不透明，直徑約1.5～3.0mm(圖1)，革蘭氏染色呈陽性(圖2)，在掃描電鏡下觀察菌株的形態(tài)為：呈球形，無鞭毛(圖3)。吲哚、v-p、半乳糖陰性，能將明膠液化，能水解蔗糖、果糖、葡糖糖，鳥氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶呈陽性。將菌株的16srdna的基因序列輸入到ncbi在線blast比對程序與基因庫中的核酸數(shù)據(jù)進行同源性比對檢索。比對結(jié)果表明，紅球菌dsh的16srdna基因序列與紅球菌屬(rhodococcus)中的多株紅球菌和馬紅球菌的16srdna的基因序列有較高的同源性。選取紅球菌屬中的18株細(xì)菌的16srdna基因序列，并選取分支桿菌屬(mycobacterium)中的2株細(xì)菌16srdna基因序列做外群，使用mega軟件并根據(jù)neighbor-joining進行系統(tǒng)進化樹分析，構(gòu)建的無根系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，結(jié)合紅球菌dsh的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)，初步鑒定dsh為紅球菌，命名為紅球菌(rhodococcussp.)dsh。該紅球菌dsh于2016年4月25日保藏到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.12392。

具體操作過程如下所述。

實施例1紅球菌(rhodococcussp.)dsh菌株的獲取與保藏

采集藥廠和污水處理廠的泥樣、水樣作為微生物源，冷藏運回實驗室。并對樣品進行唯一碳源培養(yǎng)。取15mg雙酚a溶于30ml甲醇中，制成濃度為500mg/l的雙酚a母液。取1ml雙酚a母液加入到盛有100ml無機鹽培養(yǎng)基的三角瓶中，使無機鹽培養(yǎng)基中雙酚a的終濃度為5mg/l。無機鹽培養(yǎng)基組成(g/l)：na2hpo44.260；kh2po42.650；mgso4·7h2o0.200；(nh4)2so41.500；cacl20.020。用0.1mol/lnaoh和0.1mol/lhcl調(diào)ph為7.0，加入1ml的微量元素。微量元素組成(g/l)：nicl2·6h2o0.024；cocl2·6h200.190；h3bo30.006；zncl20.070；cucl2·2h2o0.002；mnso4·h2o0.061；na2moo4·2h2o0.024。將三角瓶放入恒溫水浴鍋中，60℃水浴30min，使甲醇完全揮發(fā)。將三角瓶瓶口用紗布、牛皮紙密封后放入高壓滅菌鍋中，溫度121℃，高壓滅菌20min。將泥樣按體積比10％加入到盛有已滅菌的培養(yǎng)基的三角瓶中(培養(yǎng)基體積為90ml)；將水樣按體積比10％加入到另一盛有已滅菌的培養(yǎng)基的三角瓶中(培養(yǎng)基體積為90ml)。在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，每個培養(yǎng)基取200μl菌液加入新鮮培養(yǎng)基(雙酚a濃度為10mg/l)，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7d。然后，從每個培養(yǎng)基取200μl菌液加入新鮮培養(yǎng)基(雙酚a濃度為20mg/l)，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7d。按此法將菌液接種到含有雙酚a濃度分別為40mg/l、60mg/l、80mg/l、100mg/l(重復(fù)三次)的新鮮無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將經(jīng)過不同梯度稀釋的菌液涂布到lb瓊脂培養(yǎng)基上，每個梯度做3個平行組。將lb瓊脂培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱，30℃，培養(yǎng)3d，觀察菌落長勢。挑取顏色、形態(tài)等不同的菌落在lb瓊脂培養(yǎng)基上進行多次劃線，直至分離出單個菌落。菌株dsh的平板劃線圖如圖1所示。菌株dsh經(jīng)過擴大培養(yǎng)后，一部分于-80℃甘油混合液保藏，一部分于4℃試管斜面保存。本發(fā)明的紅球菌dsh已于2016年4月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，登記入冊編號為cgmccno.12392。

實施例2紅球菌(rhodococcussp.)dsh菌株的鑒定

用細(xì)菌的通用引物通過pcr擴增技術(shù)擴增dna。測序結(jié)果利用ncbi中的blast工具與genbank數(shù)據(jù)庫中的16srdna基因序列進行同源性比對檢索。比對結(jié)果表明，紅球菌dsh的16srdna基因序列與紅球菌屬(rhodococcus)中的多株紅球菌和馬紅球菌的16srdna的基因序列有較高的同源性。選取紅球菌屬中的18株細(xì)菌的16srdna基因序列，并選取分支桿菌屬(mycobacterium)中的2株細(xì)菌16srdna基因序列做外群，使用mega軟件并根據(jù)neighbor-joining進行系統(tǒng)進化樹分析，構(gòu)建的無根系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)合紅球菌dsh的形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)，初步鑒定菌株dsh為紅球菌，命名為紅球菌(rhodococcussp.)dsh。

實施例3紅球菌(rhodococcussp.)dsh對雙酚a的降解能力

將菌株接種到含有濃度為50mg/l雙酚a的無機鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h。將菌液倒入滅菌的離心管中，4000rpm離心10min，棄上清液，加入ph為7的磷酸鹽緩沖溶液洗滌，再4000rpm離心15min，倒去上清液。如此反復(fù)洗滌3次，用漩渦混合器將菌體打散，最后，用磷酸鹽緩沖溶液將菌液稀釋到od600值為1.0，制成菌懸液備用。從每株細(xì)菌的菌懸液中取出200μl的菌液接種到以雙酚a為唯一碳源，濃度為50mg/l的無機鹽培養(yǎng)基中，在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中在30℃，120rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7d，每天取一次樣。將培養(yǎng)基經(jīng)過預(yù)處理后，用高效液相色譜儀(high-performanceliquidchromatography，hplc)檢測各株細(xì)菌對雙酚a的降解能力(圖5)。檢測器uv(dualλabsorbancedetector，water2487)，色譜柱為zorbaxeclipseplusc18柱(150×4.6mm，3.5mm)。流動相體積比為乙腈∶水＝1∶1，檢測器波長為275nm，流速為0.8ml/min，進樣量為10μl。并用酶標(biāo)儀檢測細(xì)菌的生長狀況，細(xì)菌的生長狀況用od600表示。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。