本發(fā)明涉及一種聚磷菌印跡生物炭的制備方法，特別涉及一種聚磷菌印跡生物炭的制備方法及應用。

背景技術：

我國每年有大量的鋸末、秸桿等生物質(zhì)遭到焚燒浪費，這不僅會給環(huán)境帶來污染危害，還會造成生物能源的浪費和損失。如何充分而又合理地利用這類“廢料”，使其變廢為寶，這是需要人們亟待解決的問題。通過熱解、改性制得的生物炭具有一定的吸附重金屬作用，能降低環(huán)境重金屬的遷移性、生物有效性，被廣泛研究，然而，單一的生物炭由于本身表面吸附位點非常有限，其吸附性能和穩(wěn)定性受到很大限制。因此，研究開發(fā)新型的具有高吸附容量、鈍化性質(zhì)穩(wěn)定和廉價實用的吸附劑，是其進一步發(fā)展和應用的關鍵，具有重要意義。

聚磷類菌種是礦渣/土壤中常見的一類微生物，其可作為環(huán)境載體吸持包括cr、u等在內(nèi)的污染物，或通過礦化沉淀等作用改變cr、pb的形態(tài)將其吸附固定，進而降低廢水中重金屬的含量或土壤中重金屬的遷移性、生物有效性和毒性。為了使聚磷菌固定在生物炭的表面，增加聚磷菌附著吸附點位及穩(wěn)定性，以期在載體的保護下提高細胞對重金屬的耐受性，增加單位體積內(nèi)的生物量，協(xié)同生物炭的作用提高對重金屬的吸附效率。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于針對現(xiàn)有技術存在的技術問題，開發(fā)一種高吸附容量、性質(zhì)穩(wěn)定和廉價實用的可用于吸附處理重金屬離子的固定化微生物印跡生物炭。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案包括以下步驟：

(1)取5-10g鋸末，在200-700℃溫度下進行厭氧恒溫熱解4h；完全炭化后冷卻至室溫取出，得生物炭，將生物炭混勻研磨，過100目篩，于干燥器中保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取10g活性污泥加入90ml無菌水中混勻，室溫靜置10min，取上清液通過10倍稀釋法將其制成濃度分別為10^-1到10^-6的6種菌懸液，分別取0.2ml不同濃度的菌液均勻涂布到固體富磷平板上，于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，在出現(xiàn)明顯單菌落的梯度平板中，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到富磷培養(yǎng)基上反復純化至平板上的單菌落形態(tài)一致，得初純菌株，接于lb固體培養(yǎng)基斜面上，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)將一部分初純菌株接入馴化培養(yǎng)基三角瓶中，瓶口用八層紗布封口，置于恒溫培養(yǎng)搖床以溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為150r/min條件下進行好氧培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察好氧培養(yǎng)條件下菌體積累聚磷顆粒的情況；另外，將另一部初純菌株接入另一馴化培養(yǎng)基三角瓶中，隨后將瓶中充入氮氣使瓶內(nèi)處于厭氧狀態(tài)，用橡膠塞密封進行好氧培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察厭氧培養(yǎng)條件下菌體內(nèi)積累phb顆粒的情況；分別對好氧培養(yǎng)中菌體積累的聚磷顆粒和厭氧培養(yǎng)條件下菌體內(nèi)積累的phb顆粒進行染色，選取在兩種染色方法中都呈陽性的菌體為初篩菌；

(4)將初篩菌株接入聚磷培養(yǎng)液中，在30℃、轉(zhuǎn)速為150r/min搖床振蕩培養(yǎng)12h，然后在10000r/min轉(zhuǎn)速下-30℃冷凍離心10min，取上清液稀釋，用鉬銻抗分光光度法，在700nm處測量其吸光度，計算磷的去除率，取菌體聚磷率大于60％的菌株為復篩菌；

(5)步驟1)中得到的磷基生物炭和復篩菌按照質(zhì)量比20:1的比例，分別加入固定化培養(yǎng)基中，固定化培養(yǎng)基包括：蔗糖10g/l，牛肉膏6g/l，酵母粉1.5g/l，ph7.0，將固定化培養(yǎng)基在溫度30℃、160r/min的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)18h，然后用30目的篩子過濾出吸附好菌體的磷基生物炭，即聚磷菌印跡生物炭。

優(yōu)選的，制備生物炭厭氧恒溫熱解溫度為400-500℃。

優(yōu)選的，所述的富磷培養(yǎng)基包括：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，氯化鈉5g/l，磷酸二氫鉀0.2g/l，瓊脂18g/l，富磷培養(yǎng)基ph為7.0。

優(yōu)選的，所述的馴化培養(yǎng)基包括：乙酸鈉0.34g/l，氯化銨0.076g/l，硫酸鎂0.02g/l，氯化鈣0.01g/l，磷酸二氫鉀0.09g/l，碳酸氫鈉0.3g/l，微量元素混合液1ml，馴化培養(yǎng)基ph7.5。

優(yōu)選的，所述的微量元素混合液包括：乙二酸四乙胺10g/l，硫酸亞鐵1.54g/l，硼酸0.15g/l，五水硫酸銅0.03g/l，氯化錳0.12g/l，碘化鉀0.18g/l，鉬酸鈉0.06g/l，七水硫酸鋅0.12g/l，六水合二氯化鈷0.15g/l。

優(yōu)選的，所述的聚磷培養(yǎng)液包括：牛肉膏0.22g/l，乙酸鈉0.5g/l，硫酸鎂0.4g/l，硫酸亞鐵0.002g/l，硫酸銅0.08g/l，硫酸銨0.2g/l，磷酸氫二鉀0.0147g/l，聚磷培養(yǎng)液ph7.0。

本發(fā)明還提供了一種聚磷菌印跡生物炭的應用，所述的聚磷菌印跡生物炭由上述的一種聚磷菌印跡生物炭吸附劑的制備方法制得，其應用于重金屬廢水的處理。

優(yōu)選的，聚磷菌印跡生物炭在重金屬廢水中用量為0.3～0.6g/l。

優(yōu)選的，聚磷菌印跡生物炭在重金屬廢水中反應條件為：重金屬廢水ph值5～7，反應時間為3～6小時。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明所公開的生物質(zhì)炭在優(yōu)選溫度400-500℃范圍內(nèi)制備，最大限度降低制備過程有機碳的損失，又盡可能提高了所形成高度芳香化有機化合物的穩(wěn)定性；然后將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的假單胞菌接種到發(fā)酵罐中，并加入生物炭，將聚磷菌進行固定化處理，得到聚磷菌印跡生物炭吸附劑。

利用本發(fā)明方法制備得到的負載聚磷菌的生物炭對于重金屬廢水處理有特別優(yōu)良的效果，以重金屬cr及金屬u離子為例，將負載聚磷菌的生物炭投加到含cr及u溶液中，經(jīng)聚磷菌與生物炭協(xié)同作用，吸附很快達到平衡，它可使廢水中的鉻、金屬鈾含量分別下降80.2-82.1％與78.9-82.7％。

本發(fā)明使用主要原料鋸末來源廣泛，制備生物炭使其變廢為寶，其它的諸如濃硝酸，磷酸鈣是常用的化工產(chǎn)品；聚磷菌常見于城市生活污水處理的剩余污泥中，分離，提取方便。

與現(xiàn)有生物炭或類生物炭吸附劑技術相比，本發(fā)明提供的負載聚磷菌的生物炭可以為微生物提供了一個良好的生存環(huán)境，而且還可以幫助聚磷菌提高抵御高鹽度和重金屬的能力，同時吸附位點增多，且具有相當?shù)姆€(wěn)定性，對重金屬的吸附性能大大提高；產(chǎn)品無毒，對環(huán)境友好，本發(fā)明提供的制備方法簡易，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

下面結合附圖對本發(fā)明作進一步說明：

圖1聚磷菌印跡生物炭的掃描電鏡圖；

圖2聚磷菌印跡生物炭的放大掃描電鏡圖；

圖3聚磷菌印跡生物炭的能譜圖；

圖4普通生物炭的掃描電鏡圖；

圖5普通生物炭的放大掃描電鏡圖；

圖6普通生物炭的能譜圖；

圖7普通生物炭與聚磷菌印跡生物炭的紅外光譜測試圖。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

實施例1：

(1)取5～10g鋸末，200-700℃溫度下進行厭氧恒溫熱解4h；完全炭化后冷卻至室溫取出，得生物炭，將生物炭混勻研磨，過100目篩，于干燥器中保存?zhèn)溆茫?/p>

(2)取10g活性污泥加入90ml無菌水中混勻，室溫靜置10min，取上清液通過10倍稀釋法將其制成濃度分別為10^-1到10^-6的6種菌懸液，分別取0.2ml不同濃度的菌液均勻涂布到固體富磷平板上，于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，在出現(xiàn)明顯單菌落的梯度平板中，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到富磷培養(yǎng)基上反復純化至平板上的單菌落形態(tài)一致，得初純菌株，接于lb固體培養(yǎng)基斜面上，4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(3)將一部分初純菌株接入馴化培養(yǎng)基三角瓶中，瓶口用八層紗布封口，置于恒溫培養(yǎng)搖床以溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為150r/min條件下進行好氧培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察好氧培養(yǎng)條件下菌體積累聚磷顆粒的情況；另外，將另一部分初純菌株接入另一馴化培養(yǎng)基三角瓶中，隨后將瓶中充入氮氣使瓶內(nèi)處于厭氧狀態(tài)，用橡膠塞密封進行好氧培養(yǎng)24h，顯微鏡觀察厭氧培養(yǎng)條件下菌體內(nèi)積累phb顆粒的情況；分別對好氧培養(yǎng)中菌體積累的聚磷顆粒和厭氧培養(yǎng)條件下菌體內(nèi)積累的phb顆粒進行染色，選取在兩種染色方法中都呈陽性的菌體為初篩菌；

聚磷顆粒異染粒染色方法：

(1)染色液

甲液：體積分數(shù)95％乙醇2ml、甲苯胺藍0.15g、冰醋酸1ml、孔雀綠0.2g、蒸餾水100ml。先將染料溶于乙醇中，向其中加入事先混合的冰醋酸和蒸餾水，放置24h后過濾備用；

乙液：碘2g、碘化鉀3g、蒸餾水100ml。

(2)染色步驟

滴一滴無菌水于載玻片上，用接菌環(huán)蘸取少量菌落于無菌水中，風干固定；用甲液染5min，傾去甲液，用乙液沖去甲液，并染色1min，用蒸餾水沖洗后吸干；聚磷菌體內(nèi)有異染色顆粒，陽性會有黑色物質(zhì)，其他部分為深綠色或淺綠色。

phb顆粒染色

(1)染色液

蘇丹黑3g/l：蘇丹黑0.3g，體積分數(shù)70％乙醇100ml，混合用力振蕩，放置過夜備用。

二甲苯：褪色劑蕃紅水溶液50g/l：復染液

(2)染色步驟

按常規(guī)染色制成涂片，用甲液染色5min，傾去甲液，用乙液沖去甲液，并染1min，水洗，吸干，鏡檢，phb在染色后，陽性會變?yōu)樗{黑色，其他部分為紅色。

(4)將初篩菌株分別接入裝有50ml聚磷培養(yǎng)液的三角瓶中，在30℃、轉(zhuǎn)速為150r/min搖床振蕩培養(yǎng)12h，然后在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，傾出上清液，移取2ml稀釋至50ml，與未接種菌的聚磷培養(yǎng)液做對照，用鉬銻抗分光光度法，在700nm處測量其吸光度，通過標準曲線查得磷濃度，計算磷的去除率，取菌體聚磷率大于60％的菌株為復篩菌；

(5)稱取4g步驟1)中得到的磷基生物炭，同時配置固定化培養(yǎng)基，固定化培養(yǎng)基包括：蔗糖10g/l，牛肉膏6g/l，酵母粉1.5g/l，ph7.0；按5％質(zhì)量濃度接種量接入活化后的復篩菌，加入稱量好的磷基生物炭，放入30℃、160r/min的恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)18h，然后用30目的篩子過濾出吸附好菌體的磷基生物炭，即聚磷菌印跡生物炭。

上述步驟制得的聚磷菌印跡生物炭外觀呈黑色，比表面積在25.42-56.27m²/g之間，將其置于掃描電鏡下觀察，其結構如圖1-3所示，通過與圖4-6(普通生物炭)sem-eds對比可以看出聚磷菌印跡生物炭表面0.16％的磷元素，說明其表面含有一定比例的含磷菌株，即聚磷菌。

實施例2

本發(fā)明的聚磷菌印跡生物炭應用于處理廢水中的cr離子，包括以下步驟：取100ml初始濃度為10～100mg/l的cr⁶⁺溶液，調(diào)節(jié)溶液的ph值為6.0，加入實施例1制得的聚磷菌印跡生物炭吸附劑，該吸附劑的用量為0.25g/l，在30℃恒溫振蕩器進行吸附反應3小時，再將該吸附劑從廢水中分離，用aas測定廢水中剩余的cr⁶⁺的含量，計算的吸附量結果如表1所示：

表1：聚磷菌印跡生物炭對不同cr⁶⁺初始濃度廢水的吸附量

由表1可知，在初始濃度為10.01mg/l的條件下該吸附劑具有8.75mg/g的吸附量，并隨cr6+初始濃度的增加而增加，到一定值后25.44mg/g基本達到穩(wěn)定。

實施例3

本發(fā)明的聚磷菌印跡生物炭用于處理廢水中的放射性金屬uo²⁺離子，包括以下步驟：取100ml初始濃度為10～100mg/l的uo²⁺溶液，調(diào)節(jié)溶液的ph值為6.0，加入實施例1制得的聚磷菌印跡生物炭吸附劑，該吸附劑的用量為0.25g/l，在30℃恒溫振蕩器進行吸附反應3小時，再將該吸附劑從廢水中分離，用aas測定廢水中剩余的uo²⁺的含量，計算的吸附量結果如表1所示：

表2：聚磷菌印跡生物炭對不同cr⁶⁺初始濃度廢水的吸附量

由表2可知，在初始濃度為10.03mg/l的條件下該吸附劑具有17.13mg/g的吸附量，并隨uo²⁺初始濃度的增加而增加，到一定值后26.52mg/g基本達到穩(wěn)定。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出：對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進應視為本發(fā)明的保護范圍。