本發(fā)明屬于斜帶石斑魚親子鑒定
技術領域：
，具體涉及一種斜帶石斑魚親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重pcr的方法。
背景技術：
：斜帶石斑魚(e.coioides)屬于鮨科(serranidae)、石斑魚亞科(epinephelinae)、石斑魚屬(epinephelus)，其分布范圍極廣，從南非德班，東至帕勞群島和斐濟，北至日本琉球群島，南至阿拉弗拉海和澳大利亞(heemstra&randall1993)。斜帶石斑魚是石斑魚中少數(shù)幾個被廣泛人工養(yǎng)殖的品種之一，因其肉質(zhì)鮮美，蛋白含量高等特點，已成為亞太地區(qū)一種重要的使用商品魚類。不過，由于生態(tài)環(huán)境的破壞和過度捕撈等原因，斜帶石斑魚已經(jīng)在2004年被世界瀕危物種紅皮書(iucnredlistofthreatenedspecies)列為近危物種(iucn2004)。良種選育是我國斜帶石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展的重要手段。分子標記是種質(zhì)資源鑒定、家系選育和放流效果評估等研究和應用中一個重要技術手段。在家系選育中，了解整個家系遺傳多樣性、子代與親代的對應關系以及子代與子代的關系，對指導親本選留，從而避免近親雜交、種質(zhì)衰退有重要作用。同樣，在增殖放流工作中，需要了解回捕個體與放流個體的對應關系，以評估放流的效果。微衛(wèi)星又稱簡單重復序列，是指一類重復單位在2～6個堿基的重復序列。微衛(wèi)星序列作為分子標記具有擴增率高，靈敏度高等優(yōu)勢，且結果可靠，方法簡單，省時省力。在對于個體的識別可以采用物理標記的方法，但這種辦法對幼魚具有很大的局限性，或因為幼體太小無法標記，或因為標記對幼體生存產(chǎn)生較大影響。因此選用有效的微衛(wèi)星標記，實現(xiàn)個體識別和親子關系鑒定是斜帶石斑魚良種選育和放流效果評估工作中一種可靠、高效的方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種斜帶石斑魚親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重pcr的方法，該方法選用有效的微衛(wèi)星引物，可靠、高效，能對斜帶石斑魚進行親子鑒定，還能用于家系管理和增殖放流效果評估。本發(fā)明的上述目的是通過如下技術方案來實現(xiàn)的：一種斜帶石斑魚親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重pcr的方法，包括以下步驟：(1)斜帶石斑魚個體dna提取取斜帶石斑魚個體鰭條，采取酚-氯仿法提取基因組dna；(2)斜帶石斑魚多態(tài)性微衛(wèi)星引物的篩選用步驟(1)獲得的基因組dna為模板，篩選8對微衛(wèi)星引物，所述8對微衛(wèi)星引物分別為m3-134，m4-44，m2-16，m2-64，m4-138，m4-116，m3-118和m3-33，其核苷酸序列分別如seqidno.1～seqidno.16所示；(3)斜帶石斑魚8重pcr條件的優(yōu)化和擴增每一對引物的正向引物5’端標記熒光物質(zhì)，設計8重pcr反應體系和反應程序，進行8重pcr擴增；(4)親子鑒定將8重pcr產(chǎn)物在測序儀上進行分型，讀取個體等位基因大小bp，即堿基對，排成數(shù)字基因型矩陣，讀取親本及子代基因型后，根據(jù)孟德爾定律判斷親子關系。在上述斜帶石斑魚親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重pcr的方法中：步驟(1)中優(yōu)選將基因組dna稀釋至100ng/μl。步驟(2)中篩選8對微衛(wèi)星引物的過程優(yōu)選是：根據(jù)已發(fā)表的斜帶石斑魚微衛(wèi)星標記，合成引物，并分別對30個野生斜帶石斑魚個體進行pcr擴增，篩選出擴增穩(wěn)定、多態(tài)性強、雜合度高并且具有相同退火溫度的8對微衛(wèi)星引物。步驟(2)中相鄰兩對引物擴增出的片段大小范圍不相同。步驟(3)中m2-16、m4-138、m3-118標記熒光物質(zhì)fam，m3-134、m4-44、m2-64、m4-116、m3-33標記熒光物質(zhì)hex。步驟(3)中所述8重pcr反應體系優(yōu)選如下：步驟(3)中8重pcr反應程序優(yōu)選設定為：94℃預變性5min，然后94℃30s，退火溫度60℃30s，72℃30s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。步驟(4)中優(yōu)選采用abi3730xl進行基因型分型，優(yōu)選利用genemapperv4.0讀取個體等位基因大小bp。進一步的，作為本發(fā)明的斜帶石斑魚親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重pcr的方法中的一種優(yōu)選的具體實施方式，該方法包括以下步驟：(1)、斜帶石斑魚個體dna提取剪取斜帶石斑魚家系父本、母本及子代個體鰭條并立即保存在95％(體積百分含量)乙醇中，用酚-氯仿方法提取基因組dna，并把樣品dna濃度調(diào)整至100ng/μl；(2)、斜帶石斑魚多態(tài)性微衛(wèi)星引物的篩選根據(jù)已發(fā)表的斜帶石斑魚微衛(wèi)星標記，合成引物，并分別對30個野生斜帶石斑魚個體進行pcr擴增，篩選出擴增穩(wěn)定、多態(tài)性強、雜合度高并且具有相同退火溫度的8對引物，設計成一個8重pcr體系；所述8對微衛(wèi)星引物為：m3-134，m4-44，m2-16，m2-64，m4-138，m4-116，m3-118，m3-33，其核苷酸序列分別如seqidno.1～seqidno.8所示，相鄰兩對引物擴增出的片段大小范圍不相同，每一對引物的正向引物5’端標記熒光物質(zhì)，其中：m2-16、m4-138、m3-118標記熒光物質(zhì)fam；m3-134、m4-44、m2-64、m4-116、m3-33標記熒光物質(zhì)hex；(3)、斜帶石斑魚8重pcr條件的優(yōu)化、擴增每一對引物的正向引物5’端標記熒光物質(zhì)，其中：m2-16、m4-138、m3-118標記熒光物質(zhì)fam，m3-134、m4-44、m2-64、m4-116、m3-33標記熒光物質(zhì)hex，其中m3-134，m4-44，m2-16，m2-64引物濃度稀釋至10μmol/l，m4-138，m4-116，m3-118，m3-33引物濃度稀釋至5μmol/l，8重pcr體系總體系具體如下：pcr反應程序設定：94℃預變性5min，然后94℃30s，退火溫度60℃30s，72℃30s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min；pcr結束后，取5μl在瓊脂糖膠上電泳檢測，送至商業(yè)公司采用abi3730xl進行基因型分型；(4)、親子鑒定將多重pcr產(chǎn)物在測序儀上進行分型，讀取個體等位基因大小bp，即堿基對。由于子代所有的基因均來自親本，且孟德爾定律顯示，生物體在進行減數(shù)分裂形成配子的時候，等位基因發(fā)生分離，分別進入到兩個配子當中，獨立地隨配子遺傳給后代。故可以在讀取親本及子代基因型后，根據(jù)孟德爾定律判斷是否具有親子關系。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：(1)本發(fā)明利用微衛(wèi)星標記與多重熒光pcr技術的結合，篩選了8個高度多態(tài)性微衛(wèi)星位點，組建一個8重熒光pcr體系，通過測序儀分型，對斜帶石斑魚家系進行個體識別和親子關系鑒定；(2)本發(fā)明一次可以檢測8個位點，相對于簡單的單位點檢測，效率提高，費用下降為原來八分之一左右；(3)本發(fā)明通過測序儀分型，等位基因大小判讀更加準確，提高了基因型數(shù)據(jù)的準確性；(4)本發(fā)明可以在斜帶石斑魚種質(zhì)鑒定，家系管理和良種選育進行推廣應用，并為增殖放流效果評估提供了一種新的技術手段。附圖說明圖1為斜帶石斑魚親子鑒定微衛(wèi)星熒光標記8重pcr基因分型圖，其中圖a是熒光物質(zhì)hex標記的引物在個體中擴增出的基因位點分型圖，從左到右每個峰分別代表引物m3-33、m4-116、m2-64、m4-44、m3-134擴增出的基因位點；圖b是熒光物質(zhì)fam標記的引物在個體中擴增出的基因位點分型圖，從左到右每個峰分別代表m3-118、m4-138、m2-16。具體實施方式下面結合實例具體進一步說明本發(fā)明的具體實施方式。本實施例提供的斜帶石斑魚親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重pcr的方法，包括以下步驟：(1)斜帶石斑魚dna提取剪取斜帶石斑魚家系父本、母本及30個子代個體鰭條并立即保存在95％乙醇中，父本標記為c，母本標記為x，30個子代分別標記為1-30，用酚-氯仿方法提取基因組dna：用鑷子取出保存在酒精中的尾鰭，剪取約20mg，用濾紙輕輕按壓吸去多余的酒精，轉(zhuǎn)移到預先加入580μl組織裂解液的1.5ml離心管中并將組織剪碎。然后加入20μl20mg/ml的蛋白酶k，輕輕搖晃混勻，置于56℃水浴鍋中直至組織完全溶解，消化過程中每隔20min取出離心管輕輕震蕩10sec混勻；加入600μl酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)溶液，上下顛倒混勻5min使水相和有機相分層，12000rpm離心5min。用剪去尖端的槍頭小心吸取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中；重復上述步驟；加入等體積-20℃預冷的無水乙醇，顛倒混勻10min，此時離心管中可以看到白色沉淀。12000rpm離心5min，棄上清液，用1ml70％乙醇洗滌沉淀兩次，如果沉淀較松散，再離心5min，室溫下空氣干燥沉淀約15-20min；加入100μlte緩沖液溶解dna，使用紫外分光光度計檢測dna濃度，并把樣品dna濃度調(diào)整至100ng/μl。(2)斜帶石斑魚多態(tài)性微衛(wèi)星引物的篩選根據(jù)已發(fā)表的斜帶石斑魚微衛(wèi)星標記，合成引物，并分別對30個野生斜帶石斑魚個體進行pcr擴增，篩選出擴增穩(wěn)定、多態(tài)性強、雜合度高并且具有相同退火溫度的8對引物，設計成一個8重pcr體系。本發(fā)明8對微衛(wèi)星引物：m3-134，m4-44，m2-16，m2-64，m4-138，m4-116，m3-118，m3-33，相鄰兩對引物擴增出的片段大小范圍不相同。上述篩選出來的8對引物，組成一個8重pcr。每一對引物的正向引物5’端標記熒光物質(zhì)，其中：m2-16、m4-138、m3-118標記熒光物質(zhì)fam；m3-134、m4-44、m2-64、m4-116、m3-33標記熒光物質(zhì)hex，見表1。表1斜帶石斑魚8重pcr組合的引物序列及熒光物質(zhì)注：f表示正向引物，r表示反向引物，所有熒光物質(zhì)均標記在正向引物的5’端。(3)斜帶石斑魚8重pcr條件的優(yōu)化和擴增將上述篩選出來的8對引物，組成一個8重pcr，每一對引物的正向引物5’端標記熒光物質(zhì)，其中：m2-16、m4-138、m3-118標記熒光物質(zhì)fam；m3-134、m4-44、m2-64、m4-116、m3-33標記熒光物質(zhì)hex。8重pcr體系總體系具體見表2：表2斜帶石斑魚親子鑒定pcr反應體系pcr反應程序設定：94℃預變性5min，然后94℃30s，退火溫度60℃30s，72℃30s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。pcr結束后，取5μl在瓊脂糖凝膠上電泳檢測，送至商業(yè)公司采用abi3730xl進行基因型分型。(4)親子鑒定根據(jù)測序儀分型結果，利用genemapperv4.0讀取個體基因型(bp，即堿基對)，具體如圖1所示，從左到右分別讀出所有個體8個位點的基因型，其中圖a是熒光物質(zhì)hex標記的引物在個體中擴增出的基因位點分型圖，從左到右每個峰分別代表引物m3-33、m4-116、m2-64、m4-44、m3-134擴增出的基因位點；圖b是熒光物質(zhì)fam標記的引物在個體中擴增出的基因位點分型圖，從左到右每個峰分別代表m3-118、m4-138、m2-16。結合人工加以校正，排成數(shù)字基因型矩陣，表3a和表3b一個斜帶石斑魚家系部分個體的基因型數(shù)據(jù)。表3a斜帶石斑魚家系親本及30個子代的部分基因型表3b斜帶石斑魚家系親本及30個子代的部分基因型表4斜帶石斑魚8個微衛(wèi)星位點遺傳學參數(shù)位點nahexphobshwepicm3-134160.8760.6330.0000*0.850m4-44130.9030.9330.06880.878m2-1660.7150.5670.05920.653m2-64130.9100.8330.16720.886m4-13880.8160.6330.06940.774m4-11660.6760.6330.32300.619m3-118120.8920.9670.39850.865m3-3360.7880.6670.17200.737注：na，等位基因數(shù)；hexp，期望雜合度；hobs，觀測雜合度；hwe，哈代溫伯格平衡檢測的p值；pic，多態(tài)信息含量；退火溫度均為57℃；*bonferroni修正之后明顯偏離hwe的位點(α＝0.05，p<0.0006)。由表3a和表3b可知，子代個體中8個引物位點擴增出的基因型均來自父母本，且父母本8個引物位點擴增出的基因型隨機分配到子代個體中，符合孟德爾定律，表明父本c和母本x與這30個子代親子關系成立。表4表明用于親子鑒定的8個微衛(wèi)星位點多態(tài)性高，能充分有效地運用于斜帶石斑魚親子鑒定系統(tǒng)。以上結果表明，本發(fā)明的微衛(wèi)星8重熒光pcr方法在斜帶石斑魚家系的親子鑒定中穩(wěn)定，準確，滿足斜帶石斑魚種質(zhì)鑒定、家系管理和增殖放流效果評估的要求。以上所述僅是本發(fā)明的非限定實施方式，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構思和不做出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。<110>中山大學<120>一種斜帶石斑魚親子鑒定微衛(wèi)星熒光多重pcr的方法<210>1<211>22<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m3-134的上游引物<400>1actccctcctcagactccacaa22<210>2<211>22<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m3-134的下游引物<400>2gttaaaccaatcaggctccacc22<210>3<211>20<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m4-44的上游引物<400>3cccaccccaaacaggaccat20<210>4<211>25<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m4-44的下游引物<400>4gagttacctcaacccaaatccatta25<210>5<211>20<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m2-16的上游引物<400>5ggatgggaggggcacagata20<210>6<211>24<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m2-16的下游引物<400>6gcagaaagggacataatgaggaga24<210>7<211>25<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m2-64的上游引物<400>7cacatacatcatttcgttcaccatc25<210>8<211>22<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m2-64的下游引物<400>8gtcagttcaagtctgcccgttt22<210>9<211>21<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m4-138的上游引物<400>9gcagtggcagatggacagaaa21<210>10<211>24<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m4-138的下游引物<400>10attaagggcaggaagtgataaacc24<210>11<211>20<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m4-116的上游引物<400>11cattgctgggtagagggacg20<210>12<211>24<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m4-116的下游引物<400>12actgtactatgcgggatttgactg24<210>13<211>22<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m3-118的上游引物<400>13gtgaggtgaccttgggtgtttc22<210>14<211>22<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m3-118的下游引物<400>14gtgaggtgaccttgggtgtttc22<210>15<211>20<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m3-33的上游引物<400>15cttctcgctgccttcgtcca20<210>16<211>20<212>dna<221>微衛(wèi)星引物m3-33的下游引物<400>16cggcttctccctgaaatccc20當前第1頁12