本發(fā)明涉及脂肪酶活力的檢測及性能評價方法，具體涉及富含油脂皮粉底物的制備方法和以富含油脂皮粉為底物的脂肪酶活力檢測和性能評價方法。

背景技術：

油脂是動物皮的成分之一，豬皮和綿羊皮中的油脂含量高達10%-30%，而且，隨著動物飼養(yǎng)條件的變化，動物皮中的油脂含量有增加的趨勢。

以動物皮為原料的制革、制裘、制膠和膠原提取等工業(yè)過程中，動物皮中的油脂對處理過程和產(chǎn)品的質(zhì)量有明顯的負面影響，因此，在這些產(chǎn)品的生產(chǎn)、加工過程中需要除去動物皮內(nèi)的油脂。動物皮脫脂的主要方法有溶劑法、皂化法、乳化法和酶法等。由于在動物皮處理加工過程中，考慮到膠原蛋白對酸、堿和高溫等的耐受性，常用的化學脫脂的條件比較溫和，皂化法的脫脂效果較差，溶劑脫脂和大量表面活性劑的使用會造成安全和污染問題，因此，酶法脫脂受到更大的關注。

動物皮的酶脫脂法主要選用脂肪酶，在較溫和的條件下，酶催化皮內(nèi)油脂水解而達到去除效果，因此，了解脂肪酶在動物皮處理條件下對皮內(nèi)油脂催化水解性能至關重要。

已報道的脂肪酶活力檢測和性能評價的方法較多，使用的底物主要有三油酸甘油酯、三丁酸甘油酯和橄欖油，也有用乙酸對硝基苯酚酯和辛酸對硝基苯酚酯作為底物，其中，橄欖油是最常用的底物（如國標gb/t23535-2009）。由于油脂與水不互溶，因此，通常用聚乙烯醇對油脂進行乳化，以改善底物的均勻性。反應結(jié)束后，通過測定脂肪酸的生成量來計算酶活力。測定反應體系中脂肪酸量的方法主要有滴定法和比色法。滴定法是直接在反應混合液中或?qū)⒅舅彷腿〕鰜砗?，通過堿滴定測定脂肪酸的量；比色法是用銅離子與脂肪酸顯色，用分光光度法測定其含量。

上述的脂肪酶活力檢測和性能評價方法中，選用的底物與動物皮中存在的油脂成分的種類和結(jié)構(gòu)有較大的差別，檢測的結(jié)果與脂肪酶對動物皮油脂的實際作用效果有一定的差異。以橄欖油或其他油脂類乳液作為底物，油脂在乳液中的分布及乳液粒子大小等受乳化方式、時間和乳化方法等因素的影響，這直接影響油脂與脂肪酶的接觸程度，導致酶活力測定結(jié)果的穩(wěn)定性較差。脂肪酶催化油脂水解的反應主要是油脂界面反應，乳液粒子表面包裹的表面活性劑和產(chǎn)物脂肪酸在油滴表面的富集會阻礙酶和油脂分子的接觸，對酶的催化效率有負面影響。在乳液體系中直接進行堿滴定測定脂肪酸的量，反應體系的緩沖性會導致測定值的偏差，而且該方法不適合在堿性反應條件下脂肪酶活力的測定。用溶劑對乳液體系中的脂肪酸萃取后進行測定，由于溶劑的萃取效率的原因，存在測定結(jié)果偏低的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種脂肪酶活力測定和性能評價方法。本發(fā)明的基本特點是以富含油脂的皮粉為底物，測定結(jié)果對以動物皮為原料的制革、制裘、制膠和膠原提取等脂肪酶應用領域中的脂肪酶的選擇和應用條件的優(yōu)化更具有實際的指導意義。

本發(fā)明的目的由以下技術措施實現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說明外，均為質(zhì)量份數(shù)。

（1）富含油脂皮粉底物的制備

方法1：取油脂含量高的動物皮100份，充分水洗后，放入轉(zhuǎn)鼓或振蕩器中，加入100-500份水，在15-30℃下轉(zhuǎn)動或振蕩60-240min后，浸泡或間隙轉(zhuǎn)動3-12h。換水，加50-100份水和蛋白酶進行脫毛，脫毛液中蛋白酶的酶活力為50-250u/ml，20-30℃下間歇轉(zhuǎn)動3-24h，毛完全松動并去除后，將皮充分水洗，再經(jīng)溶劑脫水-自然干燥或冷凍干燥后，剪成小塊，并用粉碎機粉碎、過50-150目篩，得到油脂含量為5%-40%的皮粉底物。

在上述技術方案中，動物皮為油脂含量高的動物皮，油脂含量大于5%，如豬皮、綿羊皮和牛皮等，包括新鮮皮、鹽腌或冷凍保存的皮等。

在上述技術方案中，脫毛用蛋白酶為來自于動、植物和/或微生物的蛋白酶中的至少一種，不含脂肪酶，脫毛液中蛋白酶的酶活力為50-250u/ml。

在上述技術方案中，制備過程中不使用酸、堿和表面活性劑，避免皮內(nèi)油脂的水解和損失。

在上述技術方案中，皮塊粉碎之前的溶劑法脫水中采用的溶劑為乙醇和丙酮中的至少一種。

在上述技術方案中，制備的富含油脂皮粉的細度為50-150目，油脂含量為5%-40%。

方法2：取按常規(guī)制革工藝制備的動物皮的二層（中間層）堿皮100份，按常規(guī)工藝脫灰后，放入轉(zhuǎn)鼓或振蕩器中，20-35℃下，加入30-100份水和0.5-2.0份脫鈣劑，轉(zhuǎn)動30-120min，對皮進行脫鈣處理，將脫鈣后的二層皮充分水洗，再經(jīng)溶劑脫水-自然干燥或冷凍干燥后，剪成小塊，并用粉碎機粉碎、過50-150目篩，得到皮粉；80-85℃下，以二氯甲烷為溶劑，抽提4-6h，得到完全脫脂皮粉；向脫脂皮粉中加入皮粉質(zhì)量的10%-50%的油脂或油脂和脂肪酸的混合物，混合均勻后，將吸附油脂的皮粉充分水洗后晾干，再研磨，過50-150目篩，得到油脂含量為5%-40%的皮粉底物。

在上述技術方案中，原料為按常規(guī)制革工藝制備的各種動物皮的二層（中間層）堿皮。

在上述技術方案中，堿皮的脫灰采用常規(guī)的制革脫灰方法，如硫酸銨、氯化銨和商用脫灰劑脫灰。

在上述技術方案中，脫鈣劑為edta鈉鹽、檸檬酸鈉、乳酸鈉中的至少一種。

在上述技術方案中，皮塊粉碎之前的溶劑法脫水中采用的溶劑為乙醇和丙酮中的至少一種。

在上述技術方案中，脫脂皮粉吸附油脂和脂肪酸的混合物中的油脂為動、植物油脂，如豬油、牛油、綿羊油、菜籽油、橄欖油、棕櫚油等中的至少一種；脂肪酸為8碳以上的脂肪酸，如油酸、棕櫚酸、硬脂酸等的至少一種；油脂和脂肪酸以任意比例混合。制備的底物用于評價脂肪酶對不同油脂的作用性能及不同脂肪酸的種類和含量對脂肪酶作用的影響。

在上述技術方案中，制備的富含油脂皮粉的細度為50-150目，油脂含量為5%-40%。

（2）脂肪酶活力的測定和性能評價方法

包括以下步驟

步驟1：準確稱取制備的富含油脂皮粉底物3-5g，加入燒杯或三角瓶中，加入皮粉質(zhì)量20倍的緩沖液，放入振蕩器中，在20-30℃下振蕩浸水1-5h，至皮粉完全潤濕。

步驟2：將待測脂肪酶的樣品用相應的緩沖溶液溶解，并稀釋至適當?shù)谋稊?shù)。將已完全潤濕的皮粉底物和酶溶液在恒溫振蕩器中預熱至設定的溫度，取待測酶溶液1ml，振蕩下加入底物浴液中，酶的加入量為底物浴液中脂肪酶活力濃度為5-10u/ml。在設定溫度下振蕩反應一定時間后，立即加入的適量氯化鈉或其他中性鹽、0-10ml的6mol/ml鹽酸或其他相當酸度的酸溶液，使反應浴液中鹽的濃度達到6%（w/v）以上，ph至2.0以下，繼續(xù)震蕩5min，終止酶反應，并使浴液中的脂肪酸鹽轉(zhuǎn)變成脂肪酸，使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附。

步驟3：用濾布過濾出反應液中的皮粉，將皮粉收集，自然晾干或在真空烘箱內(nèi)干燥（40-50℃）。再次用粉碎機將干燥后的皮粉打散。準確稱量2-4g干燥后皮粉，在索氏抽提器中，80-85℃下，以二氯甲烷為溶劑，回流4-6h，抽提皮粉中的油脂。蒸干抽提瓶中的二氯甲烷溶劑后，向抽提瓶中加入預先中和過的中性乙醚-95%乙醇混合溶劑（2:1，v/v），溶解抽提物，再加入2~3滴酚酞指示劑，然后用koh標準溶液進行滴定，測定出皮粉內(nèi)油脂抽提物中脂肪酸的量。

步驟4：空白對照樣：在步驟2中用相同體積的緩沖液代替酶溶液，稱取的皮粉質(zhì)量和酶反應實驗的量一致，其他操作相同。

步驟5：脂肪酶活力的計算：

脂肪酶活力定義：1g固體酶，一定條件下（一定的溫度和ph值），水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1μmol脂肪酸，即為1個活力單位，以u/g表示。

脂肪酶活力計算公式：

x=(v-v0)×c×w1×n×1000/(w2×t)

式中：

x—樣品的酶活力，u/g；

v—滴定樣品時消耗的koh標準溶液的體積，ml；

v0—滴定空白時消耗的koh標準溶液的體積，ml；

c—koh標準溶液濃度，mol/l

w1—稱取的富含油脂皮粉底物的質(zhì)量，g；

w2—酶處理后抽提皮粉的質(zhì)量，g；

n—酶樣品的稀釋倍數(shù)；

t—反應時間，min；

1000—mmol轉(zhuǎn)化為μmol的系數(shù)。

在上述技術方案中，用富含油脂的皮粉作為底物，反應介質(zhì)為緩沖劑的水溶液，不含乳化劑，脂肪酶直接與皮粉內(nèi)吸附的油脂接觸、反應。

在上述技術方案中，使用的緩沖液為根據(jù)脂肪酶活力測定和性能評價的需要，選擇為ph值在2-13之間的任何ph值的任何緩沖液。

在上述技術方案中，反應液中脂肪酶的加入量為使反應浴液中脂肪酶的活力濃度達到5-10u/ml。

在上述技術方案中，根據(jù)脂肪酶活力測定和性能評價的需要，反應溫度為5-60℃之間的任何溫度。

在上述技術方案中，根據(jù)脂肪酶活力測定和性能評價的需要，反應時間為20-120min。

在上述技術方案中，終止酶反應，并使浴液中的脂肪酸鹽轉(zhuǎn)變成脂肪酸，使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附中使用的中性鹽為氯化鈉或硫酸鈉中的一種，鹽的加入量為使浴液中鹽的濃度達到6%（w/v）以上；使用的酸為鹽酸、硫酸、甲酸、乙酸或三氯乙酸中的至少一種，使用量為調(diào)節(jié)浴液ph值在2以下。

在上述技術方案中，酶反應后，將皮粉中的油脂和脂肪酸用二氯甲烷完全抽提，并用中性乙醚-95%乙醇混合溶劑（2:1，v/v）溶解抽提物，然后用koh標準溶液進行滴定，測定出皮粉內(nèi)油脂抽提物中脂肪酸的產(chǎn)生量。

本發(fā)明優(yōu)點的如下。

（1）以富含油脂的皮粉為底物，底物中的油脂成分和動物皮中的成分一致，反應條件與動物皮處理過程中脂肪酶對皮內(nèi)油脂作用的條件相近，測定結(jié)果對以動物皮為原料的制革、制裘、制膠和膠原提取等脂肪酶應用領域中的脂肪酶的選擇和應用條件的優(yōu)化具有指導意義。

（2）底物的針對性強。按底物制備方法1，由不同種類動物皮制備的富含油脂皮粉底物用于以相應種類的動物皮為原料的制革、制裘、制膠和膠原提取等脂肪酶應用領域中的脂肪酶活力測定和性能的評價；按底物制備方法2，吸附不同種類油脂或油脂和脂肪酸混合物的皮粉底物用于評價脂肪酶對不同油脂的作用性能及不同脂肪酸的種類和含量對脂肪酶作用的影響。

（3）采用油脂分布均勻的皮粉為底物，反應介質(zhì)為緩沖劑的水溶液，不含乳化劑，脂肪酶直接與皮粉內(nèi)吸附的油脂接觸、反應，克服了以乳化橄欖油等為底物的脂肪酶催化油脂水解反應中，乳化劑、乳液粒子大小及均勻性等對酶與油脂分子有效接觸的影響，結(jié)果更準確。

（4）適合的測定ph值范圍更廣，能在ph2-13范圍內(nèi)對脂肪酶的活力進行測定和性能評價。

（5）酶反應結(jié)束后，用中性鹽和酸終止酶反應，并使浴液中的脂肪酸鹽（堿性條件下反應）轉(zhuǎn)變成脂肪酸，使油脂和脂肪酸完全被皮粉吸附；對生成的脂肪酸完全抽提后，再測定其量，克服了在反應液中直接滴定存在偏差的問題，保證了結(jié)果的準確性。

附圖說明

圖1是三種脂肪酶活力-ph曲線1（皮粉底物，40℃）。

圖2是三種脂肪酶-ph活力曲線2（乳化橄欖油底物，40℃）。

圖3油脂中脂肪酸的含量對脂肪酶活力的影響（皮粉底物，ph7.5，40℃）。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是，本實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容做出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。

實施例1：脂肪酶活力的測定

（1）底物的制備（方法1）

取豬鹽濕皮頸部皮塊100g，放入轉(zhuǎn)鼓中，加入水300g，常溫下轉(zhuǎn)20分鐘，排水，重復3次。再加入水300g，5℃下轉(zhuǎn)動120分鐘后，間歇轉(zhuǎn)動，每1h轉(zhuǎn)動5min，共12小時，排水。重新加入水100g，1398蛋白酶（活力50000u/g）0.3g，在28℃下轉(zhuǎn)動120分鐘后，間歇轉(zhuǎn)動，每30min轉(zhuǎn)動5min，共24小時，毛完全松動、脫落后排水。再加入水300g，常溫下轉(zhuǎn)20分鐘，排水，重復3次。取出脫毛后的豬皮，在-10℃下冷凍24小時，再放入冷凍干燥機中至完全干燥。將凍干后的豬皮剪成2×2cm大小的小皮塊，并用粉碎機粉碎，過50和150目篩，得到富含油脂的皮粉底物。隨機稱取4份3g左右皮粉，用二氯甲烷抽提油脂，測定皮粉中的油脂含量、酸值及皂化值，結(jié)果見表1。

表1豬皮皮粉底物的基本參數(shù)

由表1可以看出，制備的豬皮皮中油脂含量為23.67%，皮粉中的油脂含量和主要指標的均勻性好，可確保實驗結(jié)果的可重復性。

（2）脂肪酶活力測定（ph7.5）

（i）試劑準備

磷酸鹽緩沖液：用磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉配制ph7.5，濃度為0.05mol/ml的緩沖液。

酶液：用緩沖液將脂肪酶溶解并稀釋至適當?shù)谋稊?shù)。

koh-乙醇標準溶液：按國標法gb/t601-2002中4.24進行配制。

（ii）測定過程

準確稱取豬制備的豬皮皮粉約5.00g于250ml錐形瓶中，加入ph7.5的磷酸鹽緩沖液100ml，放入水浴振蕩器中，在溫度40℃下振蕩2h，皮粉完全潤濕，同時將待測酶溶液在相同溫度下預熱5min。精確吸取待測酶溶液1.00ml加入皮粉浴液中，并在40℃下振蕩反應30min后，立即加入10gnacl和5ml濃度為6mol/ml的hcl溶液，浴液ph快速調(diào)至2.0以下，繼續(xù)振蕩5min，用濾布過濾，將皮粉收集，在真空烘箱內(nèi)完全干燥（40-50℃）。

準確稱量完全干燥后的酶處理皮粉約3.00g，在索氏抽提器中，80-85℃下，以二氯甲烷為溶劑，回流4-6h，抽提皮粉中的油脂。蒸干抽提瓶中的二氯甲烷溶劑后，向抽提瓶中加入預先中和過的中性乙醚-95%乙醇混合溶劑（2:1，v/v），溶解抽提物，再加入2~3滴酚酞指示劑，然后用koh標準溶液進行滴定至微紅，記錄消耗的koh標準溶液體積。

（iii）空白實驗

在步驟（2）中用相同體積的緩沖液替代待測酶溶液，稱取的皮粉質(zhì)量和酶反應實驗的量一致，其他操作相同。

（iv）酶活力的計算

脂肪酶活力定義：1g固體酶，一定條件下（一定的溫度和ph值）水解脂肪，每分鐘產(chǎn)生1μmol脂肪酸，即為1個活力單位，以u/g表示。

脂肪酶活力計算公式：

x=(v-v0)×c×w1×n×1000/(w2×t)

把稱取的富含油脂皮粉底物的質(zhì)量，酶處理后抽提皮粉的質(zhì)量，酶樣品的稀釋倍數(shù)和反應時間等數(shù)值代入上述公式，得到脂肪酶的活力值。

（v）測定結(jié)果

三種商業(yè)脂肪酶的活力測定結(jié)果見表2。脂肪酶lkt來自山東隆科特酶制劑有限公司，脂肪酶mg來自諾維信生物有限公司，脂肪酶yn來自云南愛科特酶制劑有限公司。

表2三種商業(yè)脂肪酶的活力測定結(jié)果(u/g，ph7.5，40℃)

由表2可以看出，兩種方法測定的脂肪酶活力的結(jié)果有一定的差異，用本發(fā)明方法，酶催化反應中酶和底物的接觸性更好，產(chǎn)物脂肪酸的量測定更準確，因此測得的結(jié)果比國標法高，與制革過程中脂肪酶的實際作用效果更接近，而且精度更高。

實施例2：ph值對脂肪酶活力的影響

底物的制備同實施例1中底物的制備。

制備不同ph值的系列緩沖溶液。測定過程中，只是加入的緩沖溶液不同，其他操作和實施例1中的操作相同。

根據(jù)三種商業(yè)脂肪酶在不同ph值下測定的酶活力值，繪制ph值-酶相對活力曲線見圖1。按國標法，以乳化橄欖油為底物的測定結(jié)果見圖2。

比較圖1和圖2可以看出，本發(fā)明的方法對三種脂肪酶的ph-活力影響的評價結(jié)果與國標法相比有較大的差異，特別是用本發(fā)明方法評價，發(fā)現(xiàn)脂肪酶mg和lkt有兩個活力峰，即在ph10左右，出現(xiàn)了第二個高活力峰，與實際的應用情況相吻合，而國標法的評價結(jié)果顯示，三種脂肪酶在ph10-11幾乎不顯示活力。因此，本發(fā)明方法的評價結(jié)果更具實際意義。

實施例3：脂肪酸的濃度對脂肪酶活力的影響

（i）底物的制備（方法2）

取按常規(guī)制革工藝制備的黃牛皮二層（中間層）堿皮500g，按常規(guī)工藝脫灰后，放入轉(zhuǎn)鼓，20-35℃下，加入250g水和1.5gedta二鈉（脫鈣劑），轉(zhuǎn)動60min，對皮進行脫鈣處理，將脫鈣后的二層皮充分水洗，滴干皮表面水，再用1000g乙醇浸泡24h，重復3次后，自然晾干。剪成小塊，并用粉碎機粉碎、過50-150目篩，得到皮粉；80-85℃下，以二氯甲烷為溶劑，抽提6h，得到完全脫脂皮粉。

稱取脫脂皮粉20g，加入2.5g以不同比例混合的橄欖油和油酸的混合物，混合均勻后，將吸附油脂的皮粉放入三角瓶中，加入200g水，30℃下振蕩30min，倒掉水，重復水洗5次，充分水洗后晾干，再研磨，過50-150目篩，得到含量油脂和脂肪酸的系列皮粉底物。

稱取3g左右皮粉，用用二氯甲烷抽提油脂，測定皮粉油脂中脂肪酸的量，結(jié)果見表3。

表3制備的系列皮粉底物中的油酸的量

以表3中的6種制備的皮粉為底物，測定過程中，只是皮粉不同，其他操作和實施例1中的操作相同。

根據(jù)三種商業(yè)脂肪酶在不同ph值下測定的酶活力值，繪制油脂中脂肪酸含量-酶相對活力曲線見圖3。

圖3表明，本發(fā)明方法能對脂肪酸對脂肪酶作用的產(chǎn)物抑制性能進行有效的表征，測定的結(jié)果表明，當油脂中的脂肪酸的量達到500μmol/g時，脂肪酶的作用明顯受到抑制，三種酶中脂肪酸對mg酶的抑制作用更大，測定的結(jié)果和實際應用情況一致。