本發(fā)明屬于分子生物學檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測產(chǎn)氣腸桿菌的引物組、試劑盒及快速檢測方法。

背景技術(shù)：

腸桿菌屬現(xiàn)有15種，其中產(chǎn)氣腸桿菌是最常見的一種，是腸道正常菌叢的一部分，認為不會引起腹瀉，廣泛存在于自然環(huán)境中，在人和動物的糞便水、泥土、植物中均可檢出，但能引起多種腸道外的條件致病性感染，如泌尿道、呼吸道和傷口感染，亦可引起菌血癥和腦膜炎。

傳統(tǒng)的產(chǎn)氣腸桿菌檢測主要通過生化鑒定和普通pcr。其中，生化鑒定需要對細菌進行純培養(yǎng)后配成相當濃度的菌液后加到商業(yè)化的生化鑒定板，前后需要時間在2天以上。普通pcr則需要變性-退火-延伸3個階段，即反應過程需要專業(yè)pcr儀控溫，擴增后需要電泳儀判讀結(jié)果。這些耗時長、操作繁瑣及需要昂貴的儀器設(shè)備的方法都限制了產(chǎn)氣腸桿菌的現(xiàn)場檢測的發(fā)展，因此，開發(fā)一種簡便、快捷的產(chǎn)氣腸桿菌的檢測方法具有極大的應用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供用于檢測產(chǎn)氣腸桿菌的引物組；

本發(fā)明的另一個目的在于提供用于檢測產(chǎn)氣腸桿菌的試劑盒；

本發(fā)明的另一個目的在于提供產(chǎn)氣腸桿菌的快速檢測方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

用于檢測產(chǎn)氣腸桿菌的lamp引物組，所述lamp引物組包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

thdf-f3:5’-gcgatcgtcaccgatatc-3’；

thdf-b3:5’-ggtaatcggcagcttagc-3’；

thdf-fip:5’-ccacttcatcactggcgtcaattcacatcgacggtatgc-3’；

thdf-bip:5’-gcgaatcggcattgaacgcgccgtcgaccataaacag-3’；

thdf-lf:5’-gcctgcggtatcgatgatat-3’；

thdf-lb:5’-attgaacaggcggatcgg-3’。

用于檢測產(chǎn)氣腸桿菌的試劑盒，包括上述的lamp引物組。

作為上述試劑盒的優(yōu)選，lamp引物組中，外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為：(1～2)：(4～8)：(2～4)。

作為上述試劑盒的改進，還包括以下成分：dna聚合酶、反應液、顯色劑、熒光染料、封閉液、陽性對照和陰性對照。

作為上述試劑盒的優(yōu)選，反應液為含有20mmph值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、10mm氯化鉀、10mm硫酸銨、8mm硫酸鎂、0.1%曲拉通x-100、甜菜堿0.8mm、4種dntps均2.8mm。

作為上述試劑盒的優(yōu)選，熒光染料為sybrgreenⅰ。

作為上述試劑盒的優(yōu)選，顯色劑為sybrgreenⅰ與鈣黃綠素與錳離子配合物的混合體積比為1：10～15。

非疾病診斷目的的產(chǎn)氣腸桿菌的快速檢測方法，包括如下步驟：

（1）提取待檢樣品dna；

（2）利用上述的lamp引物組對待檢樣品dna進行恒溫熒光擴增或恒溫擴增；

所述恒溫熒光擴增反應在qpcr儀器中進行，實時讀取熒光信號；若有“s”型擴增曲線，則判斷為陽性，若無“s”型擴增曲線，則判斷為陰性；

所述恒溫擴增反應在恒溫裝置下進行，反應結(jié)束后加入1～2μl的顯色劑，混勻后即可觀察反應液的顏色：若呈現(xiàn)熒光黃綠色，則判斷為陽性，若呈現(xiàn)橙色，則判斷為陰性；

上述方法所用的引物與試劑如前所述。

作為上述檢測方法的優(yōu)選，所述恒溫熒光擴增反應的25μl反應體系含有：thdf-f30.02μm、thdf-b30.02μm、thdf-fip0.16μm、thdf-bip0.16μm、thdf-lf0.08μm、thdf-lb0.08μm、反應液12.5μl、dna聚合酶2μl、待檢樣品dna2μl、熒光染料0.5μl，用超純水補齊到25μl；反應體系混勻后，加入20μl密封液；恒溫熒光擴增反應的條件為60～65℃反應55～65min。

作為上述檢測方法的優(yōu)選，所述恒溫擴增反應的25μl反應體系含有：thdf-f30.02μm、thdf-b30.02μm、thdf-fip0.16μm、thdf-bip0.16μm、thdf-lf0.08μm、thdf-lb0.08μm、反應液12.5μl、dna聚合酶2μl、待檢樣品dna2μl，用超純水補齊到25μl；反應體系混勻后，加入20μl密封液；恒溫熒光擴增反應的條件為60～65℃反應55～65min。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）高特異性：本發(fā)明的lamp引物是根據(jù)產(chǎn)氣腸桿菌thdf基因設(shè)計的六條特異性引物（2條內(nèi)部引物fip/bip、2條外部引物f3/b3、2條環(huán)狀引物lf/lb），應用上述六條引物，擴增靶序列的6個區(qū)域，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高，且非常穩(wěn)定，形成引物二聚體概率低，保證了反應的順利進行；并且引物在反應體系用量僅10^-2μm級，便可實現(xiàn)特異性擴增，能夠有效鑒別產(chǎn)氣腸桿菌。

（2）高靈敏度：最低檢測極限可達到1個dna拷貝，靈敏度遠高于目前現(xiàn)有技術(shù)公開的檢測水平；

（3）快速高效：60min內(nèi)可以完成對dna樣品的檢測；

（4）可靈活選擇檢測方法：可根據(jù)實際情況靈活選擇檢測方法，恒溫熒光擴增需額外配備qpcr儀器采集熒光信號，通過擴增曲線是否為“s”型來判斷結(jié)果；而恒溫擴增則無需大型設(shè)備，利用肉眼觀察的顯色反應，即可判斷結(jié)果，其顯色原理是利用鈣黃綠素與錳離子結(jié)合處于淬火狀態(tài)；擴增反應的副產(chǎn)物焦磷酸離子與錳離子結(jié)合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠色熒光。

附圖說明

圖1：實施例2的方法靈敏度評價結(jié)果，圖中，標注的10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、1為對應樣品的質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)，control為depc水；

圖2：實施例3的方法靈敏度評價結(jié)果，圖中，標注的10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、1為對應樣品的質(zhì)粒標準品拷貝數(shù)，control為depc水；

圖3：實施例2的方法特異性評價結(jié)果，圖中，positive（陽性樣本）為20株產(chǎn)氣腸桿菌；negative（陰性樣本）共30個，分別為陰溝腸桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、普通變形桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、粘質(zhì)沙雷菌、摩氏摩根菌、糞腸球菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、草綠鏈球菌、溶血葡萄球菌、鳥腸球菌、棉子糖腸球菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、人體白細胞；圖中negative（陰性樣本）擴增曲線重疊在一起；

圖4：實施例3的方法特異性評價結(jié)果，圖中，樣品管上標注的1～20為20株產(chǎn)氣腸桿菌；標注的q1～q30依次對應樣品為陰溝腸桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、.普通變形桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、粘質(zhì)沙雷菌、摩氏摩根菌、糞腸球菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、草綠鏈球菌、溶血葡萄球菌、鳥腸球菌、棉子糖腸球菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、人體白細胞。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1、用于檢測產(chǎn)氣腸桿菌的試劑盒

用于檢測產(chǎn)氣腸桿菌的試劑盒，包括以下成分：（1）lamp引物組；（2）dna聚合酶；（3）反應液；（4）顯色劑；（5）熒光染料；（6）封閉液；（7）陽性對照和陰性對照。

（1）lamp檢測引物組

根據(jù)產(chǎn)氣腸桿菌多個種特異靶基因進行多套lamp引物設(shè)計，經(jīng)過多次敏感性和特異性實驗，篩選出thdf（genbank登錄號為：eu569333.1）為最終靶基因，并最終優(yōu)選的引物組擴增效率高，敏感性和特異性優(yōu)，包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

thdf-f3:5’-gcgatcgtcaccgatatc-3’（seqidno:1）；

thdf-b3:5’-ggtaatcggcagcttagc-3’（seqidno:2）；

thdf-fip:5’-ccacttcatcactggcgtcaattcacatcgacggtatgc-3’（seqidno:3）；

thdf-bip:5’-gcgaatcggcattgaacgcgccgtcgaccataaacag-3’（seqidno:4）；

thdf-lf:5’-gcctgcggtatcgatgatat-3’（seqidno:5）；

thdf-lb:5’-attgaacaggcggatcgg-3’（seqidno:6）。

（2）dna聚合酶：bstdna聚合酶，酶活為8u/μl。

（3）反應液：含有20mmph值為8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、10mm氯化鉀、10mm硫酸銨、8mm硫酸鎂、0.1%曲拉通x-100、甜菜堿0.8mm、4種dntps均2.8mm。

（4）顯示劑：sybrgreenⅰ與鈣黃綠素與錳離子配合物的混合體積比為1：12。

（5）熒光染料：sybrgreenⅰ。

（6）封閉液：液體石蠟油。

（7）陽性對照：含有產(chǎn)氣腸桿菌thdf基因片段的質(zhì)粒樣品，其制備方法為：以分離鑒定的產(chǎn)氣腸桿菌為模板，利用的thdf外引物（seqidno：1和seqidno：2）進行擴增，回收該擴增片段，利用常規(guī)方法連接到pmd-18t載體中，即為陽性對照。

（8）陰性對照：depc水。

實施例2、產(chǎn)氣腸桿菌的恒溫熒光擴增檢測方法

利用實施例1的試劑盒檢測產(chǎn)氣腸桿菌，具體步驟如下：

（1）提取待檢樣品dna；

（2）利用lamp引物組對待檢樣品dna進行恒溫熒光擴增：

在反應管內(nèi)加入恒溫擴增的25μl體系，其含有：thdf-f30.02μm、thdf-b30.02μm、thdf-fip0.16μm、thdf-bip0.16μm、thdf-lf0.08μm、thdf-lb0.08μm、反應液12.5μl、dna聚合酶2μl、待檢樣品dna2μl、熒光染料0.5μl、用超純水補齊到25μl，混勻后，加入20μl密封液，蓋緊反應管蓋；

設(shè)置qpcr儀器，選用fam通道，反應程序為63℃30s，將63℃15s，63℃45s作為一個循環(huán)，于63℃45s處采集熒光信號，反應40個循環(huán)；

結(jié)果判斷：若有“s”型擴增曲線，則判斷為陽性，若無“s”型擴增曲線，則判斷為陰性。

實施例3、產(chǎn)氣腸桿菌的恒溫擴增檢測方法

利用實施例1的試劑盒檢測產(chǎn)氣腸桿菌，具體步驟如下：

（1）提取待檢樣品dna；

（2）利用lamp引物組對待檢樣品dna進行恒溫擴增：

在反應管內(nèi)加入恒溫擴增的25μl體系，其含有：thdf-f30.02μm、thdf-b30.02μm、thdf-fip0.16μm、thdf-bip0.16μm、thdf-lf0.08μm、thdf-lb0.08μm、反應液12.5μl、dna聚合酶2μl、待檢樣品dna2μl、用超純水補齊到25μl，混勻后，加入20μl密封液，最后在管蓋加1μl顯色液，蓋緊反應管蓋；于恒溫裝置中63℃反應60min；

反應結(jié)束后，通過瞬時離心，將反應管蓋上的顯色液甩至管內(nèi)，用肉眼觀察顏色變化；

結(jié)果判斷：若呈現(xiàn)熒光黃綠色，則判斷為陽性，若呈現(xiàn)橙色，則判斷為陰性。

實施例4、靈敏度評價

含有產(chǎn)氣腸桿菌thdf基因片段的質(zhì)粒樣品作為模板，進行10倍梯度稀釋，至拷貝數(shù)分別為10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10、1，用實施例2和實施例3的方法分別進行靈敏度鑒定，陰性對照為depc水。

圖1所示為實施例2產(chǎn)氣腸桿菌的恒溫熒光擴增檢測方法的靈敏度評價結(jié)果，可以看出：該方法的最低檢測限為dna拷貝數(shù)1。

圖2所示為實施例3產(chǎn)氣腸桿菌的恒溫擴增檢測方法的靈敏度評價結(jié)果，可以看出：該方法的最低檢測限為dna拷貝數(shù)1。

實施例5、特異性評價

分別用實施例2和3的方法對下述樣品進行檢測：包括20株產(chǎn)氣腸桿菌，以及30株非產(chǎn)氣腸桿菌樣品，分別為陰溝腸桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯桿菌、惡臭假單胞菌、奇異變形桿菌、弗氏枸櫞酸桿菌、沙門氏菌、志賀桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、普通變形桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、粘質(zhì)沙雷菌、摩氏摩根菌、糞腸球菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、草綠鏈球菌、溶血葡萄球菌、鳥腸球菌、棉子糖腸球菌、白色念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、人體白細胞。

圖3所示為實施例2產(chǎn)氣腸桿菌的恒溫熒光擴增檢測方法的特異性評價結(jié)果，可以看出：選取的20株產(chǎn)氣腸桿菌均為陽性，30株非產(chǎn)氣腸桿菌均為陰性，圖中30株陰性樣品及陰性對照的擴增曲線重疊。

圖4所示為實施例3產(chǎn)氣腸桿菌的恒溫擴增檢測方法的特異性評價結(jié)果，可以看出：選取的20株產(chǎn)氣腸桿菌均呈現(xiàn)熒光黃綠色，為陽性，30株非產(chǎn)氣腸桿菌均為橙色，為陰性。

綜上，以上實施例說明本發(fā)明所用的檢測產(chǎn)氣腸桿菌的引物和方法靈敏度高、特異性強，檢測準確度可以達99%以上。

以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應被視為本發(fā)明的一部分。

sequencelisting

<110>南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院

<120>用于檢測產(chǎn)氣腸桿菌的lamp引物組、試劑盒及快速檢測方法

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