本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌的靶基因、特異性引物對(duì)及檢測(cè)方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

甲型副傷寒沙門氏菌(salmonellaparatyphia)是引起人類感染的主要沙門氏菌血清型之一，此血清型菌株的主要宿主為人類。這是一種消化道傳染病，潛伏期為8至10天，被感染者起病急，先有惡心，嘔吐，2-3天后發(fā)熱等傷寒癥狀并伴有不同程度的其他病癥。在最近的研究報(bào)告中顯示，甲型副傷寒沙門氏菌會(huì)通過(guò)某些食物經(jīng)口腔侵染到健康人體，從而引起以上各方面的癥狀。弓耀忠、趙海霞在2007年s2期的《一株甲型副傷寒沙門氏菌的啟示》講述，通過(guò)一株甲型副傷寒沙門氏菌的檢測(cè)驗(yàn)證，提示檢驗(yàn)人員在具體檢驗(yàn)過(guò)程中，在遵循一般規(guī)律的同時(shí)，要考慮特殊菌株的生化特異性，多參考國(guó)內(nèi)外最新資料，不能機(jī)械、一味地按gb/t4789.4-2003程序檢驗(yàn)，易導(dǎo)致漏檢或誤判。國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局的2002年第25和26號(hào)令中明確規(guī)定沙門氏菌為必檢項(xiàng)目。目前，甲型副傷寒沙門氏菌檢測(cè)主要使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程步驟較多，時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要4-6個(gè)工作日，而且干擾的因素較多，檢測(cè)結(jié)果的判定較復(fù)雜，給食品檢測(cè)帶來(lái)非常不利的影響。

目前，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的發(fā)展，通過(guò)分子技術(shù)檢測(cè)鑒定沙門氏菌血清型變得更加可靠。用于甲型副傷寒沙門氏菌的pcr檢測(cè)的靶基因研究較少且主要是依賴于國(guó)外學(xué)者的研究，如gracejieyinngan等在《researchinmicrobiology》2010年161期243-248頁(yè)發(fā)表的題為《developmentofanovelmμltiplexpcrforthedetectionanddifferentiationofsalmonellaentericaserovarstyphiandparatyphia》中所述，其中sspa1723a和sspa1724a是甲型副傷寒沙門氏菌檢測(cè)的靶標(biāo)基因。但通過(guò)進(jìn)一步分析，以上基因同時(shí)存在鼠傷寒沙門氏菌，由此證明以其作為甲型副傷寒沙門氏菌的檢測(cè)靶點(diǎn)很可能出現(xiàn)假陽(yáng)性的現(xiàn)象，以上述基因作為靶基因，會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌的靶基因、特異性引物對(duì)及檢測(cè)方法和試劑盒，解決了現(xiàn)有技術(shù)中甲型副傷寒沙門氏菌結(jié)果不準(zhǔn)確、檢測(cè)結(jié)果判定復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)的技術(shù)問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌的靶基因，gene3270、gene3268、gene3106，gene3270具有如seqidno.1所示的核苷酸序列或其特異性片段，gene3268具有如seqidno.2所示的核苷酸序列或其特異性片段，gene3106具有如seqidno.3所示的核苷酸序列或其特異性片段。

用于擴(kuò)增所述靶基因的特異性引物對(duì)，所述特異性引物對(duì)分別為：pa2、pa5、pa7，其中，

pa2-f：核苷酸序列如seqidno.5所示、pa2-r：核苷酸序列如seqidno.6所示；

pa5-f：核苷酸序列如seqidno.7所示、pa5-r：核苷酸序列如seqidno.8所示；

pa7-f：核苷酸序列如seqidno.9所示、pa7-r：核苷酸序列如seqidno.10所示。

一種檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

s1、提取樣品dna，pcr擴(kuò)增；

s2、凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；

s3、比較電泳后條帶，若在574bp、146bp和191bp位置有條帶，則樣品中含有甲型副傷寒沙門氏菌。

優(yōu)選的，所述凝膠電泳后574bp位置分離出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.1所示；146bp位置分離出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.2所示；191bp位置分離出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.3所示。

優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增過(guò)程中，25μl包含有2×master12.5μl，10μm引物對(duì)1μl，模板取1-5μl，補(bǔ)ddh2o至25μl。

優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增過(guò)程的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

優(yōu)選的，所述凝膠電泳采用瓊脂糖凝膠電泳。

優(yōu)選的，以25μlpcr反應(yīng)體系計(jì)量，對(duì)于權(quán)利要求2所述的pa2、pa5和pa7引物，需要甲型副傷寒沙門氏菌總dna濃度≥4.837pg/μl。

一種用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌的試劑盒，所述試劑盒包括所述的特異性引物對(duì)。

一種所述的靶基因或所述的特異性引物對(duì)或所述的試劑盒在檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌的靶基因、特異性引物對(duì)及檢測(cè)方法和試劑盒，與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明通過(guò)基因組比較分析獲得甲型副傷寒沙門氏菌的特異性檢測(cè)靶基因，從而通過(guò)特異性引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增、電泳檢測(cè)該目的基因，本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短，實(shí)現(xiàn)了甲型副傷寒沙門氏菌高特異性快速檢測(cè)的目的；

本發(fā)明提供檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌的3個(gè)特異性靶基因、相應(yīng)的pcr引物對(duì)、利用以上引物對(duì)和靶基因進(jìn)行檢測(cè)，特異性引物對(duì)是根據(jù)3個(gè)甲型副傷寒沙門氏菌特異性檢測(cè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)而成，該特異性檢測(cè)靶點(diǎn)穩(wěn)定高、特異性強(qiáng)，通過(guò)合理優(yōu)化pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系，凝膠電泳檢測(cè)手段，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定出甲型副傷寒沙門氏菌；

采用本發(fā)明的檢測(cè)方法可直接鑒定甲型副傷寒沙門氏菌，不需要血清型實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)時(shí)間縮短在12h以內(nèi)，并且，由于檢測(cè)過(guò)程無(wú)需采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法中必須使用的抗血清，可降低檢測(cè)成本，本發(fā)明通過(guò)pcr檢測(cè)特異性dna片段，具有單一性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果可靠，結(jié)果判定簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，能夠廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明特異性引物對(duì)pa2、pa5和pa7對(duì)不同菌種特異性評(píng)價(jià)凝膠電泳結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明特異性引物對(duì)pa2、pa5和pa7對(duì)不同模板濃度靈敏度評(píng)價(jià)凝膠電泳結(jié)果圖。

圖中a為pa2特異性引物對(duì)；b為pa5特異性引物對(duì)；c為pa7特異性引物對(duì)；2a為pa2特異性引物對(duì)；2b為pa5特異性引物對(duì)；2c為pa7特異性引物對(duì)；

1、甲型副傷寒沙門氏菌；2、無(wú)菌水；3、豬霍亂沙門氏菌；4、乙型副傷寒沙門氏菌；5、丙型副傷寒沙門氏菌；6、湯普遜沙門氏菌；7、亞利桑那沙門氏菌；8、都柏林沙門氏菌；9、鴨沙門氏菌；10、波斯坦沙門氏菌；11、阿伯丁沙門氏菌；12、病牛沙門氏菌；13、山夫頓堡沙門氏菌；14、火雞沙門氏菌；15、德比沙門氏菌；16、倫敦沙門氏菌；17、鼠傷寒沙門氏菌；18、鼠傷寒沙門氏菌；19、腸炎沙門氏菌；20、布雷德沙門氏菌；21、達(dá)喀爾沙門氏菌；22、伊斯特本沙門氏菌；23、邁阿密沙門氏菌；24、腸炎沙門氏菌；25、阿貢納沙門氏菌；26、巴森海德沙門氏菌；27、蒙特維的亞沙門氏菌；28、耶路撒冷沙門氏菌；29、波恩沙門氏菌；30、布倫登魯普沙門氏菌；31、圣保羅沙門氏菌；32、海德?tīng)柋ど抽T氏菌；33、肯塔基沙門氏菌；34、布洛克利沙門氏菌；35、博納恩沙門氏菌；36、旺茲沃斯沙門氏菌；37、阿德萊德沙門氏菌；38、無(wú)菌水。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：

pcr檢測(cè)方法對(duì)不同菌種特異性評(píng)價(jià)

1、甲型副傷寒沙門氏菌血清型特異性基因的篩選

在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了甲型副傷寒沙門氏菌cmcc50973菌株(nz_cp009049.1)的全基因組序列，根據(jù)比較基因組的方法將該菌基因組的每個(gè)基因利用ncba網(wǎng)站的blast程序進(jìn)行比對(duì)，選擇與該血清型同源性較高(e值＝0,qμerycover＝0％)同時(shí)與其它微生物的同源性很低(qμerycover＜10％)的基因作為甲型副傷寒沙門氏菌的準(zhǔn)特異性基因。通過(guò)該方法共獲得7個(gè)甲型副傷寒沙門氏菌的準(zhǔn)特異性基因，再針對(duì)每一個(gè)基因設(shè)計(jì)多對(duì)引物，利用實(shí)驗(yàn)室保存的沙門氏菌其它血清型進(jìn)行特異性驗(yàn)證。根據(jù)pcr結(jié)果，確定gene3270、gene3268和gene3106基因作為甲型副傷寒沙門氏菌血清型特異性的檢測(cè)靶點(diǎn)，基因序列分別如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示。

2、引物設(shè)計(jì)

通過(guò)primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)置gc％范圍在40-60％，產(chǎn)物大小范圍為100-600bp，從備選引物對(duì)中選擇出引物，3對(duì)特異性引物對(duì)：pa2、pa5和pa7，核苷酸序列分別為pa2-f：seqidno.5、pa2-r：seqidno.6；pa5-f：seqidno.7、pa5-r：seqidno.8；pa7-f：seqidno.9、pa7-r：seqidno.10；委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3、dna模板的制備

將包括甲型副傷寒沙門氏菌(s.paratyphia)等46株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和18株非沙門氏菌(如表1)(編號(hào)為cicc的菌株購(gòu)自于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，編號(hào)為cmcc的菌株購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心，無(wú)編號(hào)的為實(shí)驗(yàn)室自己保藏的菌株，如果其他同行出于研究需要，本試驗(yàn)室愿意提供該菌株)的各個(gè)血清型分別接種到30ml的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h。分別取1ml各菌菌懸液于1.5ml離心管中，12000r/min，離心1min，棄上清。用500μl滅菌的純水洗滌菌體沉淀兩次，再用100μl滅菌純水溶解沉淀。在沸水浴中煮沸10min，12000r/min，離心1min，取上清液作為pcr模板。

4、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立

建立pcr檢測(cè)體系：25μl反應(yīng)體系包含：2×master12.5μl，10μm引物對(duì)1μl，模板取1μl，補(bǔ)ddh2o至25μl。

設(shè)定pcr的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。于pcr儀中按照既定的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序分別以上述步驟中提取的各菌菌株dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以做凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

5、凝膠電泳檢測(cè)

將上述進(jìn)行pcr擴(kuò)增后的產(chǎn)物和作為marker的ds2000按照既定的順序分別取6μl加到1％的瓊脂糖凝膠中，用150v電壓跑40min后，goldview染色后觀察結(jié)果。

pcr凝膠檢測(cè)結(jié)果如圖1、表1和表2，以包括甲型副傷寒沙門氏菌(s.paratyphia)在內(nèi)的37株沙門氏菌dna作為模板，pcr擴(kuò)增后僅有甲型副傷寒沙門氏菌在574bp、191bp和146bp出現(xiàn)特異性電泳條帶；為更好說(shuō)明本發(fā)明的特異性，以不同來(lái)源的沙門氏菌共46株和18株非沙門氏菌(表1和表2中，其中“*”代表分離株，其它為標(biāo)準(zhǔn)菌株)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，凝膠電泳得到結(jié)果如表1所述。電泳結(jié)果在574bp、191bp和146bp位置出現(xiàn)擴(kuò)增條帶時(shí)，證明為陽(yáng)性結(jié)果，以“+”表示；當(dāng)該位置沒(méi)有擴(kuò)增條帶，證明為陰性結(jié)果，以“-”表示；從表1也可以看出，經(jīng)過(guò)該方法pcr擴(kuò)增，僅甲型副傷寒沙門氏菌(s.paratyphia)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)果很好地說(shuō)明了本發(fā)明提供的方法穩(wěn)定性高，特異性強(qiáng)，適用范圍廣，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確。

實(shí)施例2：

pcr檢測(cè)方法對(duì)不同模板濃度靈敏度評(píng)價(jià)

甲型副傷寒沙門氏菌血清型特異性基因的篩選、引物設(shè)計(jì)步驟如實(shí)施例1。

dna模板的制備：挑取甲型副傷寒沙門氏菌單菌落轉(zhuǎn)接到30ml的lb液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。以上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組dna小量提取試劑盒，提取甲型副傷寒沙門氏菌總dna，經(jīng)測(cè)定，濃度為48.37ng/μl。用無(wú)菌水作10倍梯度稀釋，共稀釋7個(gè)梯度，作為pcr模板。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立：建立pcr檢測(cè)體系：25μl反應(yīng)體系包含：2×master12.5μl，10μm引物對(duì)1μl，模板取5μl，補(bǔ)ddh2o至25μl。設(shè)計(jì)pcr的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

取上述步驟中6個(gè)梯度dna模板各取1μl加入pcr反應(yīng)體系，于pcr儀上進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。取6μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物到1％的瓊脂糖凝膠中，用150v電壓跑40min后，goldview染色后觀察結(jié)果。

針對(duì)于pa2、pa5和pa7引物對(duì)從第1到第5泳道574bp、146bp和191bp處均有條帶顯示，第5泳道相應(yīng)的濃度為4.837pg/μl，電泳結(jié)果如圖2中的2a、2b和2c(圖2中m為dl2000；模板濃度1-6為48.37ng/μl、4.837ng/μl、483.7pg/μl、48.37pg/μl、4.837pg/μl和483.7fg/μl)所示。因此，判定對(duì)于pa2、pa5和pa7引物的pcr檢測(cè)靈敏度為4.837pg/μl。

表1特異性評(píng)價(jià)所用的菌株及檢測(cè)結(jié)果

表2特異性評(píng)價(jià)所用的菌株及檢測(cè)結(jié)果

綜上所述，本發(fā)明通過(guò)基因組比較分析獲得甲型副傷寒沙門氏菌的特異性檢測(cè)靶基因，從而通過(guò)特異性引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增、電泳檢測(cè)該目的基因，本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短，實(shí)現(xiàn)了甲型副傷寒沙門氏菌高特異性快速檢測(cè)的目的；

本發(fā)明提供檢測(cè)甲型副傷寒沙門氏菌的3個(gè)特異性靶基因、相應(yīng)的pcr引物對(duì)、利用以上引物對(duì)和靶基因進(jìn)行檢測(cè)，特異性引物對(duì)是根據(jù)3個(gè)甲型副傷寒沙門氏菌特異性檢測(cè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)而成，該特異性檢測(cè)靶點(diǎn)穩(wěn)定高、特異性強(qiáng)，通過(guò)合理優(yōu)化pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系，凝膠電泳檢測(cè)手段，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定出甲型副傷寒沙門氏菌；

采用本發(fā)明的檢測(cè)方法可直接鑒定甲型副傷寒沙門氏菌，不需要血清型實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)時(shí)間縮短在12h以內(nèi)，并且，由于檢測(cè)過(guò)程無(wú)需采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法中必須使用的抗血清，可降低檢測(cè)成本，本發(fā)明通過(guò)pcr檢測(cè)特異性dna片段，具有單一性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果可靠，結(jié)果判定簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。

以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。