本發(fā)明涉及ph檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種糖基化3-氨基喹啉化合物及其制備方法和作為ph探針的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：許多細(xì)胞的代謝過程都會受到ph值的調(diào)控，比如細(xì)胞內(nèi)吞、信號傳遞、細(xì)胞發(fā)育、死亡及防御過程。酸性的環(huán)境能夠調(diào)節(jié)酶活性并導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。在真核細(xì)胞內(nèi)，溶酶體(ph4.5-5.5)和核內(nèi)體(ph4.5-6.8)這些酸性細(xì)胞器ph值發(fā)生反常預(yù)示著細(xì)胞功能發(fā)生障礙。在植物細(xì)胞的生長發(fā)育過程中，往往也會伴隨著液泡ph值的改變，這些變化與果實的酸味及芳香性密切相關(guān)。因此，檢測細(xì)胞或組織的ph變化對研究細(xì)胞的生理和病理過程有重要的意義。關(guān)于nmr(核磁共振)，熒光，pet(正電子發(fā)射型計算機(jī)斷層顯像)等多種成像技術(shù)應(yīng)用于組織及細(xì)胞的ph檢測和成像的報道有很多。相比于這幾類成像技術(shù)，質(zhì)譜成像是一種接近細(xì)胞水平的免標(biāo)記分子成像技術(shù)。它是將分子的相對豐度大小轉(zhuǎn)化成圖像中不同深淺顏色，能同時檢測多種生物分子，比如蛋白質(zhì)，多肽，核酸，多糖，代謝物等，已廣泛用于生物、醫(yī)藥、化學(xué)等領(lǐng)域。而質(zhì)譜成像在ph檢測領(lǐng)域的應(yīng)用目前還沒有報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種糖基化3-氨基喹啉化合物及其制備方法和作為ph探針的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的在于提供一種靈敏的生物組織ph檢測方法，利用質(zhì)譜成像技術(shù)觀察組織的ph分布和變化。本發(fā)明提供的一種糖胺類質(zhì)譜ph探針，是糖基化3-氨基喹啉，連接了一分子單糖和一分子3-aq，在具備良好的水溶性的同時還能吸收紫外激光，實現(xiàn)在maldi(基質(zhì)輔助激光解吸)中免基質(zhì)檢測。一種糖基化3-氨基喹啉化合物，為式i結(jié)構(gòu)：其中，即具體結(jié)構(gòu)式如下：本發(fā)明的糖基化3-氨基喹啉化合物，可用作質(zhì)譜ph探針。它是由單糖和3-aq(3-氨基喹啉)反應(yīng)制得。結(jié)合葡萄糖等單糖良好的水溶性優(yōu)勢和3-氨基喹啉能夠吸收紫外激光的優(yōu)勢，這種探針分子具有良好的水溶性以及在不添加基質(zhì)情況下，就能在maldi質(zhì)譜中出峰，且靈敏度高。該探針分子還可以在酸性溶液中發(fā)生水解，而且水解產(chǎn)物的相對豐度隨ph的減小而增加。將這種新化合物應(yīng)用在組織表面上，利用maldi質(zhì)譜成像，可以用于組織表面ph變化檢測。本發(fā)明的ph探針含有糖胺鍵，遇酸易發(fā)生水解，且酸性越強，水解產(chǎn)物越多，因而該探針對酸的響應(yīng)性良好。一種糖基化3-氨基喹啉化合物的制備方法，包括以下步驟：在反應(yīng)容器中加入單糖和3-氨基喹啉(3-aq)，再加入水和乙醇混合溶液，滴加冰醋酸，之后進(jìn)行反應(yīng)，待冷卻后，將反應(yīng)后的溶液除去溶劑，然后用重結(jié)晶，得到淺黃色固體，即糖基化3-氨基喹啉化合物。所述的單糖、3-氨基喹啉的摩爾比為1：1.5～2.5；進(jìn)一步優(yōu)選，所述的單糖、3-氨基喹啉的摩爾比為1：2。所述的水和乙醇的體積比為1：1.5～2.5；進(jìn)一步優(yōu)選，所述的水和乙醇的體積比為1：2；所述的反應(yīng)的條件：將反應(yīng)容器置于50～70℃的油浴中攪拌反應(yīng)2～4h；進(jìn)一步優(yōu)選，所述的反應(yīng)的條件：將反應(yīng)容器置于60℃的油浴中攪拌反應(yīng)3h。所述的除去溶劑包括：將反應(yīng)后的溶液置于水浴鍋中，旋蒸濃縮除去溶劑；所述的重結(jié)晶采用乙醇重結(jié)晶2～5次。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的重結(jié)晶采用乙醇重結(jié)晶3次。其合成路線如下(以下檢測實驗均以葡萄糖為例)：所述的糖基化3-氨基喹啉化合物特別適合作為質(zhì)譜ph探針，一種ph的質(zhì)譜檢測方法，包括以下步驟：(1)將糖基化3-氨基喹啉化合物用水配置3～10mg/ml的探針儲備液；(2)將探針儲備液添加到等體積的一系列ph標(biāo)準(zhǔn)液中，在40℃～50℃水浴中加熱35～45min后，點樣，進(jìn)入maldi系統(tǒng)測試；以ph為橫坐標(biāo)，水解產(chǎn)物3-氨基喹啉(3-aq)的相對豐度為縱坐標(biāo)繪圖并進(jìn)行線性擬合，得到擬合曲線；(3)將探針儲備液噴在不同酸度的測試對象上，利用maldi系統(tǒng)測試，得到水解產(chǎn)物3-氨基喹啉(3-aq)的相對豐度，然后與步驟(2)的擬合曲線對照，完成測試對象的ph檢測。步驟(1)中，所述的探針儲備液的濃度為5mg/ml。步驟(2)中，所述的點樣采用雙薄層法點樣，即先取探針儲備液和ph標(biāo)準(zhǔn)液(v/v＝1:1)的混合液點在靶板上，待干燥后再取等體積混合液點在結(jié)晶點上，干燥后能夠在靶板上形成了一層薄且均勻的結(jié)晶層，這有利于提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和maldi成像的分辨率。即所述的探針maldi質(zhì)譜檢測時采用雙薄層法點樣，先取2.5ul的gly-3-aq點在靶板上，待干燥后再取2.5ul點在結(jié)晶點上，干燥后能夠在靶板上形成了一層薄且均勻的結(jié)晶層，這有利于提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和maldi成像的分辨率。進(jìn)一步的，樣品點結(jié)晶均勻，可用于定量，在每個樣品結(jié)晶4處不同位點各采集一張質(zhì)譜圖，計算3-aq相對豐度的rsd％，都在10％以內(nèi)。在45℃水浴中加熱40min，即所述探針?biāo)鈺r間優(yōu)化為40min，溫度為45℃，在這種水解條件下，ph4和ph6標(biāo)準(zhǔn)液的3-aq相對豐度差別最大。在測試ph時，maldi質(zhì)譜的激光能量控制在40％，以避免激光能量不同帶來的誤差，將這種探針分子噴在不同酸度的生物組織上，利用質(zhì)譜成像技術(shù)可以實現(xiàn)組織ph分布成像，并區(qū)分出不同組織的酸度差異。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的ph探針有以下幾個優(yōu)勢：(1)是一種水溶性良好的新化合物；(2)實現(xiàn)了maldi質(zhì)譜的免基質(zhì)檢測，排除了基質(zhì)的干擾，質(zhì)譜圖更干凈，信噪比更高；(3)對ph的響應(yīng)良好，線性響應(yīng)范圍為3.5-6.0，回歸方程為r2＝0.99；(4)在靶板上能夠形成均勻的結(jié)晶，定量重現(xiàn)性好；(5)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，重復(fù)3次，標(biāo)準(zhǔn)曲線都能很好吻合；(6)能夠應(yīng)用于組織上，區(qū)分組織的ph差異。附圖說明圖1為實施例1的純化的gly-3-aq的核磁譜圖；圖2為實施例2的gly-3-aq的maldi質(zhì)譜圖；圖3為實施例3的不同點樣方式下，gly-3-aq在maldi靶板上結(jié)晶圖,其中，圖3(a)為在干燥液滴法點樣方式下，gly-3-aq在maldi靶板上結(jié)晶圖,圖3(b)為在雙薄層法點樣方式下，gly-3-aq在maldi靶板上結(jié)晶圖,；圖4為實施例4的gly-3-aq不同水解條件下水解產(chǎn)物相對豐度差異圖,其中，圖4(a)為水解時間分別是20，40，60min時水解產(chǎn)物3-aq的相對豐度圖，圖4(b)是在20℃和45℃下水解相對豐度圖；圖5為實施例5的探針在不同ph標(biāo)準(zhǔn)液水解后的maldi質(zhì)譜圖；圖6為實施例5的探針對ph響應(yīng)的工作曲線，其中，圖6(a)是將相對豐度(ra)帶入公式(1)取對數(shù)所得的工作曲線，圖6(b)是將3次重復(fù)實驗結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施方式實施例1ph質(zhì)譜探針gly-3-aq的制備(以葡萄糖為例)，步驟如下：(1)將180mg(1mmol)的葡萄糖加入燒瓶并溶于1ml的蒸餾水中，再將280mg(2mmol)的3-aq溶于2ml的乙醇中并加入燒瓶混勻，滴加2滴乙酸，在60℃的油浴中攪拌30min，旋蒸除去大部分溶劑后，加入5ml*3的乙醇重結(jié)晶3次，干燥后，得到淡黃色固體產(chǎn)物(gly-3-aq)178mg，產(chǎn)率58％。gly-3-aq探針用核磁和高分辨質(zhì)譜表征，結(jié)果如下：gly-3-aq,1hnmr(dmso-d6,500mhz):δ(ppm)＝3.19(m,1h),3.26(m,1h),3.34(m,2h),3.48(m,1h),3.70(m,1h)4.53(m,2h),4.98(d,1h),5.01(d,1h),5.07(d,1h),6.93(d,1h),7.29(d,1h),7.40(m,2h),7.68(d,1h),7.81(d,1h),8.56(d,1h)；13cnmr(dmso-d6,125mhz):δ(ppm)＝60.89,70.14,73.04,77.48,77.72,84.54,111.00,124.51,126.10,128.47,129.17,140.96,141.54,143.59.1hnmr譜圖如附圖1所示。精確分子量測定,calculatedforc15h19n2o5+([m+h]+):307.1288,found:307.1283,relativeerror:-1.63ppm.通過上述表征，可以確定該淡黃色固體產(chǎn)物為為式i結(jié)構(gòu)：其中，實施例2ph探針gly-3-aq的maldi質(zhì)譜檢測取2.5ul2.5mg/ml的gly-3-aq水溶液點在maldi靶板上，待干燥后進(jìn)靶，調(diào)節(jié)maldi的測試參數(shù)為：加速電壓19kv，激光500shots，激光強度40％，采集范圍m/z50-600，反射模式。圖2顯示gly-3-aq在不加基質(zhì)情況下可以出峰，免除了基質(zhì)峰的干擾，信號的靈敏度和信噪比大大提高。實施例3點樣方式的優(yōu)化樣品點結(jié)晶是否均勻細(xì)小是maldi定量的關(guān)鍵。為了提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性和可靠性，對點樣方式進(jìn)行了優(yōu)化。吸取2.5ul5mg/ml水解后的ph6探針溶液，采用最常規(guī)的點樣方式干燥液滴法點樣，干燥后的結(jié)晶圖3(a)所示。然后，采用雙薄層法先點2.5ul2.5mg/ml的水解后的ph6探針溶液在maldi靶板上形成一薄層，等干燥后再點2.5ul探針溶液，干燥后的結(jié)晶圖如圖3(b)所示。很顯然，雙薄層法結(jié)晶明顯比干燥液滴法更均勻細(xì)小。然后，在每個樣品結(jié)晶點6處不同位點點擊激光，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，3-aq相對豐度表如表一所示。干燥液滴法(drieddroplet)采集的3-aq相對豐度數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較差，rsd％為12.4％，而雙薄層法(twothinlayer)得到的數(shù)據(jù)rsd％為3.2％，重現(xiàn)性明顯高于干燥液滴法，因而更適宜定量。表1實施例3的不同點樣方式下，3-aq相對豐度重現(xiàn)性考察表。表1position123456averagersd％drieddroplet16.50(a)18.0021.4016.7020.5016.0018.1812.4twothinlayer8.579.178.428.548.958.788.743.2a(relativeabundance,％)實施例4優(yōu)化水解反應(yīng)的各項因素，使得探針分子對ph的響應(yīng)最靈敏。配置2.5mg/ml的ph4.0和ph6.0探針緩沖溶液，調(diào)節(jié)水解時間和溫度。圖4(a)是水解時間分別是20，40，60min時水解產(chǎn)物3-aq的相對豐度圖，很顯然，40min處ph4.0和ph6.0的溶液水解產(chǎn)物的相對豐度差別最大，故選擇40min作為探針最佳反應(yīng)時間，能夠使探針對ph響應(yīng)最靈敏。圖4(b)是在20℃和45℃下水解相對豐度圖，45℃下ph4.0和ph6.0的相對豐度差異明顯大于20℃的水解，因此選擇45℃作為最佳反應(yīng)溫度。實施例5質(zhì)譜探針對ph響應(yīng)的工作曲線(1)配置一系列0.03m的醋酸銨水溶液，調(diào)節(jié)溶液ph為3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，6.5，7.0，8.0；(2)稱取10mg的gly-3-aq溶于2ml水中，配成5mg/ml的探針?biāo)芤海?3)吸取200ul的上述探針?biāo)芤旱较嗤w積的ph3-8系列緩沖溶液中，混勻后在45℃下，水解40min；(4)采用雙薄層法點樣，干燥后進(jìn)入maldi系統(tǒng)檢測，每個樣品結(jié)晶6處不同位置采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，除去兩個異常值，選擇4個相對豐度值計算平均相對豐度和rsd％，利用平均相對豐度繪制ph標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5顯示溶液的ph越低，水解產(chǎn)物3-氨基喹啉峰強度越低。重復(fù)上述實驗3次，結(jié)果如圖6所示。圖6(a)縱坐標(biāo)是將相對豐度(ra)帶入公式(1)取對數(shù)所得，可以看出lgα-ph在ph3.5-6.0呈線性，超過6.0后曲線走平。圖6(b)將3次重復(fù)實驗結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3次結(jié)果都能夠很好相吻合，且線性相關(guān)系數(shù)為0.99，rsd％均小于10％。(5)將這種探針分子噴在不同酸度的生物組織上，利用maldi系統(tǒng)測試，得到水解產(chǎn)物3-氨基喹啉的相對豐度，然后與步驟(4)的擬合曲線對照，利用質(zhì)譜成像技術(shù)可以實現(xiàn)組織ph分布成像，并區(qū)分出不同組織的酸度差異。實施例6糖基化3-氨基喹啉化合物，為式i結(jié)構(gòu)：其中，選用這些糖基化3-氨基喹啉化合物，重復(fù)實施例5的步驟，將這些糖基化3-氨基喹啉化合物噴在不同酸度的生物組織上，利用質(zhì)譜成像技術(shù)可以實現(xiàn)組織ph分布成像，并區(qū)分出不同組織的酸度差異。當(dāng)前第1頁12