本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細胞貼壁因子，以及采用該細胞貼壁因子的細胞貼壁試劑和包被液，以及采用該包被液處理后的細胞培養(yǎng)容器，以及它們在培養(yǎng)干細胞或t淋巴細胞方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高等生物細胞除了循環(huán)運輸類細胞以外，一般都是固定生長、必須貼附在基質(zhì)上生長，此基質(zhì)被稱為細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ecm)。對于干細胞的體外培養(yǎng)來說，ecm的提供是必須的。

已知的ecm為多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要包含膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖和糖蛋白等。細胞貼附到細胞外的間質(zhì)糖蛋白上(類似纖維網(wǎng)蛋白)，以利細胞的生長、伸展與分化。血清是這些糖蛋白的豐富來源，但卻相當(dāng)昂貴且難以分離，因此限制了細胞大量培養(yǎng)能力。在不加入血清的培養(yǎng)基中，通常需要另加入一些貼壁因子(也稱貼附因子)。

目前一些已知的貼壁因子，大多是以單一蛋白或多個不同蛋白混和物。通常來說，以多個不同蛋白的混合物作為貼壁因子的細胞生長效果較單一種蛋白的好，這背后的原因據(jù)推測可能是由于不同蛋白分別提供不同的功能區(qū)域，從而使細胞能更好的生長。

為了能夠大量生產(chǎn)這些蛋白(貼壁因子)，通常是利用細菌或是真菌的表達系統(tǒng)來制造，然而在純化提取的時候，常容易殘留細菌或是真菌的碎片，會造成一些不利于細胞生長的問題，特別是，當(dāng)培養(yǎng)的細胞要應(yīng)用于人體治療時，殘留的細菌碎片將對人體造成過敏反應(yīng)，嚴(yán)重危害病人的生命安全。

因此，本領(lǐng)域希望能夠研發(fā)一種無細菌或無真菌殘留，化學(xué)成分明確的貼壁因子以及試劑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于相關(guān)技術(shù)的上述問題和/或其他問題，本發(fā)明一方面提供了一種細胞貼壁因子，該細胞貼壁因子為具有如seqno.1所示的氨基酸序列的化學(xué)合成多肽。

本發(fā)明再一方面提供了一種細胞貼壁試劑，所述細胞貼壁試劑含有如上述的細胞貼壁因子。

優(yōu)選的，所述細胞貼壁試劑為所述細胞貼壁因子與磷酸鹽緩沖液的混合液。

優(yōu)選的，所述細胞貼壁試劑還含有丙三醇和藥用乙醇。

優(yōu)選的，每毫升所述細胞貼壁試劑含有5-15mg所述細胞貼壁因子、100μl磷酸鹽緩沖液、100μl丙三醇和800μl藥用乙醇。

本發(fā)明還一方面提供了一種用于促進細胞貼壁的包被液，所述包被液含有上述的細胞貼壁因子，且所述細胞貼壁因子的濃度為5-15μg/ml；并且，所述包被液是通過將上述的細胞貼壁因子溶解于磷酸鹽緩沖液配制而成；或者，所述包被液是采用磷酸鹽緩沖液將上述的細胞貼壁試劑稀釋配制而成。

本發(fā)明還一方面一種細胞培養(yǎng)容器，所述細胞培養(yǎng)容器具有供細胞貼壁的內(nèi)壁，所述內(nèi)壁經(jīng)過包被處理，所述包被處理采用如上述的用于促進細胞貼壁的包被液。

優(yōu)選的，所述包被處理是將上述的用于促進細胞貼壁的包被液均勻地涂布于所述內(nèi)壁，并在4～30攝氏度下包被1～6小時，最后棄去所述內(nèi)壁上殘留的包被液。

本發(fā)明還一方面提供了上述的細胞貼壁因子、上述細胞貼壁試劑、上述的包被液以及上述的細胞培養(yǎng)容器在培養(yǎng)干細胞或免疫細胞方面的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述免疫細胞為淋巴細胞或樹突狀細胞。

優(yōu)選的，所述淋巴細胞為cik細胞。

本發(fā)明的細胞貼壁因子為一化學(xué)合成多肽，一方面其具有多個ecm蛋白的功能區(qū)域，可以提供多種ecm蛋白的功能，可以使得細胞如同在原本的生長環(huán)境中貼壁生長，提高細胞的生長速度，另一方面，其化學(xué)成分明確，配方質(zhì)量穩(wěn)定，不使用細菌或真菌，不存在細菌或真菌碎片，可以避免殘留碎片或其他雜質(zhì)對細胞生長的危害，安全性更高，可以安全地應(yīng)用于臨床治療。

附圖說明

圖1為應(yīng)用例1的細胞貼壁生長的相差光學(xué)顯微鏡圖片；

圖2為對比例1的細胞貼壁生長的相差光學(xué)顯微鏡圖片；

圖3為對比例2的細胞貼壁生長的相差光學(xué)顯微鏡圖片；

圖4為對比例3的細胞貼壁生長的相差光學(xué)顯微鏡圖片。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明并不限于這些具體實施方式。

合成細胞貼壁因子

在本發(fā)明的一個具體實施方案中，采用常規(guī)的多肽合成方法來合成具有如seqno.1所示的氨基酸序列的化學(xué)合成多肽；合成產(chǎn)物可以采用常規(guī)的多肽純化方法來純化，進而配制細胞貼壁因子。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，采用9-芴甲氧羰基保護法來合成具有如seqno.1所示的氨基酸序列的化學(xué)合成多肽；合成產(chǎn)物采用hplc純化，進而配制細胞貼壁因子。

在本實施例中，發(fā)明人委托生工生物合成具有如seqno.1所示的氨基酸序列，并進行純化獲得細胞貼壁因子。

細胞貼壁試劑的配制

在本實施例中，配制1l細胞貼壁試劑：

取100ml的磷酸緩沖液、100ml的丙三醇和800ml的藥用乙醇，混合均勻，再加入10g上述合成的細胞貼壁因子，攪拌使之溶解，從而獲得1l細胞貼壁試劑，其中細胞貼壁因子的濃度為10mg/ml。

將配制的細胞貼壁試劑置于棕色試劑瓶中，室溫下，避光保存。

用于促進細胞貼壁的包被液

包被液的配制有兩種方式：

方式1：將上述合成的細胞貼壁因子溶解于磷酸緩沖液中，配制成細胞貼壁因子濃度為5-15μg/ml的包被液；

方式2：取配制好的細胞貼壁試劑(含細胞貼壁因子5-15mg/ml)，采用磷酸鹽緩沖液將其稀釋至細胞貼壁因子的濃度為5-15μg/ml。

本實施例中采用方式2，取上述配制的細胞貼壁試劑，用磷酸鹽緩沖液稀釋1000倍，稀釋后細胞貼壁因子的濃度為5-15μg/ml。

包被處理細胞培養(yǎng)容器

細胞培養(yǎng)容器一般包括：培養(yǎng)瓶(按照底面積的大小分為各種規(guī)格)、培養(yǎng)皿(按照底面積的大小分為各種規(guī)格)和培養(yǎng)板(例如6孔板、12孔板、24孔板和96孔板)。一般來說，細胞擴增一般采用培養(yǎng)瓶。

細胞培養(yǎng)容器中具有供細胞貼壁的內(nèi)壁。

將上述獲得的包被液均勻地涂布在細胞培養(yǎng)容器的內(nèi)壁上，例如細胞培養(yǎng)瓶的內(nèi)壁，細胞培養(yǎng)皿的內(nèi)壁等，在4～30攝氏度下包被1～6小時，最后棄去殘留的包被液即可。

在本實施例中，將上述獲得的細胞貼壁因子的濃度為10μg/ml涂布于細胞培養(yǎng)皿(購自corning公司，型號430639)的內(nèi)壁，25攝氏度下包被1-2小時。

包被處理完成后，即可將干細胞或免疫細胞放進去培養(yǎng)。

應(yīng)用例以及效果數(shù)據(jù)

本應(yīng)用例中以cik細胞為例介紹，在上述經(jīng)包被處理的細胞培養(yǎng)容器中進行細胞培養(yǎng)的過程。

依照常規(guī)的淋巴細胞分離方法，首先從人類全血中分離出單核球淋巴細胞(pbmc)，并調(diào)整細胞濃度至1x10⁶個pmbc/ml，再將該細胞溶液加入到上述經(jīng)包被處理的細胞培養(yǎng)皿中，加入無血清培養(yǎng)基(購自biologicalindustries公司，型號05-080-1a)10ml，再放置于37攝氏度、5％co2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)三天后觀察貼壁細胞(cik細胞)的培養(yǎng)結(jié)果。

應(yīng)用例：采用上述經(jīng)本實施例的包被液處理的細胞培養(yǎng)皿；

對比例1：采用未經(jīng)包被處理的細胞培養(yǎng)皿；具體的細胞培養(yǎng)過程同上述應(yīng)用例；

對比例2：采用經(jīng)市售的貼壁溶液包被處理后的細胞培養(yǎng)皿，其中市售的貼壁溶液購自corning公司，產(chǎn)品型號為356234，包被處理方法參照該產(chǎn)品的說明書；具體的細胞培養(yǎng)過程同上述應(yīng)用例；

對比例3：采用經(jīng)市售的貼壁溶液包被處理后的細胞培養(yǎng)皿，其中市售的貼壁溶液購自biologicalindustries公司，產(chǎn)品型號為05-752-1h，包被處理方法參照該產(chǎn)品的說明書；具體的細胞培養(yǎng)過程同上述應(yīng)用例；

經(jīng)過三天的培養(yǎng)，用相差光學(xué)顯微鏡觀察并拍攝cik細胞的貼壁生長情況；圖1為應(yīng)用例1的cik細胞貼壁生長情況，圖2-4分別為對比例1-3的cik細胞貼壁生長情況；

可以看出，在對比例1中，cik細胞在未經(jīng)包被處理的細胞培養(yǎng)皿中，生長情況很差，細胞生長稀疏，三天培養(yǎng)后，一個顯微鏡視野僅有5-6個細胞團塊，且團塊明顯偏小，顯示細胞數(shù)不足；在對比例2和對比例3中，cik在經(jīng)過市售貼壁溶液處理后的細胞培養(yǎng)皿中，生長情況有所改善，出現(xiàn)了幾個明顯的細胞聚團，但是團塊數(shù)量仍然不多，一個顯微鏡視野只有8-10個細胞團塊；在本發(fā)明的應(yīng)用例中，cik細胞在經(jīng)本發(fā)明的貼壁試劑處理后的細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)三天后，顯微鏡視野下幾乎全為細胞團塊，大型團塊約占50％以上，顯示細胞數(shù)極多；這說明本發(fā)明的貼壁試劑可刺激cik細胞活化，大幅增殖，效果明顯優(yōu)于對比例1，以及對比例2和對比例3。

下面分別檢測應(yīng)用例和對比例1-3的細胞的增殖情況；檢測方法大致是棄去細胞培養(yǎng)皿中細胞培養(yǎng)液，并用無血清培養(yǎng)基清洗以去除殘余的懸浮細胞；再采用胰蛋白酶(購自biologicalindustries公司，型號03-050-1acs)消化細胞團塊，打散均勻后，檢測細胞濃度。

經(jīng)檢測，應(yīng)用例1的細胞濃度為2.8x10⁷個/ml，對比例1-3的細胞濃度分別為1.2x10⁴個/ml、6.6x10⁵個/ml和3.7x10⁵/ml個/ml。

經(jīng)比較可以看出，本發(fā)明應(yīng)用例的cik細胞的增殖效果最好，明顯高于對比例1-3。cik細胞正常為懸浮細胞，但它也具有與貼壁細胞類似的細胞膜接受體(integrin)，只是平時不活化。本發(fā)明的貼壁試劑因子包被在培養(yǎng)皿上，其可活化cik細胞的細胞膜接受體，故可以刺激懸浮的cik細胞生長增殖，當(dāng)懸浮的cik細胞接觸到培養(yǎng)皿底部包被的貼壁試劑時，就會被活化而大幅增殖。

應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施方式中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。

上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施方式的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方式或變更均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

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<110>上海逍鵬生物科技有限公司

<120>一種細胞貼壁因子及其試劑和包被液

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