本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種分泌抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：中藥材從生產(chǎn)、采收、加工、運輸、貯藏等過程均有可能因自身性質(zhì)與外界因素的影響而污染真菌，進而發(fā)生霉變并污染真菌毒素。霉變不僅會影響中藥材的質(zhì)量，使藥材失去原有的藥用價值，造成巨大的經(jīng)濟損失，而且在霉變過程中，產(chǎn)生的多種真菌毒素會對患者的肝、腎、神經(jīng)和造血系統(tǒng)等造成嚴重的損害，甚至可能誘發(fā)癌癥。同時，隨著當今中醫(yī)藥保健養(yǎng)生觀念的普及，越來越多“藥食同源”的大宗中藥材被用于人們?nèi)粘５娘嬍澈捅＝‘斨?，市場的需求量大，若這些中藥材受到真菌毒素的污染，則勢必會危害更多的人群的健康，加重個人和醫(yī)療系統(tǒng)的經(jīng)濟負擔，更有可能進一步影響社會的和諧和穩(wěn)定。黃曲霉毒素(aflatoxins，簡稱afs)主要是由黃曲霉a.flavus和寄生曲霉a.parasiticus產(chǎn)生的一類具有生物活性的有毒次生代謝產(chǎn)物，目前已經(jīng)證實有17種afs相關(guān)的衍生物，包括黃曲霉毒素b1(afb1)、b2(afb2)、g1(afg1)和g2(afg2)，而其中又以afb1的毒性最強，因此1993年世界衛(wèi)生組織(who)的癌癥研究機構(gòu)(iarc)將其劃定為ⅰ類致癌物，而另外三種黃曲霉毒素afb2、afg1和afg2先后也被劃分為2b類致癌物。鑒于afs具有極強的毒性作用，且對人和動物的危害性大，世界各國及相關(guān)組織紛紛制定了嚴苛的限量標準?！吨腥A人民共和國藥典》(2015版)要求對部分中藥材如遠志、大棗、肉豆蔻、決明子、麥芽、陳皮、使君子、柏子仁、胖大海、蓮子、桃仁、檳榔、酸棗仁、薏苡仁等必需開展afb1檢測，并規(guī)定afb1不得超過5μg/kg。目前中藥中afb1的檢測方法主要是儀器分析方法，包括薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。薄層色譜法檢測方便，但檢測限高，不能很好地定量；高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等檢測準確、檢測限低，但需要復(fù)雜的樣品前處理過程、專門的儀器以及專業(yè)的人員培訓。儀器分析方法的這些先天性不足，使其在實際應(yīng)用中受到了很大的限制。免疫分析法可以彌補以上所有缺點，免疫分析法是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測各種物質(zhì)的分析方法，建立小分子化合物的免疫分析方法的關(guān)鍵是能夠制造出對小分子化合物具有高親和力和高特異性的抗體。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種分泌抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該細胞株制備的單克隆抗體對afb1具有較好的特異性和較高的檢測靈敏度，對中藥中可能存在的真菌毒素、農(nóng)藥、重金屬、炮制過程中使用的輔料及污染菌等均具有較好的抗干擾性，為建立中藥中afb1的免疫學檢測方法奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案，一種分泌抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為黃曲霉毒素b1單克隆抗體雜交瘤細胞株f-2-4，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13805，保藏日期為2017年03月08日。抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體，其是由保藏編號為cgmccno.13805的黃曲霉毒素b1單克隆抗體雜交瘤細胞株f-2-4分泌產(chǎn)生的，所述抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體應(yīng)用于中藥中黃曲霉毒素b1的分析檢測。本發(fā)明提供f-2-4細胞株的基本制備過程：(1)afb1半抗原合成及鑒定：在25ml圓底燒瓶中加入100mg黃曲霉毒素b1和5mln,n-二甲基甲酰胺，機械攪拌溶解，0℃條件下緩慢滴加147.3mg三氯氧磷，升溫至40℃，并在磁力攪拌下反應(yīng)2h，再升溫至80℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻，緩慢倒入冰水中，加入w(naoh)＝10％的水溶液調(diào)節(jié)溶液ph＝7～8，用乙酸乙酯30ml，萃取三次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥蒸干。無水乙醇重結(jié)晶，得黃色固體醛基黃曲霉毒素b1103mg，即為afb1半抗原，收率95.37％，核磁共振氫譜鑒定結(jié)果；(2)完全抗原合成：將afb1半抗原分別與牛血清白蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)偶聯(lián)得到免疫抗原(afb1-bsa)和包被抗原(afb1-ova)；(3)動物免疫：取健康的6～8周雌性balb/c小鼠10只(分為a與b兩組，每組5只)，初次免疫用弗氏完全佐劑乳化后頸背部皮下多點注射，每只小鼠免疫劑量為200μgafb1-bsa；之后加強免疫每兩周頸背部皮下多點注射一次，乳化用弗氏不完全佐劑；最后一次免疫使用生理鹽水代替弗氏不完全佐劑，采用腹腔注射，注射劑量和前面幾次相同；通過間接elisa檢測血清效價；(4)細胞融合與細胞株篩選：加強免疫后第三天，通過聚乙二醇(peg4000)法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，利用間接elisa法檢測分泌afb1的細胞株，利用間接競爭elisa法測定該細胞株的抑制效果，篩選最好抑制的陽性細胞株進行三次亞克隆，最終獲得雜交瘤細胞株f-2-4；(5)抗體制備純化及特性鑒定：將液體石蠟注射6～8周balb/c小鼠，500μl/只；10天后每只小鼠0.5ml雜交瘤細胞cgmccno.13805注射到腹腔，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，sds-page凝膠電泳法分析純化效果，獲得的單克隆抗體進行效價、亞型、交叉反應(yīng)性、抗干擾性測定，置于-20℃保存；(6)抗體的應(yīng)用：將雜交瘤細胞株f-2-4分泌的抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體用于制備黃曲霉毒素b1酶聯(lián)免疫試劑盒，以用于中藥中黃曲霉毒素b1的分析檢測。本發(fā)明的有益效果在于：(1)本發(fā)明提供的雜交瘤細胞株f-2-4可以用于制備高效價抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體，抗黃曲霉毒素b1小鼠腹水抗體elisa法測得的效價≥20000。(2)本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體靈敏度高、特異性好、抗干擾性好，對黃曲霉毒素b1的50％抑制濃度ic50為0.141μg/l，與afb2的交叉反應(yīng)率為9％，與afg1的交叉反應(yīng)率為19％，與afg2、afm1的交叉反應(yīng)率均＜1％，對中藥中可能存在的真菌毒素、農(nóng)藥、重金屬、炮制過程中使用的輔料及污染菌等均具有較好的抗干擾性。(3)本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體可應(yīng)用于測定中藥中黃曲霉毒素b1含量。生物材料樣品保藏：一株分泌抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期2017年03月08日，保藏編號為cgmccno.13805。附圖說明圖1黃曲霉毒素b1半抗原合成路線圖圖2黃曲霉毒素b1半抗原核磁共振氫譜圖圖3抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體sds-page電泳結(jié)果圖圖4黃曲霉毒素b1競爭elisa標準曲線圖圖5黃曲霉毒素b1競爭elisalogit/log標準曲線圖具體實施方式本發(fā)明下面的實施例僅作為本
發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例1：雜交瘤細胞株f-2-4的篩選1.半抗原合成及鑒定afb1半抗原的合成路線如附圖1所示。在25ml圓底燒瓶中加入100mg黃曲霉毒素b1和5mln,n-二甲基甲酰胺，機械攪拌溶解，0℃條件下緩慢滴加147.3mg三氯氧磷，升溫至40℃，并在磁力攪拌下反應(yīng)2h，再升溫至80℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻，緩慢倒入冰水中，加入w(naoh)＝10％的水溶液調(diào)節(jié)溶液ph＝7～8，用乙酸乙酯30ml，萃取三次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥蒸干。無水乙醇重結(jié)晶，得黃色固體醛基黃曲霉毒素b1103mg，即為afb1半抗原，收率95.37％。取上述半抗原經(jīng)核磁共振氫譜鑒定，結(jié)果見附圖2。1h-nmr(cdcl3,300mhz)δ：10.36(1h,s,-cho)，6.78(1h,s,-ch-)，6.22(1h,d,c＝c)，4.82(1h,dd,c＝c)，4.31(1h,dd,-ch-)，3.83(3h,s,-och3)，2.98(2h,dd,ch2)，2.07(2h,t,ch2)。圖譜中，化學位移δ＝10.36的為引入的醛基氫共振吸收峰，除原藥本身具有的特征氫吸收峰外，該氫吸收峰的存在，證明間隔臂偶聯(lián)成功，afb1半抗原結(jié)構(gòu)正確。2.完全抗原合成免疫抗原合成——afb1半抗原與bsa偶聯(lián)取afb1半抗原12mg，加n,n-二甲基甲酰胺0.5ml溶解，得到a液；另取50mgbsa，加ph5.40.05mol/l醋酸鹽緩沖液溶解，得到b液；將a液逐滴滴加到b液中，4℃攪拌過夜，加5mg硼氫化鈉，繼續(xù)攪拌2h，0.05mol/l磷酸鹽緩沖液透析三天，每天換液3次，封裝，-20℃保存?zhèn)溆?。包被抗原合成——afb1半抗原與ova偶聯(lián)取afb1半抗原6mg，加二甲基亞砜0.5ml溶解，得到a液；另取50mgova，加ph5.40.05mol/l醋酸鹽緩沖液溶解，得到b液；將a液逐滴滴加到b液中，4℃攪拌過夜，加3mg硼氫化鈉，繼續(xù)攪拌2h，0.05mol/l磷酸鹽緩沖液透析三天，每天換液3次，封裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?.動物免疫取健康的6～8周雌性balb/c小鼠10只(分為a與b兩組，每組5只)，初次免疫用弗氏完全佐劑乳化后頸背部皮下多點注射，每只小鼠免疫劑量為200μgafb1-bsa；之后加強免疫每兩周頸背部皮下多點注射一次，乳化用弗氏不完全佐劑；最后一次免疫使用生理鹽水代替弗氏不完全佐劑，采用腹腔注射，注射劑量和前面幾次相同。具體免疫步驟見表1。表1小鼠免疫程序第三次、四次、加強免疫后7d，對小鼠斷尾取血，elisa方法測定小鼠血清效價，具體步驟如下：(1)用0.05mol/lph9.6的碳酸鹽緩沖液將包被抗原(afb1-ova)做1:1000稀釋，每孔100μl包被酶標板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以pbst洗滌1次，拍干；(2)每孔加入150μl封閉液，37℃反應(yīng)2h后傾去封閉液，拍干；(3)每孔加入50μl以pbs倍比稀釋的抗血清，25℃反應(yīng)30min后傾去反應(yīng)液，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；(4)加pbs稀釋的酶標二抗(1:1000)100μl/孔，25℃反應(yīng)30min，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；(5)每孔加入底物顯色液a液和b液各50μl，25℃避光反應(yīng)15min，每孔加入50μl2mol/l的h2so4溶液終止反應(yīng)；(6)酶標儀測定波長在450nm的od值，以樣品孔od450接近于1的稀釋倍數(shù)作為陽性血清的效價。4.細胞融合(1)飼養(yǎng)細胞制備：斷頸處死8～10周齡balb/c小鼠，浸泡在75％酒精中5min，隨即放入超凈工作臺內(nèi)，腹部朝上放于平皿內(nèi)或固定于解剖板上。用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下兩側(cè)做鈍性分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mlrpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，注入小鼠腹腔，輕輕抽回注射器，晃動小鼠腿部和尾部幾次。用原注射器抽回腹腔內(nèi)液體，注入離心管。如此反復(fù)操作3～4次。1000r/min離心10min，棄上清。用20～50ml完全培養(yǎng)液重懸細胞，100μl/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。(2)脾細胞制備：加強免疫后3d，取免疫balb/c小鼠，眼眶采血后脫臼處死，在75％酒精中消毒后取脾臟，去除結(jié)締組織，制備脾細胞懸液，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加rpmi-1640至30ml，1500～2000r/min離心5min，棄上清，加rpmi-1640至30ml，計數(shù)待用。(3)骨髓瘤細胞制備：取3瓶生長狀態(tài)良好的(活細胞數(shù)>95％)骨髓瘤細胞，將之完全吹下，轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加rpmi-1640至30ml，1500～2000r/min離心5min，棄上清，加rpmi-1640至30ml，計數(shù)待用。(4)細胞混合：脾細胞:骨髓瘤細胞＝8:1，混合，1500～2000r/min離心5min。(5)細胞融合：將混合好的細胞離心，倒干上清，把沉淀細胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，在1min內(nèi)加入1ml融合劑，融合劑為聚乙二醇(peg)4000，作用2min，并輕輕攪拌細胞，在隨后4min內(nèi)加入20ml無血清的peg營養(yǎng)液，1000r/min離心10min，棄上清。用20～50ml完全培養(yǎng)液重懸細胞，鋪種于含飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μl，置培養(yǎng)箱中。5.細胞株篩選待細胞長至孔底的1/2～1/3時，即可進行抗體檢測。采用elisa方法對有雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)孔進行篩選，篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽性細胞孔，第二步選用afb1、afb2、afg1、afg2、afm1為標準品，用間接競爭elisa對陽性細胞進行抑制效果測定。選出對afb1標準品具有較好抑制，對afb2、afg1、afg2、afm1標準品均沒有抑制的孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復(fù)三次，即可得到能穩(wěn)定分泌抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的細胞株f-2-4。該細胞株已于2017年03月08日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為cgmccno.13805。實施例2：抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的制備純化和特性鑒定1.腹水制備將液體石蠟注射6～8周balb/c小鼠，500μl/只。10天后將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞cgmccno.13805用rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基收集，用血球計數(shù)板和顯微鏡計數(shù)，細胞濃度在1.0×106～1.5×106個/ml范圍內(nèi)。每只小鼠0.5ml雜交瘤細胞cgmccno.13805注射到腹腔。注意觀察在一周后小鼠腹部膨大，用無菌注射器于小鼠腹腔采集腹水，每隔一到兩天采集一次，這樣多次反復(fù)采集直到小鼠自然死亡。4℃下5000r/min離心5min，收集上清，并去掉腹水上層漂浮的脂肪和蛋白質(zhì)膜。2.抗體純化單克隆抗體采用辛酸-硫酸銨方法純化，具體步驟如下：(1)將腹水從-20℃冰箱拿出室溫解凍。腹水用雙層濾紙過濾，初步除去脂肪片、細胞碎片及其他雜質(zhì)。12000r/min離心15min，取上清，棄沉淀。精確量腹水體積；(2)1份體積的腹水與3份體積的醋酸鹽緩沖液磁力攪拌混勻，用2mol/lhcl調(diào)ph至4.5～4.8；(3)磁力攪拌下緩慢加入正辛酸，1ml腹水加33μl正辛酸，加完后室溫磁力攪拌30min，后置4℃靜置2h；(4)12000r/min離心5min，取上清，雙層濾紙過濾，收集濾液；(5)量取濾液體積，加入1/10體積的0.1mol/lph7.4的pbs，用2mol/lnaoh(記錄naoh體積)調(diào)ph至7.4；(6)將上清冰浴預(yù)冷，加硫酸銨固體至0.277g/ml，邊加邊攪拌，并于30min內(nèi)加完，置4℃過夜；(7)12000r/min離心15min，棄上清。用一定體積的0.01mol/lpbs溶解沉淀。用pb透析兩天后換0.01mol/lpbs透析兩天，收集透析液，12000r/min離心15min，取上清，置-20℃保存；(8)純化的抗體用sds-page凝膠電泳法分析純化效果，結(jié)果見附圖3，抗體在變性sds-page電泳后，目的蛋白帶大小與預(yù)期一致。抗體會解離成兩個亞基，一個大亞基(重鏈，50kd)和一個小亞基(輕鏈，25kd)，說明純度良好。3.抗體效價測定采用間接elisa方法測定，具體步驟為：(1)用0.05mol/lph9.6的碳酸鹽緩沖液將包被抗原(afb1-ova)做1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀釋，每孔100μl包被酶標板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以pbst洗滌1次，拍干；(2)每孔加入150μl封閉液，37℃反應(yīng)2h后傾去封閉液，拍干；(3)用pbs將單克隆抗體做1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000梯度稀釋，同時將酶標二抗稀釋1000倍，稀釋好的抗體與酶標二抗做10:1混合，每孔加入100μl，置25℃溫箱中孵育45min，每個濃度做一個重復(fù)，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；(5)每孔加入底物顯色液a液和b液各50μl，25℃避光反應(yīng)15min，每孔加入50μl2mol/l的h2so4溶液終止反應(yīng)；(6)酶標儀測定波長在450nm的od值，結(jié)果見表2。表2效價測定結(jié)果由表2可知，運用棋盤法檢測，以od值大于1.0的抗體濃度作為效價，結(jié)果顯示在抗原分別包被1:1000、1:2000、1:4000、1:8000時，5批抗體的效價分別為1:80000、1:80000、1:40000、1:20000(第1批)，1:80000、1:80000、1:40000、1:20000(第2批)，1:80000、1:80000、1:40000、1:40000(第3批)，1:80000、1:80000、1:40000、1:40000(第4批)，1:40000、1:40000、1:40000、1:20000(第5批)，可見，抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的效價≥20000。4.抗體亞型鑒定用市售sigma亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細胞株f-2-4分泌的抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的亞型為igg1型。5.抗體交叉反應(yīng)性測定采用間接競爭elisa方法測定，具體步驟為：(1)用0.05mol/lph9.6的碳酸鹽緩沖液將包被抗原(afb1-ova)做1:1000稀釋，每孔100μl包被酶標板，37℃孵育2h，甩掉包被液，以pbst洗滌1次，拍干；(2)每孔加入150μl封閉液，37℃反應(yīng)2h后傾去封閉液，拍干；(3)每孔先加入50μl系列稀釋的黃曲霉毒素標準工作液(濃度分別為0、0.05、0.15、0.45、1.35μg/l)，然后加入50μl以pbs做1:20000稀釋的單克隆抗體，25℃反應(yīng)30min后傾去反應(yīng)液，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；(4)加pbs稀釋的酶標二抗(1:1000)100μl/孔，25℃反應(yīng)30min，以pbst洗滌3～5次，每次間隔30s，拍干；(5)每孔加入底物顯色液a液和b液各50μl，25℃避光反應(yīng)15min，每孔加入50μl2mol/l的h2so4溶液終止反應(yīng)；(6)酶標儀測定波長在450nm的od值。以黃曲霉毒素濃度的對數(shù)值為橫坐標，以百分吸光度值(各濃度標準品od值與不加標準品孔od值的百分比)為縱坐標繪制標準曲線。以各曲線50％百分吸光度值的質(zhì)量濃度(ic50)按下式計算交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表3，交叉反應(yīng)率越小，抗體特異性越高。式中：si——交叉反應(yīng)率，％；y——afb1標準工作液曲線的ic50值；z——afb1以外黃曲霉毒素標準工作液曲線的ic50值。表3交叉反應(yīng)測定結(jié)果由表3可知，抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體對其他類型的黃曲霉毒素交叉反應(yīng)較小，特異性較好。6.抗體抗干擾性測定根據(jù)5.交叉反應(yīng)性的測定步驟繪制黃曲霉毒素b1的標準曲線，同時分別將以下干擾物質(zhì)用標準品緩沖液稀釋至表格所列的添加值用于分析，根據(jù)藥物顯色對應(yīng)的od值，結(jié)合標準曲線分析出的回收值算出交叉反應(yīng)率(交叉反應(yīng)率＝回收值/添加值×100％)，結(jié)果見表4。表4對中藥中常見的其他物質(zhì)的抗干擾性數(shù)據(jù)由表4可知，中藥中可能存在的真菌毒素、農(nóng)藥、重金屬、炮制過程中使用的輔料及污染菌對抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的性質(zhì)沒有干擾。實施例3：抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的應(yīng)用將雜交瘤細胞株f-2-4分泌的抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體用于制備黃曲霉毒素b1酶聯(lián)免疫試劑盒，以用于中藥中黃曲霉毒素b1的分析檢測。1.酶聯(lián)免疫試劑盒的組成(1)包被抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的酶標板；(2)酶標黃曲霉毒素b1抗原：實施例1中所述的包被抗原與辣根過氧化物酶(hrp)進行偶聯(lián)制備獲得，并用酶標抗原稀釋液稀釋至最佳工作濃度；(3)黃曲霉毒素b1標準品：標準品溶液濃度分別為0μg/l、0.05μg/l、0.15μg/l、0.45μg/l、1.35μg/l；(4)底物顯色液：由a液和b液組成，a液為2％過氧化脲的水溶液，b液為1％四甲基聯(lián)苯胺的水溶液；(5)終止液：2mol/l硫酸溶液；(6)洗滌液：每1l洗滌液按照如下方法配制：將10ml吐溫-20、5g疊氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.02mol/l，ph值為7.4；(7)復(fù)溶液：每1l復(fù)溶液按照如下方法配制：將12g酪蛋白用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.02mol/l，ph值為7.4。2.試劑盒組分的制備(1)包被抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體的酶標板的制備用包被緩沖液將抗黃曲霉毒素b1單克隆抗體稀釋至最佳工作濃度，包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100μl，37℃孵育2h，甩掉包被液，用洗滌液洗滌1次，每次30s，拍干，然后在每孔加入150μl封閉液，37℃孵育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。包被緩沖液：ph9.6、0.05mol/l的碳酸鹽緩沖液；封閉液：每1l封閉液按照如下方法配制：將5ml馬血清、1g疊氮化鈉、30g酪蛋白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.02mol/l，ph值為7.2。(2)酶標黃曲霉毒素b1抗原的制備取實施例1中所述的包被抗原15mg，加入300μln,n-二甲基甲酰胺溶解，加入碳化二亞胺10mg和n-羥基琥珀酰亞胺10mg，活化反應(yīng)0.5h；用0.05mol/l、ph9.0的cb緩沖液0.5ml，溶解辣根過氧化物酶20mg，加入2ml水，然后加入上述活化液300μl，加入1mol/l氫氧化鈉30μl，室溫反應(yīng)4h；用0.02mol/lpbs透析2天，每天換液4次，取出得到透析液2.8ml；加入bsa保護蛋白，萬分之五防腐劑，并用酶標抗原稀釋液稀釋至最佳工作濃度，分裝保存。酶標抗原稀釋液：每1l酶標抗原稀釋液按照如下方法配制：將8g牛血清白蛋白用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.02mol/l，ph值為7.2。3.試劑盒檢測方法(1)樣品前處理稱取1.0g粉碎的中藥樣本至50ml離心管中，加入10ml甲醇，振蕩5min，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；取2ml至10ml干凈離心管中，于20-30℃(68-86℉)水浴氮氣流下吹干；加入2ml去離子水渦動1min，再加入6ml三氯甲烷振蕩5min，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；去掉上層水相，取下層3ml于20-30℃(68-86℉)水浴氮氣流下吹干；加入1ml正己烷渦動2min，再加入1ml復(fù)溶液渦動3min，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；去掉上層有機相，取下層進行分析。(2)用試劑盒檢測向板孔中加入afb1標準品溶液/樣本液50μl/孔，酶標afb1抗原50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)45min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液250μl，30s后倒出孔內(nèi)液體，如此重復(fù)操作共洗板5次，用吸水紙拍干；每孔加入底物顯色液a液和b液各50μl，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min；每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處，測定每孔的吸光度值。(3)結(jié)果計算計算百分吸光度值：用所獲得的標準品溶液或樣本液吸光度值與空白溶液吸光度值的比值進行計算，見下式：式中：w——百分吸光度值，％；a——標準品溶液或樣本液的平均吸光度值；a0——空白溶液(濃度為0μg/l的標準品溶液)的平均吸光度值。繪制標準曲線：以計算的百分吸光度值(％)為縱坐標，標準品溶液濃度的對數(shù)值(log10)為橫坐標繪制標準曲線。樣本結(jié)果計算：將樣本液的百分吸光度值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度后，樣本中黃曲霉毒素b1的含量按下式計算：x＝c×nx＝c×n式中：x——樣本中黃曲霉毒素b1的含量，μg/kg；c——從標準曲線上查得的樣本中黃曲霉毒素b1的濃度，μg/l；n——樣本稀釋倍數(shù)。也可以用各種酶標儀的數(shù)據(jù)處理軟件進行計算。注：計算結(jié)果扣除空白值，所得結(jié)果保留一位小數(shù)。4.檢測效果評價(1)線性關(guān)系標準溶液濃度分別為0、0.05、0.15、0.45、1.35μg/l，測定的od值見表5。以百分吸光度值(w，％)為縱坐標，標準溶液濃度的對數(shù)值(log10)為橫坐標繪制標準曲線(見附圖4)。以logitw為縱坐標，標準溶液濃度的對數(shù)值為橫坐標，將附圖4轉(zhuǎn)換后可知，在0.05μg/l～1.35μg/l濃度范圍內(nèi)，logitw與黃曲霉毒素b1濃度對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(見附圖5)，得回歸方程y＝－2.393x－2.327，r2＝0.994。表5標準溶液的od值測定結(jié)果(2)方法檢測限和定量限參照《中華人民共和國藥典》2015年版9101藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則，方法檢測限lod＝3.3δ/s，定量限loq＝10δ/s，式中δ：測定空白值的標準偏差；s：標準曲線的斜率。根據(jù)上述(1)可知，δ＝0.023，s＝2.393，因此確定檢測限lod為0.032μg/l，定量限loq為0.096μg/l。(3)樣本檢測限采用不同來源的空白麥芽、桃仁、酸棗仁、胖大海、僵蠶、蜈蚣、薏苡仁、全蝎、水蛭、蓮子、使君子、陳皮、遠志、決明子、大棗、檳榔、地龍、柏子仁樣品各20份進行測定，檢測限以測定平均值加3倍標準偏差確定，結(jié)果見表6。表6樣本檢測限結(jié)果樣品檢測限/(ng/kg)樣品檢測限/(ng/kg)樣品檢測限/(ng/kg)麥芽285.7桃仁592.9酸棗仁437.2胖大海382.3僵蠶217.5蜈蚣339.8薏苡仁159.9全蝎388.6水蛭174.7蓮子383.5使君子291.5陳皮235.5遠志267.8決明子371.0大棗397.0檳榔420.3地龍337.1柏子仁355.8(4)準確度(回收率)與精密度(重復(fù)性)以不含afb1的麥芽、桃仁、酸棗仁、胖大海、僵蠶、蜈蚣、薏苡仁、全蝎、水蛭、蓮子、使君子、陳皮、遠志、決明子、大棗、檳榔、地龍、柏子仁為空白樣品基質(zhì)，進行三個濃度水平的添加回收試驗，分別用三批次試劑盒測定，計算樣品添加回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)，結(jié)果見表7。表7樣本準確度與精密度結(jié)果結(jié)果表明，麥芽、桃仁、酸棗仁、胖大海、僵蠶、蜈蚣、薏苡仁、全蝎、水蛭、蓮子、使君子、陳皮、遠志、決明子、大棗、檳榔、地龍、柏子仁18種基質(zhì)的添加回收率在60％～120％，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均＜15％。(4)試劑盒保存期試劑盒保存條件為2-8℃，經(jīng)過12個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、afb1添加回收率均在正常范圍內(nèi)?？紤]到運輸和使用過程中會有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃下放置8天進行加速老化實驗，結(jié)果該試劑盒的各項指標完全符合要求；考慮到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒在-20℃冰箱中放置8天，結(jié)果該試劑盒的各項指標也完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少保存12個月以上。當前第1頁12