本發(fā)明涉及生物
技術領域：
：，具體涉及一種植物耐鹽相關蛋白HbSCaBP10及其編碼基因與應用。
背景技術：
：：土壤鹽漬化、干旱等逆境是植物生長、發(fā)育的主要環(huán)境限制因素。植物為了應對逆境，在長期進化過程中演化形成一套感知逆境脅迫、傳導逆境信號，并在分子、細胞和生理水平上響應的精細調(diào)控機制。Ca2+依賴的信號途徑在植物多種生物過程包括逆境脅迫響應中發(fā)揮重要作用。在解密Ca2+信號、應答植物逆境脅迫的過程中鈣離子感受器是重要的信號傳遞者，調(diào)控脅迫響應基因的開與關。根據(jù)功能和結(jié)構的不同，鈣離子感受器分為響應型和依賴性鈣離子感受器。前者既能結(jié)合Ca2+，又具有激酶活性，如鈣離子依賴性蛋白激酶(CDPKs)；而后者只能結(jié)合Ca2+，并與特異的蛋白激酶互作后才能傳遞鈣信號，如SOS3類似鈣離子感受器(SOS3-LIKECALCIUMBINDINGPROTEIN，簡稱SCaBP)。野大麥(HoMeumbrevisubulatum(Trin.)Link)是禾本科大麥屬一種多年生兼性鹽生的優(yōu)良牧草，主要分布在西西伯利亞、蒙古和我國東北、華北、新疆、西藏和內(nèi)蒙等省區(qū)，是鹽化和堿化草甸草原的建群種，可在含鹽量0.6-1.0％的土地上良好生長，它的耐鹽性可與小花堿茅等媲美，具有重要的應用和科學研究價值。但前人只局限在形態(tài)、解剖、生理等方面的研究，在抗逆調(diào)控基因的克隆與功能分析方面研究較少。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種植物耐鹽相關蛋白HbSCaBP10及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)，獲自野大麥，命名為HbSCaBP10蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(a2)將序列4的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與生物耐鹽性相關的由序列4衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a1)中的HbSCaBP10蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(a2)中的HbSCaBP10蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(a2)中的HbSCaBP10蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列3所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。編碼所述HbSCaBP10蛋白的基因(HbSCaBP10基因)也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述HbSCaBP10基因為如下(b1)-(b3)中任一所述的DNA分子：(b1)序列表中序列3所示的DNA分子；(b2)在嚴格條件下與(b1)限定的DNA序列雜交且編碼與生物耐鹽性相關蛋白的DNA分子；(b3)與(b1)或(b2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼與生物耐鹽性相關蛋白的DNA分子。上述嚴格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。含有所述HbSCaBP10基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。使用所述基因構建重組表達載體時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用所述基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入在植物中表達可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。所述重組表達載體具體可為在pGreen0029載體的多克隆位點中插入了序列表的序列3自5′端第1-783位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達載體具體可為將pGreen0029載體的BamHI和MfeI酶切位點之間的小片段取代為了序列表的序列3自5′端第1-783位核苷酸所示的雙鏈DNA分子得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護HbSCaBP10蛋白或HbSCaBP10基因在調(diào)控生物耐鹽性中的應用。本發(fā)明還保護HbSCaBP10蛋白或HbSCaBP10基因在生物育種中的應用。所述生物育種是為了選育耐鹽性高的生物。本發(fā)明還保護一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將HbSCaBP10基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性高于所述目的植物。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護一種培育轉(zhuǎn)基因生物的方法，是將HbSCaBP10基因、HbCIPK2基因和HbSOS1基因共同導入目的生物中，得到轉(zhuǎn)基因生物；所述轉(zhuǎn)基因生物耐鹽性高于所述目的生物。所述HbCIPK2基因為編碼HbCIPK2蛋白的基因。所述HbSOS1基因為編碼HbSOS1蛋白的基因。所述HbCIPK2蛋白是由序列表中序列6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。所述HbSOS1蛋白是由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。所述碼HbCIPK2蛋白的基因為如下(c1)或(c2)所述的DNA分子：(c1)編碼區(qū)如序列表中序列5自5′末端第68-1426位核苷酸所示的DNA分子；(c2)序列表中序列5所示的DNA分子。所述編碼HbSOS1蛋白的基因為如下(d1)或(d2)所述的DNA分子：(d1)編碼區(qū)如序列表中序列1自5′末端第71至3490位核苷酸所示的DNA分子；(d2)序列表中序列1所示的DNA分子。所述目的生物可為植物或微生物。所述微生物具體可為酵母。所述酵母具體可為酵母敏鹽突變菌株AXT3K。本發(fā)明還保護一種提高植物耐鹽性的方法，是增加目的植物中HbSCaBP10蛋白的表達量和/或活性，提高植物耐鹽性。所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護一種提高生物耐鹽性的方法，是增加目的生物中HbSCaBP10蛋白、HbCIPK2蛋白和HbSOS1蛋白的表達量和/或活性，提高生物耐鹽性。所述目的生物可為植物或微生物。所述微生物具體可為酵母。所述酵母具體可為酵母敏鹽突變菌株AXT3K。本發(fā)明還保護以上任一所述方法在生物育種中的應用。所述生物育種是為了選育耐鹽性高的生物。以上任一所述生物可為植物或微生物。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述微生物具體可為酵母。所述酵母具體可為酵母敏鹽突變菌株AXT3K。本發(fā)明提供了一種HbSCaBP10蛋白及其編碼基因，上調(diào)HbSCaBP10基因的表達量能夠提高植物耐鹽性。同時提高HbSOS1基因、HbSCaBP10基因和HbCIPK2基因的表達量，能夠更為顯著的提高生物的耐鹽性。本發(fā)明可以應用到植物育種中，對培育耐鹽植物有著積極的作用。附圖說明圖1為HbSCaBP10的表達譜。圖2為HbSCaBP10在突變體sos3過表達轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性分析。圖3為HbSCaBP10與蛋白激酶HbCIPK2互作的鑒定。圖4為蛋白激酶HbCIPK2與Na+轉(zhuǎn)運體HbSOS1互作的鑒定。圖5為HbSOS1表達及功能受HbSCaBP10-HbCIPK2調(diào)控的分析。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。Fe-EDTA溶液：稱取7.45gNa2-EDTA和5.57gFeSO4.7H2O，溶解于200mL蒸餾水中，加熱攪拌使其溶解，蒸餾水定容至1L。A-Z溶液：稱取H3BO32.80mg，CuSO4·5H2O0.08mg，ZnSO4·7H2O0.22mg，MgCl2·6H2O81mg，HMoO·4H2O0.09mg，蒸餾水定容至1L。1/2Hoagland培養(yǎng)液：0.51gKNO3、0.82gCa(NO3)2、0.49gMgSO4.7H2O、0.136gKH2PO4，蒸餾水定容至1L；再加入lmLFe-EDTA溶液；然后加入lmLA-Z溶液。擬南芥突變體sos3：在http://www.arabidopsis.org網(wǎng)站的突變體編號為CS3864。參考文獻：LiuJP&ZhuJKJ.AnArabidopsismutantthatrequiresincreasedcalciumforpotassiumnutritionandsalttolerance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94：14960-14964；公眾可以從北京市農(nóng)林科學院獲得。野大麥：參考文獻：LiRF，ZhangJW，WuGY，WangHZ，ChenYJ，WeiJH.HbCIPK2，anovelCBL-interactingproteinkinasefromhalophyteHordeumbrevisubulatum，conferssaltandosmoticstresstolerance.Plant，CellandEnvironment，2012，35(9)：1582-1600.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學院獲得。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥：參考文獻：LiRF，ZhangJW，WuGY，WangHZ，ChenYJ，WeiJH.HbCIPK2，anovelCBL-interactingproteinkinasefromhalophyteHordeumbrevisubulatum，conferssaltandosmoticstresstolerance.Plant，CellandEnvironment，2012，35(9)：1582-1600.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學院獲得。p35S：GFP：參考文獻：LiRF，ZhangJW，WuGY，WangHZ，ChenYJ，WeiJH.HbCIPK2，anovelCBL-interactingproteinkinasefromhalophyteHordeumbrevisubulatum，conferssaltandosmoticstresstolerance.Plant，CellandEnvironment，2012，35(9)：1582-1600.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學院獲得。pGreen0029載體：天恩澤公司，網(wǎng)址：http://www.tiandz.com/product/4017.html。pBT3-STE載體：北京達科為公司。pPR3-STE載體：北京達科為公司。pUC-SPYCE載體：德國MünsterInstitutfürBotanik。pUC-SPYNE載體：德國MünsterInstitutfürBotanik。pcDNA3.1(+)質(zhì)粒：Invitrogen公司。pDR195載體：參考文獻：Rentsch，D.，Laloi，M.，Rouhara，I.，Schmelzer，E.，Delrot，S.&Frommer，W.B.V(1995)NTR1encodesahighaffinityoligopeptidetransporterinArabidopsis.FEBSLett.370，264-268.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學院獲得。p424pMA1載體：參考文獻：MumbergD，MüllerR，F(xiàn)unkM.1994.RegulatablepromotersofSaccharomycescerevisiae：comparisonoftranscriptionalactivityandtheiruseforheterologousexpression.NucleicAcidsResearch25：5767-5768.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學院獲得。pYPGE15載體：參考文獻：QuinteroFJ，OhtaM，ShiH，ZhuJ-KandPardoJM.ReconstitutioninyeastoftheArabidopsisSOSsignalingpathwayforNahomeostasis.PNAS，2002，99(13)：9061-9066).；公眾可以從北京市農(nóng)林科學院獲得。農(nóng)桿菌GV3101：上海北諾生物科技有限公司，網(wǎng)址：http://www.app17.com/c76211/products/d4152051.html。酵母敏鹽突變菌株AXT3K：參考文獻：QuinteroFJ，OhtaM，ShiH，ZhuJK，PardoJM.2002.ReconstitutioninyeastoftheArabidopsisSOSsignalingpathwayforNa+homeostasis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，USA99(13)：9061-9066.；公眾可以從北京市農(nóng)林科學院獲得。LipofectaminTM2000：Invitrogen公司。以下實施例中所涉及的HbCIPK2基因的cDNA序列如序列表中序列5所示，其中第68-1426位為編碼序列(ORF)。序列5編碼序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)(HbCIPK2蛋白)，由452個氨基酸殘基組成。實施例1、耐鹽相關蛋白的獲得一、HbSOS1蛋白及其編碼基因的獲得對野大麥基因組進行序列分析，發(fā)現(xiàn)一種Na+/H+轉(zhuǎn)運體，將其命名為HbSOS1蛋白，如序列表的序列2所示。將編碼HbSOS1蛋白的基因命名HbSOS1基因，HbSOS1基因全長cDNA如序列表的序列1所示，序列1自5’端第71-3490位為開放閱讀框。二、HbSCaBP10蛋白及其編碼基因的獲得對野大麥基因組進行序列分析，發(fā)現(xiàn)一種鈣離子感受器，將其命名為HbSCaBP10蛋白，如序列表的序列4所示。將編碼HbSCaBP10蛋白的基因命名HbSCaBP10基因，HbSCaBP10基因全長cDNA如序列表的序列3所示，序列3自5’端第1-783位為開放閱讀框。實施例2、HbSCaBP10和HbSOS1表達分析及亞細胞定位一、表達分析1、取野大麥種子，置于去離子水中，室溫浸泡12h，然后置于4℃冰箱中過夜。2、取步驟1處理的種子，用滅菌的去離子水沖洗3遍，置放有濕潤紗布的培養(yǎng)皿中，25℃萌芽。經(jīng)過4-5天待種子大部分發(fā)芽之后，轉(zhuǎn)移至滅菌的盛有1/2Hoagland培養(yǎng)液的玻璃瓶中(玻璃瓶用不透光的紙包住)培養(yǎng)(溫度22-23℃，光照強度2000μmolm-2s-1，光照12h/黑暗12h)，待幼苗長至兩葉一心時取材。3、將步驟2長至兩葉一心的幼苗，分別進行如下分組處理：組I：將幼苗置于含有350mMNaCl的1/2Hoagland培養(yǎng)液中，室溫培養(yǎng)6h。組II：將幼苗置于含有350mM甘露醇的1/2Hoagland培養(yǎng)液中，室溫培養(yǎng)6h。組III：將幼苗置于含有10％(體積百分比)PEG6000的1/2Hoagland培養(yǎng)液中，室溫培養(yǎng)6h。組IV：將幼苗置于1/2Hoagland培養(yǎng)液中，4℃培養(yǎng)12h。對照組：將幼苗置于1/2Hoagland培養(yǎng)液中，室溫培養(yǎng)6h。4、完成步驟3中，取所述幼苗的根和葉，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-PCR的方法檢測HbSCaBP10和HbSOS1的表達情況(以Cyclophilin基因為內(nèi)參基因)，采用引物F1和引物R1組成的引物對檢測HbSCaBP10基因的表達，采用引物F2和引物R2組成的引物對檢測HbSOS1基因的表達。采用引物F3和引物R3組成的引物對檢測Cyclophilin基因的表達。F1：5’-CATTGAGCGTGAAGAGGTGA-3’；R1：5’-TGACAGATGGATGCTGCAAT-3’；F2：5’-CAGGGTGGTAGCAGGTGATAACT-3’；R2：5’-TCAACAACAACAAAATATCGGTACA-3’；F3：5’-CCTGTCGTGTCGTCGGTCTAAA-3’；R3：5’-ACGCAGATCCAGCAGCCTAAAG-3’。HbSCaBP10的檢測結(jié)果如圖1b所示。結(jié)果表明，HbSCaBP10主要在地上部(莖葉)表達，在模擬干旱和低溫脅迫下地上部表達均下降，而在高鹽脅迫下根部表達顯著增加。從表達特性來看，HbSCaBP10在高鹽脅迫下表達均顯著增加，說明HbSCaBP10與鹽脅迫有關，可能參與耐鹽性調(diào)控。HbSOS1的檢測結(jié)果如圖5a所示。結(jié)果表明，HbSOS1主要在野大麥根部表達，在NaCl脅迫下根部表達極顯著增加。說明HbSOS1受鹽脅迫表達，其功能與耐鹽性調(diào)控有關。二、亞細胞定位1、GFP：：HbSCaBP10融合基因達載體：將序列表的序列3自5’端第1-783位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入p35S：GFP的BamHI和MfeI酶切位點之間，得到GFP：：HbSCaBP10融合基因表達載體(測序驗證正確)。2、取生長5周的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片，參照文獻：SheenJ.SignalTransductioninMaizeandArabidopsisMesophyllProtoplasts[J].PlantPhysiology，2001，127(4)：1466-1475.中的方法制備擬南芥原生質(zhì)體。3、取步驟1得到的GFP：：HbSCaBP10融合基因表達載體，通過PEG介導法轉(zhuǎn)化步驟2制備的擬南芥原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在23℃培養(yǎng)12-18h，然后使用Confocal激光共聚焦顯微鏡(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)觀察GFP的表達部位。4、取p35S：GFP為陽性對照，通過PEG介導法轉(zhuǎn)化步驟2制備的擬南芥原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在23℃培養(yǎng)12-18h，然后使用Confocal激光共聚焦顯微鏡(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)觀察GFP的表達部位。結(jié)果如圖1c所示。結(jié)果表明，HbSCaBP10主要在細胞膜上表達，其定位與功能直接相關。實施例3、HbSCaBP10在調(diào)控植物耐鹽性中的應用一、轉(zhuǎn)基因株系的獲得1、pGreen0029-HbSCaBP10過表達載體：將序列表的序列3自5’端第1-783位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pGreen0029載體的BamHI和MfeI酶切位點之間，得到pGreen0029-HbSCaBP10過表達載體(測序驗證正確)。2、將步驟1制備的pGreen0029-HbSCaBP10過表達載體導入農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌HbSCaBP10。3、采用蘸花法(方法參照文獻：CloughS.J.&BentA.F.，1998.Floraldip：asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.ThePlantJournal16，735-743)用步驟2得到的重組農(nóng)桿菌HbSCaBP10侵染擬南芥突變體sos3，得到T0代種子。在含50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基平板上進行篩選，在T3代得到突變體sos3轉(zhuǎn)HbSCaBP10基因純合株系。4、采用pGreen0029載體替代pGreen0029-HbSCaBP10過表達載體，按照步驟2-3進行操作，得到突變體sos3轉(zhuǎn)空載體擬南芥。二、轉(zhuǎn)基因株系檢測待測材料為：擬南芥突變體sos3種子、突變體sos3轉(zhuǎn)HbSCaBP10基因純合株系(10s-14、10s-16、10s-121)的T3代種子、突變體sos3轉(zhuǎn)空載體擬南芥的T3代種子。1、取待測種子(每個株系60粒)消毒處理后，接種于含有不同濃度(0mM、100mM、125mM、150mM)NaCl的MS平板上，22-23℃培養(yǎng)2天(光照強度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)，再垂直放置生長7天，記錄各株系發(fā)芽率。2、取待測種子(每個株系60粒)消毒處理后，接種于MS平板上培養(yǎng)，取發(fā)芽5天的幼苗，轉(zhuǎn)接至含有不同濃度(0mM、100mM、125mM、150mM、175mM)NaCl的MS平板上，垂直生長2周(22-23℃、光照強度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)后觀察幼苗的生長狀況，統(tǒng)計幼苗的主根長和側(cè)根數(shù)。3、取待測種子(每個株系60粒)消毒處理后，接種于營養(yǎng)缽(1質(zhì)量份花卉土和1質(zhì)量份跖石混合)，溫室中生長3周(22-23℃、光照強度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)，選取生長狀態(tài)一致的幼苗進行如下分組處理：鹽處理組：第1天：每缽澆30mL含有50mMNaCl的蒸餾水；第3天：每缽澆30mL含有100mMNaCl的蒸餾水；第5天：每缽澆30mL含有150mMNaCl的蒸餾水；第7天：每缽澆30mL含有200mMNaCl的蒸餾水；第9天：每缽澆30mL含有250mMNaCl的蒸餾水。對照組：第1天：每缽澆30mL蒸餾水；第3天：每缽澆30mL蒸餾水；第5天：每缽澆30mL蒸餾水；第7天：每缽澆30mL蒸餾水；第9天：每缽澆30mL蒸餾水。第16天，記錄各株系萎蔫和抽苔實情況，并拍照。4、取待測種子(每個株系60粒)消毒處理后，接種于MS平板上，發(fā)芽后垂直放置生長2周(22-23℃、光照強度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)，然后轉(zhuǎn)移至含有不同濃度(0mM、125mM)NaCl的MS平板上1周(22-23℃、光照強度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)。觀察幼苗表型，收集根部和莖葉，用去離子水沖洗5次，吸干，記錄鮮重，用日立Z-8000原子吸收儀測定Na+、K+含量(單位：mg·g-1DW)。5、取待測種子(每個株系60粒)消毒處理后，接種于MS平板上，發(fā)芽后垂直放置生長3周(22-23℃、光照強度2000μmolm-2s-1，光照16h/黑暗8h)，采用Northernblotting檢測HbSCaBP10表達情況：提取總RNA，1％甲醛變性凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜；擴增HbSCaBP10基因完整CDS序列為探針；參照DigDectionstarterKitII(Roche，11585614910)操作說明，洗膜和免疫學檢測；雜交膜直接在光學成像系統(tǒng)(FUJILAS-4000，Japan)曝光拍照。檢測結(jié)果如圖2所示。圖2a為步驟5的檢測結(jié)果。圖2b為步驟1的檢測結(jié)果。圖2c為步驟2的表型觀察結(jié)果。圖2d為步驟3的表型觀察結(jié)果。圖2e和圖2f為步驟2的檢測結(jié)果。圖2g和圖2h為步驟4的檢測結(jié)果。轉(zhuǎn)基因株系在125-150mMNaCl脅迫下株系的發(fā)芽率顯著高于突變體sos3，因為在此濃度下突變體sos3基本不發(fā)芽(圖2b)。幼苗生長試驗結(jié)果表明，在含不同NaCl平板上轉(zhuǎn)基因株系的幼苗生長狀態(tài)(圖2c)、主根長(圖2e)和側(cè)根數(shù)(圖2f)均顯著優(yōu)于突變體sos3。轉(zhuǎn)基因株系莖葉和根部K+含量均顯著高于突變體sos3(圖2g)，兩部位Na+含量均顯著低于突變體sos3(圖2h)。生長3周溫室盆栽苗脅迫實驗進一步表明，HbSCaBP10可互補突變體sos3的耐鹽性(圖2d)。HbSCaBP10主要在莖葉發(fā)揮耐鹽調(diào)控作用。實施例4、HbSCaBP10與蛋白激酶HbCIPK2相互作用分析一、酵母雙雜交實驗1、pBT3-STE-HbCIPK2載體：將序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pBT3-STE載體的SfiI酶切位點之間，得到pBT3-STE-HbCIPK2載體(測序驗證正確)。2、pPR3-STE-HbSCaBP10載體：將序列表的序列3自5’端第1-738位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pPR3-STE載體的SfiI酶切位點之間，得到pPR3-STE-HbSCaBP10載體(測序驗證正確)。3、根據(jù)酵母雙雜交試劑盒DUALmembranestarterkits(Switzerland，P01201-P01229)操作說明，以步驟1構建的pBT3-STE-HbCIPK2載體為誘餌載體，采用步驟2構建的pPR3-STE-HbSCaBP10載體為捕獲載體，轉(zhuǎn)化酵母NMY51菌株(試劑盒中提供)，觀察菌斑生長情況，同時根據(jù)操作說明進行β-Gal染色分析。采用試劑盒中提供的陽性對照載體作為陽性對照。設置采用pPR3-STE載體為捕獲載體的陰性對照。結(jié)果如圖3a所示。酵母菌斑在選擇性培養(yǎng)基梯度稀釋生長和β-Gal染色分析結(jié)果表明，HbSCaBP10分別與HbCIPK2互作。二、雙分子熒光互補實驗(BiFC)1、HbSCaBP10：：SPYCE融合基因載體：將序列表的序列3自5’端第1-738核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pUC-SPYCE載體的BamHI和KpnI酶切位點之間，得到HbSCaBP10：：SPYCE融合基因載體(測序驗證正確)。2、SPYNE：：HbCIPK2融合基因載體：將序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pUC-SPYNE載體的BamHI和KpnI酶切位點之間，得到SPYNE：：HbCIPK2融合基因載體(測序驗證正確)。3、取生長5周的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片，參照文獻：SheenJ.SignalTransductioninMaizeandArabidopsisMesophyllProtoplasts[J].PlantPhysiology，2001，127(4)：1466-1475.中的方法制備擬南芥原生質(zhì)體。4、取步驟1得到的HbSCaBP10：：SPYCE融合基因載體和步驟2得到的SPYNE：：HbCIPK2融合基因載體進行分組，通過PEG介導法轉(zhuǎn)化步驟3制備的擬南芥原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在23℃培養(yǎng)12-18h，然后使用Confocal激光共聚焦顯微鏡(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)觀察。組I：5μgHbSCaBP10：：SPYCE融合基因載體和5μgSPYNE：：HbCIPK2融合基因載體；組II：5μgpUC-SPYCE載體和5μgSPYNE：：HbCIPK2融合基因載體。結(jié)果如圖3b所示。結(jié)果表明，HbSCaBP10與HbCIPK2在細胞質(zhì)膜上互作。三、免疫共沉淀(CoIP)1、pcDNA3.1-HbSCaBP10-HA質(zhì)粒：人工合成序列3所示的雙鏈DNA分子。以所述雙鏈DNA分子為模板，采用引物F4和引物R4進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的BamHI和XbaI酶切位點之間，得到pcDNA3.1-HbSCaBP10-HA質(zhì)粒(測序驗證正確)。F4：5’-CGGGATCCGCCACCATGGACCCCT-3’：R4：5’-GCTCTAGATTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACATGTCTTCGACT-3’：引物R4中，下劃線部分為HA序列。2、pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒：人工合成序列5所示的雙鏈DNA分子。以所述雙鏈DNA分子為模板，采用引物F5和引物R5進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的BamHI和EcoRI酶切位點之間，得到pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒(測序驗證正確)。F5：5’-CGGGATCCGCCACCATGGGGGAGC-3’；R5：5’-GGAATTCTTACAGGTCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCATTGATGCCATACATGGTTGC-3’；引物R5中，下劃線部分為myc序列。3、將HEK293T細胞接種至24孔板(每孔接種5-10×104個細胞)，采用DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，37℃靜置培養(yǎng)直至細胞長至40-60％。4、完成步驟3后，取所述24孔板，進行如下分組處理：組1：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復合物A，輕微搖動細胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h；組2：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復合物B，輕微搖動細胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h；組3：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復合物C，輕微搖動細胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染復合物A：將1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。轉(zhuǎn)染復合物B：將1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒和1.2μg的pcDNA3.1-HbSCaBP10-HA質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。轉(zhuǎn)染復合物C：將1.2μg的pcDNA3.1-HbSCaBP10-HA質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。5、完成步驟4后，收集細胞，用冷PBS洗一遍，再用細胞裂解液[150mMNaCl，50mMTris(pH7.6)，1％(v/v)NP40，10％(v/v)甘油]裂解30min，4℃、12000rpm離心15min，收集上清液。6、將步驟5的上清液進行蛋白定量，取等量的蛋白分別與小鼠單克隆HAM5抗體(1∶2000，Sigma)和c-Myc抗體(1∶2000，SantaCruz)在4℃孵育3h，然后4℃添加蛋白G/A瓊脂糖磁珠(GEHealthcare公司)孵育1h。然后用細胞裂解液清洗磁珠3次，結(jié)合蛋白用2×上樣緩沖液(Bio-rad公司)洗脫下來，在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用相應的二抗雜交，用化學發(fā)光劑(購自Thermo公司)在X-光片上曝光。結(jié)果如圖3c所示。結(jié)果表明，免疫共沉淀(CoIP)技術從生化水平進一步證明HbSCaBP10與HbCIPK2存在互作關系。實施例5、蛋白激酶HbCIPK2與HbSOS1蛋白相互作用一、酵母雙雜交實驗1、pBT3-STE-HbSOS1載體：將序列表的序列1自5’端第71-3490位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pBT3-STE載體的SfiI酶切位點之間，得到pBT3-STE-HbSOS1載體(測序驗證正確)。2、pPR3-STE-HbCIPK2載體：將序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pPR3-STE載體的SfiI酶切位點之間，得到pPR3-STE-HbCIPK2載體(測序驗證正確)。3、根據(jù)酵母雙雜交試劑盒DUALmembranestarterkits(Switzerland，P01201-P01229)操作說明，以步驟2構建的pBT3-STE-HbCIPK2載體為誘餌載體，采用步驟1構建的pPR3-STE-HbSOS1載體為捕獲載體，轉(zhuǎn)化酵母NMY51菌株(試劑盒中提供)，觀察菌斑生長情況，同時根據(jù)操作說明進行β-Gal染色分析。采用試劑盒中提供的陽性對照載體作為陽性對照。設置采用pPR3-STE載體為捕獲載體的陰性對照。結(jié)果如圖4a所示。酵母菌斑在選擇性培養(yǎng)基梯度稀釋生長和β-Gal染色分析結(jié)果表明，HbSOS1與HbCIPK2互作。二、免疫共沉淀(CoIP)1、pcDNA3.1-HbSOS1-Flag質(zhì)粒：人工合成序列1所示的雙鏈DNA分子。以所述雙鏈DNA分子為模板，采用引物F6和引物R6進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的KpnI和XhoI酶切位點之間，得到pcDNA3.1-HbSOS1-Flag質(zhì)粒(測序驗證正確)。F6：5’-GGGGTACCGCCACCATGGAGGAGG-3’；R6：5’-GCTCTAGATTACTTGTCATCGTCTTTGTAGTCCATGTTGCCTCGT-3’；引物R6中，下劃線部分為Flag序列。2、pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒：人工合成序列5所示的雙鏈DNA分子。以所述雙鏈DNA分子為模板，采用引物F5和引物R5進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒的BamHI和EcoRI酶切位點之間，得到pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒(測序驗證正確)。F5：5’-CGGGATCCGCCACCATGGGGGAGC-3’；R5：5’-GGAATTCTTACAGGTCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCATTGATGCCATACATGGTTGC-3’；引物R5中，下劃線部分為myc序列。3、將HEK293T細胞接種至24孔板(每孔接種5-10×104個細胞)，采用DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，37℃靜置培養(yǎng)直至細胞長至40-60％。4、完成步驟4后，取所述24孔板，進行如下分組處理：組1：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復合物A，輕微搖動細胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h；組2：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復合物B，輕微搖動細胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h；組3：棄掉培養(yǎng)液，更換為DMEM培養(yǎng)基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml鏈霉素)，培養(yǎng)1h后，向每孔中加入300μL室溫孵育5min后的轉(zhuǎn)染復合物C，輕微搖動細胞培養(yǎng)板，使之混勻，培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染復合物A：將1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。轉(zhuǎn)染復合物B：將1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc質(zhì)粒和1.2μg的pcDNA3.1-HbSOS1-Flag質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。轉(zhuǎn)染復合物C：將1.2μg的pcDNA3.1-HbSOS1-Flag質(zhì)粒加至150μLLipofectaminTM2000中，輕微吹打混勻。5、完成步驟4后，收集細胞，用冷PBS洗一遍，再用細胞裂解液[150mMNaCl，50mMTris(pH7.6)，1％(v/v)NP40，10％(v/v)甘油]裂解30min，4℃、12000rpm離心15min，收集上清液。6、將步驟5的上清液進行蛋白定量，取等量的蛋白分別與Flag抗體(1∶2000，SantaCruz)和c-Myc抗體(1：2000，SantaCruz)在4℃孵育3h，然后4℃添加蛋白G/A瓊脂糖磁珠(GEHealthcare公司)孵育1h。然后用細胞裂解液清洗磁珠3次，結(jié)合蛋白用2×上樣緩沖液(Bio-rad公司)洗脫下來，在12％聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用相應的二抗雜交，用化學發(fā)光劑(購自Thermo公司)在X-光片上曝光。結(jié)果如圖4b所示。結(jié)果表明，免疫共沉淀(CoIP)技術從生化水平進一步證明HbSOS1與HbCIPK2存在互作關系。實施例6、HbSCaBP10、蛋白激酶HbCIPK2和HbSOS1蛋白調(diào)控耐鹽性1、p424pMA1載體：以pDR195載體為模板，采用引物pMA1-SacI-F和引物pMA1-XbaI-R進行PCR擴增，采用擴增產(chǎn)物取代p424GALL載體SacI和XbaI酶切位點之間的片段，得到p424pMA1載體(測序驗證正確)。pMA1-SacI-F：5’-TGAGCTCCCTGAAACGGAGAAACATAAAC-3’：pMA1-XbaI-R：5’-CTCTAGAGCTGGGGTATATTTTTTTTCTTTCTTTTG-3’；引物pMA1-SacI-F和引物pMA1-XbaI-R中，下劃線部分分別為SacI和XbaI酶切位點。2、p424pMA1-HbSOS1載體：將序列表的序列1自5’端第71-3490位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入步驟1制備的p424pMA1載體的SpeI和SalI酶切位點之間，得到p424pMA1-HbSOS1酵母表達載體(測序驗證正確)。3、pDR195-HbCIPK2載體：將序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pDR195載體的XhoI和BamHI酶切位點之間，得到pDR195-HbCIPK2酵母表達載體(測序驗證正確)。4、pYPGE15-HbSCaBP10載體：將序列表的序列3自5’端第1-738位核苷酸所示的雙鏈DNA分子插入pYPGE15載體的BamHI和MfeI酶切位點之間，得到pYPGE15-HbSCaBP10酵母表達載體(測序驗證正確)5、將載體分組轉(zhuǎn)化至酵母敏鹽突變菌株AXT3K中，對于單個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的在單缺選擇培養(yǎng)基(SD/-Trp，Clontech公司)上培養(yǎng)至菌液OD600nm＝0.8；對于兩個以上質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的在雙缺選擇培養(yǎng)基(SD/-Trp-Ura，Clontech公司)上培養(yǎng)至菌液OD600nm＝0.8，離心，將沉淀用無菌水洗滌3次，最后重懸于無菌水中，按10倍梯度稀釋，分別取3μL原液和各稀釋液滴在含有不同濃度(0mM、75mM、100mM)NaCl的AP培養(yǎng)基(10mM精氨酸、8mM磷酸、2％葡萄糖、2mMMgSO4、1mMKCl、0.2mMCaCl2，500ng/mlH38O4，50ng/mlCuSO4，100ng/mlKI，400ng/mlMnSO4，200ng/mlNa2MoO4，400ng/mlZnSO4，10ng/ml生物素，0.4ng/ml煙草酸，2ug/ml肌醇，0.4ng/ml泛酸鈣)上，在30℃培養(yǎng)3天觀察菌斑生長情況。組I：5μgp424pMA1載體；組II：5μgp424pMA1-HbSOS1載體；組III：5μgpDR195-HbCIPK2載體和5μgp424pMA1-HbSOS1載體；組IV：5μgpYPGE15-HbSCaBP10載體、5μgpDR195-HbCIPK2載體和5μgp424pMA1-HbSOS1載體。結(jié)果如圖5b所示。將HbSOS1單獨在AXT3K突變體中表達后可以在含75mMNaCl的AP平板上生長，而轉(zhuǎn)空載體的菌株不能生長。HbSOS1與HbCIPK2組合表達與HbSOS1單獨表達沒有差別。HbSCaBP10組合HbCIPK2、HbSOS1表達后，該菌株不僅在含75mMNaCl的AP平板上生長，還可以在含100mMNaCl平板上生長。<110>北京市農(nóng)林科學院<120>植物耐鹽相關蛋白HbSCaBP10及其編碼基因與應用<160>6<210>1<211>3652<212>DNA<213>野大麥（Hordeumbrevisubulatum）<400>1aagcagtggtatcaacgcagagtacatggggactgaaagagcagtccacctcgcctcatc60cacgccggcgatggaggaggaggccggcgccccgagccccgacgacgccgtgctcttctt120cggggtgtccctcgtgctgggcatcgcctcccgccacctcctccgcggcacccgcgtccc180ctacaccgtcgccctcctcgtcctcggcgtcgccctcggcggcctcgagtacgggaccaa240gcacggcctgggcaagctcggaaatggcattcgcatctgggcggccataaatcccgatct300acttctggccgttttcctccccgccctcctcttcgaaagctccttctcaatggaagtcca360ccaaatcaagaaatgcatggcacagatggtgttacttgctgttccaggtgtggtgatctc420aacagttttgcttggcactgctgtaaagcttacttttccatacgactggaactggaaaac480atcgttcttgtttagtggactgcttagtgcaacagaccctgttgctgtggtcgctcttct540aaaagatctaggagcaagcaaaaagctcagtacaataattgaaggagaatccttaatgaa600tgatgggactgctattgttgtctatcagttattctatcgaatggtgcttggaagaacttt660tgatgcagggtccataattaagttcttgtcagaagtttcacttggagctgttgctctagg720ccttgcatttggagttgcatcagtattatggctgggatttattttcaatgatacaatcat780agagatttcacttacccttgctgtcagctatattgctttcttcactgcgcaagatgcatt840ggagatctctggtgttttggccgtcatgaccttggggatgttctatgctgctttcgcaaa900aactgcttttaagggtgacagccaggaaagtttgcatcatttctgggaaatggtggctta960cattgcgaacacacttattttcatactgagtggggttgttattgcagatggtgtactaca1020agataatattcattttgagaggcatggcacatcatgggggttccttcttctgctctatgt1080gtttgtgcaaatatcgcgtgctgtagttgtcggtgttttgtatccattattgagtcactt1140tggatatggtatggacgtcaaagaagccacagttcttgtttggtcagggctgcgaggggc1200tgttgctctatcactctctctgtctgttaaacgtgctagtgattcagttcaatcttatct1260gaaaccagaagttggaacaatgtttgtgttcttcacaggtggtatcgtgtttctgacatt1320gattttgaatggttccaccacacaatttttgttgcacctgcttggcttgggaaaattgtc1380agcaacaaagcttcgtgtattgaagtatacacggtatgaaatgctaaacaaggcattgga1440ggcttttggtgatctcagggatgatgaggaacttgggcctgctgattggattactgtgaa1500gaaacatatcacatgtttgaataacttggaagatgaacaagcacatccccatgatgttcc1560tgacaaggatgatcacgtacataccatgaatttggaggatactcgagtgcggcttttgaa1620tggtgtgcaagctgcttactggggaatgcttgaagaggggc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