本發(fā)明屬于生物試劑發(fā)明領(lǐng)域，具體的說(shuō)，是涉及一種綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖的制備方法。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于小分子之間的互作研究越來(lái)越熱門，一般而言，小分子互作主要包括蛋白和蛋白之間的互作，dna和蛋白之間的互作，rna和蛋白之間的互作，要研究清楚靶蛋白和其互作分子之間的關(guān)系一般采用免疫沉淀的方式，簡(jiǎn)而言之，就是用靶蛋白的抗體和proteina/g偶聯(lián)后，靶蛋白會(huì)結(jié)合到proteina/g上面，其互作分子也會(huì)相應(yīng)被拖下來(lái)，采用westernblot或者質(zhì)譜的方式來(lái)分析其互作情況。但是，靶蛋白特異性的抗體和proteina/g結(jié)合能力較弱，因此捕獲靶蛋白的能力也弱，一些和靶蛋白互作較弱或者間接性互作的分子就不容易被發(fā)掘。

目前常用的商業(yè)化beads有很多種，比如myc、flag、ha、his等等，這些beads結(jié)合效率不僅低，而且成本非常昂貴，對(duì)于大量做ip或者質(zhì)譜的實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，選擇一種經(jīng)濟(jì)實(shí)惠而且效價(jià)很高的beads是非常重要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖的制備方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖的制備方法，包括如下：

（1）載體設(shè)計(jì)以及構(gòu)建：設(shè)計(jì)引物pet28ahis-gbpf：tcgcggatccgaattcatgcaggttcagctggttga，pet28ahis-gbpr：gtgcggccgcaagcttagaagaaacggtaacctggg，以pcr擴(kuò)增的方式獲得gbp基因產(chǎn)物，回收后和線性化的pet28a載體連接，轉(zhuǎn)化dh5a，菌落pcr驗(yàn)證大小正確的克隆送測(cè)序，測(cè)序正確的單菌落提取質(zhì)粒并保菌；獲得的gbp基因產(chǎn)物是做了突變改造的gbp，具體表現(xiàn)為將第66個(gè)氨基酸賴氨酸k突變?yōu)楸彼醓；

（2）將取得的質(zhì)粒用于目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化；

（3）nhs偶聯(lián)獲得綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖。

所述的目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化為：

（1）轉(zhuǎn)化：取1μl質(zhì)粒加到50μlbl21感受態(tài)細(xì)胞中，冰上30min，42℃熱擊90秒，冰上2min，加入500μl不含抗生素的液體lb培養(yǎng)基，37℃150rpm復(fù)蘇1h，取100μl菌液涂布于含50ug/ml卡那霉素的固體lb培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18h；

（2）活化：挑取單克隆于含50ug/ml卡那霉素的15ml液體lb培養(yǎng)基的50ml離心管中，37℃220rpm培養(yǎng)過(guò)夜；

（3）擴(kuò)培：菌液按1:100的體積比例轉(zhuǎn)接5ml菌液到兩瓶含50ug/ml卡那霉素的500ml液體lb培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃220rpm培養(yǎng)2h，od值0.4-0.6；

（4）誘導(dǎo)：分別加入500μl0.1miptg，終濃度0.1mm，16℃220rpm誘導(dǎo)過(guò)夜14h；

（5）收菌：用離心瓶或者50ml離心管收集菌體，4℃6000rpm離心5min；

（6）重懸：菌體用10mlpbs重懸，加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物，100μltritonx-100，終濃度1%，100μl1m咪唑，終濃度10mm；

（7）破碎：放置冰上超聲破碎直至菌液不再粘稠；

（8）離心：4℃12000rpm離心15min；

（9）平衡ni-ntaagarose：取250μlni-natagarose于1.5ml離心管中，加入750μlpbs，顛倒數(shù)次，4℃1000g離心3min；重復(fù)洗兩次；

（10）結(jié)合：將蛋白上清轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，加入平衡過(guò)的ni-ntaagarose250μl，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合2h或者過(guò)夜；

（11）洗脫：4℃1000g離心3min，棄上清；用10倍體積含50mm咪唑的pbs洗脫雜蛋白，總共洗三次；將ni-ntaagarose轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，吸干上清，用400μl500mm咪唑洗脫his-gbp，4℃旋轉(zhuǎn)15min后離心收集上清到新的離心管中；重復(fù)洗脫一次；

（12）bca法測(cè)蛋白濃度；同時(shí)跑sds-page膠，考染鑒定純化效果；

（13）超濾法除咪唑：用200μlddh2o平衡10k超濾管，14000g室溫離心15min；將蛋白上清轉(zhuǎn)移到超濾管中，14000g室溫離心15min，用450μlpbs洗五次；更換新的收集管，倒扣離心15min收集上清液蛋白。

所述nhs偶聯(lián)為：

（1）稱取0.15gnhs-activatedagarose干粉于15ml離心管中，200μl蛋白上清用1mlpbs稀釋后加入管中，另外加入2mlpbs讓干粉充分吸脹，室溫結(jié)合1h；

（2）4℃1000g離心3min，棄上清，用3mlpbs洗三次；

（3）加入3mlph7.41mtris-cl封閉nhs未結(jié)合位點(diǎn)，室溫結(jié)合20min；

離心棄上清，用3mlpbs洗三次；

（4）加入1mlpbs，1μl1000×nan3，終0.02w/v%，4℃保存，最終得到綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖利用原核表達(dá)的方式誘導(dǎo)表達(dá)出gfpbindingprotein，gfpbindingprotein能夠和nhs-activatedagarose高效地結(jié)合，這種結(jié)合能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他瓊脂糖的結(jié)合能力，同時(shí)也大于gfp抗體和proteina/g制作的瓊脂糖的結(jié)合能力，同時(shí)，在gfpbindingprotein和nhs-activatedagarose完全偶聯(lián)以后，采用quenchingbuffer封閉住未結(jié)合位點(diǎn)，有效地降低了非特異結(jié)合。

附圖說(shuō)明

圖1鋪有hek293t細(xì)胞的六孔板中各轉(zhuǎn)染3微克gfp質(zhì)粒，裂解后做免疫共沉淀，a為本發(fā)明綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)瓊脂糖珠，b為proteina/g和gfp抗體孵育后座的ip，左邊本發(fā)明瓊脂糖珠做完ip后都發(fā)綠，說(shuō)明結(jié)合效率非常高，右邊為對(duì)應(yīng)的考馬斯亮藍(lán)染色圖。

圖2在hek293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染以下質(zhì)粒：1微克cry2，1.5微克gfpcop1，1微克flag-co，1微克myc-spa1質(zhì)粒，光處理0h、0.5h、1.5h，裂解后使用本發(fā)明瓊脂糖做的co-ip結(jié)果，結(jié)果表明cry2、spa1在藍(lán)光下競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合cop1，從而抑制了cop1和co的互作。

圖3在大豆中使用k599農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法注射含有g(shù)fp的農(nóng)桿菌，長(zhǎng)出的發(fā)剪下研磨裂解開(kāi)后使用本發(fā)明瓊脂糖珠做ip，然后跑sds聚丙烯酰胺變性膠后切膠酶解，使用質(zhì)譜檢測(cè)gfp蛋白的表達(dá)，可以非常清晰的檢測(cè)到gfp的表達(dá)。

圖4綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖特異性結(jié)合結(jié)果圖。a是用普通方法做的ip，有明顯的背景雜帶，b是用我們gfpbeads做的ip，背景非常干凈。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖的制備方法，包括如下：

（1）載體設(shè)計(jì)以及構(gòu)建：設(shè)計(jì)引物pet28ahis-gbpf：tcgcggatccgaattcatgcaggttcagctggttga，pet28ahis-gbpr：gtgcggccgcaagcttagaagaaacggtaacctggg，以pcr擴(kuò)增的方式獲得gbp基因產(chǎn)物，回收后和線性化的pet28a載體連接，轉(zhuǎn)化dh5a，菌落pcr驗(yàn)證大小正確的克隆送測(cè)序，測(cè)序正確的單菌落提取質(zhì)粒并保菌；

（2）將取得的質(zhì)粒用于目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化；

（3）nhs偶聯(lián)獲得綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖。

所述的目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化為：

（1）轉(zhuǎn)化：取1μl質(zhì)粒加到50μlbl21感受態(tài)細(xì)胞中，冰上30min，42℃熱擊90秒，冰上2min，加入500μl不含抗生素的液體lb培養(yǎng)基，37℃150rpm復(fù)蘇1h，取100μl菌液涂布于含50ug/ml卡那霉素的固體lb培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18h；

（2）活化：挑取單克隆于含50ug/ml卡那霉素的15ml液體lb培養(yǎng)基的50ml離心管中，37℃220rpm培養(yǎng)過(guò)夜；

（3）擴(kuò)培：菌液按1:100的體積比例轉(zhuǎn)接5ml菌液到兩瓶含50ug/ml卡那霉素的500ml液體lb培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃220rpm培養(yǎng)2h，od值0.5；

（4）誘導(dǎo)：分別加入500μl0.1miptg，終濃度0.1mm，16℃220rpm誘導(dǎo)過(guò)夜14h；

（5）收菌：用離心瓶或者50ml離心管收集菌體，4℃6000rpm離心5min；

（6）重懸：菌體用10mlpbs重懸，加入一片cocktail片劑蛋白酶抑制劑復(fù)合物，100μltritonx-100，終濃度1%，100μl1m咪唑，終濃度10mm；

（7）破碎：放置冰上超聲破碎直至菌液不再粘稠；

（8）離心：4℃12000rpm離心15min；

（9）平衡ni-ntaagarose：取250μlni-natagarose于1.5ml離心管中，加入750μlpbs，顛倒數(shù)次，4℃1000g離心3min；重復(fù)洗兩次；

（10）結(jié)合：將蛋白上清轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，加入平衡過(guò)的ni-ntaagarose250μl，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合2h；

（11）洗脫：4℃1000g離心3min，棄上清；用10倍體積含50mm咪唑的pbs洗脫雜蛋白，總共洗三次；將ni-ntaagarose轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，吸干上清，用400μl500mm咪唑洗脫his-gbp，4℃旋轉(zhuǎn)15min后離心收集上清到新的離心管中；重復(fù)洗脫一次；

（12）bca法測(cè)蛋白濃度；同時(shí)跑sds-page膠，考染鑒定純化效果；

（13）超濾法除咪唑：用200μlddh2o平衡10k超濾管，14000g室溫離心15min；將蛋白上清轉(zhuǎn)移到超濾管中，14000g室溫離心15min，用450μlpbs洗五次；更換新的收集管，倒扣離心15min收集上清液蛋白。

所述nhs偶聯(lián)為：

（1）稱取0.15gnhs-activatedagarose干粉于15ml離心管中，200μl蛋白上清用1mlpbs稀釋后加入管中，另外加入2mlpbs讓干粉充分吸脹，室溫結(jié)合1h；

（2）4℃1000g離心3min，棄上清，用3mlpbs洗三次；

（3）加入3mlph7.41mtris-cl封閉nhs未結(jié)合位點(diǎn)，室溫結(jié)合20min；

離心棄上清，用3mlpbs洗三次；

（4）加入1mlpbs，1μl1000×nan3，終0.02w/v%，4℃保存，最終得到綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖。

應(yīng)用實(shí)施例2

（1）在鋪有hek293t細(xì)胞的六孔板中各轉(zhuǎn)染3μggfp質(zhì)粒，裂解后采用本發(fā)明制備的瓊脂糖做免疫共沉淀，具體結(jié)果如圖1，a為我們自己制作的綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)瓊脂糖，b為proteina/g和gfp抗體孵育后做的免疫共沉淀，左邊自己制作的瓊脂糖，做完ip后都發(fā)綠，說(shuō)明結(jié)合效率非常高，右邊為對(duì)應(yīng)的考馬斯亮藍(lán)染色圖；而b中顯示了在做完免疫共沉淀后，beads沒(méi)有明顯發(fā)綠，說(shuō)明ip下來(lái)的gfp蛋白相對(duì)來(lái)說(shuō)比較少，而且做了考馬斯亮藍(lán)染色后基本看不到條帶，也印證了其結(jié)合效率要比我們自己做的beads低很多。

（2）在hek293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染以下質(zhì)粒：1微克cry2，1.5微克gfpcop1，1微克flag-co，1微克myc-spa1質(zhì)粒，光處理0h、0.5h、1.5h，裂解后使用實(shí)施例1中制作的瓊脂糖珠做的co-ip結(jié)果如圖2，結(jié)果表明cry2、spa1在藍(lán)光下競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合cop1，從而抑制了cop1和co的互作，此結(jié)果使用普通的方法即proteina/g和抗體孵育的方法做不出來(lái)。

gfpcop1、flag-co、myc-spa1、cry2質(zhì)粒的制備方法為：

分別設(shè)計(jì)如下pcr引物：

cop1f：gcgtggtacctctagaatggaagagatttcgacgga；

cop1r：gaagcggccgcccgggtcacgcagcgagtaccaga；

cof：gcgtggtacctctagaatgttgaaacaagagagtaa；

cor：gaagcggccgcccgggtcagaatgaaggaacaatc；

spa1f：gcgtggtacctctagaatgcctgttatggaaagagt；

spa1r：gaagcggccgcccgggtcaaacaagttttagtagc；

cry2f：gcgtggtacctctagaatgaagatggacaaaaagac；

cry2r：gaagcggccgcccgggtcatttgcaaccatttttt；

以擬南芥cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后回收pcr產(chǎn)物，將產(chǎn)物與線性化pci(neo)載體相連獲得相對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒。

（3）在大豆中使用k599農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法注射含有g(shù)fp的農(nóng)桿菌，長(zhǎng)出的發(fā)根剪下研磨裂解開(kāi)后使用實(shí)施例1制作的瓊脂糖珠做ip，然后跑sds聚丙烯酰胺變性膠后切膠酶解，使用質(zhì)譜檢測(cè)gfp蛋白的表達(dá)，可以非常清晰的檢測(cè)到gfp的表達(dá)（如圖3），此結(jié)果使用proteina/g和gfp抗體孵育的方式做不出來(lái)，因?yàn)榇蠖拱l(fā)根中蛋白表達(dá)量非常少，只有高效的富集能力才能富集得到質(zhì)譜能夠識(shí)別的蛋白量。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>吉林大學(xué)

<120>一種綠色熒光蛋白結(jié)合蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖的制備方法

<130>10

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<170>patentinversion3.3

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<213>人工序列

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