本發(fā)明是基于申請日為2012年12月18日，申請?zhí)枮椤?01280063467.x”(國際申請?zhí)枮閜ct/ep2012/076028)，發(fā)明名稱為“枯草桿菌酶變體和編碼它們的多核苷酸”的專利申請的分案申請。序列表的引用本申請含有一個計算機可讀形式的序列表，該序列表通過引用結(jié)合在此。發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及相對于親本枯草桿菌酶在一種或多種特性中展示變化的多種新蛋白酶變體，所述特性包括：洗滌性能、熱穩(wěn)定性、存儲穩(wěn)定性或催化活性。本發(fā)明的這些變體適合用于例如清潔劑或洗滌劑組合物中，如衣物洗滌劑組合物和餐具洗滌劑組合物，包括自動餐具洗滌劑組合物。本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的dna序列、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以及用于產(chǎn)生和使用本發(fā)明變體的方法。此外，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明變體的清潔劑和洗滌劑組合物。相關(guān)技術(shù)說明在洗滌劑工業(yè)中，酶在洗滌配制品中的應(yīng)用已經(jīng)超過30年。用于此類配制品的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或其混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。越來越多商業(yè)上使用的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程化變體，和(諾維信公司(novozymesa/s))、以及(杜邦/杰能科國際公司(dupont/genencorinternational,inc.))。此外，本領(lǐng)域描述了多種變體，如在wo2004/041979(諾維信公司)中描述了相對于親本枯草桿菌酶在例如洗滌性能、熱穩(wěn)定性、存儲穩(wěn)定性或催化活性方面展示變化的多種枯草桿菌酶變體。這些變體適合用于在例如清潔劑或洗滌劑組合物中使用。已描述多種有用的枯草桿菌酶變體，其中很多已提供在不同洗滌劑中的改進(jìn)活性、穩(wěn)定性以及溶解度。us6,436,690(布羅德三世(brodeiii)等人)描述了在環(huán)59至66(bpn’編號)中的變化，在wo2009/149200(丹尼斯克公司(daniscousinc.))中描述了在位置53和55(bpn’編號)處的取代。此外，wo2002/31133(諾維信公司)描述了環(huán)51-56(bpn’編號)中的插入。然而，多種因素造成進(jìn)一步改進(jìn)蛋白酶是有利的。洗滌條件例如就溫度和ph而言不斷發(fā)生變化，并且很多污物仍難以在常規(guī)洗滌條件下被完全除去。因此，盡管在蛋白酶開發(fā)方面已有深入研究，但仍然存在對新的改進(jìn)蛋白酶的需要。因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種蛋白酶的與其親本蛋白酶相比具有改進(jìn)特性的多種變體。發(fā)明概述本發(fā)明涉及在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的一個或多個(例如，若干個)位置上包含一個變化的多種蛋白酶變體，其中該變體具有蛋白酶活性并且其中這些變體具有與seqidno:2至少65％一致的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的一個或多個位置引入一個缺失，其中該變體具有與seqidno:2至少65％一致的氨基酸序列；以及回收該變體。本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體、以及宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些變體的方法。定義蛋白酶：術(shù)語“蛋白酶”在此被定義為水解肽鍵的酶。它包括任何屬于ec3.4酶組的酶(包括其13個亞類中的每一種)。ec編號是指來自加利福尼亞州(california)，圣地哥(sandiego)，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)的nc-iubmb的酶命名法1992，包括分別在歐洲生物化學(xué)雜志(eur.j.biochem.)1994,223,1-5；歐洲生物化學(xué)雜志1995,232,1-6；歐洲生物化學(xué)雜志1996,237,1-5；歐洲生物化學(xué)雜志1997,250,1-6；以及歐洲生物化學(xué)雜志1999,264,610-650中公開的補充文獻(xiàn)1至5。蛋白酶活性：術(shù)語“蛋白酶活性”意指蛋白質(zhì)分解活性(ec3.4)。本發(fā)明的蛋白酶是內(nèi)肽酶(ec3.4.21)。存在若干蛋白酶活性類型：三種主要活性類型是：其中在p1的arg或lys之后存在酰胺底物裂解的胰蛋白酶樣活性、其中在p1的多個疏水氨基酸中的一個之后發(fā)生裂解的糜蛋白酶樣活性、以及其中在p1的ala之后裂解的彈性蛋白酶樣活性。出于本發(fā)明的目的，根據(jù)以下“材料與方法(materialsandmethods)”所述的程序確定蛋白酶活性。本發(fā)明的這些枯草桿菌酶變體具有seqidno:2的成熟多肽的至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。等位基因變體：術(shù)語“等位基因變體”意指基因的占據(jù)相同染色體基因座的兩種或更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異通過突變天然地發(fā)生，并且可以導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性。基因突變可以是沉默的(在所編碼的多肽中沒有變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。cdna：術(shù)語“cdna”意指可以通過從得自原核或真核細(xì)胞的成熟的、剪接的mrna分子反轉(zhuǎn)錄來制備的dna分子。cdna缺乏可以存在于相應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。起始的、初級的rna轉(zhuǎn)錄物是mrna的前體，其通過包括剪接的一系列步驟加工，然后作為成熟的已剪接的mrna出現(xiàn)。編碼序列：術(shù)語“編碼序列”意指直接指明其多肽產(chǎn)物的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架通常以atg起始密碼子或替代性起始密碼子(例如gtg和ttg)開始，并且以終止密碼子(例如taa、tag、和tga)結(jié)束。編碼序列可以是dna、cdna、合成或重組的多核苷酸?？刂菩蛄校盒g(shù)語“控制序列”意指對于表達(dá)編碼本發(fā)明變體的多核苷酸所必需的所有部件。每個控制序列對于編碼變體的多核苷酸可以是天然的或外源的，或者彼此可以是天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。為了引入特異性限制位點以便促進(jìn)控制序列與編碼變體的多核苷酸的編碼區(qū)的連接，控制序列可以帶有接頭。表達(dá)：術(shù)語“表達(dá)”包括涉及變體產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于：轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。表達(dá)載體：術(shù)語“表達(dá)載體”意指包含編碼一種變體的一種多核苷酸并可操作地連接至提供其表達(dá)的額外核苷酸的線性或環(huán)形dna分子。高嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語“高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”意指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡法(southernblotting)程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200μg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后使用2xssc、0.2％sds在65℃下將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。宿主細(xì)胞：術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指對于用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的任何細(xì)胞類型。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。改進(jìn)的特性：術(shù)語“改進(jìn)的特性”意指與一種變體有關(guān)的特征，該特征相比于親本、或者相比于具有seqidno:2的蛋白酶、或者相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有變化的蛋白酶有所改進(jìn)。此類改進(jìn)的特性包括但不限于洗滌性能、蛋白酶活性、熱活性曲線、熱穩(wěn)定性、ph活性曲線、ph穩(wěn)定性、底物/輔因子特異性、改善的表面特性、底物特異性、產(chǎn)物特異性、增加的穩(wěn)定性、在存儲條件下的改進(jìn)的穩(wěn)定性、以及化學(xué)穩(wěn)定性。改進(jìn)的洗滌性能：術(shù)語“改進(jìn)的洗滌性能”在此被定義為一種蛋白酶變體例如通過增強的去污能力(這是特別優(yōu)選的)而相對于親本枯草桿菌酶變體、相對于具有seqidno:2的蛋白酶、或者相對于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有變化的蛋白酶的洗滌性能展示蛋白酶變體的洗滌性能的變化。術(shù)語“洗滌性能”包括在衣物洗滌并且例如在餐具洗滌中的洗滌性能。洗滌性能可以被量化，如在此的“洗滌性能”定義下所描述的。改進(jìn)的蛋白酶活性：術(shù)語“改進(jìn)的蛋白酶活性”在此被定義為通過增加的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化而相對于(相比于)親本枯草桿菌酶、或相比于具有seqidno:2的蛋白酶、或者相對于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有變化的蛋白酶的活性展示活性改變的蛋白酶變體的改變的蛋白酶活性(如上文所定義的)。改進(jìn)的熱活性：術(shù)語“改進(jìn)的熱活性”意指一種變體在特定溫度下相對于親本或相對于具有seqidno:2的蛋白酶的溫度依賴的活性曲線展示改變的溫度依賴的活性曲線。熱活性值提供了變體在一定溫度范圍內(nèi)增強水解反應(yīng)的催化的效率的測量。在特定溫度范圍內(nèi)一種變體是穩(wěn)定的并且保留其活性，但是隨著溫度增加而變得不太穩(wěn)定并且因此活性有所降低。此外，由一種變體催化的初始反應(yīng)速率可以通過增加溫度來加速，這通過確定該變體的熱活性來測量。一種具有較大熱活性的變體將引起一種酶組合物在增強底物水解速率方面的增加，從而減少所需要的時間和/或降低活性所需要的酶濃度?？商娲?，具有減小的熱活性的一種變體將在比由親本的溫度依賴活性曲線定義的親本的最佳溫度更低的溫度下提高酶促反應(yīng)。分離的變體：術(shù)語“分離的變體”意指通過人工修飾的變體。在一個方面，如通過sds-page確定的，該變體是至少1％純的、例如至少5％純的、至少10％純的、至少20％純的、至少40％純的、至少60％純的、至少80％純的、以及至少90％純的。分離的多核苷酸：術(shù)語“分離的多核苷酸”意指通過人工修飾的多核苷酸。在一個方面，如通過瓊脂糖電泳法確定的，該分離的多核苷酸是至少1％純的、例如至少5％純的、至少10％純的、至少20％純的、至少40％純的、至少60％純的、至少80％純的、至少90％純的、以及至少95％純的。多核苷酸可以是基因組的、cdna、rna、半合成、合成來源或其任何組合。低嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語“低嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200μg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后使用2xssc、0.2％sds在50℃下將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。成熟多肽：術(shù)語“成熟多肽”意指在翻譯和任何翻譯后修飾如n末端加工、c末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后處于其最終形式的多肽。在一個方面，該成熟多肽與具有seqidno:2的氨基酸序列對應(yīng)。成熟多肽編碼序列：術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一個方面，成熟多肽編碼序列是基于預(yù)測編碼信號肽的seqidno:1的核苷酸1至90的signalp(尼爾森(nielsen)等人，1997，蛋白質(zhì)工程(proteinengineering)10:1-6)的seqidno:1的核苷酸322至1146。中嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語“中嚴(yán)謹(jǐn)度條件”意指對于至少100個核苷酸長度的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200μg/ml剪切和變性的鮭魚精子dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后使用2xssc、0.2％sds在55℃下將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語“中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200μg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后使用2xssc、0.2％sds在60℃下將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。突變體：術(shù)語“突變體”意指編碼變體的多核苷酸。核酸構(gòu)建體：術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指從天然存在的基因中分離的、或以自然界中不會另外存在的方式被修飾成包含核酸片段的、或合成的單鏈或雙鏈的核酸分子。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明編碼序列所需要的控制序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達(dá)盒”含義相同。可操作地連接：術(shù)語“可操作地連接”意指如下構(gòu)造，其中控制序列相對于多核苷酸的編碼序列安置在適當(dāng)位置，這樣使得控制序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。親本：術(shù)語“親本”意指對其做出改變以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的一種蛋白酶。因此，親本是具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有變化的一種蛋白酶。應(yīng)理解，在上下文中，表述“具有一致氨基酸序列”與100％序列一致性有關(guān)。該親本可以是天然存在的(野生型)多肽或其變體。在一個具體實施例中，該親本是與具有seqidno:2的多肽具有至少60％的一致性、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的一致性的蛋白質(zhì)。序列一致性：通過參數(shù)“序列一致性”描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的相關(guān)性。出于本發(fā)明的目的，使用在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開發(fā)軟件套(theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，賴斯(rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(trendsgenet)16:276-277)(優(yōu)選版本3.0.0或更新版本)的尼德爾(needle)程序中實施的尼德曼-翁施(needleman-wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)48:443-453)確定兩個氨基酸序列之間的序列一致性程度。可任選使用的參數(shù)是空位開放罰分(gapopenpenalty)10、空位延伸罰分(gapextensionpenalty)0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版)取代矩陣。使用尼德爾(needle)標(biāo)記的“最長一致性(longestidentity)”的輸出(使用-nobrief選項獲得)作為一致性百分比，并且計算如下：(一致的殘基x100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))。出于本發(fā)明的目的，使用在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開發(fā)軟件套，賴斯等人，2000，同上)(優(yōu)選版本3.0.0或更新版本)的尼德爾程序中實施的尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性程度?？扇芜x使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5、以及ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)取代矩陣。使用尼德爾標(biāo)記的“最長一致性”的輸出(使用-nobrief選項獲得)作為一致性百分比，并且計算如下：(一致的脫氧核糖核苷酸x100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))?；旧霞兊淖凅w：術(shù)語“基本上純的變體”意指包含按重量計至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料的制劑，這些其他多肽材料是與其天然或重組地相關(guān)的。優(yōu)選地，該變體按存在于制劑中的總多肽材料的重量計是至少92％純的，例如至少94％純的、至少95％純的、至少96％純的、至少97％純的、至少98％純的、至少99％純的、至少99.5％純的、以及100％純的。本發(fā)明的變體優(yōu)選以基本上純的形式存在。例如，這可通過經(jīng)由眾所周知的重組方法或經(jīng)由經(jīng)典的純化方法制備變體來完成。變體：術(shù)語“變體”意指具有蛋白酶活性的相比于其親本在一個或多個(或一個或若干個)位置包含一個變化即取代、插入、和/或缺失的多肽，該親本是具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有所述變化的蛋白酶。取代意指占據(jù)一個位置的氨基酸被一個不同的氨基酸置換；缺失意指除去占據(jù)一個位置的氨基酸；并且插入意指在與占據(jù)一個位置的氨基酸相鄰處添加氨基酸，例如1至10個氨基酸，優(yōu)選1至3個氨基酸。非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語“非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200μg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后使用2xssc、0.2％sds在70℃下將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件：術(shù)語“非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件”是指對于長度為至少100個核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200μg/ml剪切并變性的鮭魚精子dna和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時。最后使用2xssc、0.2％sds在45℃下將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。洗滌性能：術(shù)語“洗滌性能”被用作酶在例如洗滌(如衣物洗滌或硬表面清潔)過程中除去存在于有待清潔的物體上的污物的能力。洗滌性能可以通過計算如在此處的材料與方法所述的amsa測定中定義的所謂強度值(int)來定量。也參見在此的實例2中的洗滌性能測試。此外，洗滌性能，特別是根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體的洗滌性能可以通過以下所述的參考洗滌測試來確定。還參見在此處的實例3。野生型蛋白酶：術(shù)語“野生型蛋白酶”意指由天然存在的有機體(例如在自然界中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、古生菌、酵母、真菌、植物或動物)表達(dá)的一種蛋白酶。野生型蛋白酶的實例是bpn’，即seqidno:2。轉(zhuǎn)錄啟動子：術(shù)語“轉(zhuǎn)錄啟動子”用于指為促進(jìn)特定基因的轉(zhuǎn)錄的一個dna區(qū)域的啟動子。轉(zhuǎn)錄啟動子典型地位于它們所調(diào)節(jié)的基因附近，在相同鏈上并且在上游(朝向有義鏈的5'區(qū)域)。轉(zhuǎn)錄終止子：術(shù)語“轉(zhuǎn)錄終止子”用于指標(biāo)記基因結(jié)束的基因序列區(qū)段或者供轉(zhuǎn)錄的基因組dna上的操縱子。變體命名慣例出于本發(fā)明的目的，在seqidno:2中披露的成熟多肽是用于確定在另一個枯草桿菌蛋白酶中的相應(yīng)氨基酸殘基。將另一種枯草桿菌蛋白酶的氨基酸序列與seqidno:2中披露的成熟多肽比對，并且基于該比對，使用在emboss包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開發(fā)軟件套，賴斯等人，2000，遺傳學(xué)趨勢16:276-277)(優(yōu)選版本5.0.0或更新版本)的尼德爾程序中實施的尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物學(xué)雜志48:443-453)確定與seqidno:2中所披露的成熟多肽的任何氨基酸殘基相對應(yīng)的氨基酸位置號。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版)取代矩陣。可以通過使用若干計算機程序、使用其對應(yīng)默認(rèn)參數(shù)比對多個多肽序列來確定在另一種枯草桿菌蛋白酶中的相應(yīng)氨基酸殘基的鑒別，所述計算機程序包括但不限于muscle(通過對數(shù)預(yù)期的多種序列比較；版本3.5或更新版本；埃德加(edgar)，2004，核酸研究(nucleicacidsresearch)32:1792-1797)、mafft(版本6.857或更新版本；加藤(katoh)和庫馬(kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(toh)，2007，生物信息學(xué)(bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生物學(xué)方法(methodsinmolecularbiology)537:39-64；加藤和都，2010，生物信息學(xué)26:1899-1900)、以及采用clustalw(1.83或更新版本；湯姆斯(thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的embossemma。當(dāng)從具有seqidno:2的成熟多肽中分出其他酶從而使得傳統(tǒng)基于序列的比對難以檢測它們的關(guān)系(林達(dá)爾(lindahl)和埃洛弗松(elofsson)，2000，分子生物學(xué)雜志295:613-615)時，可以使用其他成對序列比對算法。在基于序列的搜索中的較大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲線(profile))來搜索數(shù)據(jù)庫。例如，psi-blast程序通過一個迭代數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生多個特征曲線并且能夠檢測關(guān)系疏遠(yuǎn)的同源物(阿特休爾等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。當(dāng)多肽的家族或超家族在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中具有一個或多個代表時，甚至可以實現(xiàn)更大的靈敏度。程序如genthreader(瓊斯(jones)，1999，分子生物學(xué)雜志287:797-815；麥古芬(mcguffin)和瓊斯(jones)，2003，生物信息學(xué)19:874-881)利用來自多種來源的信息(psi-blast、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、結(jié)構(gòu)比對曲線、以及溶劑化潛能)作為到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入，該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊。類似地，高夫(gough)等人，2000，分子生物學(xué)雜志313:903-919的方法可以用于比對具有未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于scop數(shù)據(jù)庫中的超家族模型。這些比對進(jìn)而可以用于生成該多肽的同源性模型，并且可以使用多種出于該目的而開發(fā)的工具來評價這類模型的準(zhǔn)確度。對于具有已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，若干工具和資源可用于檢索和生成結(jié)構(gòu)比對。例如，已對蛋白質(zhì)的scop超家族進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對，并且那些比對是可訪問的并且可下載的?？梢允褂枚喾N算法如距離比對矩陣(奧爾姆(holm)和桑德(sander)，1998，蛋白質(zhì)(proteins)33:88-96)或者組合延伸(shindyalov和伯恩(bourne)，1998，蛋白質(zhì)工程11:739-747)比對兩種或更多種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且這些算法的實施可以另外用于查詢具有感興趣結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，以便發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，奧爾姆和帕克(park)，2000，生物信息學(xué)16:566-567)。在描述本發(fā)明的變體中，采用以下所述的命名法以方便參考。采用已接受的iupac單個字母和三字母的氨基酸縮寫。取代。對于一個氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226處的蘇氨酸被丙氨酸取代表示為“thr226ala”或者“t226a”。多個突變通過加號(“+”)、逗號或空格分開，例如，“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”、“g205r,s411f”、“g205rs411f”，分別代表位置205和411的甘氨酸(g)取代為精氨酸(r)，以及絲氨酸(s)取代為苯丙氨酸(f)。缺失。對于一個氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失表示為“gly195*”或者“g195*”。多個缺失通過加號(“+”)分開，例如，“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。插入：額外的氨基酸殘基的插入，例如像在g195后插入賴氨酸可以表示為：gly195glylys或者g195gk?？商娲?，額外的氨基酸殘基的插入，如在g195后插入賴氨酸可以表示為：*195al。當(dāng)插入多于一個的氨基酸殘基，例如像在g195后插入lys和a1a時，這種插入可以表示為：gly195glylysala或者g195gka。在此類情況下，還可以通過將小寫字母添加到在一個或多個插入的氨基酸殘基前的氨基酸殘基位置號處來對一個或多個插入的氨基酸殘基進(jìn)行編號，在這個實例中：*195ak*195ba。在以上的實例中，序列194至196因此為：在其中取代和插入發(fā)生在相同位置的情況下，這可以表示為s99sd+s99a或者簡單地為s99ad。相同修飾也可以表示為s99a+*99ad。在其中插入與所存在的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的情況下，顯然是在命名中出現(xiàn)了簡并。如果例如在以上實例中，在甘氨酸之后插入甘氨酸，則將它表示為g195gg或者*195agbg。對于以下變化，相同的實際變化也可以僅表示為a194ag或者*194ag，從這些情況對于技術(shù)人員來說是顯而易見的，并且因此表示式g195gg和這種類型插入的相應(yīng)表示式旨在包括這種等同簡并表示式。不同變化?？梢栽谝粋€位置上引入不同的變化時，這些不同的變化由一個逗號分開，例如“arg170tyr,glu”代表在位置170上的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”指示以下變體：“tyrl67gly+argl70gly”、“tyrl67gly+argl70ala”、“tyrl67ala+argl70gly”、以及“tyrl67ala+argl70ala”。發(fā)明詳細(xì)說明先前沒有預(yù)料到的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在位置53-57處含有一個或多個缺失和/或取代的蛋白酶變體相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有該一個或多個變化的蛋白酶或者相比于具有seqidno:2的蛋白酶具有改進(jìn)的洗滌性能。與seqidno:2的位置53-57相對應(yīng)的氨基酸形成一個環(huán)的部分，該環(huán)的部分連接β-折疊與含有h64的α-螺旋，該h64是活性位點的催化三聯(lián)體d32、h64和s221的一部分。α-螺旋的氨基酸序列在s8-型的野生型蛋白酶之間是非常保守的。β-折疊也是保守的。然而，連接環(huán)具有一個高度序列變化性。這通過兩種s8蛋白酶bpn’(seqidno:2)和諾維信蛋白酶(一種本領(lǐng)域已熟知的蛋白酶)的氨基酸序列位置51-70的以下比對進(jìn)行舉例說明：生成在位置53-57(bpn’編號)中含有一個單一缺失的新蛋白酶變體以及在環(huán)區(qū)域內(nèi)含有該缺失以及一個或若干個取代的變體，并如“材料與方法”所述對其測試洗滌性能，并且發(fā)明人證明在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的一個位置的一個或多個氨基酸的一個或多個缺失相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有這些變化的蛋白酶或者相比于具有seqidno:2的蛋白酶顯著改進(jìn)了洗滌性能。因此，本發(fā)明涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括以下步驟：在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的一個或多個位置引入一個缺失；以及回收該變體。在一個優(yōu)選實施例中，蛋白酶變體在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體與seqidno:2，即與具有seqidno:2的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)蛋白酶(bpn’)具有至少65％的一致性。因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的一個或多個位置引入一個缺失，其中該變體與seqidno2具有至少65％的一致性；以及回收該變體。因此，本發(fā)明涉及這樣一種方法，該方法包括在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中缺失一個或多個氨基酸，其中該變體與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％，如至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的變體是由與seqidno:1的成熟多肽編碼序列或者編碼具有seqidno:2的成熟多肽的序列具有至少70％的一致性的多核苷酸編碼的多肽。在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的變體是由一種多核苷酸編碼的一種多肽，該多核苷酸與seqidno:1的成熟多核苷酸具有至少70％的一致性、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。另一個實施例涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中缺失一個或多個氨基酸，特別是如以上所述的方法，其中親本枯草桿菌酶是選自下組，該組由以下各項組成：a.與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％的序列一致性的一種多肽；b.由在中嚴(yán)謹(jǐn)度或高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列、(ii)編碼具有seqidno:2的成熟多肽的一種序列、或者(iii)(i)或(ii)的全長互補體雜交的一種多核苷酸編碼的一種多肽；c.由與seqidno:1的成熟多肽編碼序列或者編碼具有seqidno:2的成熟多肽的一種序列具有至少70％一致性的一種多核苷酸編碼的一種多肽；以及d.具有seqidno:2的成熟多肽的一個片段，該片段具有蛋白酶活性。一個具體實施例涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的一個或多個位置引入一個缺失，其中所產(chǎn)生的變體是親本蛋白酶的變體，該變體與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。在一個具體實施例中，蛋白酶變體是在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失的一種bpn’變體。因此，一個具體方面涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入一個或多個氨基酸的缺失，其中該一個或多個缺失是在seqidno2中進(jìn)行的。在另一個實施例中，本發(fā)明涉及一種方法，其中該變體包含與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的兩個、三個、四個或五個缺失。一個優(yōu)選實施例涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入兩個或更多個氨基酸的缺失，其中該變體與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。另一個實施例涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的環(huán)中引入兩個或更多個氨基酸的缺失，其中所產(chǎn)生的變體是親本蛋白酶的變體，它與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或100％的序列一致性。在一個具體實施例中，蛋白酶變體是在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失的一種bpn’變體。一個特別優(yōu)選的實施例涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體與seqidno:2具有至少65％的一致性并且其中該方法包括分別在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中缺失一個或多個選自下組的氨基酸，該組由ser、glu、thr、asn或pro組成。一個具體實施例涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入一個或多個選自下組的氨基酸的缺失，該組由ser、glu、thr、asn或pro組成，其中該變體與seqidno:2具有至少65％的一致性，如與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在一個方面，用于獲得該蛋白酶變體的方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置53相對應(yīng)的位置引入一個缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的具有seqidno:2的成熟多肽的位置53處引入氨基酸的缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置53相對應(yīng)的位置引入氨基酸ser的缺失或者由其組成。在一個方面，用于獲得該蛋白酶變體的方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置54相對應(yīng)的位置引入一個缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的具有seqidno:2的成熟多肽的位置54處引入氨基酸的缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置54相對應(yīng)的位置引入氨基酸glu的缺失或者由其組成。在一個方面，該蛋白酶變體通過一種方法獲得，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置55相對應(yīng)的位置引入一個缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的具有seqidno:2的成熟多肽的位置55處引入氨基酸的缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置55相對應(yīng)的位置引入氨基酸t(yī)hr的缺失或者由其組成。在一個方面，該蛋白酶變體通過一種方法獲得，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置56相對應(yīng)的位置引入一個缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的具有seqidno:2的成熟多肽的位置56處引入氨基酸的缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置56相對應(yīng)的位置引入氨基酸asn的缺失或者由其組成。在一個方面，該蛋白酶變體通過一種方法獲得，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置57相對應(yīng)的位置引入一個缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的具有seqidno:2的成熟多肽的位置57處引入氨基酸的缺失或者由其組成。在另一方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的位置57相對應(yīng)的位置引入氨基酸pro的缺失或者由其組成。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的成熟多肽的位置55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入一個或多個氨基酸的缺失。在一個優(yōu)選的實施例中，所述方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的成熟多肽的位置55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體與seqidno2具有至少65％的一致性。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的方面，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的成熟多肽的位置55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入一個或多個氨基酸的缺失。在一個優(yōu)選的實施例中，所述方法包括在親本枯草桿菌酶的與seqidno:2的成熟多肽的位置55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體與seqidno2具有至少65％的一致性。因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體與seqidno2具有至少65％的一致性。因此，本發(fā)明涉及一種用于獲得一種蛋白酶變體的方法，該方法包括在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中引入一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。本發(fā)明的一個方面涉及一種產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的多種變體的方法，其中該方法包括在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中缺失一個氨基酸，并且進(jìn)一步包括在與位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的一個或多個位置包含一個取代，其中(a)該變體與seqidno:2具有至少65％且小于100％的序列一致性并且(b)該變體具有蛋白酶活性。在一個實施例中，根據(jù)所述方法獲得的變體在與seqidno:2的位置53相對應(yīng)的一個位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置54、55、56或57相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代。在一個實施例中，根據(jù)所述方法獲得的變體在與seqidno:2的位置54相對應(yīng)的一個位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、55、56或57相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代。在一個實施例中，根據(jù)所述方法獲得的變體在與seqidno:2的位置55相對應(yīng)的一個位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、56或57相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代。在一個實施例中，根據(jù)所述方法獲得的變體在與seqidno:2的位置56相對應(yīng)的一個位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55或57相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代。在一個實施例中，根據(jù)所述方法獲得的變體在與seqidno:2的位置57相對應(yīng)的位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55或56相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代變體本發(fā)明提供了多種蛋白酶變體，這些蛋白酶變體在與位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的一個或多個(例如，若干個)位置包含一個缺失，其中該變體具有蛋白酶活性。因此，本發(fā)明涉及多種蛋白酶變體，其中包含與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的位置的環(huán)已縮短至少一個氨基酸。此外，在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中缺失一個氨基酸以及在環(huán)區(qū)域內(nèi)的多個取代相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有變化的蛋白酶或者相比于具有seqidno:2的蛋白酶引起顯著改進(jìn)的洗滌性能。與seqidno:2的位置53-57相對應(yīng)的氨基酸形成一個環(huán)的部分，該環(huán)的部分連接β-折疊與在位置64處含有活性位點殘基組氨酸的α-螺旋。在不受任何理論約束的情況下，認(rèn)為改變該環(huán)影響了活性位點組氨酸。擴散到活性位點殘基的環(huán)變化尤其可以是缺失，但是取代對于擴散到序列下游約7至11個位置也可以具有足夠強的影響。甚至在活性位點殘基定位的微秒改變可以具有酶活性和因此酶性能的顯著影響。特別用gly、ala、ser、thr以及asn進(jìn)行環(huán)中的氨基酸取代，因為它們較小并因此不會對蛋白質(zhì)具有其他不希望的影響，例如化學(xué)位阻。此外，gly、ala、ser、thr以及asn的疏水性不是很強，這對于這個水暴露位置時很重要的。因此，本發(fā)明涉及多種分離的蛋白酶變體，這些變體在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的一個或多個(例如，若干個)位置包含一個變化，其中該變體具有蛋白酶活性。本發(fā)明的一個實施例涉及一種分離的蛋白酶變體，該蛋白酶變體在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體具有蛋白酶活性。本發(fā)明的一個具體實施例涉及一種分離的蛋白酶變體，該變體在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。優(yōu)選地，該變體具有蛋白酶活性。本發(fā)明的另一個方面涉及一種在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個缺失以及一個或多個取代的變體。優(yōu)選地，該變體具有蛋白酶活性。一個具體實施例涉及一種分離的蛋白酶變體，該蛋白酶變體在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的位置進(jìn)一步包含一個或多個取代，其中該變體具有蛋白酶活性。另一個實施例涉及一種分離的蛋白酶變體，該變體在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的位置進(jìn)一步包含一個或多個取代，其中該變體與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。優(yōu)選地，該變體具有蛋白酶活性。在一個實施例中，該變體在與seqidno:2的位置53相對應(yīng)的一個位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置54、55、56或57相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代。在一個實施例中，該變體在與seqidno:2的位置54相對應(yīng)的一個位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、55、56或57相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代。在一個實施例中，該變體在與seqidno:2的位置55相對應(yīng)的一個位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、56或57相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代。在一個實施例中，該變體在與seqidno:2的位置56相對應(yīng)的一個位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55或57相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代。在一個實施例中，該變體在與seqidno:2的位置57相對應(yīng)的一個位置包含一個缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55或56相對應(yīng)的一個或多個位置進(jìn)一步包含一個取代。在一個實施例中，該變體與親本枯草桿菌蛋白酶或者具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置不具有變化的蛋白酶的氨基酸序列具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。在另一個實施例中，該變體與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。在一個方面，在本發(fā)明的變體中的總變化數(shù)目是1至20個，例如1至10個和1至5個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個變化。在另一個方面，根據(jù)本發(fā)明的變體在與位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的一個或多個(例如，若干個)位置包含一個變化。在另一個方面，根據(jù)本發(fā)明的變體在與位置53、54、55、56、以及57中任一個相對應(yīng)的兩個位置包含一個變化。在另一個方面，根據(jù)本發(fā)明的變體在與位置53、54、55、56、以及57中任一個相對應(yīng)的三個位置包含一個變化。在另一個方面，根據(jù)本發(fā)明的變體在與位置53、54、55、56、以及57中任一個相對應(yīng)的四個位置包含一個變化。在另一個方面，根據(jù)本發(fā)明的變體在與位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的每個位置包含一個變化。在另一個方面，該變體在與位置53相對應(yīng)的位置上包含一個變化或由其組成。在另一個方面，在與位置53相對應(yīng)的位置上的氨基酸被ala、gly或thr、優(yōu)選gly取代。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g或者由該取代組成。在一個具體實施例中，在位置53上的變化是一個缺失，即該位置是不存在的。因此，在與位置53相對應(yīng)的位置上的氨基酸選自gly、ala或thr或者是不存在的。術(shù)語“不存在”在此背景下應(yīng)被理解為氨基酸已從其原始背景中缺失，即不再存在于與seqidno:2的位置53至57相對應(yīng)的環(huán)中。這實際上意味著與seqidno:2的位置53至57相對應(yīng)的環(huán)已縮短一個氨基酸。在另一個方面，該變體在與位置54相對應(yīng)的位置上包含一個變化或由其組成。在另一個方面，在與位置54相對應(yīng)的位置上的氨基酸被ala、gly、ser、或thr、優(yōu)選ala取代。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a或者由該取代組成。在一個具體實施例中，在位置54上的變化是一個缺失，即該位置是不存在的。因此，在與位置54相對應(yīng)的位置上的氨基酸選自ser、gly、ala或thr或者是不存在的。在另一個方面，該變體在與位置55相對應(yīng)的位置上包含一個變化或由其組成。在另一個方面，在與位置55相對應(yīng)的位置上的氨基酸被ala、gly或ser、優(yōu)選ser取代。在另一方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s或者由該取代組成。在一個具體實施例中，在位置55上的變化是一個缺失，即該位置是不存在的。因此，在與位置55相對應(yīng)的位置上的氨基酸選自ser、gly或ala或者是不存在的。在另一個方面，該變體在與位置56相對應(yīng)的位置上包含一個變化或由其組成。在另一個方面，在與位置56相對應(yīng)的位置上的氨基酸被ala、gly、ser、或thr、優(yōu)選ser取代。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56s或者由該取代組成。在一個具體實施例中，在位置56上的變化是一個缺失，即該位置是不存在的。因此，在與位置56相對應(yīng)的位置上的氨基酸選自ser、gly、ala或thr或者是不存在的。在另一個方面，該變體在與位置57相對應(yīng)的位置上包含一個變化或由其組成。在另一個方面，在與位置57相對應(yīng)的位置上的氨基酸被ala、gly、ser、或thr、優(yōu)選ala取代。在另一方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代p57a或者由該取代組成。在一個具體實施例中，在位置57上的變化是一個缺失，即該位置是不存在的。因此，在與位置57相對應(yīng)的位置上的氨基酸選自ser、gly、ala或thr或者是不存在的。在另一方面，該變體在與位置53和54相對應(yīng)的位置上包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53和55相對應(yīng)的位置上包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53和56相對應(yīng)的位置上包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53和57相對應(yīng)的位置上包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置54和55相對應(yīng)的位置上包含變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置54和56相對應(yīng)的位置上包含變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置54和57相對應(yīng)的位置上包含變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置55和56相對應(yīng)的位置上包含變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置55和57相對應(yīng)的位置上包含變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置56和57相對應(yīng)的位置上包含變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53、54、以及55相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53、54、以及56相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53、54、以及57相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53、55、以及56相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53、55、以及57相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53、56、以及57相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置54、55、以及56相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置54、55、以及57相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置54、56、以及57相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置55、56、以及57相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53、54、55、以及56相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置54、55、56、以及57相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一方面，該變體在與位置53、54、55、56、以及57相對應(yīng)的位置包含多個變化或由其組成，例如以上描述的那些。在另一個方面，該變體包含一個或多個(例如，若干個)選自下組的取代(該組由x53g、x54a、x55s、x56a、x57ax53g組成，優(yōu)選選自下組的取代，該組由s53g、e54a、t55s、n56a、p57a組成)和/或一個或多個(例如，若干個)選自下組的缺失(該組由53*、54*、55*、56*、57*組成)或者由其組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g或者由該取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a或者由該取代組成。在另一方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s或者由該取代組成。在另一方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56a或者由該取代組成。在另一方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代p57a或者由該取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+n56a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+n56a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+n56a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56a+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+t55s或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+n56a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s+n56a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+n56a+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s+n56a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+n56a+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g和缺失54*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g和缺失55*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g和缺失56*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g和缺失57*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a和缺失53*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a和缺失55*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a和缺失56*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a和缺失57*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s和缺失53*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s和缺失54*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s和缺失56*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s和缺失57*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56a和缺失53*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56a和缺失54*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56a和缺失55*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56a和缺失57*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代p57a和缺失53*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代p57a和缺失54*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代p57a和缺失55*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代p57a和缺失56*或者由該取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a和缺失55*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+n56a和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+p57a和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+n56a和缺失55*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+p57a和缺失55*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+n56a和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+p57a和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+n56a和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+p57a和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+n56a和缺失55*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+p57a和缺失55*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+n56a和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+p57a和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+n56a和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+p57a和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+n56a和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+p57a和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+n56a和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+p57a和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56a+p57a和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56a+p57a和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代n56a+p57a和缺失55*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+t55s和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+n56a和缺失55*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+p57a和缺失55*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+t55s和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+n56a和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+p57a和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s+n56a和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s+p57a和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s+n56a和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+t55s+p57a和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+n56a+p57a和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+n56a+p57a和缺失55*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s+n56a和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s+p57a和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s+n56a和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s+p57a和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+n56a+p57a和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代t55s+n56a+p57a和缺失54*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失53*+54*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失53*+55*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失53*+56*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失53*+57*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失54*+55*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失54*+56*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失54*+57*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失55*+56*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失55*+57*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的缺失56*+57*或者由這些缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+t55s+n56a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+t55s+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s+n56a+p57a或者由這些取代組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+t55s+n56a和缺失57*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代s53g+e54a+t55s+p57a和缺失56*或者由這些取代和該缺失組成。在另一個方面，該變體包含具有seqidno:2的成熟多肽的取代e54a+t55s+n56a+p57a和缺失53*或者由這些取代和該缺失組成。這些變體在一個或多個(例如，若干個)其他位置上可進(jìn)一步包含一個或多個額外的變化。氨基酸改變可以具有次要性質(zhì),即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；至多20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或另一功能來促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。保守取代的實例在下組之內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及甲硫氨酸)。一般不改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域中已知的，并且(例如)由h.紐拉特(neurath)和r.l.希爾(hill)，1979在《蛋白質(zhì)》(學(xué)術(shù)出版社，紐約)中描述。常見取代是ala/ser、val/ile、asp/glu、asn/gln、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、glu/gln、leu/ile、leu/val、ala/glu、以及asp/gly?？商娲兀被岣淖兙哂懈淖兌嚯牡奈锢砘瘜W(xué)特性的這種性質(zhì)。例如，氨基酸改變可以提高多肽的熱穩(wěn)定性、改變底物特異性、改變最適ph，等等。例如，這些變體在與位置53、54、55、56、57相對應(yīng)的位置上可以包含一個變化并且在選自下組的任何位置上進(jìn)一步包含一個變化，該組由位置4、14、63、79、84、86、88、92、98、101、146、以及217組成，優(yōu)選為位置63和217(根據(jù)seqidno:2編號)。在一個優(yōu)選實施例中，在選自下組的任何位置上的變化是一個取代，該組由4、14、63、79、84、86、88、92、98、101、146、以及217組成。在一個特別優(yōu)選的實施例中，根據(jù)本發(fā)明的變體在與seqidno:2的位置53、54、55、56、57相對應(yīng)的位置上包含一個變化，其中這些變化中的至少一個是缺失并且該變體進(jìn)一步包含一個或多個選自下組的取代，該組由v4i、p14t、s63g、i79t、p86h、a88v、a92s、a98t、s101l、g146s或y217l組成。在本發(fā)明的一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的變體包括以下任何變體或者由其組成：s53g+t55s+n56*+p57a+y217l、p14t+t55s+n56*+p57a+y217l、p14t+s53g+n56*+p57a+y217l、p14t+s53g+t55s+n56*+y217l、p14t+s53g+t55s+n56*+p57a、p14t+s53g+t55s+n56*+p57a+s101l+y217l、v4i+s53g+t55s+n56*+p57a+y217l、p14t+s53g+t55s+n56*+p57a+y217l、t55s+n56*+p57a+y217l、s53g+t55s+n56*+p57a+i79t+y217l、s53g+t55s+n56*+p57a+p86h+a92s+y217l、s53g+t55s+n56*+p57a+a88v+y217l、s53g+t55s+n56*+p57a+a98t+y217l、s53g+t55s+n56*+p57a+y217l、s53g+t55p+n56*+s63g+g146s+y217l在一個特別優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的變體在與seqidno:2的位置53、54、55、56、57相對應(yīng)的一個或多個位置上包含一個缺失并且進(jìn)一步包含取代y217l。在另一個特別優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的變體在與seqidno:2的位置53、54、55、56、57相對應(yīng)的兩個或更多個位置上包含一個缺失并且進(jìn)一步包含取代y217l。可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的程序，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(坎寧漢(cunningham)和威爾斯(wells)，1989，科學(xué)(science)244:1081-1085)來鑒定多肽中的必需氨基酸。在后一項技術(shù)中，在該分子中的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并且對所得突變體分子的蛋白酶活性進(jìn)行測試以鑒別對于該分子的活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還參見，希爾頓(hilton)等人，1996，生物化學(xué)雜志271:4699-4708。酶活性位點或其他生物學(xué)相互作用也可以通過對結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué)分析來確定，如通過以下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記，與假定接觸位點氨基酸的突變相結(jié)合來確定。參見，例如，德沃斯(devos)等人，1992，科學(xué)255:306-312；史密斯(smith)等人，1992，分子生物學(xué)雜志224:899-904；wlodaver等人，1992，febslett.309:59-64。必需氨基酸的身份還可以從與相關(guān)多肽的比對來推斷。對于bpn’(seqidno:2)，包含氨基酸s221、h64、以及d32的催化三聯(lián)體對于酶的蛋白酶活性是必須的。這些變體可以由200至900個氨基酸，例如210至800、220至700、230至600、240至500、250至400、255至300、260至290、265至285、270至280、或者270、271、272、273、274、275、276、277、278、279或280個氨基酸組成。在一個實施例中，該變體相比于親本酶或者相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置上不具有變化的蛋白酶或者相比于具有seqidno:2的蛋白酶具有改進(jìn)的催化活性。在一個實施例中，該變體相比于親本酶或者相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置上不具有變化的蛋白酶或者相比于具有seqidno:2的蛋白酶具有改進(jìn)的洗滌性能，其中如在此處的“材料與方法”所述地在amsa中測量洗滌性能。在一個實施例中，根據(jù)本發(fā)明的變體相比于親本酶或者相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置上不具有變化的蛋白酶或者相比于具有seqidno:2的蛋白酶具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性，其中該變體在特定溫度下相對于親本或者相對于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置上不具有變化的蛋白酶或者相對于具有seqidno:2的蛋白酶的溫度依賴活性曲線展示改變的溫度依賴活性曲線。在一個具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的變體具有減小的熱活性，其中所述變體在比由親本的溫度依賴活性曲線定義的親本的最佳溫度更低的溫度下提高酶促反應(yīng)。在一個具體實施例中，該親本是具有seqidno:2或者與其具有至少65％的一致性的蛋白酶。親本蛋白酶裂解蛋白質(zhì)底物中的酰胺鍵的酶被分類為蛋白酶或(可互換地)肽酶(參見，沃爾什(walsh)，1979，酶促反應(yīng)機制(enzymaticreactionmechanisms)，福利曼出版公司(w.h.freemanandcompany)，舊金山(sanfrancisco)，第3章)。氨基酸位置/殘基的編號如果沒有另外指出，則在此所用的氨基酸編號對應(yīng)于枯草桿菌酶bpn'(basbpn)序列的氨基酸編號。對于進(jìn)一步描述bpn’序列，參見seqidno:2或斯艾森(siezen)等人，蛋白質(zhì)工程4(1991)719-737。絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是催化肽鍵水解并且在活性位點處存在一個必需絲氨酸殘基的酶(懷特(white)、漢德勒(handler)和史密斯(smith)，1973，“生物化學(xué)原理(principlesofbiochemistry)”，第五版，麥格勞-希爾圖書公司(mcgraw-hillbookcompany)，紐約(ny)，第271-272頁)。細(xì)菌絲氨酸蛋白酶的分子量范圍是20,000至45,000道爾頓。它們被二異丙基氟磷酸所抑制。它們水解簡單末端酯并且在活性上與同樣是絲氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶相似。一個更狹義的術(shù)語堿性蛋白酶包括一個亞組，它反映某些絲氨酸蛋白酶的最佳高ph值ph9.0至ph11.0(綜述參見普里斯特(priest)(1977)細(xì)菌學(xué)評論(bacteriologicalrev.)41:711-753)?？莶輻U菌酶斯艾森等人，蛋白質(zhì)工程4(1991)719-737以及斯艾森等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(proteinscience)6(1997)501-523提出了被暫時命名為枯草桿菌酶(subtilase)的一個絲氨酸蛋白酶亞組。它們是通過對先前稱為枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的170多個氨基酸序列進(jìn)行同源性分析而定義的?？莶輻U菌蛋白酶以前通常被定義為由革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)斯艾森等人則為枯草桿菌酶的一個亞組。已鑒定大量的枯草桿菌酶，并且已確定很多枯草桿菌酶的氨基酸序列。對于此類枯草桿菌酶以及其氨基酸序列的更詳細(xì)描述參見斯艾森等人(1997)?？莶輻U菌酶的一個亞組，i-s1或“真”枯草桿菌蛋白酶，包含“標(biāo)準(zhǔn)的”枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168(bss168)、枯草桿菌蛋白酶bpn’、枯草桿菌蛋白酶嘉士伯(subtilisincarlsberg)(諾維信公司)、以及枯草桿菌蛋白酶dy(bssdy)。bpn’是來自解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶bpn’，bpn’具有氨基酸序列seqidno:2。斯艾森等人(見上文)識別了枯草桿菌酶的另一個亞組，i-s2或強堿性枯草桿菌蛋白酶。亞組i-s2蛋白酶被描述為強堿性枯草桿菌蛋白酶并且包括如以下的酶：枯草桿菌蛋白酶pb92(baalkp)(杜邦/杰能科國際公司)、枯草桿菌蛋白酶309(諾維信公司)、枯草桿菌蛋白酶147(bls147)(諾維信公司)、以及堿性彈性蛋白酶yab(bseyab)?？莶輻U菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶是來自s8家族、特別是來自s8a子族的絲氨酸蛋白酶，如merops數(shù)據(jù)庫(http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/famsum？family＝s8)所定義的。bpn’和諾維信蛋白質(zhì)分別具有merops編號s08.034和s08.003。親本枯草桿菌酶根據(jù)本發(fā)明的親本蛋白酶是一種親本枯草桿菌酶。術(shù)語“親本枯草桿菌酶”描述一種根據(jù)斯艾森等人(1991和1997)定義的枯草桿菌酶。更詳細(xì)的信息參見以上“枯草桿菌酶”的描述。親本枯草桿菌酶也可以是從自然來源中分離的枯草桿菌酶，其中在保留枯草桿菌酶特性的同時，對其進(jìn)行隨后的修飾。此外，親本枯草桿菌酶可以是一種通過dna改組技術(shù)制備的枯草桿菌酶，如通過j.e.內(nèi)斯(ness)等人，自然生物技術(shù)(naturebiotechnology)，17,893-896(1999)所描述的。可替代地，術(shù)語“親本枯草桿菌酶”可被稱為“野生型枯草桿菌酶”。提供了在此提到的各種枯草桿菌酶的首字母縮寫參考表，對于另外的首字母縮寫，參見斯艾森等人，蛋白質(zhì)工程4(1991)719-737以及斯艾森等人，蛋白質(zhì)科學(xué)6(1997)501-523。表iii枯草桿菌酶的修飾在此使用的術(shù)語“修飾”被定義為包括枯草桿菌酶的化學(xué)修飾以及對編碼枯草桿菌酶的dna所進(jìn)行的遺傳操作。該修飾可以是氨基酸側(cè)鏈的置換、在感興趣氨基酸中或感興趣氨基酸處的取代、刪除和/或插入?？莶輻U菌酶變體術(shù)語“變體”和術(shù)語“枯草桿菌酶變體”是如以上所定義的。同源枯草桿菌酶序列兩個氨基酸序列之間的同源性是在出于本發(fā)明的目的由參數(shù)“一致性”描述的背景下，兩個氨基酸序列之間的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法來確定的。來自程序的結(jié)果除了氨基酸比對之外還計算兩個序列之間的“一致性百分比”?；诒久枋?，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，鑒別可以根據(jù)本發(fā)明來修飾的適當(dāng)同源枯草桿菌酶是相當(dāng)簡單的?；旧贤吹挠H本枯草桿菌酶變體可以具有一個或多個(若干個)氨基酸取代、缺失和/或插入，在此背景下，術(shù)語“一個或多個”與術(shù)語“若干個”是互換使用的。這些改變優(yōu)選具有一種次要性質(zhì)，即并不顯著影響蛋白質(zhì)或多肽的三維折疊或活性的如上所述的保守氨基酸取代和其他取代；典型地具有1個至約30個氨基酸的小缺失；以及小氨基-或羧基-末端延伸，如一種氨基-末端蛋氨酸殘基、具有至多約20-25個殘基的一種小接頭肽、或促進(jìn)純化(親和標(biāo)記)的一種小延伸，如一種多組氨酸序列、或蛋白質(zhì)a(尼爾森(nilsson)等人，1985，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志(emboj.)4:1075；尼爾森等人，1991，酶學(xué)方法(methodsenzymol.)198:3)。通常還參見，福特(ford)等人，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)與純化(proteinexpressionandpurification)2:95-107。盡管以上所述的這些改變優(yōu)選具有一種次要性質(zhì)，此類改變也可以具有一種實質(zhì)性質(zhì)，如至多300個氨基酸或更多個氨基酸的更大多肽的融合，二者都作為氨基-或羧基-末端延伸。親本枯草桿菌酶可以包含seqidno:2的氨基酸序列或其等位基因變體；或其具有蛋白酶活性的片段，或者由其組成。在一個方面，該親本枯草桿菌酶包含seqidno:2的氨基酸序列或者由其組成。該親本枯草桿菌酶可以是(a)與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％序列一致性的一種多肽；(b)由在中嚴(yán)謹(jǐn)度或高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列、(ii)編碼具有seqidno:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全長互補體雜交的多核苷酸編碼的一種多肽；或者(c)由與seqidno:1的成熟多肽編碼序列具有至少60％序列一致性的多核苷酸編碼的一種多肽。在一個方面中，該親本與具有seqidno:2的成熟多肽具有至少65％、如至少70％、例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％的序列一致性，該成熟多肽具有蛋白酶活性。在一個方面，親本的氨基酸序列與具有seqidno:2的成熟多肽的不同不超過10個氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個氨基酸。在另一個方面，該親本包含seqidno:2的氨基酸序列或者由其組成。在另一個方面，該親本包含具有seqidno:2的成熟多肽或者由其組成。在另一個方面，該親本包含seqidno:2的氨基酸1至275或者由其組成。在另一個方面，該親本是具有seqidno:2的成熟多肽的片段，該片段含有至少202個氨基酸殘基，例如seqidno:2的位置28至230。在另一個實施例中，該親本是具有seqidno:2的成熟多肽的一個等位基因變體。在另一個方面，該親本是由在非常低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、中嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、或高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下與(i)seqidno:1的成熟多肽編碼序列、(ii)編碼具有seqidno:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全長互補體雜交的多核苷酸編碼的(薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，分子克隆，實驗室手冊(molecularcloning,alaboratorymanual)，第2版，冷泉港(coldspringharbor)，紐約)。seqidno:1的多核苷酸或其子序列以及具有seqidno:2的多肽或其片段可以用于設(shè)計核酸探針，從而根據(jù)領(lǐng)域內(nèi)熟知的方法，從不同屬或種的菌株中識別并克隆編碼親本的dna。具體來說，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的dna印跡程序，將這類探針用于與感興趣細(xì)胞的基因組dna或cdna雜交，以便在其中鑒別并分離相對應(yīng)的基因。這類探針可以明顯短于完整序列，但是長度應(yīng)為至少15，例如至少25、至少35、或至少70個核苷酸。優(yōu)選地，該核酸探針的長度為至少100個核苷酸，例如長度為至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、或至少900個核苷酸。dna和rna探針二者均可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記(例如，用32p、3h、35s、生物素、或抗生物素蛋白)，以檢測相應(yīng)的基因。這類探針涵蓋于本發(fā)明?？梢院Y選由這類其他菌株制備的基因組dna或cdna文庫中與上述探針雜交并且編碼親本的dna?？梢酝ㄟ^瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、或其他分離技術(shù)來分離來自這類其他菌株的基因組或其他dna?？梢詫碜晕膸斓膁na或分離的dna轉(zhuǎn)移至硝化纖維素或其他合適的載體材料上并且固定于其上。為了鑒別與seqidno:1或其子序列雜交的克隆或dna，在dna印跡法中使用載體材料。出于本發(fā)明的目的，雜交指示該多核苷酸與和(i)seqidno:1；(ii)seqidno:1的成熟多肽編碼序列；(iii)編碼具有seqidno:2的成熟多肽的序列；(iv)其全長互補體；或者(v)其子序列相對應(yīng)的標(biāo)記的核酸探針；在非常低至非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下雜交?？梢允褂美鐇-射線片或本領(lǐng)域中已知的任何其他檢測手段檢測核酸探針在這些條件下所雜交的分子。在一個方面，該核酸探針是seqidno:1的成熟多肽編碼序列。在另一個方面，該核苷酸探針是seqidno:1的80至1140個核苷酸長片段，例如長度為90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1100核苷酸。在另一個方面中，該核酸探針是編碼具有seqidno:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的一種多核苷酸。在另一個方面，該核酸探針是seqidno:1或編碼具有seqidno:2的成熟多肽的序列。在另一個實施例中，該親本是由一種多核苷酸編碼的，該多核苷酸與seqidno:1的成熟多肽編碼序列或者編碼具有seqidno:2的成熟多肽的序列具有至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％的一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％的序列一致性。該多肽可以是一種雜合多肽，其中一個多肽的一個區(qū)域融合在另一個多肽的一個區(qū)域的n末端或c末端處。該親本可以是一種融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一個多肽融合在本發(fā)明的多肽的n末端或c末端。融合多肽是通過將編碼另一種多肽的多核苷酸融合到本發(fā)明的多核苷酸來產(chǎn)生。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，并且包括連接編碼多肽的編碼序列，以使得它們在框內(nèi)并且融合多肽的表達(dá)受到相同的一個或多個啟動子和終止子的控制。融合多肽還可以使用內(nèi)蛋白技術(shù)來構(gòu)建，其中融合多肽在翻譯后產(chǎn)生(庫珀(cooper)等人，1993，歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志12:2575-2583；道森(dawson)等人，1994，科學(xué)266:776-779)。一個融合多肽可以在兩個多肽之間進(jìn)一步包含一個切割位點。一旦分泌融合蛋白，該位點就被裂解，從而釋放這兩個多肽。裂解位點的實例包括但不限于在以下各項中披露的位點：馬丁(martin)等人，2003，工業(yè)微生物與生物技術(shù)雜志(j.ind.microbiol.biotechnol.)3:568-576；斯韋蒂納(svetina)等人，2000，生物技術(shù)雜志(j.biotechnol.)76:245-251；拉斯馬森-威爾遜(rasmussen-wilson)等人，1997，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(appl.environ.microbiol.)63:3488-3493；沃德(ward)等人，1995，生物技術(shù)(biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(contreras)等人，1991，生物技術(shù)9:378-381；伊頓(eaton)等人，1986，生物化學(xué)(biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(collins-racie)等人，1995，生物技術(shù)13:982-987；卡特(carter)等人，1989，蛋白質(zhì)：結(jié)構(gòu)、功能與遺傳(proteins:structure,function,andgenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(stevens)，2003，藥物發(fā)現(xiàn)的世界(drugdiscoveryworld)4:35-48。該親本可以從任何屬的有機體中獲得。出于本發(fā)明的目的，如在此結(jié)合一種給定的來源使用的術(shù)語“從...中獲得”應(yīng)意指由多核苷酸編碼的親本是由該來源或者由其中已經(jīng)插入來自該來源的多核苷酸的一種菌株產(chǎn)生的。在一個方面，該親本是胞外分泌的。該親本可以是細(xì)菌蛋白酶。例如，該親本可以是一種革蘭氏陽性細(xì)菌多肽，如芽孢桿菌屬(bacillus)、梭菌屬(clostridium)、腸球菌屬(enterococcus)、土芽孢桿菌屬(geobacillus)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、海洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、或鏈霉菌屬(streptomyces)蛋白酶；或一種革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如彎曲桿菌屬(campylobacter)、大腸桿菌(e.coli)、黃桿菌屬(flavobacterium)、梭桿菌屬(fusobacterium)、螺桿菌屬(helicobacter)、泥桿菌屬(ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(neisseria)、假單胞菌屬(pseudomonas)、沙門菌屬(salmonella)或脲原體屬(ureaplasma)蛋白酶。在一個方面，該親本是嗜堿芽孢桿菌(bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、或蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)蛋白酶。在一個方面，該親本是一種解淀粉芽孢桿菌蛋白酶，例如seqidno:2的蛋白酶。公眾在許多培養(yǎng)物保藏中心易于獲得這些種的菌株，如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)、德國微生物菌種保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，dsmz)、荷蘭菌種保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures，cbs)、以及美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心南方地區(qū)研究中心(nrrl)?？梢允褂靡陨咸岬降奶结槒钠渌麃碓矗◤淖匀唤?例如，土壤、堆肥、水等等)分離的微生物或直接從自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)獲得的dna樣品鑒定和獲得該親本。用于直接從天然生境分離微生物和dna的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。然后可以通過類似地篩選另一種微生物的基因組dna或cdna文庫或混合的dna樣品來獲得編碼親本的多核苷酸。一旦用一種或多種探針檢測到編碼親本的多核苷酸，就可以通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)分離或克隆該多核苷酸(參見，例如，薩姆布魯克等人，1989，見上文)。變體的制備本發(fā)明還涉及用于獲得一種具有蛋白酶活性的多肽的方法，該方法包括：(a)在親本枯草桿菌酶的與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的一個或多個(例如，若干個)位置上引入一個變化；以及(b)回收該變體?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何誘變程序，如定點誘變、合成基因構(gòu)建、半合成基因構(gòu)建、隨機誘變、改組等等來制備這些變體。定點誘變是在編碼該親本的多核苷酸中的一個或多個限定位點處引入一個或多個(例如，若干個)突變的技術(shù)。定點誘變可以在體外通過涉及使用含有所希望的突變的寡核苷酸引物的pcr來完成。定點誘變還可以在體外通過表達(dá)盒誘變來執(zhí)行，這涉及用限制酶在包含編碼該親本的多核苷酸的質(zhì)粒中的位點進(jìn)行裂解，并且隨后將含有該突變的寡核苷酸連接在該多核苷酸中。消化該質(zhì)粒和該寡核苷酸的限制酶通常是相同的，從而允許該質(zhì)粒和插入物的粘性末端互相連接。參見，例如，謝勒(scherer)和戴維斯(davis)，1979，美國國家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)76:4949-4955；以及巴頓(barton)等人，1990，核酸研究18:7349-4966。定點誘變還可以在體內(nèi)通過本領(lǐng)域已知的方法完成。參見，例如美國專利申請?zhí)?004/0171154；storici等人，2001，自然生物技術(shù)19:773-776；克倫(kren)等人，1998，自然醫(yī)學(xué)(nat.med.)4:285-290；以及卡利薩諾(calissano)和馬奇諾(macino)，1996，真菌遺傳學(xué)通訊(fungalgenet.newslett.)43:15-16。在本發(fā)明中，可以使用任何定點誘變程序。存在可用于制備變體的很多可商購的試劑盒。合成基因構(gòu)建需要體外合成設(shè)計成編碼目標(biāo)多肽的多核苷酸分子?？梢岳枚喾N技術(shù)進(jìn)行基因合成，如由田(tian)等人(2004，自然432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技術(shù)以及其中在光可編程的微流體芯片上合成并組裝寡核苷酸的類似技術(shù)。使用已知的誘變、重組和/或改組方法、隨后進(jìn)行一個相關(guān)的篩選程序可以做出單一或多個氨基酸取代、缺失和/或插入并對其進(jìn)行測試，該相關(guān)的篩選程序例如由瑞德哈爾-奧爾森(reidhaar-olson)和薩奧爾(sauer)，1988，科學(xué)241:53-57；鮑依(bowie)和薩奧爾，1989，美國國家科學(xué)院院刊86:2152-2156；wo95/17413；或者wo95/22625所描述的那些?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族epcr、噬菌體展示(例如，洛曼(lowman)等人，1991，生物化學(xué)30:10832-10837；美國專利號5,223,409；wo92/06204)以及區(qū)域定位誘變(region-directedmutagenesis)(德比修(derbyshire)等人，1986，基因(gene)46:145；內(nèi)爾(ner)等人，1988，dna7:127)。誘變/改組方法可以與高通量、自動篩選方法組合以檢測由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆、誘變的多肽的活性(內(nèi)絲等人，1999，自然生物技術(shù)l7:893-896)。編碼活性多肽的誘變的dna分子可以從這些宿主細(xì)胞中回收并使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法來快速測序。這些方法允許迅速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。通過組合合成基因構(gòu)建、和/或定點誘變、和/或隨機誘變、和/或改組的多個方面來實現(xiàn)半合成基因構(gòu)建。半合成構(gòu)建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一個過程結(jié)合pcr技術(shù)。基因的限定區(qū)域因而可以從頭合成，而其他區(qū)域可以使用位點特異性誘變引物擴增，而其他區(qū)域可以進(jìn)行易錯pcr或非易錯pcr擴增。然后可以對多核苷酸子序列進(jìn)行改組。多核苷酸本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明的變體的分離的多核苷酸。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明的一種變體的、可操作地連接至一個或多個控制序列上的一種多核苷酸的核酸構(gòu)建體，該一個或多個控制序列在與控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列在一種適合的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。可以按多種方式操縱該多核苷酸以提供一種變體的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在其插入載體之前操縱多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重組dna方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的?？刂菩蛄锌梢允且粋€啟動子，即由一個宿主細(xì)胞識別用于表達(dá)該多核苷酸的一種多核苷酸。啟動子包含介導(dǎo)該變體的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。該啟動子可以是在宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變體、截短的及雜合啟動子，并且可以是由編碼與該宿主細(xì)胞同源或異源的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從以下基因中獲得的啟動子：解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penp)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢桿菌xyla和xylb基因、蘇云金芽孢桿菌cryiiia基因(阿蓋塞(agaisse)和勒爾克呂(lereclus)，1994，分子微生物學(xué)(molecularmicrobiology)13:97-107)、大腸桿菌lac操縱子、大腸桿菌trc啟動子(埃貢(egon)等人，1988，基因69:301-315)、天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂水解酶基因(daga)、以及原核β-內(nèi)酰胺酶基因(維拉-卡馬洛夫(villa-kamaroff)等人，1978，美國國家科學(xué)院院刊75:3727-3731)、以及tac啟動子(德波爾(deboer)等人，1983，美國國家科學(xué)院院刊80:21-25)。其他啟動子描述在吉爾伯特(gilbert)等人，1980，科學(xué)美國人(scientificamerican)242:74-94的“來自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)(usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在薩姆布魯克等人，1989(見上文)中。串聯(lián)啟動子的實例披露在wo99/43835中?？刂菩蛄羞€可以是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的一種轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子序列被可操作地連接至編碼該變體的多核苷酸的3’末端?？梢允褂迷谒拗骷?xì)胞中起作用的任何終止子。細(xì)菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下基因中獲得：克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(amyl)、以及大腸桿菌核糖體rna(rrnb)?？刂菩蛄羞€可以是啟動子下游和基因的編碼序列上游的mrna穩(wěn)定子區(qū)，它增加該基因的表達(dá)。合適的mrna穩(wěn)定子區(qū)的實例是從以下基因中獲得：蘇云金芽孢桿菌cryiiia基因(wo94/25612)和枯草芽孢桿菌sp82基因(休(hue)等人，1995，細(xì)菌學(xué)雜志(journalofbacteriology)177:3465-3471)?？刂菩蛄羞€可以是編碼連接至一個變體的n-末端的一個信號肽并指導(dǎo)該變體進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑的一個信號肽編碼區(qū)。多核苷酸的編碼序列的5’-末端可以固有地包含信號肽編碼序列，該信號肽編碼序列在翻譯閱讀框中與編碼該變體的編碼序列的區(qū)段天然地連接在一起?？商娲?，編碼序列的5’-末端可以包含對編碼序列是外源的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號肽編碼序列的情況下，可能需要外源信號肽編碼序列。可替代地，外源信號肽編碼序列可以簡單地置換天然信號肽編碼序列，以便增加變體的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)表達(dá)的變體進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼序列。用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼序列是從以下基因中獲得的信號肽編碼序列：芽孢桿菌屬ncib11837麥芽糖淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)、以及枯草芽孢桿菌prsa。另外的信號肽由西蒙(simonen)和帕夫拉(palva)，1993，微生物學(xué)綜述(microbiologicalreviews)57:109-137進(jìn)行描述。該控制序列還可以是編碼位于一個變體的n-末端的前肽的一種前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原一般是無活性的并且可以通過從該多肽原上催化或自動催化裂解前肽而被轉(zhuǎn)化成一種活性多肽。前肽編碼序列可以從以下基因中獲得：枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(apre)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt)、嗜熱毀絲霉漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α-因子。在信號肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰該變體的n末端并且該信號肽序列定位成緊鄰該前肽序列的n末端。還令人希望的可以是添加相對于宿主細(xì)胞的生長來調(diào)節(jié)該變體的表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激而引起基因的表達(dá)開啟或關(guān)閉的那些，包括調(diào)控化合物的存在。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)序列包括lac、tac、以及trp操縱子系統(tǒng)。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸、啟動子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號的重組表達(dá)載體。不同的核苷酸和控制序列可以接合在一起以產(chǎn)生一個重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體可以包括一個或多個便利的限制酶切位點以允許在這些位點處插入或取代編碼該變體的多核苷酸?？商娲兀摱嗪塑账峥梢酝ㄟ^將該多核苷酸或包含該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來進(jìn)行表達(dá)。在形成該表達(dá)載體時，該編碼序列是位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是能夠方便地進(jìn)行重組dna程序并且可以引起多核苷酸的表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇將典型地取決于載體與該載體待引入其中的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體、或人工染色體。載體可以含有用于確保自我復(fù)制的任何構(gòu)件?？商娲兀撦d體可以是這樣一種載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時，被整合到基因組中并且與其中整合它的一個或多個染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)粒、或兩個或更多個載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同包含了有待引入到宿主細(xì)胞的基因組中的總dna)、或轉(zhuǎn)座子。該載體優(yōu)選包含允許容易選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞或類似細(xì)胞的一個或多個選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實例是地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因、或者賦予抗生素抗性(例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、或四環(huán)素抗性)的標(biāo)記。載體優(yōu)選含有允許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或載體在細(xì)胞中獨立于基因組自主復(fù)制的一個或多個元件。對于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該變體的多核苷酸序列或者用于通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件?？商娲?，該載體可以包含用于指導(dǎo)通過同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個或多個染色體中的一個或多個精確位置的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置的整合可能性，這些整合元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10,000個堿基對、400至10,000個堿基對、以及800至10,000個堿基對，這些堿基對與相應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，通過非同源重組可以將該載體整合到該宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)。對于自主復(fù)制，該載體可以進(jìn)一步包含使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自主復(fù)制的復(fù)制起點。復(fù)制起點可以是在細(xì)胞內(nèi)起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制因子。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指能夠使質(zhì)?；蜉d體在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。細(xì)菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pbr322、puc19、pacyc177、以及pacyc184的復(fù)制起點，以及允許在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pub110、pe194、pta1060、以及pamβ1的復(fù)制起點?？梢詫⒈景l(fā)明的多核苷酸的多于一個的拷貝插入到一個宿主細(xì)胞中以增加變體的產(chǎn)生。通過將序列的至少一個另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過包含一個與該多核苷酸的可擴增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得增加的多核苷酸拷貝數(shù)目，其中通過在適當(dāng)選擇性試劑存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含可擴增的選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴增的拷貝的細(xì)胞，并且由此是該多核苷酸的另外的拷貝。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，薩姆布魯克等人，1989，見上文)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些重組宿主細(xì)胞包含編碼本發(fā)明的變體的、可操作地連接至一個或多個控制序列的一種多核苷酸，該一個或多個控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的變體的產(chǎn)生。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所描述。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上將取決于編碼該變體的基因及其來源。宿主細(xì)胞可以是在重組產(chǎn)生一個變體中有用的任何細(xì)胞，例如原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽性細(xì)菌包括但不限于：芽孢桿菌、梭菌、腸球菌、土芽孢桿菌、乳桿菌、乳球菌、海洋芽孢桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、以及鏈霉菌。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于：彎曲桿菌、大腸桿、黃桿菌、梭桿菌、螺桿菌、泥桿菌、奈瑟氏菌、假單胞菌、沙門菌、以及脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞，包括但不限于：嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、以及蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌細(xì)胞，包括但不限于：似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌、以及馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌細(xì)胞，包括但不限于：不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌、以及淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如常(chang)和科恩(cohen)，1979，分子遺傳學(xué)和基因組(mol.gen.genet.)168:111-115)、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(參見，例如，楊(young)和斯皮宰曾(spizizen)，1961，細(xì)菌學(xué)雜志(j.bacteriol.)81:823-829、或者杜布(dubnau)和大衛(wèi)杜夫-阿貝爾森(davidoff-abelson)，1971，分子生物學(xué)雜志56:209-221)、電穿孔(參見，例如，茂川(shigekawa)和道爾(dower)，1988，生物技術(shù)(biotechniques)6:742-751)、或共軛(參見，例如，凱勒(koehler)和索恩(thorne)，1987，細(xì)菌學(xué)雜志169:5271-5278)實現(xiàn)dna到芽孢桿菌細(xì)胞中的引入?？梢酝ㄟ^原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，哈那汗(hanahan)，1983，分子生物學(xué)雜志166:557-580)或者電穿孔(參見，例如，道爾(dower)等人，1988，核酸研究16:6127-6145)實現(xiàn)dna到大腸桿菌細(xì)胞中的引入。可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見，例如，貢(gong)等人，2004，葉線形微生物學(xué)(foliamicrobiol.(praha))49:399-405)、共軛(參見，例如，馬佐迪耶(mazodier)等人，1989，細(xì)菌學(xué)雜志171:3583-3585)、或者轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，伯克(burke)等人，2001，美國國家科學(xué)院院刊98:6289-6294)實現(xiàn)dna到鏈霉菌細(xì)胞中的引入。可以通過電穿孔(參見，例如，蔡(choi)等人，2006，微生物學(xué)方法雜志(j.microbiol.methods)64:391-397)、或者共軛(參見，例如，皮內(nèi)多(pinedo)和斯梅茨(smets)，2005，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)71:51-57)實現(xiàn)dna到假單孢菌細(xì)胞中的引入。可以通過天然感應(yīng)態(tài)(參見，例如，佩里(perry)和藏滿(kuramitsu)，1981，感染與免疫(infect.immun.)32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，卡特(catt)和卓林克(jollick)，1991，微生物(microbios)68:189-207)、電穿孔(參見，例如，巴克利(buckley)等人，1999，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)65:3800-3804)或者共軛(參見，例如，克利威爾(clewell)，1981，微生物學(xué)評論(microbiol.rev.)45:409-436)實現(xiàn)dna到鏈球菌細(xì)胞中的引入。然而，可以使用在本領(lǐng)域已知的任何方法將dna引入到宿主細(xì)胞中。產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生一種變體的方法，這些方法包含：(a)在適合于該變體的表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的一種宿主細(xì)胞；以及(b)回收該變體。使用本領(lǐng)域已知的方法在適合于產(chǎn)生該變體的一種營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)，或者在一種適合的培養(yǎng)基中并在允許該變體表達(dá)和/或分離的條件下在實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中進(jìn)行小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批給料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)該細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包含碳源和氮源以及無機鹽。適合的培養(yǎng)基從商業(yè)供應(yīng)商處可獲得或者可根據(jù)公開的組成(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中)來制備。如果變體被分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可以從該培養(yǎng)基中直接回收該變體。如果變體不被分泌，那么可以從細(xì)胞裂解物中回收它。可以使用本領(lǐng)域已知的對具有蛋白酶活性的這些變體特異的方法檢測該變體。這些檢測方法包括但不限于特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一種酶測定來確定該變體的活性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法回收該變體。例如，可以通過多種常規(guī)程序從該營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收該變體，這些常規(guī)程序包括但不限于收集、離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)、或沉淀?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種程序來純化該變體以獲得基本上純的變體，這些程序包括但不限于色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及大小排阻色譜)、電泳程序(例如，制備型等電點聚焦)、有差別的溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page、或者萃取(參見，例如蛋白純化(proteinpurification)，詹森(janson)和賴登(ryden)編輯，vch出版社(vchpublishers)，紐約，1989)。在一個替代方面，沒有回收該變體，而是將表達(dá)該變體的本發(fā)明的宿主細(xì)胞用作該變體的一個來源。組合物在某一方面中，根據(jù)本發(fā)明的這些變體相比于親本酶或者相比于具有與所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述指定位置上不具有變化的蛋白酶或者相比于具有seqidno:2的蛋白酶具有改進(jìn)的洗滌性能，其中如在此處的“材料與方法”所述地在amsa中測量洗滌性能。因此，在一個優(yōu)選實施例中，組合物是一種洗滌劑組合物，并且本發(fā)明的一個方面涉及包含根據(jù)本發(fā)明的一種變體的洗滌劑組合物在清潔過程(如衣物洗滌或硬表面清潔)中的使用。額外組分的選擇是在普通技術(shù)人員技術(shù)范圍內(nèi)并且包括常規(guī)成分，包括以下列出的示例性、非限制性組分。組分的選擇可以包括(用于織物保養(yǎng))有待清潔的織物類型、污物的類型和/或程度、進(jìn)行清潔時的溫度、以及洗滌劑產(chǎn)品的配制的考慮。雖然以下提及的組分根據(jù)特定功能通過通用標(biāo)題(generalheader)進(jìn)行分類，但是這并不被解釋為限制，因為正如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所了解的，一種組分可以包含額外的功能。本發(fā)明的酶在本發(fā)明的一個實施例中，可以將本發(fā)明的變體以對應(yīng)于以下各項的量添加至一種洗滌劑組合物中：每升洗滌液體0.001-100mg的蛋白質(zhì)，例如0.01-100mg的蛋白質(zhì)，優(yōu)選是0.005-50mg的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選是0.01-25mg的蛋白質(zhì)，甚至更優(yōu)選是0.05-10mg的蛋白質(zhì)，最優(yōu)選是0.05-5mg的蛋白質(zhì)，并且甚至最優(yōu)選是0.01-1mg的蛋白質(zhì)?？梢允褂贸Ｒ?guī)穩(wěn)定劑使本發(fā)明的洗滌劑組合物中的一種或多種酶穩(wěn)定化，這些穩(wěn)定劑例如為多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸、或硼酸衍生物(例如，芳族硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰苯基硼酸))，并且該組合物可以如(例如)wo92/19709和wo92/19708中所述進(jìn)行配制，或者可以使用如wo2005/105826和wo2009/118375所述的肽醛或酮使根據(jù)本發(fā)明的變體穩(wěn)定化。本發(fā)明的變體還可以結(jié)合到wo97/07202中所披露的洗滌劑配制品中，該專利通過引用結(jié)合在此。表面活性劑洗滌劑組合物可以包含一種或多種表面活性劑，它們可以是陰離子的和/或陽離子的和/或非離子的和/或半極性的和/或兼性離子的表面活性劑、或其混合物。在一個具體實施例中，洗滌劑組合物包括一種或多種非離子型表面活性劑和一種或多種陰離子表面活性劑的混合物。這種或這些表面活性劑典型地以按重量計從約0.1％至60％的水平存在，例如約1％至約40％、或約3％至約20％、或約3％至約10％。基于所希望的清潔應(yīng)用來選擇這種或這些表面活性劑，并且這種或這些表面活性劑包括本領(lǐng)域中已知的任何一種或多種常規(guī)表面活性劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何表面活性劑。當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1％至約40％，例如從約5％至約30％(包括從約5％至約15％)、或從約20％至約25％的陰離子表面活性劑。陰離子表面活性劑的非限制性實例包括硫酸鹽和磺酸鹽，具體地說是直鏈烷基苯磺酸鹽(las)、las的異構(gòu)體、支鏈烷基苯磺酸鹽(babs)、苯基鏈烷磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽(aos)、烯烴磺酸鹽、鏈烯烴磺酸鹽、鏈烷-2,3-二基雙(硫酸鹽)、羥基鏈烷磺酸鹽以及二磺酸鹽、烷基硫酸鹽(as)(如十二烷基硫酸鈉(sds))、脂肪醇硫酸鹽(fas)、伯醇硫酸鹽(pas)、醇醚硫酸鹽(aes或aeos或fes，也被稱為醇乙氧基硫酸鹽或脂肪醇醚硫酸鹽)、仲鏈烷磺酸鹽(sas)、石蠟烴磺酸鹽(ps)、酯磺酸鹽、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-sfme或ses)(包括甲酯磺酸鹽(mes))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(dtsa)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和單酯、及其組合。當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1％至約40％的陽離子表面活性劑。陽離子表面活性劑的非限制性實例包括烷基二甲基乙醇季胺(admeaq)、溴化十六烷基三甲基銨(ctab)、二甲基雙十八烷基氯化銨(dsdmac)、以及烷基芐基二甲基銨、以及其組合、烷基季銨化合物、烷氧基化的季銨(aqa)。當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約0.2％至約40％的非離子型表面活性劑，例如從約0.5％至約30％，具體地說是從約1％至約20％、從約3％至約10％、例如從約3％至約5％、或從約8％至約12％。非離子型表面活性劑的非限制性實例包括醇乙氧基化物(ae或aeo)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(pfa)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(ape)、壬基酚乙氧基化物(npe)、烷基多糖苷(apg)、烷氧基化胺、脂肪酸單乙醇酰胺(fam)、脂肪酸二乙醇酰胺(fada)、乙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(efam)、丙氧基化的脂肪酸單乙醇酰胺(pfam)、多羥基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的n-?；鵱-烷基衍生物(葡糖酰胺(ga)、或脂肪酸葡糖酰胺(faga))、以及在span和tween商品名下可獲得的產(chǎn)品、以及其組合。當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1％至約40％的半極化表面活性劑。半極化表面活性劑的非限制性實例包括氧化胺(ao)，例如烷基二甲胺氧化物、n-(椰油基烷基)-n,n-二甲胺氧化物和n-(牛油-烷基)-n,n-雙(2-羥乙基)胺氧化物、脂肪酸鏈烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸鏈烷醇酰胺、以及其組合。當(dāng)被包括在其中時，洗滌劑將通常包含按重量計從約1％至約40％的兼性離子表面活性劑。兼性離子表面活性劑的非限制性實例包括甜菜堿、烷基二甲基甜菜堿、以及磺基甜菜堿、以及其組合。助水溶劑助水溶劑是一種化合物，該化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非極性環(huán)境中溶劑極性物質(zhì))。典型地，助水溶劑同時具有親水和疏水兩種特征(如從表面活性劑已知的所謂兩親特性)；然而，助水溶劑的分子結(jié)構(gòu)一般并不有利于自發(fā)自聚集，參見，例如霍奇登(hodgdon)和卡勒(kaler)(2007)的綜述，膠體與界面科學(xué)新見(currentopinionincolloid&interfacescience)，12:121-128。助水溶劑并不顯示一個臨界濃度，高于該濃度就會發(fā)生自聚集，如發(fā)現(xiàn)表面活性劑和脂質(zhì)形成膠束、薄層或其他很好地定義的中間相。很多助水溶劑反而示出一個連續(xù)型聚集過程，其中聚集的大小隨著濃度增加而增長。然而，很多助水溶劑改變了包含極性和非極性特征的物質(zhì)的系統(tǒng)(包括水、油、表面活性劑、以及聚合物的混合物)的相狀態(tài)、穩(wěn)定性、以及膠體特性。經(jīng)典地從制藥、個人護(hù)理、食品跨行業(yè)至技術(shù)應(yīng)用使用助水溶劑。助水溶劑在洗滌劑組合物中的使用允許例如更濃的表面活性劑配制品(如在通過除去水而壓縮液體洗滌劑的過程中)而不引起不希望的現(xiàn)象，例如相分離或高黏度。洗滌劑可以包含按重量計0％-5％，例如約0.5％至約5％、或約3％至約5％的助水溶劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何助水溶劑。助水溶劑的非限制性實例包括苯磺酸鈉、對甲苯磺酸鈉(sts)、二甲苯磺酸鈉(sxs)、枯烯磺酸鈉(scs)、傘花烴磺酸鈉、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羥基萘甲酸鈉、羥基萘磺酸鈉、乙基己基磺酸鈉、以及其組合。增效劑和助增效劑洗滌劑組合物可以包含按重量計約0％-65％，例如約5％至約50％的洗滌劑增效劑或助增效劑、或其混合物。在洗滌餐具洗滌劑中，增效劑的水平典型地是40％-65％，特別是50％-65％。增效劑劑和/或助增效劑可以具體是形成具有ca和mg的水溶性復(fù)合物的螫合劑?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何增效劑和/或助增效劑。增效劑的非限制性實例包括沸石、二磷酸鹽(焦磷酸鹽)、三磷酸鹽(如三磷酸鈉(stp或stpp))、碳酸鹽(如碳酸鈉)、可溶性硅酸鹽(如偏硅酸鈉)、層狀硅酸鹽(例如來自赫斯特公司(hoechst)的sks-6)、乙醇胺(如2-氨基乙-1-醇(mea)、亞胺基二乙醇(dea)和2,2’,2”-次氨基三乙醇(tea))、以及羧甲基菊粉(cmi)、以及其組合。洗滌劑組合物還可以包含按重量計0％-65％，例如約5％至約40％的洗滌劑助增效劑、或其混合物。洗滌劑組合物可以包括單獨的助增效劑、或者與一種增效劑(例如沸石增效劑)結(jié)合的助增效劑。助增效劑的非限制性實例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(paa)或共聚(丙烯酸/馬來酸)(paa/pma)。另外的非限制性實例包括檸檬酸鹽、螯合劑(如氨基羧酸鹽、氨基多羧酸鹽和膦酸鹽)、以及烷基-或鏈烯基琥珀酸。額外的特定實例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(nta)、乙二胺四乙酸(edta)、二亞乙基三胺五乙酸(dtpa)、亞氨二琥珀酸(ids)、乙二胺-n,n’-二琥珀酸(edds)、甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、谷氨酸-n,n-二乙酸(glda)、1-羥乙烷-1,1-二基雙(膦酸)(hedp)、乙二胺四(亞甲基)四(膦酸)(edtmpa)、二亞乙基三胺五(亞甲基)五(膦酸)(dtpmpa)、n-(2-羥乙基)亞氨基二乙酸(edg)、天冬氨酸-n-單乙酸(asma)、天冬氨酸-n,n-二乙酸(asda)、天冬氨酸-n-單丙酸(asmp)、亞氨二琥珀酸(ida)、n-(2-磺甲基)天冬氨酸(smas)、n-(2-磺乙基)天冬氨酸(seas)、n-(2-磺甲基)谷氨酸(smgl)、n-(2-磺乙基)谷氨酸(segl)、n-甲基亞氨基二乙酸(mida)、α-丙氨酸-n,n-二乙酸(α-alda)、絲氨酸-n,n-二乙酸(seda)、異絲氨酸-n,n-二乙酸(isda)、苯丙氨酸-n,n-二乙酸(phda)、鄰氨基苯甲酸-n,n-二乙酸(anda)、對氨基苯磺酸-n、n-二乙酸(slda)、氨基乙磺酸-n、n-二乙酸(tuda)和磺甲基-n,n-二乙酸(smda)、n-(羥乙基)-亞乙基二胺三乙酸鹽(hedta)、二乙醇甘氨酸(deg)、二亞乙基三胺五(亞甲基膦酸)(dtpmp)、氨基三(亞甲基膦酸)(atmp)、以及其組合和鹽。其他示例性增效劑和/或助增效劑描述于例如wo09/102854、us5977053中。漂白系統(tǒng)洗滌劑可以包含按重量計0％-10％，例如約1％至約5％的漂白系統(tǒng)?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何漂白系統(tǒng)。合適的漂白系統(tǒng)組分包括漂白催化劑、光漂白劑(photobleach)、漂白活化劑、過氧化氫源(例如過碳酸鈉和過硼酸鈉)、預(yù)成型過酸以及其混合物。適合的預(yù)成型過酸包括但不限于過氧羧酸和鹽、過碳酸和鹽、過白啶酸(perimidicacid)和鹽，過氧單硫酸和鹽(例如，過硫酸氫鉀(oxone(r)))、以及其混合物。漂白系統(tǒng)的非限制性實例包括基于過氧化物的漂白系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以包括例如一種與過酸形成的漂白活化劑組合的無機鹽，包括堿金屬鹽，例如過硼酸鹽(通常是單水合物或四水合物)、過碳酸鹽、過硫酸鹽、過磷酸鹽、過硅酸鹽的鈉鹽。漂白活化劑在此意指一種與過氧化物漂白劑(像過氧化氫)反應(yīng)以形成過酸的化合物。以此方式形成的過酸構(gòu)成活化的漂白劑。有待在此使用的適合漂白活化劑包括屬于酯酰胺、酰亞胺或酸酐類別的那些。適合的實例是四乙?；叶?taed)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸鈉、二過氧十二烷酸、4-(十二酰氧基)苯磺酸鹽(lobs)、4-(癸酰氧基)苯磺酸鹽、4-(癸酰氧基)苯甲酸鹽(dobs)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸鹽(isonobs)、四乙酰基乙二胺(taed)以及4-(壬酰氧基)苯磺酸鹽(nobs)、和/或wo98/17767中披露的那些。感興趣的漂白活化劑的具體家族披露于ep624154中，并且在該家族中特別優(yōu)選的是乙酰檸檬酸三乙酯(atc)。atc或短鏈甘油三酸酯(像特雷森(triacin))具有以下優(yōu)點，它是環(huán)境友好的，因為它最終降解為檸檬酸和醇。此外，乙酰檸檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在存儲時在產(chǎn)品中具有良好的水解穩(wěn)定性，并且它是一種有效的漂白活化劑。最后，atc為洗衣添加劑提供一種良好的增效能力?？商娲?，漂白系統(tǒng)可以包括例如酰胺、亞胺、或砜型的過氧酸。漂白系統(tǒng)還可以包括過酸，如6-(鄰苯二甲?；被?過己酸(pap)。漂白系統(tǒng)還可以包括漂白催化劑。在一些實施例中，漂白組分可以是選自下組的有機催化劑，該組由以下各項組成：具有下化學(xué)式的有機催化劑：(i)(ii)(iii)以及其混合物；其中每個r1獨立地是包含從9至24個碳的支鏈烷基或包含從11至24個碳的直鏈烷基，優(yōu)選每個r1獨立地是包含從9至18個碳的支鏈烷基或包含從11至18個碳的直鏈烷基，更優(yōu)選每個r1獨立地選自下組，該組由以下各項組成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、異-壬基、異-癸基、異-十三烷基以及異-十五烷基。其他示例性漂白系統(tǒng)描述于例如wo2007/087258、wo2007/087244、wo2007/087259、wo2007/087242中。合適的光漂白劑可以例如是磺化的酞菁鋅。聚合物洗滌劑可以包含按重量計0％-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在洗滌劑中使用的任何聚合物。聚合物可以作為如以上提到的助增效劑起作用，或可以提供抗再沉積、纖維保護(hù)、污物釋放、染料轉(zhuǎn)移抑制、油污清潔和/或抗發(fā)泡特性。一些聚合物可以具有多于一種的以上提到的特性和/或多于一種的以下提到的主旨。示例性聚合物包括(羧甲基)纖維素(cmc)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯吡咯烷酮)(pvp)、聚(乙二醇)或聚(環(huán)氧乙烷)(peg)、乙氧基化的聚(乙烯亞胺)、羧甲基菊糖(cmi)、以及聚羧化物(例如paa、paa/pma、聚-天冬氨酸、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)、疏水改性cmc(hm-cmc)和硅酮、對苯二甲酸與低聚乙二醇的共聚物、聚對苯二甲酸乙二酯與聚氧乙烯對苯二甲酸乙二酯的共聚物(pet-poet)、pvp、聚(乙烯基咪唑)(pvi)、聚(乙烯吡啶-n-氧化物)(pvpo或pvpno)、以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(pvpvi)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷(peo-ppo)以及乙氧基磺酸二季銨鹽。其他示例性聚合物披露于例如wo2006/130575中。也考慮了以上提到的聚合物的鹽?？椢镏珓┍景l(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括織物著色劑，例如當(dāng)配制在洗滌劑組合物中時，可以在織物與包含所述洗滌劑組合物的洗滌液體接觸時沉積在所述織物上從而通過可見光吸收/反射來改變所述織物色彩的染料或色素。熒光增白劑發(fā)射至少一些可見光。相比之下，因為它們吸收至少一部分可見光光譜，所以織物著色劑改變表面的色彩。合適的織物著色劑包括染料和染料-黏土軛合物，并且還可以包括色素。合適的染料包括小分子染料和聚合物染料。合適的小分子染料包括選自下組的小分子染料，該組由屬于顏色索引(colourindex)(c.i.)分類的以下染料組成：直接藍(lán)、直接紅、直接紫、酸性藍(lán)、酸性紅、酸性紫、堿性藍(lán)、堿性紫以及堿性紅、或其混合物，例如，如wo2005/03274、wo2005/03275、wo2005/03276以及ep1876226(它們通過引用結(jié)合在此)中所描述的。洗滌劑組合物優(yōu)選包括從約0.00003wt％至約0.2wt％、從約0.00008wt％至約0.05wt％、或甚至從約0.0001wt％至約0.04wt％的織物著色劑。該組合物可以包括從0.0001wt％至0.2wt％的織物著色劑，當(dāng)該組合物處于單位劑量袋的形式時，這可以是尤其優(yōu)選的。合適的著色劑還披露于例如wo2007/087257、wo2007/087243中。(額外的)酶在一個實施例中，將根據(jù)本發(fā)明的變體與一種或多種酶，例如至少兩種酶，更優(yōu)選是至少三種、四種或五種酶組合。優(yōu)選地，這些酶具有不同的底物特異性，例如蛋白質(zhì)分解活性、淀粉分解活性、脂質(zhì)分解活性、溶半纖維活性或溶果膠活性。洗滌劑添加劑以及洗滌劑組合物可以包括一種或多種額外的酶，例如碳水化合物活性酶，如碳水化物酶、果膠酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、或蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、氧化酶，例如漆酶、和/或過氧化物酶。一般說來，所選擇的一種或多種酶的特性應(yīng)與所選擇的清潔劑相容(即最佳ph，與其他酶和非酶成分的相容性等)，并且這一種或多種酶應(yīng)以有效量存在。纖維素酶：合適的纖維素酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾的或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、梭孢殼屬、枝頂孢霉屬的纖維素酶，例如，從在us4,435,307、us5,648,263、us5,691,178、us5,776,757以及wo89/09259中披露的特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉和尖鐮孢產(chǎn)生的真菌纖維素酶。特別合適的纖維素酶是具有顏色保護(hù)益處的堿性或中性纖維素酶。這類纖維素酶的實例為在ep0495257、ep0531372、wo96/11262、wo96/29397、wo98/08940中描述的纖維素酶。其他實例是纖維素酶變體，如在wo94/07998、ep0531315、us5,457,046、us5,686,593、us5,763,254、wo95/24471、wo98/12307以及pct/dk98/00299中描述的那些?？缮藤彨@得的纖維素酶包括celluzymetm和carezymetm(諾維信公司)、clazinasetm和puradaxhatm(杰能科國際有限公司)、以及kac-500(b)tm(花王株式會社(kaocorporation))。蛋白酶額外的酶可以是另一種蛋白酶或蛋白酶變體。蛋白酶可以是動物、植物或微生物來源的，包括化學(xué)或基因修飾的突變體。優(yōu)選微生物來源。它可以是堿性蛋白酶，如絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。絲氨酸蛋白酶可以例如是s1家族(如胰蛋白酶)或s8家族(如枯草桿菌蛋白酶)。金屬蛋白酶的蛋白酶可以例如是來自例如家族m4、m5、m7或m8的嗜熱菌蛋白酶。術(shù)語“枯草桿菌酶”是指根據(jù)斯艾森等人，蛋白質(zhì)工程4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白質(zhì)科學(xué)6(1997)501-523的絲氨酸蛋白酶子組。絲氨酸蛋白酶是特征為在活性位點具有絲氨酸的蛋白酶子組，它與底物一起形成共價加合物?？莶輻U菌酶可以劃分為6個亞部，即，枯草桿菌蛋白酶家族、嗜熱蛋白酶(thermitase)家族、蛋白酶k家族、羊毛疏抗生素肽酶家族、kexin家族和熱分解素(pyrolysin)家族。在本發(fā)明的一個方面，額外的蛋白酶可以是枯草桿菌酶，如枯草桿菌蛋白酶或其變體。枯草桿菌蛋白酶的實例是來源于芽孢桿菌的那些，如枯草桿菌蛋白酶lentus、芽孢桿菌lentus、枯草桿菌蛋白酶novo、枯草桿菌蛋白酶嘉士伯(carlsberg)、地衣芽孢桿菌、枯草桿菌蛋白酶bpn’、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147以及枯草桿菌蛋白酶168(描述于wo89/06279中)以及蛋白酶pd138(wo93/18140)。額外的絲氨酸蛋白酶實例描述于wo98/020115、wo01/44452、wo01/58275、wo01/58276、wo03/006602以及wo04/099401中?？莶輻U菌酶變體的其他實例可以是在任何以下位置上具有突變的那些：使用bpn’編號的3、4、9、15、27、36、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、217、218、222、232、235、236、245、248、252以及274。更優(yōu)選的枯草桿菌酶變體可以包括以下突變：s3t、v4i、s9r、a15t、k27r、*36d、v68a、n76d、n87s,r、*97e、a98s、s99g,d,a、s99ad、s101g,m,rs103a、v104i,y,n、s106a、g118v,r、h120d,n、n123s、s128l、p129q、s130a、g160d、y167a、r170s、a194p、g195e、v199m、v205i、l217d、n218d、m222s、a232v、k235l、q236h、q245r、n252k、t274a(使用bpn’編號)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例是胰蛋白酶(例如來自豬或牛的)以及如wo89/06270和wo94/25583中所述的鐮孢霉蛋白酶。有用的蛋白酶的實例是如wo92/19729、wo98/20115、wo98/20116、以及wo98/34946所描述的變體，特別是在一個或多個以下位置上具有取代的變體：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。金屬蛋白酶的實例是如wo07/044993(杰能科國際公司)所述的中性金屬蛋白酶。優(yōu)選的可商購獲得的蛋白酶包括alcalasetm、coronasetm、duralasetm、durazymtm、esperasetm、everlasetm、kannasetm、liquanasetm、liquanaseultratm、ovozymetm、polarzymetm、primasetm、relasetm、savinasetm和savinaseultratm(諾維信公司)、axapemtm(吉斯特-布羅卡德斯公司(gist-brocasesn.v.))、excellasetm、fn2tm、fn3tm、fn4tm、maxacatm、maxapemtm、maxatasetm、properasetm、purafasttm、purafecttm、purafectoxptm、purafectprimetm以及puramaxtm(杜邦/杰能科國際公司)。另一種優(yōu)選的蛋白酶是來自遲緩芽孢桿菌dsm5483的堿性蛋白酶(如在(例如)wo95/23221中所述)、以及其變體(在wo92/21760、wo95/23221、ep1921147以及ep1921148中描述的)。脂肪酶和角質(zhì)酶：合適的脂肪酶和角質(zhì)酶包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。實例包括來自嗜熱真菌屬(thermomyces)的脂肪酶，例如來自如在ep258068和ep305216中描述的疏棉狀嗜熱絲孢菌(t.lanuginosus)(之前命名為柔毛腐質(zhì)霉(humicolalanuginosa))；來自腐質(zhì)霉屬的角質(zhì)酶，例如在wo96/13580中描述的特異腐質(zhì)霉(h.insolens)；一種假單胞菌屬脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(p.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(p.pseudoalcaligenes)(ep218272)、洋蔥假單胞菌(p.cepacia)(ep331376)、斯氏假單胞菌(p.stutzeri)(gb1,372,034)、螢光假單胞菌(p.fluorescens)、假單胞菌屬菌株sd705(wo95/06720和wo96/27002)、威斯康星假單胞菌(p.wisconsinensis)(wo96/12012)；一種芽胞桿菌屬脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(達(dá)托斯(dartois)等人，1993，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(biochemicaetbiophysicaacta)，1131:253-360)、嗜熱脂肪芽桿菌(jp64/744992)或短小芽孢桿菌(wo91/16422)。其他實例是脂肪酶變體，例如wo92/05249、wo94/01541、ep407225、ep260105、wo95/35381、wo96/00292、wo95/30744、wo94/25578、wo95/14783、wo95/22615、wo97/04079、wo97/07202、wo00/060063、wo2007/087508以及wo2009/109500中描述的那些。優(yōu)選的可商購獲得的脂肪酶包括lipolasetm、lipolaseultratm、以及l(fā)ipextm；lecitasetm、lipolextm；lipocleantm、lipoprimetm(諾維信公司)。其他可商購獲得的脂肪酶包括lumafast(杜邦/杰能科國際公司)；lipomax(吉斯特-布羅卡德斯公司/杰能科國際公司)以及來自蘇威公司(solvay)的芽胞桿菌脂肪酶。淀粉酶：合適的淀粉酶(α和/或β)包括細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。淀粉酶包括例如從芽孢桿菌屬獲得的α淀粉酶，例如，在gb1,296,839中更詳細(xì)描述的地衣芽孢桿菌的特定菌株。有用的淀粉酶的實例是在wo94/02597、wo94/18314、wo96/23873、以及wo97/43424中描述的變體，尤其是在一個或多個以下位置上具有取代的變體：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、以及444。可商購獲得的淀粉酶為duramyltm、termamyltm、fungamyltm以及bantm(諾維信公司)、rapidasetm和purastartm(來自杜邦/杰能科國際有限公司)。過氧化物酶/氧化酶：合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物、細(xì)菌或真菌來源的那些。包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程改造的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬例如來自灰蓋鬼傘的過氧化物酶、以及其變體(如在wo93/24618、wo95/10602、以及wo98/15257中描述的那些)?？缮藤彨@得的過氧化物酶包括guardzymetm(諾維信公司)。這一種或多種洗滌劑酶可以通過添加包含一種或多種酶的獨立添加劑，或通過添加包含所有這些酶的組合添加劑而被包含于洗滌劑組合物中?？梢詫⑾礈靹┨砑觿┘椽毩⑻砑觿┗蚪M合添加劑配制為例如顆粒、液體、漿液等等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑配制品是顆粒(特別是無塵顆粒)、液體(特別是穩(wěn)定的液體)、或漿液。無塵顆?？梢岳缛缭趗s4,106,991和4,661,452中所披露地產(chǎn)生，并且可以可任選地通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行涂覆。蠟狀涂覆材料的實例為具有1000至20000的平均摩爾重量的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，peg)；具有從16至50個環(huán)氧乙烷單元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中該醇含有12至20個碳原子，并且其中具有15至80個環(huán)氧乙烷單元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油單酯、和甘油二酯、以及甘油三酯。適用于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜涂覆材料的實例在gb1483591中給出。液體酶制劑可以例如通過根據(jù)已確立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而穩(wěn)定化。受保護(hù)的酶可以根據(jù)ep238,216中披露的方法制備。輔料還可以利用本領(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何洗滌劑組分。其他任選的洗滌劑組分包括防腐劑、防縮劑、抗污物再沉積劑、抗皺劑、殺細(xì)菌劑、粘合劑、腐蝕抑制劑、崩解劑(disintegrant)/崩解劑(disintegrationagent)、染料、酶穩(wěn)定劑(包括硼酸、硼酸鹽、cmc、和/或多元醇如丙二醇)、織物整理劑(包括黏土)、填充劑/加工助劑、熒光劑增白劑/光增亮劑、泡沫促進(jìn)劑、泡沫(泡)調(diào)節(jié)劑、香料、污物助懸劑、軟化劑、抑泡劑、晦暗抑制劑、以及芯吸劑，單獨抑或組合使用?？梢岳帽绢I(lǐng)域中已知的用于在衣物洗滌劑中使用的任何成分。此類成分的選擇完全在普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。分散劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包含分散劑。具體地說，粉狀洗滌劑可以包括分散劑。合適的水溶性有機材料包括均聚合或共聚合的酸或其鹽，其中多羧酸包含至少兩個羧基，這兩個羧基被不超過兩個碳原子彼此分開。合適的分散劑例如描述于粉狀洗滌劑，表面活性劑科學(xué)系列(powdereddetergents,surfactantscienceseries)，第71卷中，馬塞爾·德克爾公司(marceldekker,inc.)。染料轉(zhuǎn)移抑制劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種染料轉(zhuǎn)移抑制劑。合適的聚合物染料轉(zhuǎn)移抑制劑包括但不限于聚乙烯吡咯酮聚合物、多胺n-氧化物聚合物、n-乙烯吡咯烷酮與n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。當(dāng)存在于主題組合物中時，染料轉(zhuǎn)移抑制劑可以按組合物重量計的以下水平存在：從約0.0001％至約10％、從約0.01％至約5％或甚至從約0.1％至約3％。熒光增白劑-本發(fā)明的洗滌劑組合物還將優(yōu)選地包含額外的組分,這些組分可以給正清潔的物品著色，例如熒光增白劑或光增亮劑。其中增亮劑優(yōu)選以約0.01％至約0.5％的水平存在。在本發(fā)明的組合物中可以使用適合用于在衣物洗滌劑組合物中使用的任何熒光增白劑。最常用的熒光增白劑是屬于以下類別的那些:二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-聯(lián)苯乙烯基衍生物。熒光增白劑的二氨芪-磺酸衍生物型的實例包括以下各項的鈉鹽：4,4'-雙-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(n-甲基-n-2-羥基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽，4,4'-雙-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸鹽；4,4'-雙-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羥基-乙氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸鹽和2-(二苯乙烯基-4"-萘-1.,2':4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸鹽。優(yōu)選的熒光增白劑是可從汽巴–嘉基股份有限公司(ciba-geigyag)(巴塞爾，瑞士)獲得的天來寶(tinopal)dms和天來寶cbs。天來寶cbs是4,4'-雙-(2-嗎啉代-4-苯氨基-s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯二磺酸鹽的二鈉鹽。天來寶cbs是2,2'-雙-(苯基-苯乙烯基)二磺酸鹽的二鈉鹽。還優(yōu)選的是，熒光增白劑是可商購獲得的parawhitekx，它由派拉蒙礦物和化學(xué)品公司(paramountmineralsandchemicals)(孟買，印度)供應(yīng)。適合用于本發(fā)明的其他熒光劑包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。合適的熒光增白劑水平包括從約0.01wt％、從0.05wt％、從約0.1wt％或甚至從約0.2wt％的較低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的較高水平。污物釋放聚合物-本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種污物釋放聚合物，這些污物釋放聚合物有助于從織物、例如棉或聚酯基織物上除去污物，特別是從聚酯基織物上除去疏水污物。污物釋放聚合物可以例如是非離子型或陰離子型對苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己內(nèi)酰胺和相關(guān)共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，參見例如粉狀洗滌劑，表面活性劑科學(xué)系列第71卷第7章，馬塞爾·德克爾公司。另一種類型的污物釋放聚合物是包含一個芯結(jié)構(gòu)和連接至該芯結(jié)構(gòu)的多個烷基化基團(tuán)的兩親性烷基化油污清潔聚合物。芯結(jié)構(gòu)可以包括聚烷基亞胺結(jié)構(gòu)或聚烷醇胺結(jié)構(gòu)，如wo2009/087523中詳細(xì)描述的(將其通過引用結(jié)合在此)。此外，任意接枝共聚物是合適的污物釋放聚合物。合適的接枝共聚物更詳細(xì)地描述于wo2007/138054、wo2006/108856以及wo2006/113314中(將其通過引用結(jié)合在此)。其他污物釋放聚合物是取代的多糖結(jié)構(gòu)，尤其是取代的纖維素結(jié)構(gòu)，例如改性纖維素衍生物，例如ep1867808或wo2003/040279中描述的那些(將二者都通過引用結(jié)合在此)。合適的纖維素聚合物包括纖維素、纖維素醚、纖維素酯、纖維素酰胺以及其混合物。合適的纖維素聚合物包括陰離子改性的纖維素、非離子改性的纖維素、陽離子改性的纖維素、兼性離子改性的纖維素、以及其混合物。合適的纖維素聚合物包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、酯羧甲基纖維素、以及其混合物?？乖俪恋韯?本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包括一種或多種抗再沉淀劑，例如羧甲基纖維素(cmc)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯酮(pvp)、聚環(huán)氧乙烷和/或聚乙二醇(peg)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸與馬來酸的共聚物、以及乙氧基化聚乙亞胺。以上在污物釋放聚合物下描述的纖維素基聚合物還可以用作抗再沉淀劑。其他合適的輔料包括但不局限于防縮劑、抗皺劑、殺細(xì)菌劑、粘合劑、載體、染料、酶穩(wěn)定劑、織物軟化劑、填充劑、泡沫調(diào)節(jié)劑、助水溶劑、香料、色素、抑泡劑、溶劑、用于液體清潔劑的結(jié)構(gòu)劑和/或結(jié)構(gòu)彈性劑。洗滌劑產(chǎn)品的配制本發(fā)明的洗滌劑組合物可以處于任何常規(guī)形式，例如棒、均勻的片劑、具有兩層或更多層的片劑、規(guī)則或壓縮的粉、顆粒、膏、凝膠、或規(guī)則壓縮或濃縮的液體。洗滌劑配制品形式：層(相同或不同的相)、袋、對比用于機器劑量單位的形式。袋可以被配置為單個或多個室。它可以具有適合保存該組合物的任何形式、形狀和材料，例如在與水接觸之前，不允許該組合物從袋中釋放出來。袋由封裝內(nèi)體積的水溶性膜制成。可以將所述內(nèi)體積分為袋的室。優(yōu)選的膜是形成膜或片的聚合材料，優(yōu)選是聚合物。優(yōu)選的聚合物、共聚物或其衍生物是選自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素、糊精鈉、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、麥芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最優(yōu)選地是聚乙烯醇共聚物以及羥丙基甲基纖維素(hpmc)。優(yōu)選地，聚合物(例如pva)在膜中的水平是至少約60％。優(yōu)選的平均分子量將典型地是約20,000至約150,000。膜還可以是共混物組合物，該共混物組合物包括水可降解且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在貿(mào)易參考m8630下，如由蓋里，印第安納州，美國(gary,ind.，us)的克里斯克拉夫特工業(yè)產(chǎn)品公司(chriscraftin.prod.)銷售)加增塑劑，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇以及其混合物。這些袋可以包括固體衣物清潔組合物或部分組分和/或液體清潔組合物或由水溶性膜分開的部分組分。用于液體組分的室在組成上可以與包含固體的室不同。參考文獻(xiàn)：(us2009/0011970a1)可以通過水可溶的袋中或不同片劑層中的室將洗滌劑成分彼此物理地分開。由此可以避免組分之間的不利的存儲相互作用。在洗滌溶液中，每個室的不同溶解特性曲線還可以引起選擇的組分的延遲溶解。這些形式的定義/特征：非單位劑量的液體或凝膠洗滌劑可以是水性的，典型地包含按重量計至少20％并且最高達(dá)95％的水，例如高達(dá)約70％的水、高達(dá)約65％的水、高達(dá)約55％的水、高達(dá)約45％的水、高達(dá)約35％的水。包括但不限于鏈烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他類型的液體可以被包含在水性液體或凝膠中。水性液體或凝膠洗滌劑可以包含從0％-30％的有機溶劑。液體或凝膠洗滌劑可以是非水性的。顆粒洗滌劑配制品可以如wo09/092699、ep1705241、ep1382668、wo07/001262、us6472364、wo04/074419或wo09/102854所述地，配制顆粒洗滌劑。其他有用的洗滌劑配制品描述于wo09/124162、wo09/124163、wo09/117340、wo09/117341、wo09/117342、wo09/072069、wo09/063355、wo09/132870、wo09/121757、wo09/112296、wo09/112298、wo09/103822、wo09/087033、wo09/050026、wo09/047125、wo09/047126、wo09/047127、wo09/047128、wo09/021784、wo09/010375、wo09/000605、wo09/122125、wo09/095645、wo09/040544、wo09/040545、wo09/024780、wo09/004295、wo09/004294、wo09/121725、wo09/115391、wo09/115392、wo09/074398、wo09/074403、wo09/068501、wo09/065770、wo09/021813、wo09/030632、以及wo09/015951。wo2011025615、wo2011016958、wo2011005803、wo2011005623、wo2011005730、wo2011005844、wo2011005904、wo2011005630、wo2011005830、wo2011005912、wo2011005905、wo2011005910、wo2011005813、wo2010135238、wo2010120863、wo2010108002、wo2010111365、wo2010108000、wo2010107635、wo2010090915、wo2010033976、wo2010033746、wo2010033747、wo2010033897、wo2010033979、wo2010030540、wo2010030541、wo2010030539、wo2010024467、wo2010024469、wo2010024470、wo2010025161、wo2010014395、wo2010044905、wo2010145887、wo2010142503、wo2010122051、wo2010102861、wo2010099997、wo2010084039、wo2010076292、wo2010069742、wo2010069718、wo2010069957、wo2010057784、wo2010054986、wo2010018043、wo2010003783、wo2010003792、wo2011023716、wo2010142539、wo2010118959、wo2010115813、wo2010105942、wo2010105961、wo2010105962、wo2010094356、wo2010084203、wo2010078979、wo2010072456、wo2010069905、wo2010076165、wo2010072603、wo2010066486、wo2010066631、wo2010066632、wo2010063689、wo2010060821、wo2010049187、wo2010031607、wo2010000636。方法和用途本發(fā)明還涉及用于在紡織品和織物的洗滌例如工業(yè)和機構(gòu)清潔、家用衣物洗滌以及工業(yè)衣物洗滌中使用其組合物的方法。本發(fā)明還涉及用于在硬表面清潔例如自動餐具洗滌(adw)、汽車洗滌以及工業(yè)表面清潔中使用其組合物的方法?？梢詫⒈景l(fā)明的蛋白酶變體添加到洗滌劑組合物中并且因此使其成為該洗滌劑組合物的組分。因此，本發(fā)明的一個方面涉及包含一種蛋白酶變體的洗滌劑組合物在清潔過程例如衣物洗滌和/或硬表面清潔中的用途，該蛋白酶變體在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體與seqidno2具有至少65％的一致性。另一個方面涉及包含一種變體的洗滌劑組合物的用途，該變體在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失并且在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的位置上進(jìn)一步包含一個或多個取代，其中該變體與seqidno:2具有至少65％且小于100％的序列一致性并且該變體具有蛋白酶活性。本發(fā)明的一個實施例涉及一種蛋白酶變體在如衣物洗滌和/或硬表面清潔的清潔過程中的用途，該蛋白酶變體在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)中包含一個或多個氨基酸的缺失，其中該變體與seqidno:2具有至少65％的一致性，并且其中該變體當(dāng)如“材料與方法”下所述地在amsa中測試時相對于親本或者相對于具有所述變體一致的氨基酸序列但是在一個或多個所述位置上不具有取代的蛋白酶親本具有增大的洗滌性能。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以配制為(例如)手洗或機洗洗衣洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理有污跡的織物的洗衣添加劑組合物和漂洗添加的織物軟化劑組合物，或者配制為用于一般家用硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或者配制用于手洗或機洗餐具洗滌操作。在一個特定方面，本發(fā)明提供了一種包含本發(fā)明的多肽的洗滌劑添加劑，如在此所述的。清潔過程或者紡織品保養(yǎng)過程可以例如是衣物洗滌過程、餐具洗滌過程或硬表面(如浴室磚、地板、桌面、排水管、水槽以及臉盆)清潔。衣物洗滌過程可以例如是家用洗滌，但是它也可以是工業(yè)洗滌。此外，本發(fā)明涉及一種用于洗滌織物和/或衣物的方法，其中該方法包括用包含一種洗滌劑組合物和至少一種本發(fā)明的蛋白酶變體的洗滌溶液處理織物。例如，可以在機器洗滌過程中或者在手動洗滌過程中進(jìn)行清潔過程或紡織品保養(yǎng)過程。洗滌溶液可以例如是含有洗滌劑組合物的水洗溶液。經(jīng)過洗滌、清潔的織物和/或衣物或者本發(fā)明的紡織品保養(yǎng)過程可以是常規(guī)的可洗滌衣物洗滌，例如家用洗滌。優(yōu)選地，衣物洗滌的主要部分是衣物和織物，包括針織品、編織物、斜紋粗棉布、非編織物、毛氈、紗線、以及毛布巾。這些織物可以是纖維素基的，如天然纖維素，包括棉布、亞麻、亞麻布、黃麻、苧麻、劍麻或椰殼纖維；或者人造纖維素(例如，來源于木漿)，包括纖維膠/人造絲、苧麻、醋酸纖維素纖維(三胞)、萊賽爾纖維(lyocell)或其共混物。這些織物還可以是非纖維素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、駱駝毛、羊絨、馬海毛、兔毛或絲；或者合成聚合物，如尼龍、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯彈性纖維(spandex)/彈性纖維；或其共混物以及纖維素基和非纖維素基纖維的共混物。共混物的例子是棉和/或人造絲/纖維膠與一種或幾種伴隨材料的共混物，該伴隨材料例如是羊毛、合成纖維(例如聚酰胺纖維、丙烯酸纖維、聚酯纖維、聚乙烯醇纖維、聚氯乙烯纖維、聚亞胺酯纖維、聚脲纖維、芳族聚酰胺纖維)以及含纖維素的纖維(例如人造絲/纖維膠、苧麻、亞麻、亞麻布、黃麻、醋酸纖維素纖維、萊賽爾纖維)。最近幾年，人們對替換洗滌劑中的組分的興趣逐漸增加，這源于用可再生生物組分如酶和多肽替換石油化學(xué)產(chǎn)品而不損害洗滌性能。當(dāng)洗滌劑組合物的組分改變新酶活性或者相比于常用洗滌劑酶(如蛋白酶)具有替代和/或改進(jìn)的特性的新酶時，需要脂肪酶和淀粉酶來實現(xiàn)與傳統(tǒng)洗滌劑組合物相比時相似或改進(jìn)的洗滌劑性能。本發(fā)明進(jìn)一步涉及本發(fā)明的蛋白酶變體在除去蛋白質(zhì)污物過程中的用途。蛋白質(zhì)污物可以是如以下的污物：食物污物(例如嬰兒食物、可可、雞蛋以及牛奶)或者體液污染(如血液和皮脂)或者其他污染(如油墨或草屑)或其組合。典型的洗滌劑組合物包含除酶之外的各種組分，這些組分具有不同的作用，一些組分像表面活性劑降低洗滌劑的表面張力，這允許正清潔的污物被提起和分散并隨后被洗滌出來，其他組分像漂白系統(tǒng)通常通過氧化除去顏色并且很多漂白劑還具有強殺菌特性，并且用于消毒和滅菌。其他組分像增效劑和螯合劑例如通過從液體中除去金屬離子來軟化洗滌水。在一個具體實施例中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的蛋白酶變體的一種組合物在衣物洗滌或餐具洗滌中的用途，其中所述酶組合物進(jìn)一步包含以下各項中的至少一種或多種：表面活性劑、增效劑、螯合劑(chelator)或螯合試劑(chelatingagent)、漂白系統(tǒng)或漂白組分。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，表面活性劑、增效劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)和/或漂白組分的量相比于在未添加本發(fā)明的蛋白酶變體情況下使用的表面活性劑、增效劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)和/或漂白組分的量有所減小。優(yōu)選地，是一種表面活性劑、增效劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)和/或漂白組分的該至少一種組分以以下量存在：比在不添加本發(fā)明的蛋白酶變體的情況下組分在系統(tǒng)中的量(例如，此組分的常規(guī)的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一個方面，將本發(fā)明的蛋白酶變體用于洗滌劑組合物中，其中所述組合物不含至少一種組分，該組分是一種表面活性劑、增效劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)或漂白組分和/或聚合物。洗滌方法本發(fā)明的洗滌劑組合物理想地適用于在洗衣應(yīng)用中使用。因此，本發(fā)明包括一種洗滌織物的方法。該方法包括將有待洗滌的織物與包含根據(jù)本發(fā)明的洗滌劑組合物的清潔洗衣溶液接觸的步驟。織物可以包括能夠在常規(guī)消費者使用條件下被洗滌的任何織物。該溶液優(yōu)選具有從約5.5至約11.5的ph?？稍谌芤褐幸砸韵聺舛仁褂媒M合物：從約100ppm、優(yōu)選500ppm至約15,000ppm。水溫的范圍典型地是從約5℃至約95℃，包括約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃以及約90℃。水與織物之比典型地是從約1:1至約30:1。在多個具體實施例中，在以下ph下執(zhí)行該洗滌方法：從約5.0至約11.5、或者從約6至約10.5、約5至約11、約5至約10、約5至約9、約5至約8、約5至約7、約5.5至約11、約5.5至約10、約5.5至約9、約5.5至約8、約5.5.至約7、約6至約11、約6至約10、約6至約9、約6至約8、約6至約7、約6.5至約11、約6.5至約10、約6.5至約9、約6.5至約8、約6.5至約7、約7至約11、約7至約10、約7至約9、或者約7至約8、約8至約11、約8至約10、約8至約9、約9至約11、約9至約10、約10至約11，優(yōu)選約5.5至約11.5。在多個具體實施例中，在以下硬度下執(zhí)行該洗滌方法：從約0°dh至約30°dh，例如約1°dh、約2°dh、約3°dh、約4°dh、約5°dh、約6°dh、約7°dh、約8°dh、約9°dh、約10°dh、約11°dh、約12°dh、約13°dh、約14°dh、約15°dh、約16°dh、約17°dh、約18°dh、約19°dh、約20°dh、約21°dh、約22°dh、約23°dh、約24°dh、約25°dh、約26°dh、約27°dh、約28°dh、約29°dh、約30°dh。在典型歐洲洗滌條件下，硬度是約16°dh，在典型美國洗滌條件下，是約6°dh，并且在典型亞洲洗滌條件下，是約3°dh。本發(fā)明涉及一種使用包含本發(fā)明的蛋白酶變體的洗滌劑組合物清潔織物、餐具或硬表面的方法。一個優(yōu)選的實施例涉及一種清潔方法，所述方法包括在適合于清潔物體的條件下將所述物體與包含本發(fā)明的蛋白酶變體的清潔組合物接觸的步驟。在一個優(yōu)選實施例中，該清潔組合物是一種洗滌劑組合物并且該過程是一個衣物洗滌或餐具洗滌過程。另一個實施例涉及一種用于從織物上除去污物的方法，該方法包括在適合于清潔所述物體的條件下將所述織物與包含本發(fā)明的蛋白酶的組合物接觸。在一個優(yōu)選實施例中，用于在以上方法中使用的組合物進(jìn)一步包含至少一種如以上“其他酶”部分列出的額外的酶，如選自下組的酶，該組由水解酶(如蛋白酶)、脂肪酶和角質(zhì)酶、糖水化合物酶(如淀粉酶)、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、以及果膠酶或其組合組成。在另一個優(yōu)選實施例中，用于在以上方法中使用的組合物包含減少的量的以下組分中的至少一種或多種：表面活性劑、增效劑、螯合劑或螯合試劑、漂白系統(tǒng)或漂白組分或聚合物。還考慮了使用一種或多種本發(fā)明的蛋白酶處理織物(例如，使紡織品脫漿)的組合物和方法。可以任何織物處理方法使用蛋白酶，這些方法在本領(lǐng)域是已熟知的(參見，例如，美國專利號6,077,316)。例如，在一個方面，通過一種方法改善織物的觸感和外觀，該方法包括將該織物與溶液中的蛋白酶接觸。在一個方面，在壓力下用該溶液處理該織物。在一個實施例中，在紡織品編織過程中或之后或者在脫漿階段或一個或多個額外織物加工步驟過程中應(yīng)用本發(fā)明的蛋白酶變體。在紡織品編織過程中，螺紋暴露于大量的機械應(yīng)變中。在機械織布機上進(jìn)行編織之前，為了提高拉伸強度并防止破裂，經(jīng)常在經(jīng)紗上涂上淀粉漿或淀粉衍生物?？梢圆捎玫鞍酌缸凅w來除去這些蛋白質(zhì)漿或蛋白質(zhì)衍生物。在編織完紡織品之后，織物可以進(jìn)行到脫漿階段。這之后可以是一個或多個額外的織物加工步驟。脫漿是從紡織品上除去漿料的作用。編織后，為了確保均勻和耐洗效果，應(yīng)在對織物進(jìn)行進(jìn)一步加工之前除去所涂的漿料。還提供了一種脫漿方法，該方法包括通過酶的作用酶促水解漿料。在此應(yīng)用中針對蛋白酶變體披露的所有問題、主題以及實施例還可應(yīng)用于在此所述的方法和用途。因此，明確參考對于也在此描述的這些方法和用途的所述披露。通過以下實例進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實例不應(yīng)當(dāng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。實例材料與方法常規(guī)分子生物學(xué)方法：除非另外提及，使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法(薩姆布魯克等人(1989)；奧蘇貝爾(ausubel)等人(1995)；哈伍德(harwood)和卡廷(cutting)(1990))進(jìn)行dna操縱和轉(zhuǎn)化。蛋白酶測定：1)suc-aapf-pna測定：pna底物：suc-aapf-pna(巴亨公司(bachem)l-1400)。溫度：室溫(25℃)測定緩沖液：100mm琥珀酸、100mmhepes、100mmches、100mmcabs、1mmcacl2、150mmkcl、0.01％曲拉通(triton)x-100，調(diào)節(jié)至ph值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、以及11.0，使用hcl或naoh。將20μl蛋白酶(在0.01％曲拉通x-100)與100μl測定緩沖液混合。通過添加100μlpna底物(將50mg溶解于1.0mldmso并進(jìn)一步用0.01％曲拉通x-100稀釋45x)開始測定。監(jiān)控od405的增加作為蛋白酶活性的測量。2)protazymeak測定：底物：protazymeak片劑(交聯(lián)和染色的酪蛋白；來自megazyme公司)溫度：37℃(或設(shè)定為其他測定溫度)。測定緩沖液：100mm琥珀酸、100mmhepes、100mmches、100mmcabs、1mmcacl2、150mmkcl、0.01％曲拉通x-100、ph6.5或ph7.0。通過輕微攪拌將protazymeak片劑懸浮于2.0ml0.01％曲拉通x-100中。在微量離心管中分配500μl的此懸浮液和500μl測定緩沖液，并將其放置在冰上。將20μl蛋白酶溶液(在0.01％曲拉通x-100中稀釋)添加到冰冷的混合物中。通過將該管轉(zhuǎn)移到37℃下的熱混合器中并以最高速度(1400rpm)進(jìn)行震蕩來開始測定。15分鐘后，將該管放回到冰浴中。為了除去未反應(yīng)的底物，在冰冷離心機上將混合物離心幾分鐘并且將200μl上清液轉(zhuǎn)移到微量滴定板上。測量上清液在650nm的吸光度。平行測定具有20μl0.01％曲拉通x-100而不是蛋白酶溶液的樣品，并且從蛋白酶樣品測量值中減去它的值。用于衣物洗滌的自動機械應(yīng)力測定(amsa)為了評定洗滌性能，在衣物洗滌中使用自動機械應(yīng)力測定(amsa)進(jìn)行洗滌實驗。使用amsa，可以檢査大量小體積酶洗滌劑溶液的洗滌性能。amsa板具有許多用于測試溶液的縫和蓋子，蓋子針對所有縫開口強力擠壓洗滌樣品(有待洗滌的紡織品)。在洗滌時間期間，板、測試溶液、織物和蓋子劇烈振動從而使測試溶液與織物接觸并以規(guī)則、周期性擺動方式應(yīng)用機械壓力。關(guān)于進(jìn)一步描述，參見wo02/42740，特別是第23-24頁的“特定方法實施例(specialmethodembodiments)”段落。在以下指定的實驗條件下進(jìn)行衣物洗滌實驗：標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑和測試材料如下：通過將cacl2、mgcl2、以及nahco3(ca2+:mg2+＝4:1:7.5)添加到測試系統(tǒng)中將水硬度調(diào)節(jié)至15°dh。在洗滌之后，將紡織品用自來水沖洗并干燥。將洗滌性能作為所洗滌紡織品顏色的亮度進(jìn)行測量。亮度也可以表達(dá)為當(dāng)用白光照亮?xí)r從樣品反射的光的強度。當(dāng)紡織品受到污染時，反射光的強度低于干凈紡織品的強度。因此，反射光的強度可以用于測量洗滌性能。使用專業(yè)平板掃描儀(kodakiqsmart(柯達(dá)(kodak))、midtager29、dk-2605(丹麥(denmark))進(jìn)行顏色測量，該掃描儀用于捕獲所洗滌紡織品的圖像。為了從掃描的圖像中提取光強度的值，將來自圖像的24-位像素值轉(zhuǎn)化為紅、綠以及藍(lán)(rgb)的值。可以通過將rgb值作為向量相加并隨后考慮所得向量的長度計算強度值(int)：實例1：蛋白酶變體的制備和測試變體的制備和表達(dá)突變和表達(dá)盒到枯草桿菌的引入。通過pcr(例如薩姆布魯克等人；分子克??；冷泉港實驗室出版社)進(jìn)行所有dna操縱并且可以由本領(lǐng)域每位技術(shù)人員重復(fù)。使用編碼枯草桿菌酶變體的重組枯草桿菌構(gòu)建體來接種含有富營養(yǎng)培養(yǎng)基(例如，ps-1:100g/l蔗糖(丹尼斯克目錄號109-0429)、40g/l大豆殼(大豆粉)、10g/lna2hpo4.12h2o(默克(merck)目錄號6579)、0.1ml/l普朗尼克(pluronic)pe6100(basf102-3098))的搖瓶中。典型地在30℃下在220rpm的振搖下進(jìn)行4天的培養(yǎng)。變體發(fā)酵可以通過本領(lǐng)域熟知的或如以下的方法進(jìn)行發(fā)酵。將具有相關(guān)表達(dá)質(zhì)粒的枯草桿菌菌株劃線接種在具有相關(guān)抗生素(6μg/ml氯霉素)的lb瓊脂板上，并在37℃下生長過夜。將菌落轉(zhuǎn)移到在500ml搖瓶中補充有相關(guān)抗生素的100mlps-1培養(yǎng)基上。通過在4500rpm下離心20-25分鐘從發(fā)酵液中除去細(xì)胞和其他未溶解的材料。然后，過濾出上清液以獲得澄清溶液。實例2：使用如“材料與方法”下描述的amsa方法在30℃的溫度下，測試在粉狀和液體標(biāo)準(zhǔn)洗滌劑中的蛋白酶變體以及來自發(fā)酵上清液的其相應(yīng)蛋白酶親本的洗滌性能。結(jié)果：蛋白酶變體以及其相應(yīng)蛋白酶親本(seqidno:2)對于兩種污物pc-03(在棉布/聚酯上的巧克力牛奶和煙灰)和pc-05(在棉布/聚酯上的血液、牛奶以及油墨)的相對洗滌性能示出在以下表2.1中。相對于bpn’(seqidno:2)的蛋白酶洗滌性能百分比。相對于bpn’y217l的蛋白酶洗滌性能百分比示出在表2.2中。以上兩表顯示所有研究的變體的洗滌性能都相對于bpn’(seqidno:2)增大。位置55、56或57的缺失顯著地且大幅度改進(jìn)洗滌性能。當(dāng)存在位置53或54的缺失時觀察到改進(jìn)的洗滌性能。此外，在環(huán)區(qū)域中的取代引起顯著改進(jìn)的洗滌性能。在與環(huán)中的缺失相鄰的位置上的取代引起稍微進(jìn)一步改進(jìn)的洗滌性能。在與具有seqidno:2的成熟多肽的位置53、54、55、56或57相對應(yīng)的環(huán)外包含額外的突變(例如，y217l)的測試變體顯示至少與其不具有額外突變的親本一樣良好的洗滌性能。實例3：通過使用以下標(biāo)準(zhǔn)化污物確定根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體的洗滌性能：a：在棉布上的巧克力牛奶和煙灰：產(chǎn)品號c-03可從cft(測試材料中心(centerfortestmaterials))b.v.，弗拉爾丁恩(vlaardingen)，荷蘭(netherlands)獲得，b：在棉布上的血液、牛奶、油墨：產(chǎn)品號c-05可從cft(測試材料中心)b.v.，弗拉爾丁恩，荷蘭獲得，c：在棉布/聚酯上的巧克力牛奶和煙灰：產(chǎn)品號pc-03可從cft(測試材料中心)b.v.，弗拉爾丁恩，荷蘭獲得，d：在棉布/聚酯上的血液、牛奶、油墨：產(chǎn)品號pc-05可從cft(測試材料中心)b.v.，弗拉爾丁恩，荷蘭獲得，e：棉布上的草屑：產(chǎn)品號164可從material-undprüfanstalt(empa)testmaterialienag[國家材料與測試機構(gòu)，測試材料(federalmaterialsandtestingagency,testmaterials)]，圣加侖州(st.gallen)，瑞士(switzerland)獲得。將具有以下組成的液體洗滌劑用作基本配制品(所有的值都以重量百分比計)：0.3％至0.5％黃原膠、0.2％至0.4％消泡劑、6％至7％甘油、0.3％至0.5％乙醇、4％至7％faeos(脂肪醇醚硫酸酯)、24％至28％非離子型表面活性劑、1％硼酸、1％至2％檸檬酸鈉(二水合物)、2％至4％蘇打、14％至16％椰子脂肪酸、0.5％hedp(1-羥基乙烷-(1,1-二磷酸))、0％至0.4％pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、0％至0.05％光增亮劑、0％至0.001％顏料、其余去離子水。基于此基本配制品，通過添加如表3.1和3.2所指示的對應(yīng)蛋白酶制備根據(jù)本發(fā)明的各種蛋白酶變體將bpn′變體bpn′y217l用作參考，該參考蛋白酶已顯示良好洗滌性能，尤其是在液體洗滌劑中。以基于總蛋白質(zhì)含量(5mg/l洗滌液體)的相同量添加蛋白酶。液體洗滌劑的劑量之比是4.7克/升洗滌液體，并且在20℃和40℃的溫度下進(jìn)行60分鐘洗滌程序，水具有15.5與16.5°(德國硬度)之間的水硬度。白度(即污物的增白)被光度測定地確定為洗滌性能的指示。使用美能達(dá)(minolta)cm508d分光儀裝置，該裝置事先使用提供有單位的白標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)。獲得的結(jié)果是使用根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體獲得的緩解單位(remissionunit)與使用含有參考蛋白酶的洗滌劑獲得的緩解單位之間的差值。因此，正值指示本發(fā)明的蛋白酶變體的改進(jìn)的洗滌性能。從表3.1(在40℃下的結(jié)果)和表3.2(在20℃下的結(jié)果)可看出，根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶變體顯示改進(jìn)的洗滌性能。表3.1：表3.2：蛋白酶變體/污物abcdev4i+s53g+t55s+n56*+p57a+y217l1.10.33.13.90.5p14t+s53g+t55s+n56*+p57a+y217l2.01.03.34.50.9t55s+n56*+p57a+y217l1.60.03.53.60.6s53g+t55s+n56*+p57a+i79t+y217l1.00.23.44.00.1s53g+t55s+n56*+p57a+v84i+y217l0.80.42.83.81.1s53g+t55s+n56*+p57a+p86h+a92s+y217l1.30.11.53.61.2s53g+t55s+n56*+p57a+a88v+y217l0.80.53.54.00.9s53g+t55s+n56*+p57a+a98t+y217l1.10.13.94.71.5s53g+t55s+n56*+p57a+n118r+y217l0.60.80.91.30.5h17y+s53g+t55s+n56*+p57a+y217l2.30.81.42.61.0s53g+t55s+n56*+p57a+g97d+y217l0.70.93.62.30.1s53g+t55s+n56*+p57a+s101n+y217l0.10.93.22.20.5s53g+t55s+n56*+p57a+g110a+y217l1.90.64.42.00.1在此描述并且要求的本發(fā)明不限于在此披露的特定方面的范圍，因為這些方面旨在作為本發(fā)明若干方面的說明。任何等效方面都旨在處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。實際上，除在此所示和描述的那些之外，本發(fā)明的不同修改對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說通過上述描述將變得清楚。這類修改也旨在屬于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下，以包括定義的本披露為準(zhǔn)。序列表<110>諾維信公司（novozymesa/s）維爾納，貝森馬特（werner，besenmatter）<120>枯草桿菌酶變體和編碼它們的多核苷酸<130>12099<160>2<170>patentin3.4版<210>1<211>1149<212>dna<213>解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)<400>1atgagaggcaaaaaagtatggatcagtttgctgtttgctttagcgttaatctttacgatg60gcgttcggcagcacatcctctgcccaggcggcagggaaatcaaacggggaaaagaaatat120attgtcgggtttaaacagacaatgagcacgatgagcgccgctaagaagaaagatgtcatt180tctgaaaaaggcgggaaagtgcaaaagcaattcaaatatgtagacgcagcttcagctaca240ttaaacgaaaaagctgtaaaagaattgaaaaaagacccgagcgtcgcttacgttgaagaa300gatcacgtagcacatgcgtacgcgcagtccgtgccttacggcgtatcacaaattaaagcc360cctgctctgcactctcaaggctacactggatcaaatgttaaagtagcggttatcgacagc420ggtatcgattcttctcatcctgatttaaaggtagcaggcggagccagcatggttccttct480gaaacaaatcctttccaagacaacaactctcacggaactcacgttgccggcacagttgcg540gctcttaataactcaatcggtgtattaggcgttgcgccaagcgcatcactttacgctgta600aaagttctcggtgctgacggttccggccaatacagctggatcattaacggaatcgagtgg660gcgatcgcaaacaatatggacgttattaacatgagcctcggcggaccttctggttctgct720gctttaaaagcggcagttgataaagccgttgcatccggcgtcgtagtcgttgcggcagcc780ggtaacgaaggcacttccggcagctcaagcacagtgggctaccctggtaaatacccttct840gtcattgcagtaggcgctgttgacagcagcaaccaaagagcatctttctcaagcgtagga900cctgagcttgatgtcatggcacctggcgtatctatccaaagcacgcttcctggaaacaaa960tacggggcgtacaacggtacgtcaatggcatctccgcacgttgccggagcggctgctttg1020attctttctaagcacccgaactggacaaacactcaagtccgcagcagtttagaaaacacc1080actacaaaacttggtgattctttctactatggaaaagggctgatcaacgtacaggcggca1140gctcagtaa1149<210>2<211>275<212>prt<213>解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)<400>2alaglnservalprotyrglyvalserglnilelysalaproalaleu151015hisserglnglytyrthrglyserasnvallysvalalavalileasp202530serglyileaspserserhisproaspleulysvalalaglyglyala354045sermetvalprosergluthrasnpropheglnaspasnasnserhis505560glythrhisvalalaglythrvalalaalaleuasnasnserilegly65707580valleuglyvalalaproseralaserleutyralavallysvalleu859095glyalaaspglyserglyglntyrsertrpileileasnglyileglu100105110trpalailealaasnasnmetaspvalileasnmetserleuglygly115120125proserglyseralaalaleulysalaalavalasplysalavalala130135140serglyvalvalvalvalalaalaalaglyasngluglythrsergly145150155160serserserthrvalglytyrproglylystyrproservalileala165170175valglyalavalaspserserasnglnargalaserpheserserval180185190glyprogluleuaspvalmetalaproglyvalserileglnserthr195200205leuproglyasnlystyrglyalatyrasnglythrsermetalaser210215220prohisvalalaglyalaalaalaleuileleuserlyshisproasn225230235240trpthrasnthrglnvalargserserleugluasnthrthrthrlys245250255leuglyaspserphetyrtyrglylysglyleuileasnvalglnala260265270alaalagln275當(dāng)前第1頁12