本申請是2013年2月1日提交的申請?zhí)枮?01380017835.1(國際申請?zhí)杙ct/us2013/024410)、發(fā)明名稱為“草甘膦抗性植物和相關(guān)方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。優(yōu)先權(quán)聲明本申請要求獲得于2012年2月1日提交的美國臨時(shí)專利申請系列號61/593,555的利益，還要求獲得于2012年4月17日提交的美國臨時(shí)專利申請系列號61/625,222的利益。根據(jù)37c.f.r.§1.821(c)或(e)-作為ascii文本文件提交的序列表的陳述根據(jù)37c.f.r.§1.821(c)或(e)，含有ascii文本格式的序列列表的文件已經(jīng)和本專利申請一起提交。本公開涉及植物生物技術(shù)。特定的實(shí)施方案涉及參與n-(膦?；谆?甘氨酸代謝的新多肽，和編碼這些多肽的核酸。特定的實(shí)施方案涉及包含前述多肽和/或核酸的植物、植物部分、和植物細(xì)胞。背景各種雜草很長時(shí)間以來都是耕地面臨的難題。盡管雜草控制可能是勞動(dòng)力密集型的操作，但是高效的殺雜草化學(xué)除草劑的獲得已經(jīng)使它變得更加容易。除草劑的廣泛使用，加上作物品種和肥料的改良，對農(nóng)業(yè)的“綠色革命”做出了顯著貢獻(xiàn)。特別有用的除草劑是具有廣譜除草活性的除草劑。不幸的是，廣譜除草劑通常會(huì)對暴露于該除草劑的作物植株造成有害影響?？朔@個(gè)問題的一個(gè)方法是產(chǎn)生能夠耐受廣譜除草劑的作物。廣譜除草劑的一個(gè)實(shí)例是n-膦酰甲基甘氨酸，也稱為草甘膦。草甘膦已經(jīng)被全世界的農(nóng)民廣泛應(yīng)用于在作物種植之前，例如在免耕種植(no-tillfarming)中，控制雜草。此外，草甘膦是一種用于在生長周期之間或作物輪作中控制雜草和自生植物(volunteerplant)的高效手段。草甘膦在使用后不會(huì)在土壤中遺留(carry-over)，因此被認(rèn)為是可用于農(nóng)業(yè)的環(huán)境安全性最高的、廣泛有效的化學(xué)除草劑之一。草甘膦通過抑制莽草酸途徑殺死植物。這個(gè)途徑導(dǎo)向芳族化合物(包括氨基酸、維生素和植物激素)的生物合成。草甘膦通過結(jié)合并抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(通常被稱作“epsp合成酶”和“epsps”)的活性，阻斷磷酸烯醇式丙酮酸(pep)與3-磷代莽草酸縮合形成5-烯醇式丙酮酰-3-磷代莽草酸。不幸的是，已知沒有作物可以天然耐受草甘膦，因此，這種除草劑在栽培作物中控制雜草的用途受到了限制。一種產(chǎn)生耐草甘膦作物的方法是，使用基因工程技術(shù)將編碼異源草甘膦耐受形式的epsps的基因?qū)氲阶魑镏小＠没瘜W(xué)誘變，已經(jīng)在細(xì)菌中產(chǎn)生了草甘膦耐受形式的epsps，并將該異源基因?qū)氲搅酥参矬w內(nèi)，產(chǎn)生了草甘膦耐受性植物。參見，例如comaietal.(1983)science221:370-71?？稍谧魑镏羞^表達(dá)異源epsps基因以獲得期望的耐受水平。前述關(guān)于相關(guān)技術(shù)及其相關(guān)局限性的實(shí)例只是說明性的，而不是排它性的。通過閱讀本說明書，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易想到相關(guān)技術(shù)的其它局限性。發(fā)明公開本文描述了與seqidno:1具有至少90％同一性的分離多肽，和編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽的核酸(例如seqidnos:2-4)。還描述了含有與seqidno:1具有至少90％同一性的異源多肽的植物、植物部分、植物器官、植物種子和植物細(xì)胞。一些實(shí)施方案包括植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞，其包含編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽異源核酸。在特定的實(shí)例中，該異源核酸包含與seqidno:2或seqidno:3具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列。一些實(shí)施方案包括植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞，其包含在高嚴(yán)格條件下與具有seqidno:2或seqidno:3的另一核酸雜交的異源核酸。在特定的實(shí)例中，包含在高嚴(yán)格條件下與具有seqidno:2或seqidno:3的另一核酸雜交的異源核酸的植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞包含由該異源核酸編碼的多肽，該多肽賦予該植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞草甘膦耐受性(或者增加草甘膦耐受性)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本公開涉及用于產(chǎn)生抗草甘膦的植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞的的方法，包括：用編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽的核酸轉(zhuǎn)化植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞；和表達(dá)該核酸，從而產(chǎn)生與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽。其他實(shí)施方案包括這樣的載體，其包含編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽的核酸。特定的實(shí)例包括這樣的載體，其包括編碼與seqidno:1具有至少95％同一性的多肽的核酸。例如，載體可包含與seqidno:2或seqidno:3具有至少90％同一性的核酸序列。特定的實(shí)施方案包括草甘膦耐受性植物和植物細(xì)胞，其表達(dá)與seqidno:1具有至少90％同一性的異源多肽。其他實(shí)施方案包括用于在含有抗除草劑植物的田地或耕種區(qū)內(nèi)控制雜草的方法，其中該方法可以包括：在田地或耕種區(qū)內(nèi)種植含有編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的異源多肽的核酸的植物或植物種子；和向該田地或耕種區(qū)施用足以控制田中的雜草、而不會(huì)顯著影響該植物的量的草甘膦。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及可再生的細(xì)胞，用于抗草甘膦植物的組織培養(yǎng)。這種組織培養(yǎng)物可以能夠再生出具有前述的抗草甘膦植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的植物，還能夠再生出與抗草甘膦植物具有基本上相同的基因型的植物。這樣組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可以是，例如，胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、花、種子、莢果、和莖。特定的實(shí)施方案涉及從根據(jù)前述的組織培養(yǎng)物再生的植物。在一些實(shí)施方案中，本公開涉及不能再生產(chǎn)生植物的細(xì)胞，例如用于產(chǎn)生耐受草甘膦的植物細(xì)胞系。在其它實(shí)施方案中，本公開涉及部分地包含這些細(xì)胞的植物。在某些實(shí)施方案中，本公開涉及向耕種區(qū)域內(nèi)種植的作物施用多種除草劑。在多種除草劑的基礎(chǔ)上附加過頂施用(overthetopapplication)草甘膦，可以對除草劑的不同性質(zhì)加以利用，從而提供將更好的靈活性與經(jīng)濟(jì)性相結(jié)合的雜草控制。例如，各種除草劑可能在耕種區(qū)域內(nèi)具有不同的耐久性；即某些除草劑在施用到該區(qū)域后可能持續(xù)存在并在相對長的時(shí)間內(nèi)有效，而其它除草劑可能會(huì)被快速降解成其它的和/或無活性的化合物。根據(jù)特定的實(shí)施方案，改良的除草劑施用系統(tǒng)允許使用草甘膦和多種除草劑，從而種植者能夠根據(jù)具體的使用情況調(diào)整具體除草劑的選擇。在其他實(shí)施方案中，本公開涉及用于制作和使用耐受多于一種除草劑或除草劑類型或亞型的植物的方法和組合物，如下文所述。在特定的實(shí)施方案中，提供了同時(shí)耐受草甘膦和至少一種其它除草劑(或除草劑類型或亞型)或化學(xué)品(或化學(xué)類型或亞型)(例如殺真菌劑、殺蟲劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等)的植物。這類植物可以用于，例如，包括用多種除草劑處理作物的方法。因此，本公開提供了除草劑抗性植物，其耐受用除草劑或除草劑組合(包括各自通過不同的除草活性模式發(fā)揮作用的除草劑的組合)的處理，或者耐受用至少一種除草劑和至少一種其它化學(xué)品的組合的處理。通過這種方式，本公開描述了用于種植作物的改良方法，其中選擇性地控制雜草。根據(jù)一些實(shí)施方案的除草劑抗性植物可以包括編碼可賦予草甘膦耐受性的異源多肽的核酸分子，和編碼賦予2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)耐受性的多肽的核酸分子。根據(jù)前面的段落，提供至少包括第三核酸分子的植物，該第三核酸分子編碼賦予植物從下組選出的一種性狀的多肽：除草劑耐受性性狀；昆蟲抗性性狀；農(nóng)藝學(xué)性狀；疾病抗性性狀；修飾的脂肪酸性狀；和植酸降低的性狀。在一些實(shí)例中，除草劑抗性的植物包含編碼賦予草甘膦耐受性的多肽的異源核酸分子，和編碼賦予草胺膦耐受性的多肽的核酸分子。一些實(shí)例包括這樣的除草劑抗性植物，它們包含編碼賦予植物選自下組的性狀的多肽的核酸分子：除草劑耐受性性狀；昆蟲抗性性狀；農(nóng)藝性狀；抗病性性狀；修飾的脂肪酸性狀；和植酸降低的性狀。在特定的實(shí)例中，除草劑抗性植物包括編碼賦予草甘膦耐受性的多肽的異源核酸分子，和編碼賦予對抑制乙酰乳酸合酶(als)((leeetal.(1988)emboj.7:1241)，也稱乙酰羥酸合成酶(ahas)(mikietal.(1990)theor.appl.genet.80:449))的除草劑的耐受性的多肽的核酸分子。一些實(shí)例包括這樣的除草劑抗性植物，它們包含編碼賦予植物選自下組的性狀的多肽的核酸分子：除草劑耐受性性狀；昆蟲抗性性狀；農(nóng)藝性狀；抗病性性狀；修飾的脂肪酸性狀；和植酸降低的性狀。在一些實(shí)施方案中，一種核酸可以在植物中與任何其他的核酸分子組合(或“疊加”)，以便，例如但不限于，提供額外的對草甘膦或其它除草劑的抗性或耐受性，提供對選定的昆蟲或疾病的抗性，或提供營養(yǎng)強(qiáng)化，提供改良的農(nóng)藝學(xué)性狀，和提供可用于飼料、食品、工業(yè)用途、醫(yī)藥用途、和/或其它用途的蛋白或其它有用產(chǎn)品。實(shí)例包括在植物基因組內(nèi)疊加兩種或更多種感興趣的核酸。這種“基因疊加”可以通過使用兩個(gè)或多個(gè)事件的常規(guī)植物育種、用含有感興趣的序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物、轉(zhuǎn)基因植物的再轉(zhuǎn)化、或通過同源重組介導(dǎo)的靶向整合添加新的性狀來加以實(shí)現(xiàn)。這種疊加的具體實(shí)例包括如下的任意組合：dgt-28核酸；cry34ab1核酸；cry35ab1核酸；cry1f核酸；cry1ac核酸；aad-12核酸；aad-1核酸；pat核酸；和dsm-2核酸。具體地，本公開提供以下各項(xiàng)：1.一種分離的核酸分子，其選自下組：包含與seqidno:2或seqidno:3的核苷酸序列有至少80％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子；編碼與seqidno:1的氨基酸序列有至少90％序列同一性的多肽的核酸分子；和包含在高嚴(yán)格度條件下與具有seqidno:2或seqidno:3的核苷酸序列的另一核酸雜交的核苷酸序列的異源核酸。2.項(xiàng)1的核酸分子，其中該核酸包含已被設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的人造序列。3.一種載體，其包含項(xiàng)1的核酸分子。4.項(xiàng)3的載體，還包含編碼異源多肽的核酸。5.項(xiàng)3的載體，其中所述核酸與啟動(dòng)子可操作連接。6.一種宿主細(xì)胞，其含有項(xiàng)1的核酸分子作為與啟動(dòng)子可操作連接的異源核酸。7.項(xiàng)5的載體，其中所述該啟動(dòng)子是atubi10啟動(dòng)子。8.項(xiàng)6的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。9.一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、植物器官、植物種子或植物細(xì)胞，其包含項(xiàng)1的核酸。10.項(xiàng)9的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、植物器官、植物種子或植物細(xì)胞，其中與相同物種的野生型植物相比，該植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞對草甘膦耐受。11.項(xiàng)9的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、植物器官、植物種子或植物細(xì)胞，其中該核酸不編碼lgnaat(seqidno:141)，并且不編碼allmxaplt，其中x選自丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸(seqidno:142)。12.項(xiàng)9的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞，其中該核酸編碼與seqidno:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽，當(dāng)將該多肽與seqidno:1對齊時(shí)，該多肽在對應(yīng)于seqidno:1的84位的位置處包含丙氨酸，和/或在對應(yīng)于seqidno:1的172位的位置處包含蘇氨酸。13.從項(xiàng)9的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、植物器官、植物種子和/或植物細(xì)胞產(chǎn)生的可再生細(xì)胞的組織培養(yǎng)物。14.從項(xiàng)9的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、植物器官、植物種子或植物細(xì)胞產(chǎn)生的原生質(zhì)體。15.項(xiàng)13的組織培養(yǎng)物，其中所述可再生細(xì)胞是從選自下組的組織類型產(chǎn)生的：葉、花粉、胚、子葉、下胚軸、分生細(xì)胞、根、根尖、花藥、花、莖和莢。16.一種從項(xiàng)13的組織培養(yǎng)物再生的植物，其中該植物對草甘膦是抗性的。17.項(xiàng)9的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分、植物器官、植物種子或植物細(xì)胞，其中基因組包含與seqidno:2或seqidno:3具有至少95％序列同一性的核酸分子。18.一種產(chǎn)生抗草甘膦的植物、植物部分、植物器官、植物種子或植物細(xì)胞的方法，該方法包括：用項(xiàng)1的核酸分子轉(zhuǎn)化植物、植物部分、植物器官、植物種子或植物細(xì)胞；和表達(dá)與seqidno:1具有至少90％序列同一性的多肽。19.根據(jù)項(xiàng)18的方法，其中被轉(zhuǎn)化的植物、植物部分、植物器官、植物種子或植物細(xì)胞對草甘膦是抗性的。20.根據(jù)項(xiàng)18的方法，其中該多肽不包含lgnaat(seqidno:141)，和/或不包含allmxaplt，其中x選自丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸(seqidno:142)。21.根據(jù)項(xiàng)18的方法，其中當(dāng)將該多肽與seqidno:1對齊時(shí)，該多肽在對應(yīng)于seqidno:1的84位的位置處包含丙氨酸，和/或在對應(yīng)于seqidno:1的172位的位置處包含蘇氨酸。22.根據(jù)項(xiàng)18的方法，其中所述核酸分子與seqidno:2或seqidno:3具有至少95％序列同一性。23.根據(jù)項(xiàng)18的方法，其中所述核酸分子包含seqidno:2或seqidno:3。24.一種用于在含有抗除草劑植物的耕種區(qū)內(nèi)控制雜草的方法，該方法包括：在耕種區(qū)內(nèi)種植包含項(xiàng)1的核酸分子的植物或植物種子；和向耕種區(qū)施用足以控制該耕種區(qū)中的雜草、而不顯著影響該植物或植物種子的量的除草劑。25.根據(jù)項(xiàng)24的方法，其中所述除草劑是草甘膦。26.根據(jù)項(xiàng)24的方法，其中所述包含項(xiàng)1的核酸分子的植物或植物種子包含編碼異源多肽的第二核酸。27.根據(jù)項(xiàng)24的方法，其中該第二核酸包含aad-1或aad-12。28.一種在植物中賦予對除草劑的抗性的方法，該方法包括：用dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述構(gòu)建體包含與項(xiàng)1的核酸分子可操作連接的啟動(dòng)子；再生轉(zhuǎn)化的植物；和表達(dá)所述核酸分子從而產(chǎn)生與seqidno:1具有至少90％序列同一性的多肽。29.根據(jù)項(xiàng)28的方法，其中所述除草劑是草甘膦。30.根據(jù)項(xiàng)28的方法，其中所述dna構(gòu)建體包含編碼在所述植物中能夠表達(dá)的異源多肽的第二核酸分子。31.根據(jù)項(xiàng)30的方法，其中所述異源多肽包括aad-1或aad-12。32.一種植物，其基因組中穩(wěn)定整合了項(xiàng)1的核酸作為異源核酸，其中該核酸與啟動(dòng)子可操作連接。33.項(xiàng)32的植物，其中該植物是大豆植物。34.項(xiàng)32的植物，其中該植物是玉米植物。35.項(xiàng)32的植物，其中該植物選自下組：小麥、玉米、大豆、煙草、臂形草、水稻、黍、大麥、番茄、蘋果、梨、草莓、橘子、苜蓿、棉花、胡蘿卜、馬鈴薯、甜菜、山藥、萵苣、菠菜、矮牽牛、玫瑰、菊花、草坪草、松樹、冷杉、云杉、重金屬積累植物、向日葵、紅花、油菜和擬南芥屬(arabidopsis)。36.項(xiàng)32的植物，其中該植物是選自下列屬中的種：天門冬屬(asparagus)、燕麥屬(avena)、臂形草屬(brachiaria)、蕓苔屬(brassica)、柑橘屬(citrus)、西瓜屬(citrullus)、辣椒屬(capsicum)、南瓜屬(cucurbita)、胡蘿卜屬(daucus)、飛蓬屬(erigeron)、大豆屬(glycine)、棉屬(gossypium)、大麥屬(hordeum)、向日葵屬(helianthus)、萵苣屬(lactuca)、黑麥草屬(lolium)、番茄屬(lycopersicon)、蘋果屬(malus)、木薯屬(manihot)、煙草屬(nicotiana)、諸葛菜屬(orychophragmus)、稻屬(oryza)、鱷梨屬(persea)、菜豆屬(phaseolus)、豌豆屬(pisum)、梨屬(pyrus)、李屬(prunus)、蘿卜屬(raphanus)、黑麥屬(secale)、茄屬(solanum)、高粱屬(sorghum)、小麥屬(triticum)、葡萄屬(vitis)、豇豆屬(vigna)和玉米屬(zea)。37.項(xiàng)8的宿主細(xì)胞，其中該植物細(xì)胞不可再生而產(chǎn)生植物。38.項(xiàng)9的植物細(xì)胞，其中該植物細(xì)胞不可再生而產(chǎn)生植物。39.項(xiàng)18的方法，其中不可再生而產(chǎn)生植物的植物細(xì)胞被轉(zhuǎn)化。除了上述示例性方面和實(shí)施方案之外，進(jìn)一步的方面和實(shí)施方案通過研究下面的描述將易于想到。附圖簡述圖1包括示例epsp合酶(即，dgt-28、dgt-32、dgt-33及其它)的部分序列比對。這3種示例dgt酶都在aroaepsp合酶氨基酸位置96處具有一個(gè)保守的丙氨酸。該氨基酸的位置用星號指示，且該氨基酸被下劃線標(biāo)出。圖2包括示例dgt酶(即，dgt-1、dgt-3和dgt-7)的比對結(jié)果。第一個(gè)星號指示了從甘氨酸變成丙氨酸的突變氨基酸殘基的位置。第二個(gè)星號指示了從蘇氨酸變成異亮氨酸的第二個(gè)突變氨基酸殘基的位置。第三個(gè)星號指示了從脯氨酸變成絲氨酸的第三個(gè)突變氨基酸殘基的位置。圖3-30包括各種示例質(zhì)粒的圖譜：pdab107527(圖3)；pdab105530(圖4)；pdab105531(圖5)；pdab105532(圖6)；pdab105533(圖7)；pdab105534(圖8)；pdab4104(圖9)；pdab102715(圖10)；pdab107532(圖11)；pdab107534(圖12)；pdab102785(圖13)；pdab100445(圖14)；pdab102946(圖15)；pdab100469(圖16)；pdab102028(圖17)；pdab102029(圖18)；pdab102032(圖19)；pdab102034(圖20)；pdab100429(圖21)；pdab100442(圖22)；pdab100430(圖23)；pdab102036(圖24)；pdab102038(圖25)；pdab102040(圖26)；pdab102042(圖27)；pdab107712(圖28)；pdab107713(圖29)；和pdab107714(圖30)。圖31包括在dgt-1(a)和dgt-7(b)中導(dǎo)入不同突變后用1mmpep獲得的ic50值。對于圖31(a)和圖31(b)的ic50曲線，實(shí)心三角形代表野生型，實(shí)心圓形代表ga突變體，空心方形代表gaps突變體，實(shí)心方形代表tips突變體。圖32-46包括各種示例質(zhì)粒的圖譜：pdab102719(圖32)；pdab102718(圖33)；pdab107663(圖34)；pdab107664(圖35)；pdab107665(圖36)；pdab107666(圖37)；pdab109812(圖38)；pdab101556(圖39)；pdab107698(圖40)；pdab108384(圖41)；pdab108385(圖42)；pdab108386(圖43)；pdab108387(圖44)；pdab102716(圖45)；pdab102717(圖46)。圖47-54包括各種示例質(zhì)粒的圖譜：pdab110828(圖47)；pdab110827(圖48)；pdab107545(圖49)；pdab107548(圖50)；pdab107553(圖51)；pdab102792(圖52)；pdab107602(圖53)；和pdab107533(圖54)。實(shí)施本發(fā)明的模式i.概覽本文公開了參與n-(膦?；谆?甘氨酸代謝的新多肽，和編碼這些多肽的核酸。在一些實(shí)例中，在異源表達(dá)這些多肽的植物細(xì)胞中這些多肽賦予(或提高)對草甘膦的耐受性，而例如不會(huì)對epsp合酶與其天然底物磷酸烯醇式丙酮酸(pep)的結(jié)合造成不良影響。ii.術(shù)語為了進(jìn)一步闡明本公開的范圍，提供了下列具體的定義、術(shù)語和縮寫。除非特別定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所普遍理解的相同的含義。除非它出現(xiàn)的上下文中另有明確指示，否則單數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)形式，復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解為包括單數(shù)形式。因此，不定冠詞“一個(gè)/種”和“該”當(dāng)在要素或組分的前面使用時(shí)對該元件或組分的實(shí)例(即出現(xiàn))數(shù)目沒有限定作用。當(dāng)在本文中提供數(shù)值的范圍時(shí)(例如，“小于大約x”，“小于x”和“例如，x1...和x2”)，該范圍應(yīng)當(dāng)理解為包括所提供范圍內(nèi)包含的所有數(shù)值和數(shù)值范圍，就如同這些所包含的數(shù)值和范圍被明確地列舉一樣。如本文中所使用的，術(shù)語“包括”，“包含”，“具有”和“含有”及其變化形式，是開放式的(即，非排他的)。例如，包含一系列要素的組合物或方法，不必僅限于那些要素。這樣的組合物或方法可以(或者可以不)包括其他未明確列出的或該組合物或方法固有的要素。此外，除非明確相反地說明，否則“或”的使用表示包含的(不是排他的)意義。例如，條件“a或b”可由下列的任一種滿足：a真(或存在)且b假(或不存在)；-a假(或不存在)且b真(或存在)；-a和b都真(或存在)。植物：如本文所使用的，術(shù)語“植物”包括整個(gè)植物及植物的任何后代、細(xì)胞、組織、或部分。術(shù)語“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：種子(包括成熟種子和未成熟種子)；植物插條；植物細(xì)胞；植物細(xì)胞培養(yǎng)物；植物器官(如花粉、胚、花、果實(shí)、芽(shoot)、葉、根、莖、和外植體)。植物組織或植物器官可以是種子、原生質(zhì)體、愈傷組織、或者任何其他被組織成一定結(jié)構(gòu)或功能單元的植物細(xì)胞群。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物可能能夠再生出具有該細(xì)胞或組織所來源的植物的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特征的植物，并且可能能夠再生出與該植物具有基本上相同的基因型的植物。與之相反，一些植物細(xì)胞不能夠再生產(chǎn)生植物。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可以是胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖、須、花、果仁、穗、穗軸、殼、或莖。植物部分包括可收獲的部分和可用于繁殖后代植物的部分?？捎糜诜敝车闹参锊糠职?，例如但不限于：種子；果實(shí)；插條；苗；塊莖；和根砧木。植物的可收獲部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；塊莖；葉；莖；果實(shí)；種子；和根。植物細(xì)胞是植物的結(jié)構(gòu)和生理的單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。植物細(xì)胞可以是分離的單細(xì)胞或細(xì)胞聚集體的形式(例如，松散型(friable)愈傷組織和培養(yǎng)細(xì)胞)，并且可以是更高級有組織單元的一部分(例如，植物組織、植物器官、和植物)。因此，植物細(xì)胞可以是原生質(zhì)體、配子產(chǎn)生細(xì)胞、或可以再生成完整植物的細(xì)胞或細(xì)胞集合。因此，包括多個(gè)植物細(xì)胞并能夠再生為完整植物的種子，在本文的實(shí)施方案中被認(rèn)為是一個(gè)“植物細(xì)胞”。除草劑抗性/耐受性：當(dāng)指稱抗草甘膦或耐受草甘膦的植物時(shí)，它意味著對該植物施用一定量的草甘膦不會(huì)顯著影響或殺死植物，而相同物種的野生型植物將由于該一定量的草甘膦的施用而受到顯著影響和/或被殺死。植物可能天然耐受特定的除草劑，或者植物可能作為遺傳工程的結(jié)果而被賦予除草劑耐受性，所述遺傳工程例如選擇性育種、遺傳轉(zhuǎn)化、和/或在植物基因組中導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因?！安莞熟⒖剐灾参铩笔侵负腥缦露嚯幕蚝怂岱肿拥闹参?，其中當(dāng)將該多肽或核酸分子提供給表達(dá)它的異源植物或其他生物時(shí)，它賦予除草劑耐受性(即，使植物或其它生物對除草劑耐受)。對草甘膦抗性或耐受性植物施用草甘膦，植物可能會(huì)顯示受到施用的某些微小的影響。例如，植物的正常生長和發(fā)育可能會(huì)發(fā)生改變，其中植物可會(huì)顯示與脅迫或疾病相關(guān)的征象或癥狀。對草甘膦抗性或耐受性植物施用草甘膦造成的這種微小影響，與對草甘膦敏感植物施用草甘膦造成的有害影響形成對照。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以區(qū)分出草甘膦抗性植物和草甘膦敏感植物之間的差異。對含有賦予草甘膦耐受性的核酸的植物施用草甘膦造成的影響顯著小于對不含賦予草甘膦耐受性的核酸分子的相同物種植物施用相同量的草甘膦。耐受除草劑或其它化學(xué)品的植物比合適的對照植物顯示更好的耐受性。除草劑或其它化學(xué)品處理所造成的損害可以通過評估植物生長或良好生存狀態(tài)的任何參數(shù)進(jìn)行評價(jià)。這些參數(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們的選擇可由本領(lǐng)域技術(shù)人員自由裁量。植物損害可以通過對植物個(gè)體或植物群的一個(gè)或多個(gè)合適的植物生長或良好生存狀態(tài)參數(shù)進(jìn)行目測檢查和/或統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行評價(jià)。因此，可以通過評估包括例如但不限于下列的參數(shù)來評價(jià)損害：植株高度；植株重量；葉色；葉長；開花；育性；抽須(silking)；產(chǎn)量；和種子產(chǎn)生。還可以通過評估到特定發(fā)育階段(例如抽須、開花和花粉脫落)為止所經(jīng)過的時(shí)間，或者到植物從特定化學(xué)品和/或除草劑處理恢復(fù)為止所經(jīng)過的時(shí)間來評價(jià)損害。在進(jìn)行損害評價(jià)時(shí)，可以給特定的損害程度賦值，以便進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析或定量比較。使用值的范圍描述特定程度的損害是本領(lǐng)域已知的，并且可以使用任何合適的范圍或量表。例如，可以指配除草劑損傷得分(也稱作耐受性得分)。相應(yīng)地，如果在該量表中其他級別處，合適的對照植物(或?qū)φ罩参锶?響應(yīng)于除草劑處理顯示的得分統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著地低于主題群，則除草劑耐受性也可以用該量表中的其它級別表示。由除草劑或其它化學(xué)品導(dǎo)致的損害可以在用除草劑處理植物之后不同時(shí)間進(jìn)行評估。很多時(shí)候，損害評價(jià)大約在對照植物表現(xiàn)出最大損傷時(shí)進(jìn)行。有時(shí)，待沒有用除草劑或其它化學(xué)品處理的對照植物經(jīng)過一段時(shí)間，與給予處理之時(shí)的大小和發(fā)育階段相比已經(jīng)發(fā)生了可測量的生長和/或發(fā)育之后，再評估損害。損害評估可以在任何合適的時(shí)間進(jìn)行，合適的時(shí)間有許多，例如在用除草劑處理主題植物后12小時(shí)；1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，和/或14天；3和/或4周；或者更長的時(shí)間。任何評估時(shí)間，只要容許檢測測試植物與對照植物對處理的響應(yīng)差異，就是合適的。當(dāng)除草劑對植物無影響，當(dāng)除草劑對植物有一些影響但植物隨后從影響恢復(fù)，或者當(dāng)除草劑對植物產(chǎn)生一些有害的影響但是有害的影響被抵消，例如被該特定的除草劑對雜草的影響所抵消時(shí)，則除草劑對植物沒有“顯著影響”。因此，例如，如果植物與合適的對照植物(例如相同物種的未被處理的植物)相比，至少一個(gè)可以指示植物健康和/或生產(chǎn)力的合適參數(shù)顯示的降低小于約25％，小于約20％，小于約15％，小于約10％以下，大于約9％，小于約8％，少于約7％，少于約6％，小于約5％，小于約4％，少于約3％，小于約2％，或小于約1％，則作物可能不被除草劑或其它處理“顯著影響”。在特定的實(shí)施方案中，如果植物與合適的對照植物相比，其顯示的損害相比于對照植物所顯示的損害低至少40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，90％，100％，150％，200％，250％，300％，400％，500％，600％，700％，800％，900％，或1000％或者更多，則該植物對除草劑或其它化學(xué)品耐受。不被除草劑或其它處理顯著影響的作物可以在至少一個(gè)參數(shù)上顯示降低，但是該降低在性質(zhì)上是暫時(shí)的，并且植物在例如約1周，約2周，約3周，約4周或約6周內(nèi)完全恢復(fù)。在特定的實(shí)施方案中，耐受除草劑或其它化學(xué)品的植物可以有這樣的特征：即該植物不被該除草劑或其它化學(xué)品的施用所顯著影響?？芍甘局参锝】岛?或生產(chǎn)力的合適參數(shù)包括，例如但不限于：植物高度；植株重量；葉長；到特定發(fā)育階段為止所經(jīng)過的時(shí)間；開花；產(chǎn)量；和種子產(chǎn)生。參數(shù)評估可以通過目視檢查和/或通過對參數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析來實(shí)施。當(dāng)對主題植物和對照植物進(jìn)行評價(jià)時(shí)，可以進(jìn)行比較以確定主題植物是否被除草劑或其它化學(xué)品顯著影響?？捎糜诖_定對除草劑(或其它化學(xué)品)耐受性的合適對照植物包括屬于相同物種但不含有推定的異源除草劑耐受性核酸和/或多肽的植物，和確實(shí)含有推定的異源除草劑耐受性核酸和/或多肽但沒有用除草劑處理過的植物。除草劑：“除草劑”是可以對植物造成暫時(shí)或永久損傷的化學(xué)品。本文其它地方更詳細(xì)地列出并論述了除草劑的非限制性實(shí)例。除草劑可以被納入到植物或其細(xì)胞內(nèi)，或者它可以在不被納入的條件下對植物或細(xì)胞發(fā)揮作用?！盎钚猿煞帧笔浅輨┲苿┲胸?fù)責(zé)該制劑的植物毒性的化學(xué)物質(zhì)。商業(yè)除草劑制劑中的活性成分通常在產(chǎn)品標(biāo)簽上被標(biāo)識為活性成分。產(chǎn)品標(biāo)簽信息可以從美國環(huán)境保護(hù)局獲取，并在oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own上有在線更新。產(chǎn)品標(biāo)簽信息還可以在www.cdms.net上在線獲取。當(dāng)關(guān)于除草劑使用時(shí)，術(shù)語“酸當(dāng)量”是指以除草活性母體酸計(jì)的比例或量。分離的：“分離的”生物組分(例如，核酸或多肽)已經(jīng)與該組分天然存在的生物細(xì)胞中的其它生物組分(即，其它染色體或染色體外dna和rna，和蛋白)實(shí)質(zhì)上分離、與之分別產(chǎn)生、或從之純化出來，在分離、產(chǎn)生和純化的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了該組分的化學(xué)或功能變化(例如核酸可以通過斷裂連接該核酸與染色體中其余dna的化學(xué)鍵而從染色體分離)。已經(jīng)“分離的”核酸分子和蛋白包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白。該術(shù)語還包括通過在宿主細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)制備的核酸分子和蛋白，以及化學(xué)合成的核酸分子、蛋白和肽。核酸：術(shù)語“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可以互換使用，并包括單個(gè)核酸、多個(gè)核酸、核酸片段、變體或其衍生物、和核酸構(gòu)建體(例如信使rna(mrna)和質(zhì)粒dna(pdna))。多核苷酸或核酸可以含有全長cdna序列、或其片段的核苷酸序列，包括非翻譯的5’和/或3’序列和編碼序列。多核苷酸或核酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸構(gòu)成，其可以包括未修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以包括單鏈、雙鏈dna；單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混合物dna；單鏈和雙鏈rna；單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混合物rna。包含dna和rna的雜交分子可以是單、雙鏈、或單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的混合物。前述術(shù)語還包括化學(xué)、酶學(xué)和代謝修飾形式的多核苷酸或核酸。應(yīng)當(dāng)理解，具體的dna還指其互補(bǔ)物，其序列根據(jù)脫氧核糖核苷酸堿基配對的規(guī)則確定。如本文所使用的，術(shù)語“基因”是指編碼功能產(chǎn)物(rna或多肽/蛋白)的核酸?；蚩梢园挥诰幋a功能產(chǎn)物的序列之前(5’非編碼序列)和/或之后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。如本文所使用的，術(shù)語“編碼序列”是指編碼特定氨基酸序列的核酸序列?！罢{(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列上游(例如，5’非編碼序列)、內(nèi)部或下游(例如，3’非編碼序列)的核苷酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、rna加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)節(jié)序列包括，例如但不限于：啟動(dòng)子；翻譯前導(dǎo)序列；內(nèi)含子；多腺苷酸化識別序列；rna加工位點(diǎn)；效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)；和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。如本文所使用的，術(shù)語“密碼子簡并性”是指遺傳密碼的冗余性，其允許特定核苷酸序列發(fā)生變異但不會(huì)影響所編碼多肽的氨基酸序列。因?yàn)槊總€(gè)密碼子由3個(gè)核苷酸構(gòu)成，并且構(gòu)成dna的核苷酸被限制于4種特定的堿基，所以有64種可能的核苷酸組合，其中61種編碼氨基酸(其余3個(gè)密碼子編碼終止翻譯信號)。結(jié)果，許多氨基酸被多于一種密碼子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由4種三聯(lián)體編碼，絲氨酸和精氨酸由6種三聯(lián)體編碼，而色氨酸和甲硫氨酸只有1種三聯(lián)體編碼。顯示哪些密碼子編碼哪些氨基酸的“遺傳密碼”是本領(lǐng)域公知的。其中的簡并性允許dna堿基在一個(gè)寬廣的范圍內(nèi)變化，而不會(huì)影響由該dna編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。在本文的一些實(shí)施方案中，當(dāng)設(shè)計(jì)密碼子序列用于在宿主細(xì)胞內(nèi)獲得改良的表達(dá)時(shí)，設(shè)計(jì)基因使其中的密碼子使用頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子利用的頻率。因此，術(shù)語“密碼子優(yōu)化的”是指用于轉(zhuǎn)化各種宿主的基因和核酸編碼序列，其中該基因或編碼序列的密碼子已被改變，以反映宿主生物的典型密碼子利用率，但不改變由該核酸編碼的多肽。在實(shí)例中，這種優(yōu)化包括用生物基因中更頻繁使用的一個(gè)或多個(gè)密碼子代替該基因或編碼序列中的至少一個(gè)、超過1個(gè)、顯著數(shù)量的、和/或全部的密碼子。許多生物顯示偏好使用特定的密碼子來編碼伸長肽鏈中的特定氨基酸插入物。密碼子優(yōu)先性或密碼子偏好性(在生物之間密碼子利用率的差異)是由遺傳密碼的簡并性提供的，并且在許多生物中有大量證據(jù)證明。密碼子偏好性經(jīng)常與信使rna(mrna)的翻譯效率相關(guān)，而該翻譯效率則被認(rèn)為依賴于(但不僅僅依賴于)接受翻譯的密碼子的性質(zhì)和特定的轉(zhuǎn)運(yùn)rna(trna)分子的可得性。細(xì)胞內(nèi)選定的trna的優(yōu)勢一般反映了最頻繁用于肽合成的密碼子。因此，可以根據(jù)密碼子優(yōu)化對基因進(jìn)行裁量或設(shè)計(jì)，以便在給定生物內(nèi)實(shí)現(xiàn)最佳的基因表達(dá)。由于有多種多樣的動(dòng)物、植物和微生物物種的大量的基因序列可用，所以有可能計(jì)算密碼子利用率的相對頻率。密碼子利用率表可以容易地獲得，例如在互聯(lián)網(wǎng)kazusa.or.jp/codon/上可訪問的“codonusagedatabase”中，并且這些表可以通過不同的方式調(diào)整適用。見nakamuraetal.(2000)nucl.acidsres.28:292。利用密碼子利用率表，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)⑾鄳?yīng)于給定物種的頻率應(yīng)用于任何給定多肽序列，來設(shè)計(jì)和產(chǎn)生密碼子優(yōu)化的編碼區(qū)的人造核酸片段，該編碼區(qū)編碼該多肽，但是使用對該物種而言最優(yōu)的密碼子。密碼子偏好在蛋白編碼區(qū)的平均堿基組成上有反映。例如，基因組中g(shù)+c含量相對較低的生物使用更多在同義密碼子第三位中具有a或t的密碼子，而g+c含量較高的生物則使用更多在第三位是g或c的密碼子。此外，人們認(rèn)為在mrna中存在的“稀有”密碼子可能會(huì)降低該mrna的絕對翻譯速度，特別是當(dāng)相應(yīng)于該稀有密碼子的負(fù)載trna的相對豐度較低時(shí)。這個(gè)推理的一個(gè)推論是，對于多個(gè)稀有密碼子而言，單個(gè)稀有密碼子對翻譯速度的減少可能至少是疊加性的。因此，具有高相對含量的稀有密碼子的mrna的翻譯速度會(huì)相應(yīng)降低。該速度可能反映在所編碼蛋白相對低水平上。密碼子偏好可以作為單個(gè)密碼子相對于所有氨基酸密碼子的相對使用頻率來計(jì)算?；蛘撸艽a子偏好可以作為用于編碼特定氨基酸的單個(gè)密碼子相對于該氨基酸的所有其它密碼子(同義密碼子)的相對使用頻率來加以計(jì)算。術(shù)語“百分比同一性”(或“％同一性”)是指兩個(gè)或多個(gè)多肽序列(或多核苷酸序列)通過序列比較確定的相互關(guān)系。百分比同一性可以表示多肽(或多核苷酸)序列之間序列相關(guān)性的程度，并可以通過這些序列的串之間的匹配加以確定。一般而言，同一性分別是指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的精確核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸一致性。兩個(gè)序列，無論是核酸還是氨基酸序列，的百分比同一性是兩個(gè)對齊的序列之間精確匹配的數(shù)目除以較短序列的長度，再乘以100。見russellandbarton(1994)j.mol.biol.244:33250。用于比對核酸和氨基酸序列并確定同一性的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，包括例如但不限于，在下列文獻(xiàn)中提供的：computationalmolecularbiology(1988)(lesk,a.m.,ed.)oxforduniversity,ny；biocomputing:informaticsandgenomeprojects(1993)(smith,d.w.,ed.)academic,ny；computeranalysisofsequencedata,parti(1994)(griffin,a.m.,andgriffin,h.g.,編輯)humania,nj；sequenceanalysisinmolecularbiology(1987)(vonheinje,g.,ed.)academic,ny；和sequenceanalysisprimer(1991)(gribskov,m.anddevereux,j.,eds.)stockton,ny。用于確定兩個(gè)序列之間百分比同一性的技術(shù)可包括提供mrna或基因的核苷酸序列和/或提供或推斷由其編碼的氨基酸序列，和將該序列與第二個(gè)核苷酸和/或氨基酸序列進(jìn)行比較?；蚪M序列也可以按照這種方式加以確定和比較。此外，用于比對核酸和氨基酸序列和確定同一性的方法納入在各種公眾可得的計(jì)算機(jī)軟件程序中。序列比對和百分比同一性計(jì)算可以使用，例如，如下程序?qū)嵤簐ector軟件包的alignxtm程序(invitrogen,carlsbad,ca)或lasergenetm生物信息學(xué)計(jì)算軟件包的megaligntm程序(dnastartminc.,madison,wi)。序列的多重比對可以用clustaltm方法實(shí)施，其包括多種比對算法版本，包括clustaltmv和clustaltmw(higginsandsharp(1989)。cabios5:1513；higginsetal.(1992)comput.appl.biosci.8:18991)。對于clustaltmv中的多重比對，可使用的默認(rèn)值包括空位罰分＝10和空位長度罰分＝10。clustaltmw中多重比對的默認(rèn)參數(shù)包括(空位罰分＝10，空位長度罰分＝0.2，延遲發(fā)散序列(delaydivergenseqs)(％)＝30,dna轉(zhuǎn)換權(quán)重(dnatransitionweight)＝0.5、蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣(proteinweightmatrix)＝gonnet系列、dna權(quán)重矩陣(dnaweightmatrix)＝iub)?？梢栽赾lustaltm方法中使用的用于在蛋白序列之間進(jìn)行逐對比對和百分比同一性計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)是：ktuple＝1、空位罰分＝3、窗口(window)＝5和diagonalssaved＝5。對于核酸，這些默認(rèn)參數(shù)為ktuple＝2，空位罰分＝5，窗口＝4和diagonalssaved＝4。在用clustaltm程序進(jìn)行序列比對后，有可能通過觀察相同程序中的“序列距離”(sequencedistances)表來獲得“百分比同一性”。在一些實(shí)施方案中，核酸編碼如下的多肽，該多肽(當(dāng)與參考多肽比較時(shí)，例如dgt多肽)具有例如但不限于：至少大約55％；至少大約60％；至少大約65％；至少大約70％；至少大約75％；至少大約80％；至少大約85％；至少大約90％；和至少大約95％的同一性，具有與參考多肽相同或相似的功能。因此，在本文中可以使用從例如55％至100％同一性的任何整數(shù)百分比描述特定的核酸，例如但不限于：55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,和99％。某些核酸片段不僅具有前述的序列同一性，而且可以編碼如下的多肽，該多肽具有，例如但不限于：至少50個(gè)氨基酸；至少100個(gè)氨基酸；至少150個(gè)氨基酸；至少200個(gè)氨基酸；和至少250個(gè)氨基酸。特定的實(shí)施方案包括與seqidno:1具有至少大約90％同一性的核酸(例如，至少89％同一性；至少大約90％同一性；至少大約91％同一性；至少大約92％同一性；至少大約93％同一性；至少大約94％同一性；至少大約95％同一性；至少大約96％同一性；至少大約97％同一性；至少大約98％同一性；至少大約99％同一性；和至少大約99.5％同一性)。術(shù)語“序列分析軟件”是指一種計(jì)算機(jī)算法或軟件程序，其可用于分析核苷酸或氨基酸序列。“序列分析軟件”可以商業(yè)獲得或獨(dú)立開發(fā)。序列分析軟件的非限制性實(shí)例包括：gcg程序軟件包(wisconsinpackageversion9.0，geneticscomputergroup(gcg)，madison，wi)；blastptm,blastntm,和blastxtm(altschuletal.(1990)j.mol.biol.215:403-10)；dnastartm(dnastartm,inc.madison,wi)；sequenchertm(genecodescorporation,annarbor,mi)；和整合了smithwaterman算法的fastatm程序(pearson(1994)comput.methodsgenomeres.[proc.int.symp.],meetingdate1992(suhaiandsandor,編輯),plenum:newyork,ny,pp.111-20)。在本文中使用序列分析軟件分析核苷酸或氨基酸序列時(shí)，除非另外指明，否則所顯示的分析結(jié)果是使用所參考程序的默認(rèn)值產(chǎn)生的。如本文所使用的，術(shù)語“默認(rèn)值”是指在首次初始化軟件時(shí)，序列分析軟件最初加載的一系列值或參數(shù)。雜交：包含全部或部分核苷酸序列的核酸可以用作探針，與克隆的基因組dna片段或cdna片段(例如，來自所選生物的基因組或cdna文庫)群體中存在的、與探針序列具有顯著量的序列同一性的核苷酸序列選擇性“雜交”。雜交探針可以是基因組dna片段、質(zhì)粒dna片段、cdna片段、rna片段、pcr擴(kuò)增的dna片段、寡核苷酸、或其他多聚核苷酸，并且探針可以用可檢測的基團(tuán)(例如32p)或任何其他可檢測的標(biāo)記標(biāo)記。因此，例如但不限于，用于雜交的探針可以通過標(biāo)記可特異性雜交本文中的核酸(例如與seqidno:1具有至少大約90％同一性的核酸)的人造寡核苷酸加以制備。用于制備雜交探針和用于構(gòu)建cdna和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域已知的。sambrook等人.(1989)molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny。關(guān)于核酸雜交的詳盡指導(dǎo)可以參見sambrook等人(1989)，同上；和ausubel等人(1997)shortprotocolsinmolecularbiology,thirdedition，wiley，ny，newyork，pp.2-40。在一些實(shí)施方案中，核酸雜交(例如，對擴(kuò)增的dna的雜交)可用于鑒定樣品中轉(zhuǎn)基因事件的存在。核酸分子或其片段能夠在某些條件下與另一個(gè)核酸分子“特異性雜交”。在一些實(shí)例中，核酸在嚴(yán)格的條件下與靶核酸特異性雜交。如本文所使用的，如果兩個(gè)核酸分子能夠在嚴(yán)格(例如高嚴(yán)格度)條件下形成反平行雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，則稱這兩個(gè)核酸分子能夠彼此特異性雜交。如果一個(gè)核酸分子與另一個(gè)核酸分子顯示完全的序列互補(bǔ)性，則稱這兩個(gè)核酸分子“互補(bǔ)”。如本文所使用的，當(dāng)一個(gè)分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)的核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則說核酸顯示“完全互補(bǔ)性”。顯示完全互補(bǔ)性的分子一般可以彼此雜交，并具有足夠的穩(wěn)定性，從而允許它們在常規(guī)的“高嚴(yán)格度”條件下仍保持彼此退火。常規(guī)的高嚴(yán)格條件如上文sambrook等人(1989)所述。如果兩個(gè)分子彼此雜交，并具有足夠的穩(wěn)定性，從而允許它們至少在常規(guī)的“低嚴(yán)格度”條件下仍保持彼此退火，則稱它們顯示“最小互補(bǔ)性”。常規(guī)的低嚴(yán)格條件如上文sambrook等人(1989)所述。核酸分子要用作引物或探針，僅需要顯示能夠在所采用的特定溶劑和鹽濃度下形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)的最小的序列互補(bǔ)性即可。影響雜交嚴(yán)格度的因素是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括例如：溫度；ph；離子強(qiáng)度；和有機(jī)溶劑(例如甲酰胺和二甲基亞砜)的濃度。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，雜交嚴(yán)格度隨著溫度升高、離子強(qiáng)度降低、和溶劑濃度降低而增加。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來實(shí)現(xiàn)。術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格度條件”是考慮一個(gè)核酸與另一個(gè)靶核酸(即，與包含感興趣的特定核苷酸序列的核酸分子)根據(jù)sambrook等人(1989)，同上(在9.52-9.55)中討論的具體雜交程序的雜交而定義的。另見sambrook等人(1989)-9.47-9.52和9.56-9.58。在許多應(yīng)用中，特異性與雜交后洗滌條件有關(guān)，其中因素包括洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對于dna-dna雜交，熔點(diǎn)溫度(tm)可以近似地用如下的公式計(jì)算：tm＝81.5℃+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％甲)-500/l,(1)其中m是單價(jià)陽離子的摩爾數(shù)，％gc是dna中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲是雜交溶液中甲酰胺的百分比，l是堿基對的雜交長度。meinkothandwahl(1984)anal.biochem.138:267-84。tm是這樣的溫度(在特定的離子強(qiáng)度和ph下)：在此溫度，50％的互補(bǔ)靶序列與完美匹配的探針雜交。每有1％的錯(cuò)配，tm下降大約1℃。因此，可以調(diào)整tm、雜交、和/或洗滌條件，以便讓具有期望的同一性的序列雜交。例如，如果尋找有90％同一性的雜交序列，則可以將tm降低10℃(在特定的離子強(qiáng)度和ph下)。例如，嚴(yán)格條件可以選擇比具體序列與其互補(bǔ)物在特定離子強(qiáng)度和ph下的熱熔點(diǎn)(tm)低大約5℃的溫度。然而，極嚴(yán)格條件可以在比tm低1、2、3或4℃的溫度下進(jìn)行雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以使用比tm低6、7、8、9或10℃的溫度進(jìn)行雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以使用比tm低11-20℃的溫度進(jìn)行雜交和/或洗滌。在一些實(shí)例中，嚴(yán)格條件是如下的條件，其中鹽濃度小于大約1.5mna+(例如大約0.01-1.0mna+)，ph7.0-8.3,溫度為短核苷酸(例如長度為10-50個(gè)核苷酸)至少大約30℃和長探針(例如長度大于50個(gè)核苷酸)至少大約60℃。低嚴(yán)格條件的實(shí)例包括在37℃的30-35％甲酰胺緩沖液、1.0mnacl、0.1％十二烷基硫酸鈉(sds)中雜交，在50-55℃的1x-2xssc(20xssc＝3.0mnacl/0.3m檸檬酸三鈉)中洗滌。中嚴(yán)格條件的實(shí)例包括在37℃的40-45％甲酰胺、1.0mnacl、0.1％sds中雜交，在55-60℃的0.5x-1xssc中洗滌。高嚴(yán)格條件的實(shí)例包括在37℃的大約50％甲酰胺、大約1.0m鈉鹽、大約0.1％sds中雜交，在約60-65℃的約0.1xssc中洗滌。如本文所使用的，術(shù)語“多肽”包括單個(gè)多肽、多個(gè)多肽、和其片段。該術(shù)語是指由通過酰胺鍵(也稱作肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)構(gòu)成的分子。術(shù)語“多肽”是指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸構(gòu)成的任何鏈，且不指示產(chǎn)物的具體長度和大小。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白質(zhì)、氨基酸鏈、和任何其它用于指示有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的鏈的術(shù)語均包含在“多肽”的定義之內(nèi)，并且前述術(shù)語在本文中可以和“多肽”互換使用。多肽可以是從天然生物源分離的或者通過重組技術(shù)產(chǎn)生的，但是具體的多肽不一定是從特定的核酸翻譯產(chǎn)生的。多肽可以用任何合適的方式產(chǎn)生，包括例如但不限于，通過化學(xué)合成。內(nèi)源的和異源的：如本文所使用的，術(shù)語“天然的”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的、并與其自身的調(diào)節(jié)序列(如果存在的話)在一起的多核苷酸、基因或多肽形式。術(shù)語“內(nèi)源的”是指處于生物或生物基因組中的天然位置處的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。相反，術(shù)語“異源的”是指在參考(宿主)生物的位置處通常不會(huì)發(fā)現(xiàn)的多核苷酸、基因或多肽。例如，異源核酸可以是通常在參考生物的不同基因組位置處被發(fā)現(xiàn)的核酸。作為進(jìn)一步的實(shí)例，異源核酸可以是通常不會(huì)在參考生物中被發(fā)現(xiàn)的核酸。含有異源多核苷酸、基因或多肽的宿主生物可以通過將異源多核苷酸、基因或多肽導(dǎo)入到宿主生物內(nèi)而產(chǎn)生。在特定的實(shí)例中，異源多核苷酸包括以不同于相應(yīng)的天然多核苷酸的形式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然編碼序列、或其部分。在特定的實(shí)例中，異源基因包括以不同于相應(yīng)的天然基因的形式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然編碼序列或其部分。例如，異源基因可以包括天然編碼序列，該天然編碼序列是含有非天然調(diào)節(jié)區(qū)的嵌合基因的一部分，該嵌合基因被重新導(dǎo)入到天然宿主內(nèi)。在特定的實(shí)例中，異源多肽是以不同于相應(yīng)的天然多肽的形式被重新導(dǎo)入到來源生物內(nèi)的天然多肽。異源基因或多肽可以是這樣的基因或多肽，其包含功能性多肽或編碼功能性多肽的核酸序列，該功能性多肽或編碼功能性多肽的核酸序列與其它基因或多肽融合從而產(chǎn)生嵌合或融合的多肽或編碼它的基因?；蚝偷鞍椎奶囟▽?shí)施方案包括具體例舉的全長序列和部分、區(qū)段、片段(包括與全長分子相比具有內(nèi)部和/或末端缺失的連續(xù)片段)、變體、突變體、嵌合體、以及這些序列的融合。修飾：如本文所使用的，術(shù)語“修飾”可以指特定參考多核苷酸內(nèi)的改變，其導(dǎo)致由該參考多核苷酸編碼的多肽的活性降低、基本上消失、或消失。修飾還指參考多肽中的改變，其導(dǎo)致參考多肽的活性減低、基本上消失、或消失?；蛘?，術(shù)語“修飾”可以指參考多核苷酸中的改變，其導(dǎo)致該參考多核苷酸編碼的多肽的活性增加或提高，以及參考多肽中的改變，其導(dǎo)致參考多肽的活性增加或提高。諸如前述的改變可以通過任何本領(lǐng)域眾所周知的方法實(shí)現(xiàn)，這樣的方法有若干種，包括，例如但不限于：缺失參考分子的一部分；突變參考分子(例如通過自發(fā)誘變；通過隨機(jī)誘變；通過增變基因?qū)е碌恼T變；和通過轉(zhuǎn)座子誘變)；取代參考分子的一部分；在參考分子內(nèi)插入元件；下調(diào)參考分子的表達(dá)；改變參考分子的細(xì)胞定位；改變參考分子的狀態(tài)(例如通過參考多核苷酸的甲基化，和通過參考多肽的磷酸化或泛素化)；除去參考分子的輔助因子；導(dǎo)入靶向參考分子的反義rna/dna；導(dǎo)入靶向參考分子的干擾rna/dna；參考分子的化學(xué)修飾；參考分子的共價(jià)修飾；用uv輻射或x射線輻照參考分子；改變參考分子的同源重組；改變參考分子的有絲分裂重組；代替參考分子的啟動(dòng)子；和/或前述的任意組合。可以通過比較參考多核苷酸或多肽的序列與同源(例如同源酵母或細(xì)菌)多核苷酸或多肽的序列，并使高度同源區(qū)(保守區(qū))或共有序列中的修飾數(shù)目最大化，來找到確定在具體實(shí)例中哪些核苷酸或氨基酸殘基可以被修飾的指引。衍生物和變體：如本文所使用的，術(shù)語“衍生物”是指本文示例序列的修飾物。這些修飾包括本文中的編碼序列中的一個(gè)或多個(gè)堿基的取代、插入、和/或缺失，這些修飾可保留、略微改變、或增加該編碼序列在作物物種中的功能。這些衍生物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定，例如但不限于，通過使用用于預(yù)測和優(yōu)化序列結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)建模技術(shù)來確定。因此，術(shù)語“衍生物”也包括這樣的異源核酸，它們包含與本文中的示例序列具有相當(dāng)大的序列同一性的序列，從而使它們可具有相同、略微改變、或增加的用于在作物植物中表達(dá)dgt-28的功能性。如本文所使用的，術(shù)語“變體”是指這樣的多肽，其由于氨基酸的插入、缺失、突變、和/或取代而與本文的示例多肽有差異，插入、缺失、突變、和/或取代可以使用，例如但不限于，重組dna技術(shù)加以導(dǎo)入。關(guān)于確定參考氨基酸序列中的哪些氨基酸殘基可以取代、添加或缺失的指引，可以通過比較特定參考多肽的序列與同源多肽的序列，并使高度同源區(qū)(保守區(qū))中被改變的氨基酸序列數(shù)目最小化，或通過用共有序列代替這些氨基酸來找到。變體多肽可以具有被取代的氨基酸，但同時(shí)仍保留參照多肽的功能活性?！白凅w”基因包括編碼與參考基因相同的多肽，或者與參考多肽具有等價(jià)或相似活性的等價(jià)多肽的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，變體基因可用于產(chǎn)生變體蛋白，并且重組宿主可用于產(chǎn)生變體蛋白。例如，可以構(gòu)建成含有任何本文例證序列的連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)的變體基因和蛋白。變體基因或蛋白可以具有，例如但不限于：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、和293個(gè)連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)，其相應(yīng)于示例序列中的一個(gè)(相同大小的)區(qū)段。類似大小的區(qū)段，特別是保守區(qū)的區(qū)段，也可用作探針和/或引物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，許多水平的序列同一性均可用于鑒定與參考多肽具有相同或相似功能或活性的多肽(例如，來自其它物種)。在一些實(shí)施方案中，具有例如，但不限于：至少大約55％；至少大約60％；至少大約65％；至少大約70％；至少大約75％；至少大約80％；至少大約85％；至少大約90％；和至少大約95％序列同一性(與參考多肽，例如dgt28多肽相比)的變體多肽具有與參考多肽相同或相似的功能?？梢酝ㄟ^獲取并檢查感興趣蛋白的結(jié)構(gòu)(例如，從晶體結(jié)構(gòu)和/或分子模型獲得原子3-d(三維)坐標(biāo))，來確定包含特定分子的連續(xù)殘基的變體基因和蛋白的設(shè)計(jì)和構(gòu)建策略。在一些實(shí)例中，策略可以指向蛋白質(zhì)中對于修飾而言理想的某些區(qū)段，例如表面暴露的區(qū)段，而不是涉及蛋白質(zhì)折疊和至關(guān)重要的3-d結(jié)構(gòu)完整性的內(nèi)部區(qū)段。例如，美國專利no.5,605,793涉及通過在隨機(jī)或聚焦(focused)斷裂之后利用dna再裝配來生成額外的分子多樣性的方法。這可以稱作基因“改組(shuffling)”，其通常包括混合兩種或多種不同dna分子的(期望大小的)片段，然后進(jìn)行重復(fù)多輪復(fù)性。這種處理可以改進(jìn)由主題基因編碼的蛋白質(zhì)的活性。結(jié)果可能是一種嵌合蛋白質(zhì)，其具有改進(jìn)的活性、改變的底物特異性、增加的酶穩(wěn)定性、改變的立體特異性(stereospecificity)、或其他特征。氨基酸“取代”可以是用另一個(gè)具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸代替參考序列中的一個(gè)氨基酸(即，保守的氨基酸取代)，或者可用一個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸代替參考序列中的一個(gè)氨基酸(即，非保守的氨基酸取代)。氨基酸可以分成如下的結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)類別：非極性、不帶電荷的極性、堿性、和酸性。相應(yīng)地，可以根據(jù)所涉及的殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、或兩親性質(zhì)上的相似性進(jìn)行“保守”氨基酸取代。例如，非極性(疏水)氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；不帶電荷的(中性)極性氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸；帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸?；蛘?，可以通過選擇這些氨基酸中的任何種類在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、或兩親性質(zhì)上的差異性來進(jìn)行“非保守”氨基酸取代?！安迦搿被颉叭笔А笨梢栽谥亟M蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)或功能上可以耐受的變化范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，變體蛋白質(zhì)相對于參考全長蛋白質(zhì)是“截短的”。在一些實(shí)例中，截短的蛋白質(zhì)保留參考蛋白質(zhì)的功能活性?！敖囟痰摹钡鞍踪|(zhì)意思是指蛋白質(zhì)的一部分可以被例如切掉，而剩下的截短的蛋白質(zhì)在切割后仍保留并顯示期望的活性。切割可以用任何蛋白質(zhì)酶實(shí)現(xiàn)，這樣的蛋白酶有很多種。此外，有效切割的蛋白質(zhì)可以用分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生，其中通過限制性內(nèi)切核酸酶消化或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的其它技術(shù)，從編碼序列中去除編碼蛋白質(zhì)的一部分的dna堿基。截短的蛋白質(zhì)可以在異源系統(tǒng)中表達(dá)，例如，大腸桿菌、桿狀病毒、基于植物的病毒系統(tǒng)和酵母。賦予除草劑耐受性的截短蛋白質(zhì)可以通過使用異源系統(tǒng)在除草劑耐受性生物測定體系中表達(dá)蛋白質(zhì)來加以確認(rèn)，例如本文中所述。本領(lǐng)域公知，可成功地產(chǎn)生截短蛋白質(zhì)，并使它們保留全長參考蛋白質(zhì)的功能活性。例如，bt蛋白質(zhì)可以以一種截短的(核心蛋白質(zhì))形式使用。參見，例如，hofteandwhiteley(1989)microbiol.rev.53(2):24255；和adangetal.(1985)gene36:289300。在一些情況下，特別是用于在植物中表達(dá)的情況下，使用表達(dá)截短蛋白質(zhì)的截短基因可能是有利的。截短基因可以編碼由例如全長蛋白質(zhì)的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％構(gòu)成的多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定保留作為其設(shè)計(jì)來源的參考序列的功能的變體基因和蛋白質(zhì)，例如通過測定重組變體的活性加以確定。如果這種活性測定是已知的并且已經(jīng)被表征，那么功能變體的確定僅需要常規(guī)的實(shí)驗(yàn)?？梢詫γ浮盎钚晕稽c(diǎn)”進(jìn)行特異性改變，以影響其在活性或立體結(jié)構(gòu)特異性方面的固有功能性。參見mulleret.al.(2006)proteinsci.15(6):135668。例如，已知的taud結(jié)構(gòu)已被用作一種模式雙加氧酶，用來在與其固有底物?；撬峤Y(jié)合的情況下確定活性位點(diǎn)殘基。參見elkinsetal.(2002)biochemistry41(16):518592。關(guān)于酶活性位點(diǎn)的序列優(yōu)化和可設(shè)計(jì)性的信息可以參見chakrabartietal.(2005)proc.natl.acad.sci.usa102(34):1203540?？梢愿淖兊鞍踪|(zhì)的各種結(jié)構(gòu)性質(zhì)和三維結(jié)構(gòu)特征，而不對蛋白質(zhì)的活性/功能性造成不良影響?？梢赃M(jìn)行不會(huì)對分子活性和/或三維構(gòu)象造成不良影響的保守氨基酸取代(“耐受性(tolerated)”取代)。還可以設(shè)計(jì)與參考蛋白質(zhì)在序列水平上不同、但保留相同或相似的總體關(guān)鍵三維結(jié)構(gòu)、表面電荷分布等的變體蛋白質(zhì)。參見例如美國專利7,058,515；larsonetal.(2002)proteinsci.11:280413；cramerietal.(1997)nat.biotechnol.15:4368；stemmer(1994)proc.natl.acad.sci.usa91:1074751；stemmer(1994)nature370:38991；stemmer(1995)bio/technology13:54953；cramerietal.(1996)nat.med.2:1003；和cramerietal.(1996)nat.biotechnol.14:3159。對適合于在表達(dá)構(gòu)建體(例如，dgt-28表達(dá)構(gòu)建體)中使用的5'或3'utr(例如，人造發(fā)夾)也可以實(shí)施計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)，這樣的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)可用于設(shè)計(jì)本文一些實(shí)施方案的核酸內(nèi)的元件。用于預(yù)測/評估5'或3'utr衍生物的計(jì)算機(jī)建模和utr和計(jì)算機(jī)建模技術(shù)包括，例如但不限于：mfoldtm3.1版(可以從geneticscorporationgroup,madison,wi獲得；見zuckeretal.“algorithmsandthermodynamicsforrnasecondarystructureprediction:apracticalguide,”錄自rnabiochemistryandbiotechnology,1143,j.barciszewski&b.f.c.clark編輯,natoasiseries,kluweracademicpublishers,dordrecht,nl,1999；zuckeretal.(1999)j.mol.biol.288:91140；zuckeretal.“rnasecondarystructureprediction,”錄自currentprotocolsinnucleicacidchemistry,s.beaucage,d.e.bergstrom,g.d.glick,andr.a.jones編輯,johnwiley&sons,newyork,11.2.111.2.10,2000)；和covetm(使用協(xié)方差模型分析rna結(jié)構(gòu)(隨機(jī)上下文無關(guān)文法方法(stochasticcontextfreegrammarmethods)))v.2.4.2(eddyanddurbin(1994)nucl.acidsres.22:207988),其以源代碼免費(fèi)發(fā)布，并可以通過登錄網(wǎng)址genetics.wustl.edu/eddy/software/下載；和foldaligntm(見gorodkinetal.(1997)nucleicacidsres.25(18):372432和gorodkinetal.(1997)proceedingsinternationalconferenceonintelligentsystemsformolecularbiologyismbinternationalconferenceonintelligentsystemsformolecularbiology5:120123),其也是免費(fèi)發(fā)布的，并可以在網(wǎng)址foldalign.ku.dk/software/index.html上下載。啟動(dòng)子：術(shù)語“啟動(dòng)子”指一種能夠控制核酸編碼序列或功能rna的表達(dá)的dna序列。在實(shí)例中，受控制的編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3'?？梢詮奶烊换蛑姓w獲得啟動(dòng)子，啟動(dòng)子可以包括來自天然出現(xiàn)的不同啟動(dòng)子的不同元件，或者啟動(dòng)子甚至可以包括人造的dna片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解，不同的啟動(dòng)子可以指導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者響應(yīng)不同的環(huán)境或生理?xiàng)l件表達(dá)。所有上述啟動(dòng)子的實(shí)例都是已知的，并且在本領(lǐng)域中用于控制異源核酸的表達(dá)。指導(dǎo)基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中在大部分時(shí)間里表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“組成型啟動(dòng)子”。此外，雖然本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)嘗試界定調(diào)節(jié)序列的確切邊界(在許多情況下未成功)，但是已經(jīng)認(rèn)識到，長度不同的dna片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。特定核酸的啟動(dòng)子活性可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行測定。可操作連接：術(shù)語“可操作連接”是指單一核酸上的多個(gè)核酸序列的關(guān)聯(lián)，其中一個(gè)核酸序列的功能受到另一個(gè)的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(shí)(例如，編碼序列在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下)，啟動(dòng)子與編碼序列就是可操作連接的。編碼序列可以沿著有義和反義方向與調(diào)節(jié)序列可操作連接。表達(dá)：如本文所使用的，術(shù)語“表達(dá)”可以指衍生自dna的有義(mrna)或反義rna的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)還指mrna翻譯成多肽。如本文所使用的，術(shù)語“過表達(dá)”是指高于相同基因或相關(guān)基因的內(nèi)源表達(dá)的表達(dá)。因此，如果異源基因的表達(dá)高于可比較的內(nèi)源基因的表達(dá)，則該異源基因被“過表達(dá)”。轉(zhuǎn)化：如本文所使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指核酸或其片段被轉(zhuǎn)移并整合到宿主生物內(nèi)，導(dǎo)致基因上穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化核酸的宿主生物被稱作“轉(zhuǎn)基因”、“重組”或“轉(zhuǎn)化”生物。已知的轉(zhuǎn)化方法包括，例如但不限于：根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根土壤桿菌(a.rhizogenes)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；磷酸鈣轉(zhuǎn)化；聚凝胺轉(zhuǎn)化；原生質(zhì)體融合；電穿孔；超聲波方法(例如，超聲波穿孔(sonoporation))；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化；顯微注射；用裸dna轉(zhuǎn)化；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化；用病毒載體轉(zhuǎn)化；基因槍轉(zhuǎn)化(微粒轟擊)；碳化硅whiskers(晶須)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；氣溶膠射線轉(zhuǎn)化(aerosol-beaming)；和peg介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。導(dǎo)入：如本文所使用的，術(shù)語“導(dǎo)入”(在將核酸導(dǎo)入細(xì)胞的上下文中)包括細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，以及包含核酸的植物與第二種植物的雜交，從而使第二種植物含有該核酸，這可以用常規(guī)植物育種技術(shù)實(shí)施。這些育種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。關(guān)于植物育種技術(shù)的討論，見poehlman(1995)breedingfieldcrops,第4版,avipublicationco.,westportct?；亟环椒捎糜趯⒑怂釋?dǎo)入植物。這種技術(shù)用于將性狀導(dǎo)入植物已有幾十年的歷史?；亟?以及其它的植物育種方法學(xué))的描述實(shí)例可以參見，例如，poelman(1995)，同上；和jensen(1988)plantbreedingmethodology,wiley,newyork,ny。在一個(gè)示例性回交方案中，將感興趣的原始植物(以下簡稱“輪回親本”)與攜帶要導(dǎo)入的核酸的第二個(gè)植物(“非輪回親本”)雜交。然后，將此雜交產(chǎn)生的子代再次與輪回親本雜交，并重復(fù)該過程直到獲得轉(zhuǎn)化植物，其中除了來自非輪回親本的核酸之外，轉(zhuǎn)化植物還復(fù)原了輪回親本的幾乎全部的期望形態(tài)和生理特征。質(zhì)粒/載體：如本文所使用的，術(shù)語“質(zhì)粒”和“載體”是指一種染色體外元件，其可攜帶一個(gè)或多個(gè)非細(xì)胞核心代謝部分的基因。質(zhì)粒和載體通常是環(huán)狀雙鏈dna分子。然而，質(zhì)粒和載體可以是線性或環(huán)狀核酸，呈單鏈或雙鏈dna或rna，并可以衍生自任何來源，其中若干核苷酸序列被連接或重組成一個(gè)獨(dú)特的構(gòu)建體，其能夠?qū)?dòng)子片段和編碼dna序列與任何合適的3’非翻譯區(qū)一起導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)。在實(shí)例中，質(zhì)粒和載體可以包括自主復(fù)制序列、基因組整合序列、和/或噬菌體或核苷酸序列。iii.dgt-28和dgt-28編碼序列本文的一些實(shí)施方案提供了分離的多肽，其與seqidno:1具有至少大約90％同一性(例如89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,和至少99％同一性)。這種多肽在本文被稱作dgt-28多肽。本文的一些實(shí)施方案提供了編碼與seqidno:1具有至少大約90％同一性的多肽的核酸。這類核酸的特定實(shí)例在本文被稱作“dgt-28”核酸。在多種多樣的應(yīng)用中期望修飾植物細(xì)胞中的草甘膦代謝(例如，導(dǎo)入草甘膦抗性)，dgt-28核酸可用于任何這樣的應(yīng)用。為舉例目的提供的dgt-28核酸的特定實(shí)例是seqidnos:2和3。因此，一些實(shí)施方案提供了包含如下核苷酸序列的核酸，其與seqidno:2或seqidno:3具有至少大約80％序列同一性(例如79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％的，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，和至少99％同一性)；其中該核酸編碼與seqidno:1具有至少大約90％同一性的多肽。dgt-28核酸的特定實(shí)例包括在嚴(yán)格(例如高嚴(yán)格)條件下與具有seqidno:2或seqidno:3的核酸特異性雜交的核酸。在一些實(shí)施方案中，提供了密碼子優(yōu)化的dgt-28核酸。例如，為了在植物中獲得異源基因的高表達(dá)，可能期望設(shè)計(jì)基因并對基因進(jìn)行重新工程化，從而使它在植物細(xì)胞內(nèi)更高效地表達(dá)。在期望在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)細(xì)菌基因的場合，這個(gè)策略是特別可取的。因此，本文的一些實(shí)例提供了編碼dgt-28蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因，和設(shè)計(jì)它的方法，用來產(chǎn)生能夠在雙子葉或單子葉植物中最優(yōu)表達(dá)的dna序列，并且其中序列修飾不會(huì)干擾翻譯或轉(zhuǎn)錄。對于以在單子葉和雙子葉植物中表達(dá)相同的dgt-28蛋白質(zhì)為目的的優(yōu)化dgt-28基因設(shè)計(jì)，在本文中用該優(yōu)化表達(dá)基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的再工程化進(jìn)行了示例。本文中植物優(yōu)化的dgt-28核酸的實(shí)例包括seqidno:2和seqidno:3。在對編碼用于在雙子葉植物或單子葉植物(例如，棉花、加拿大油菜、煙草、玉米、大豆、小麥和水稻)中表達(dá)的dgt-28蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行工程化時(shí)，可以確定預(yù)期的宿主植物的密碼子偏好，例如通過使用可公開獲得的dna序列數(shù)據(jù)庫找到關(guān)于植物基因組或各種植物基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)的密碼子分布信息來加以確定。在設(shè)計(jì)用于植物表達(dá)的核酸中的編碼區(qū)時(shí)，當(dāng)存在多種選擇時(shí)，應(yīng)當(dāng)確定植物優(yōu)選的主要(“第一選擇”)密碼子，以及優(yōu)選密碼子的第二、第三、第四選項(xiàng)等。然后，可以設(shè)計(jì)編碼相同肽(例如，dgt-28蛋白質(zhì))的氨基酸序列的新dna序列，但是新dna序列與原始dna序列的區(qū)別在于用植物(第一優(yōu)選的、第二優(yōu)選的、第三優(yōu)選的、或第四優(yōu)選的，等等)密碼子進(jìn)行了取代，以規(guī)定氨基酸序列中每個(gè)位置處的氨基酸。然后可以對新序列進(jìn)行分析，尋找可能由這些修飾產(chǎn)生的限制酶位點(diǎn)。對于鑒定出的位點(diǎn)，可以進(jìn)一步通過用第一、第二、第三或第四選擇的優(yōu)選密碼子替換這些密碼子來進(jìn)行修飾。序列中其他可能影響感興趣的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的位點(diǎn)是莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、外顯子:內(nèi)含子接點(diǎn)(5'或3')、多聚腺苷酸添加信號、和rna聚合酶終止信號；這些位點(diǎn)可通過用植物密碼子取代予以去除。可以對序列進(jìn)行進(jìn)一步的分析和修飾，以減少ta或cg雙聯(lián)體(doublet)的頻率。除了雙聯(lián)體之外，具有超過大約6個(gè)相同殘基的g或c雙聯(lián)體序列區(qū)塊(block)會(huì)影響序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯。因此，可以通過將密碼子的第一或第二選擇替換為下一級優(yōu)選的密碼子等方式來對這些區(qū)塊進(jìn)行修飾。seqidno:2(dgt-28(v5))是針對雙子葉植物中的表達(dá)優(yōu)化的。seqidno:3(dgt-28(v6))是針對單子葉植物中的表達(dá)優(yōu)化的。這些人造序列中的密碼子利用率是基于優(yōu)選的密碼子利用率而選擇的；即每一個(gè)的表達(dá)產(chǎn)物都是由具有單子葉或雙子葉植物利用率偏好的密碼子編碼的，并且除去了有害的序列和多余的限制性位點(diǎn)，以增加dgt-28多肽的轉(zhuǎn)錄/翻譯效率且便于進(jìn)行dna操作步驟。類似地，對seqidno:4的核酸分子(dgt-28(v1))進(jìn)行了優(yōu)化，以提高在大腸桿菌中的表達(dá)。seqidno:4中的密碼子利用率是根據(jù)大腸桿菌優(yōu)選的密碼子利用率而選擇的；所表達(dá)的蛋白質(zhì)由具有大腸桿菌利用率偏好的密碼子所編碼。在重新設(shè)計(jì)過程中，除去了有害的序列和多余的限制性位點(diǎn)，以增加dgt-28編碼序列的轉(zhuǎn)錄/翻譯效率并便于進(jìn)行dna操作步驟。因此，在大腸桿菌中從包含seqidno:4的核酸表達(dá)dgt-28可導(dǎo)致強(qiáng)健的蛋白質(zhì)表達(dá)，例如，用于dgt-28的酶學(xué)表征。一旦在紙上或計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)出了優(yōu)化的(例如，植物優(yōu)化的)dna序列，便可以在實(shí)驗(yàn)室里人造出在序列上與設(shè)計(jì)的序列精確對應(yīng)的實(shí)際dna分子。可以對這些人造的核酸分子進(jìn)行克隆和進(jìn)行其他操作，完全如同它們來自自然或天然的來源一樣。本文中的核酸可以被克隆到載體中，用于轉(zhuǎn)化到原核或真核細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和/或表達(dá)。載體可以是原核載體；例如，質(zhì)粒、或穿梭載體、昆蟲載體、或真核載體。本文的核酸也可以被克隆到表達(dá)載體中，例如，用于施用到植物細(xì)胞中。在某些應(yīng)用中，可能優(yōu)選的是具有在大腸桿菌中發(fā)揮功能的載體(例如，生產(chǎn)用于產(chǎn)生抗體的蛋白質(zhì)，dna序列分析，插入物構(gòu)建，獲得大量核酸)。為了在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)dgt-28蛋白質(zhì)，通常將編碼蛋白質(zhì)的核酸亞克隆到含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的表達(dá)載體中。合適的細(xì)菌和真核啟動(dòng)子是本領(lǐng)域公知的，例如在sambrook等,molecularcloning,alaboratorymanual(第2版1989；第3版，2001年)；kriegler,genetransferandexpression:alaboratorymanual(1990)；和currentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.,同上)中所述。本文中用于表達(dá)核酸的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)可以在，例如，大腸桿菌、芽孢桿菌屬和沙門氏菌屬中獲得(palvaetal.,gene22:229235(1983))。用于這些表達(dá)系統(tǒng)的試劑盒可以商購。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母和昆蟲細(xì)胞的真核表達(dá)系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且也可以商購?？紤]dgt-28蛋白質(zhì)的預(yù)期用途(例如，在植物、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物中表達(dá))來選擇用于將遺傳信息轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)的具體表達(dá)載體。通用的細(xì)菌和動(dòng)物表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，并在例如，美國專利公開20050064474a1和國際專利公開wo05/084190，wo05/014791和wo03/080809中有詳細(xì)說明?？梢杂猛ㄓ玫霓D(zhuǎn)染方法產(chǎn)生表達(dá)大量蛋白質(zhì)的細(xì)菌細(xì)胞系，隨后可以使用通用技術(shù)加以純化。用于指導(dǎo)本文核酸表達(dá)的啟動(dòng)子的選擇取決于特定的應(yīng)用。在本文的實(shí)施方案中可以使用多種在植物中指導(dǎo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以從組成型、化學(xué)調(diào)節(jié)型、誘導(dǎo)型、組織特異型、和種子優(yōu)選型啟動(dòng)子中選擇。例如，適合于宿主細(xì)胞的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子可用于表達(dá)和純化dgt-28蛋白質(zhì)。植物啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例包括來自如下來源的啟動(dòng)子序列：擬南芥泛素-10(ubi10)(callis,etal.,1990,j.biol.chem.,265:1248612493)；根癌土壤桿菌甘露堿合酶(δmas)(petolinoetal.,u.s.patentno.6,730,824)；和/或木薯葉脈花葉病毒(csvmv)(verdagueretal.,1996,plantmolecularbiology31:11291139)。組成型啟動(dòng)子包括，例如，核心花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子(odelletal.(1985)nature313:810812)；水稻肌動(dòng)蛋白質(zhì)啟動(dòng)子(mcelroyetal.(1990)plantcell2:163171)；玉米泛素啟動(dòng)子(美國專利號5,510,474；christensenetal.(1989)plantmol.biol.12:619632和christensenetal.(1992)plantmol.biol.18:675689)；pemu啟動(dòng)子(lastetal.(1991)theor.appl.genet.81:581588)；als啟動(dòng)子(美國專利號5,659,026)；玉米組蛋白啟動(dòng)子(chaboutéetal.plantmolecularbiology,8:179191(1987))；等?？捎玫闹参锛嫒菪詥?dòng)子的范圍包括組織特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型調(diào)控元件是能夠響應(yīng)誘導(dǎo)劑而直接或間接激活一種或多種dna序列或基因的轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件。在沒有誘導(dǎo)物時(shí)，上述dna序列或基因?qū)⒉槐晦D(zhuǎn)錄。通常，特異性結(jié)合誘導(dǎo)型調(diào)控元件從而激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無活性的形式存在，隨后會(huì)被誘導(dǎo)劑直接或間接地轉(zhuǎn)化為活性形式。誘導(dǎo)物可以是化學(xué)劑，例如蛋白質(zhì)、代謝物、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類化合物，或由熱、冷、鹽、或有毒元素所直接施用的生理脅迫，或通過病原體或致病劑如病毒而間接施用的生理脅迫。典型地，特異性結(jié)合誘導(dǎo)型調(diào)控元件從而激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無活性的形式存在，隨后會(huì)被誘導(dǎo)劑直接或間接地轉(zhuǎn)化為活性形式。可以通過從外部將誘導(dǎo)物施用給細(xì)胞或植物，例如通過噴霧、澆水、加熱或類似的方法，而將含有誘導(dǎo)型調(diào)控元件的植物細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)物。在本文的實(shí)施方案中可以使用任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。見wardetal.plantmol.biol.22:361366(1993)。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括，例如但不限于：蛻皮激素受體啟動(dòng)子(美國專利號6,504,082)；來自ace1系統(tǒng)的響應(yīng)銅的啟動(dòng)子(mettetal.pnas90:45674571(1993))；來自玉米的響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的in2-1和in2-2基因(美國專利號5,364,780；hersheyetal.,mol.gen.genetics227:229-237(1991)和gatzetal.,mol.gen.genetics243:32-38(1994))；來自tn10的tet阻遏物(gatzetal.,mol.gen.genet.227:229-237(1991)；來自類固醇激素基因的啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性受到糖皮質(zhì)激素的誘導(dǎo)(schenaetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.88:10421(1991)和mcnellisetal.,(1998)plantj.14(2):247-257)；玉米gst啟動(dòng)子，其被用作預(yù)應(yīng)急除草劑的疏水親電子化合物激活(參見美國專利no.5,965,387和國際專利申請公開no.wo93/001294)；和煙草pr-1a啟動(dòng)子，其被水楊酸激活(見onos,kusamam,ogurar,hiratsukak.,“evaluationoftheuseofthetobaccopr-1apromotertomonitordefensegeneexpressionbytheluciferasebioluminescencereportersystem,”bioscibiotechnolbiochem.2011sep23；75(9):1796-800)。其他受化學(xué)調(diào)控的感興趣的啟動(dòng)子包括四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素抑制型的啟動(dòng)子(參見，例如，gatzetal.,(1991)mol.gen.genet.227:229-237,和美國專利號5,814,618和5,789,156)。其它可調(diào)節(jié)的感興趣啟動(dòng)子包括冷應(yīng)答調(diào)控元件或熱激調(diào)控元件，其轉(zhuǎn)錄分別受到冷或熱暴露的影響(takahashietal.,plantphysiol.99:383-390,1992)；可被厭氧條件誘導(dǎo)的醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子(gerlachetal.,pnasusa79:2981-2985(1982)；walkeretal.,pnas84(19):6624-6628(1987))，來自豌豆rbcs基因或豌豆psadb基因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(yamamotoetal.(1997)plantj.12(2):255-265)；光誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件(feinbaumetal.,mol.gen.genet.226:449,1991；lamandchua,science248:471,1990；matsuokaetal.(1993)proc.natl.acad.sci.usa90(20):9586-9590；orozcoetal.(1993)plantmol.bio.23(6):1129-1138)；植物激素誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件(yamaguchishinozakietal.,plantmol.biol.15:905,1990；karesetal.,plantmol.biol.15:225,1990)，等等。誘導(dǎo)型調(diào)控元件還可以是玉米in2-1或in2-2基因，它們響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑(hersheyetal.,mol.gen.gene.227:229-237,1991；gatzetal.,mol.gen.genet.243:32-38,1994)，和轉(zhuǎn)座子tn10的四環(huán)素阻遏物(gatzetal.,mol.gen.genet.227:229-237,1991)。脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括鹽/水脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如p5cs(zangetal.(1997)plantsciences129:81-89)；冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如cor15a(hajelaetal.(1990)plantphysiol.93:1246-1252),cor15b(wilhelmetal.(1993)plantmolbiol23:1073-1077),wsc120(ouelletetal.(1998)febslett.423324-328),ci7(kirchetal.(1997)plantmolbiol.33:897-909),和ci21a(schneideretal.(1997)plantphysiol.113:335-45)；干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如trg-31(chaudharyetal.(1996)plantmol.biol.30:1247-57)和rd29(kasugaetal.(1999)naturebiotechnology18:287-291)。滲透壓誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如rab17(vilardelletal.(1991)plantmol.biol.17:985-93)和滲壓素(osmotin)(raghothamaetal.(1993)plantmolbiol23:1117-28)。熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如熱激蛋白(barrosetal.(1992)plantmol.19:665-75；marrsetal.(1993)dev.genet.14:27-41)、smhsp(watersetal.(1996)j.experimentalbotany47:325-338)；和來自歐芹泛素啟動(dòng)子的熱激誘導(dǎo)型元件(wo03/102198)。其它脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括rip2(美國專利號5,332,808和美國公開號no.2003/0217393)和rd29a(yamaguchishinozakietal.(1993)mol.gen.genetics236:331-340)。某些啟動(dòng)子可以被創(chuàng)傷誘導(dǎo)，包括土壤桿菌屬的pmas啟動(dòng)子(guevaragarciaetal.(1993)plantj.4(3):495-505)和土壤桿菌orf13啟動(dòng)子(hansenetal.,(1997)mol.gen.genet.254(3):337-343)。組織優(yōu)選的啟動(dòng)子可用于在特定植物組織內(nèi)靶向增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。這些類型啟動(dòng)子的實(shí)例包括種子優(yōu)先(seed-preferred)的表達(dá)，例如由菜豆蛋白(phaseolin)啟動(dòng)子(bustosetal.1989.theplantcellvol.1,839-853)，和玉米球蛋白-1基因(belanger,etal.1991genetics129:863-972)提供的種子優(yōu)先表達(dá)。對于雙子葉植物，種子優(yōu)先的啟動(dòng)子包括，但不限于，菜豆的β-菜豆蛋白(β-phaseolin)、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝集素(soybeanlectin)、十字花科蛋白(cruciferin)，等等。對于單子葉植物，種子優(yōu)先的啟動(dòng)子包括但不限于：玉米的15kda玉米醇溶蛋白、22kda玉米醇溶蛋白、27kda玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、糯質(zhì)蛋白質(zhì)(waxy)、超甜素(shrunken)1和超甜素2，球蛋白1，等等。種子優(yōu)先的啟動(dòng)子還包括那些指導(dǎo)基因主要在種子內(nèi)的特定組織中表達(dá)的啟動(dòng)子，例如，γ-玉米醇溶蛋白的胚乳優(yōu)先的啟動(dòng)子，來自煙草的隱藏(cryptic)啟動(dòng)子(fobertetal.1994.tdnataggingofaseedcoatspecificcrypticpromoterintobacco.plantj.4:567-577)，來自玉米的p-基因啟動(dòng)子(chopraetal.1996.allelesofthemaizep-genewithdistincttissuespecificitiesencodemyb-homologousproteinswithc-terminalreplacements.plantcell7:1149-1158,erratuminplantcell.1997,1:109)，來自玉米的球蛋白-1啟動(dòng)子(belengerandkriz.1991.molecularbasisforallelicpolymorphismofthemaizeglobulin-1gene.genetics129:863-972)，和指導(dǎo)在玉米粒的種皮或果殼上表達(dá)的啟動(dòng)子，例如果皮特異性谷氨酰胺合成酶啟動(dòng)子(muhitchetal.,2002.isolationofapromotersequencefromtheglutaminesynthetase1-2genecapableofconferringtissuespecificgeneexpressionintransgenicmaize.plantscience163:865-872)。除了啟動(dòng)子之外，表達(dá)載體通常還含有轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒，其含有用于在宿主細(xì)胞(無論是原核還是真核)內(nèi)表達(dá)核酸所需的全部其它元件。因此，典型的表達(dá)盒含有，例如，與編碼蛋白質(zhì)的核酸序列可操作連接的啟動(dòng)子，和信號，例如高效進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本多聚腺苷酸化、轉(zhuǎn)錄終止、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、或翻譯終止的信號。表達(dá)盒的其它元件包括，例如，增強(qiáng)子和異源剪接信號?？梢园渌妮d體組分，其也取決于基因的預(yù)期用途。實(shí)例包括選擇標(biāo)記、靶向序列或調(diào)控序列，轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列如優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(見美國專利號5,510,471)，穩(wěn)定化序列如rb7mar(見thompsonandmyatt,(1997)plantmol.biol.,34:687692和wo9727207)，或前導(dǎo)序列、內(nèi)含子等。植物表達(dá)載體和報(bào)告基因的一般描述和實(shí)例可以參見gruber等,“vectorsforplanttransformation”，錄自methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology,glick等編輯；crcpress，第89-119頁(1993)。合適的表達(dá)載體的選擇將取決于宿主和將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主內(nèi)的方法。表達(dá)盒可以包括在植物中發(fā)揮功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)，其位于感興趣的異源核苷酸序列3’端。終止區(qū)可以是感興趣的dna序列天然具有的，或者可以來自其他的來源。易用的終止區(qū)可以從根癌土壤桿菌的ti質(zhì)粒獲得，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶(nos)終止區(qū)(depickeretal.,mol.andappl.genet.1:561-573(1982)和shawetal.(1984)nucleicacidsresearchvol.12,no.20pp7831-7846(nos))，另見guerineauetal.mol.gen.genet.262:141-144(1991)；proudfoot,cell64:671-674(1991)；sanfaconetal.genesdev.5:141149(1991)；mogenetal.plantcell2:1261-1272(1990)；munroeetal.gene91:151-158(1990)；ballasetal.nucleicacidsres.17:7891-7903(1989)；joshietal.nucleicacidres.15:9627-9639(1987)。表達(dá)盒可以含有5’前導(dǎo)序列。這些前導(dǎo)序列可以發(fā)揮增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的，并包括例如小核糖核酸病毒(picornavirus)的前導(dǎo)序列、emcv前導(dǎo)序列(腦心肌炎5'非編碼區(qū))，elroy-steinetal.proc.nat.acad.sci.usa86:6126-6130(1989)；馬鈴薯y病毒前導(dǎo)序列，例如，tev前導(dǎo)序列(煙草蝕紋病毒)carringtonandfreedjournalofvirology,64:1590-1597(1990)，mdmv前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒)，allisonetal.,virology154:9-20(1986)；人免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(bip)，macejaketal.nature353:90-94(1991)；來自苜蓿花葉病毒的外殼蛋白mrna的未翻譯前導(dǎo)序列(amvrna4)，joblingetal.nature325:622-625(1987)；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(tmv)，gallieetal.(1989)molecularbiologyofrna,237-256頁；和玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)序列(mcmv)lommeletal.virology81:382-385(1991)。另見dellacioppaetal.plantphysiology84:965-968(1987)。構(gòu)建體還包含可增強(qiáng)翻譯和/或mrna穩(wěn)定性的序列，例如內(nèi)含子。這種內(nèi)含子的一個(gè)實(shí)例是擬南芥組蛋白h3.iii變體的基因ii的第一內(nèi)含子。chaubetetal.journalofmolecularbiology,225:569-574(1992)。在期望將異源核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物引導(dǎo)到特定的細(xì)胞器，特別是質(zhì)體、造粉體，或到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者分泌在細(xì)胞表面或細(xì)胞外的場合，表達(dá)盒可以進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列。這些轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域公知的，并且包括但不限于：?；d體蛋白、rubisco的小亞基、植物epsp合酶和向日葵的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(見lebrun等人的美國專利5,510,417)，玉米brittle1葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(nelsonetal.plantphysiol117(4):1235-1252(1998)；sullivanetal.plantcell3(12):1337-48；sullivanetal.,planta(1995)196(3):477-84；sullivanetal.,j.biol.chem.(1992)267(26):18999-9004)等。此外，嵌合的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域已知的，例如優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(參見美國專利號5,510,471)。其它的如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽先前已經(jīng)在美國專利號nos.5,717,084；5,728,925中有描述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將很容易意識到，有許多種選項(xiàng)可用于將產(chǎn)物表達(dá)到特定的細(xì)胞器中。例如，大麥α淀粉酶序列常被用于指導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的表達(dá)。rogers,j.biol.chem.260:37313738(1985)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識到，使用重組dna技術(shù)能夠提高被轉(zhuǎn)染核酸分子的表達(dá)控制，例如通過操縱宿主細(xì)胞內(nèi)核酸分子的拷貝數(shù)、核酸分子轉(zhuǎn)錄的效率、所得的轉(zhuǎn)錄本翻譯的效率、和翻譯后修飾的效率。此外，可以對啟動(dòng)子序列進(jìn)行基因工程改造，使其與天然啟動(dòng)子相比表達(dá)水平提高。可用于控制核酸分子表達(dá)的重組技術(shù)包括，但不限于，將核酸分子穩(wěn)定整合到一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞染色體中，向質(zhì)粒添加載體穩(wěn)定性序列，替換或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(例如啟動(dòng)子、操縱基因、增強(qiáng)子)，替換或修飾翻譯控制信號(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)、shine-dalgarno或kozak序列)，修飾核酸分子使其與宿主細(xì)胞的密碼子利用率對應(yīng)、和刪除導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本不穩(wěn)定的序列。轉(zhuǎn)化載體中可以包含用于篩選被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織或植物部分或植物的報(bào)告基因或標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記的實(shí)例包括那些賦予針對抗代謝物(例如除草劑或抗生素)的耐受性的標(biāo)記，例如：二氫葉酸還原酶，其賦予對氨甲喋呤的抗性(reiss,plantphysiol.(lifesci.adv.)13:143-149,1994；另見herreraestrellaetal.,nature303:209-213,1983；meijeretal.,plantmol.biol.16:807-820,1991)；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其賦予對氨基糖苷類新霉素、卡那霉素和巴龍霉素的抗性(herreraestrella,emboj.2:987-995,1983andfraleyetal.proc.natl.acad.sciusa80:4803(1983))；潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其賦予潮霉素抗性(marsh,gene32:481485,1984；另見waldronetal.,plantmol.biol.5:103-108,1985；zhijianetal.,plantscience108:219-227,1995)；trpb，其允許細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸；hisd，其允許細(xì)胞利用組氨醇代替組氨酸(hartman,proc.natl.acad.sci.,usa85:8047,1988)；甘露糖6-磷酸異構(gòu)酶，允許細(xì)胞利用甘露糖(wo94/20627)；鳥氨酸脫羧酶，其賦予對鳥氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-dl-鳥氨酸的抗性(dfmo；mcconlogue,1987,錄自:currentcommunicationsinmolecularbiology,coldspringharborlaboratoryed.)；和來自土曲霉的脫氨酶，其賦予對稻瘟菌素s的抗性(tamura,biosci.biotechnol.biochem.59:2336-2338,1995)。其它的選擇標(biāo)記包括，例如，突變體乙酰乳酸合酶，其賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(leeetal.,emboj.7:1241-1248,1988)，突變體psba，其賦予阿特拉津(atrazine)抗性(smedaetal.,plantphysiol.103:911-917,1993)，或突變體原卟啉原氧化酶(見美國專利no.5,767,373)，其它賦予對除草劑(例如草胺膦)抗性的標(biāo)記。合適的選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括，但不限于，編碼氯霉素抗性(herreraestrellaetal.,emboj.2:987-992,1983)；鏈霉素抗性(jonesetal.,mol.gen.genet.210:86-91,1987)；壯觀霉素抗性(bretagne-sagnardetal.,transgenicres.5:131-137,1996)；博來霉素抗性(hilleetal.,plantmol.biol.7:171-176,1990)；磺酰胺抗性(guerineauetal.,plantmol.biol.15:127-136,1990)；溴苯腈抗性(stalkeretal.,science242:419-423,1988)；草甘膦抗性(shawetal.,science233:478-481,1986)；草銨膦(phosphinothricin)抗性(deblocketal.,emboj.6:2513-2518,1987)，等的基因。供選擇基因使用的一個(gè)選項(xiàng)是編碼草胺膦抗性的dna，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，可以是處于木薯葉脈花葉病病毒啟動(dòng)子控制之下的草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(pat)、玉米優(yōu)化的pat基因或bar基因。這些基因賦予對雙丙氨膦(bioalaphos)的抗性。見wohllebenetal.,(1988)gene70:25-37)；gordonkammetal.,plantcell2:603；1990；uchimiyaetal.,biotechnology11:835,1993；whiteetal.,nucl.acidsres.18:1062,1990；spenceretal.,theor.appl.genet.79:625-631,1990；和anzaietal.,mol.gen.gen.219:492,1989。pat基因的一個(gè)版本是玉米優(yōu)化的pat基因，其在美國專利no.6,096,947中有描述。此外，可以使用這樣的標(biāo)記，其有助于鑒定含有編碼該標(biāo)記的多核苷酸的植物細(xì)胞。當(dāng)序列的存在產(chǎn)生可測量的產(chǎn)物，并且能夠產(chǎn)生產(chǎn)物而不會(huì)破壞植物細(xì)胞時(shí)，可以使用可評分的(scorable)或可篩選的(screenable)標(biāo)記。實(shí)例包括β-葡糖醛酸酶或uida基因(gus)，其編碼一種酶，該酶有多種發(fā)色底物是已知的(例如，美國專利5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(jeffersonetal.theembojournalvol.6no.13pp.3901-3907)；和堿性磷酸酶。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的標(biāo)記是β-胡蘿卜素或維生素原a(yeetal.,science287:303-305(2000))。該基因已被用于提高稻米的營養(yǎng)，但在這里是使用它作為可篩選標(biāo)記，利用所提供的金黃色來檢測與感興趣基因連鎖的該基因的存在。與使用該基因?yàn)橹参镓暙I(xiàn)營養(yǎng)的情況不同的是，更小量的蛋白質(zhì)足以實(shí)現(xiàn)該目的。其它可篩選標(biāo)記包括一般的花青素/類黃酮的基因(見taylorandbriggs,theplantcell(1990)2:115-127中所討論的)，包括例如，r-座位基因，其編碼的產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)植物組織中花青素色素(紅色)的產(chǎn)生(dellaportaetal.,錄自chromosomestructureandfunction,kluweracademicpublishers,appelsandgustafsoneds.,pp.263-282(1988))；控制類黃酮色素生物合成的基因，如玉米c1基因(kaoetal.,plantcell(1996)8:11711179；scheffleretal.,mol.gen.genet.(1994)242:40-48)和玉米c2基因(wienandetal.,mol.gen.genet.(1986)203:202207)；b基因(chandleretal.,plantcell(1989)1:1175-1183)，p1基因(grotewoldetal.,proc.natl.acad.sciusa(1991)88:4587-4591；grotewoldetal.,cell(1994)76:543-553；sidorenkoetal.,plantmol.biol.(1999)39:11-19)；青銅色(bronze)座位基因(ralstonetal.,genetics(1988)119:185-197；nashetal.,plantcell(1990)2(11):1039-1049)，等等。合適標(biāo)記的其他實(shí)例包括青色熒光蛋白質(zhì)(cyp)基因(bolteetal.(2004)j.cellscience117:943-54和katoetal.(2002)plantphysiol129:913-42)，黃色熒光蛋白質(zhì)基因(來自evrogen公司的phiyfptm；見bolteetal.(2004)j.cellscience117:943-54)；lux基因，其編碼一種熒光素酶，該熒光素酶的存在可以通過使用，例如，x射線膠片、閃爍計(jì)數(shù)、熒光光度法、低光度攝像機(jī)、光子計(jì)數(shù)攝像機(jī)或多孔發(fā)光法等進(jìn)行檢測(teerietal.(1989)emboj.8:343)；綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)基因(sheenetal.,plantj.(1995)8(5):777-84)；和dsred2，用該標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞呈紅色，因此可以通過目測選擇(dietrichetal.(2002)biotechniques2(2):286293)。其它的實(shí)例包括β-內(nèi)酰胺酶基因(sutcliffe,proc.nat'l.acad.sci.u.s.a.(1978)75:3737)，其編碼各種發(fā)色底物已知的酶(例如padac，一種發(fā)色頭孢菌素)；xyle基因(zukowskyetal.,proc.nat'l.acad.sci.u.s.a.(1983)80:1101)，其編碼鄰苯二酚雙加氧酶，該酶能夠轉(zhuǎn)化發(fā)色兒茶酚；α-淀粉酶基因(ikutaetal.,biotech.(1990)8:241)；和酪氨酸酶基因(katzetal.,j.gen.microbiol.(1983)129:2703)，其編碼的酶能夠?qū)⒗野彼嵫趸蒬opa和多巴醌，后者進(jìn)一步縮合形成容易檢測的化合物黑色素。顯然，許多這樣的標(biāo)記是本領(lǐng)域技術(shù)人員可用并且知曉的。iv.包含dgt-28的細(xì)胞和生物在一些實(shí)施方案中，提供了細(xì)胞和/或生物(例如植物細(xì)胞或植物)，其包含與seqidno:1具有至少90％同一性的異源多肽。在特定的實(shí)施方案中，提供了細(xì)胞和/或生物，其包含編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的異源多肽的異源核酸；例如dgt-28核酸。一些實(shí)施方案包括這樣細(xì)胞和/或生物，其包含在高嚴(yán)格度條件下與另一個(gè)具有seqidno:2或seqidno:3的核酸雜交的異源核酸。植物細(xì)胞、植物部分、和/或植物可以通過本領(lǐng)域已知的多種導(dǎo)入異源核酸的方法中的任何方法進(jìn)行遺傳修飾，從而包含異源多肽(例如，dgt-28蛋白)和/或異源核酸(例如，dgt-28-核酸)。在本文的特定實(shí)施方案中，通過選自例如但不限于轉(zhuǎn)化和選擇育種(例如回交育種)的方法向植物細(xì)胞、植物部分和/或植物中引入異源分子。任何植物物種或植物細(xì)胞均可被遺傳修飾從而包含本文的異源多肽和/或核酸。在一些實(shí)施方案中，這樣遺傳修飾的植物細(xì)胞不能夠再生而產(chǎn)生植株。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本公開遺傳修飾的植物(例如植物宿主細(xì)胞)包括，但不限于，高等植物、雙子葉植物、單子葉植物、可消費(fèi)植物(consumable-plant)、作物植物、和油料植物(例如含油種子植物)。這樣的植物包括，例如但不限于：苜蓿；大豆；棉花；油菜籽(加拿大油菜)；亞麻籽；玉米；水稻；臂形草屬(brachiaria)；小麥；紅花；高粱；甜菜；向日葵；煙草；和草(例如，草坪草)。在特定的實(shí)例中，本文中經(jīng)過遺傳修飾的植物細(xì)胞或植物包括，例如但不限于：歐洲油菜(brassicanapus)；印度芥菜(brassicajuncea)；埃塞俄比亞芥菜(brassicacarinata)；蘿卜(brassicarapa)；甘藍(lán)(brassicaoleracea)；大豆(glycinemax)；亞麻(linumusitatissimum)；玉米(zeamays)；紅花(carthamustinctorius)；向日葵(helianthusannuus)；煙草(nicotianatabacum)；擬南芥(arabidopsisthaliana)，巴西堅(jiān)果(betholettiaexcelsa)；蓖麻子(ricinuscommunis)；椰子(cocusnucifera)；香菜(coriandrumsativum)；棉花屬(gossypiumspp.)；花生(arachishypogaea)；希蒙得木(simmondsiachinensis)；油棕(elaeisguineeis)；橄欖(oleaeurpaea)；水稻；筍瓜(cucurbitamaxima)；大麥(hordeumvulgare)；甘蔗(saccharumofficinarum)；小麥屬(包括硬粒小麥(triticumdurum)和普通小麥(triticumaestivum))；和浮萍(lemnaceaesp.)。在某些實(shí)施方案中，植物可以具有特定的遺傳背景，如優(yōu)良栽培種、野生型栽培種，和商業(yè)上可區(qū)分的品種。可以利用引入到植物細(xì)胞內(nèi)的核酸向幾乎任何植物賦予期望的性狀。利用編碼dgt多肽的核酸和各種轉(zhuǎn)化方法，可以對多種植物或植物細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行工程化，以獲得本文所述的期望的生理學(xué)和農(nóng)藝學(xué)特征。本文的實(shí)施方案可以使用本領(lǐng)域眾多轉(zhuǎn)化植物(以及產(chǎn)生遺傳修飾的植物)的方法中的任何方法。已經(jīng)開發(fā)出了大量用于植物轉(zhuǎn)化的方法，包括用于雙子葉植物以及單子葉植物的生物和物理轉(zhuǎn)化方案(見，例如，gotofumiyukietal.(1999)nat.biotechnol.17:282-6；mikietal.(1993)methodsinplantmolecularbiologyandbiotechnology(glick,b.r.andthompson,j.e.,eds.),crcpress,inc.,bocaraton,fl,pp.67-88)。此外，在例如gruberetal.(1993),同上,第89-119頁記載了用于植物細(xì)胞和組織轉(zhuǎn)化和再生的載體和體外培養(yǎng)方法。可用于將核酸導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)包括，例如但不限于：用根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌的卸甲t-dna作為轉(zhuǎn)化劑轉(zhuǎn)化；磷酸鈣轉(zhuǎn)染；聚凝胺轉(zhuǎn)化；原生質(zhì)體融合；電穿孔(d'halluinetal.(1992)plantcell4:1495-505)；超聲波方法(例如，超聲穿孔(sonoporation))；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化；顯微注射；與裸dna接觸；與質(zhì)粒載體接觸；與病毒載體接觸；基因槍法(例如，dna粒子轟擊(見，例如kleinetal.(1987)nature327:703)和微粒轟擊(sanfordetal.(1987)part.sci.technol.5:27；sanford(1988)trendsbiotech.6:299,sanford(1990)physiol.plant79:206；andkleinetal.(1992)biotechnology10:268)；碳化硅晶須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(kaeppleretal.(1990)plantcellrep.9:415-8)；納米顆粒轉(zhuǎn)化(見，例如，美國專利公開號no.us2009/0104700a1)；氣溶膠射線轉(zhuǎn)化；和聚乙二醇(peg)介導(dǎo)的攝取。在具體的實(shí)例中，可直接將異源核酸引入到植物細(xì)胞的基因組dna中。一種廣泛使用的將表達(dá)載體引入到植物中的方法是基于土壤桿菌的自然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。horschetal.(1985)science227:1229。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是已知可用于遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物致病性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌各自的ti和ri質(zhì)粒攜帶有負(fù)責(zé)對植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因。kado(1991)crit.rev.plant.sci.10:1。關(guān)于土壤桿菌載體系統(tǒng)和用于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的方法的詳細(xì)說明也可以在例如下列文獻(xiàn)中獲得：gruberetal.,同上,mikietal.,同上,moloneyetal.(1989)plantcellreports8:238,和美國專利nos.4,940,838和5,464,763。如果使用土壤桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，那么通常將待插入的dna克隆入特殊的質(zhì)粒中，或者是插入中間載體或者是插入二元載體。中間載體不能在土壤桿菌中自我復(fù)制。中間載體可以通過利用輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌內(nèi)(接合(conjugation))。日本煙草超二元系統(tǒng)是這種系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例(綜述參見，komarietal.(2006)methodsinmolecularbiology(k.wang,編輯)no.343；agrobacteriumprotocols,第2版，第1卷,humanapressinc.,totowa,nj,pp.15-41；和komorietal.(2007)plantphysiol.145:1155-60)。二元載體能夠在大腸桿菌和土壤桿菌中自我復(fù)制。二元載體包含選擇標(biāo)記基因和由tdna的左右邊界區(qū)框定的接頭或多接頭。它們能夠被直接轉(zhuǎn)化到土壤桿菌中(holsters,1978)。土壤桿菌含有攜帶vir區(qū)域的質(zhì)粒。ti或ri質(zhì)粒也包含轉(zhuǎn)移tdna必需的vir區(qū)。vir區(qū)是將t-dna轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中必需的。可以包含額外的t-dna。當(dāng)使用二元t-dna載體(bevan(1984)nuc.acidres.12:871121)或共培養(yǎng)程序(horschetal.(1985)science227:122931)讓細(xì)菌感染細(xì)胞時(shí)，根癌土壤桿菌宿主的毒力功能將會(huì)令含有構(gòu)建體和近鄰的標(biāo)記的t-鏈插入到植物細(xì)胞dna中。一般地，土壤桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用于對雙子葉植物進(jìn)行工程化。bevanetal.(1982)ann.rev.genet16:357-84；rogersetal.(1986)methodsenzymol.118:627-41。土壤桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也可用于將核酸轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移到單子葉植物和植物細(xì)胞中。參見，美國專利no.5,591,616；hernalsteenetal.(1984)emboj3:3039-41；hooykassvanslogterenetal.(1984)nature311:763-4；grimsleyetal.(1987)nature325:1677-9；boultonetal.(1989)plantmol.biol.12:3140；和gouldetal.(1991)plantphysiol.95:426-34。本文中重組宿主的遺傳操作可以使用通用的遺傳技術(shù)和篩選來進(jìn)行，并且可以在任何適于遺傳操作的宿主細(xì)胞中實(shí)施。在一些實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞可以是任何適合于基因修飾和/或重組基因表達(dá)的生物或微生物宿主。在一些實(shí)施方案中，重組宿主可以是植物。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組dna和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并且在下列文獻(xiàn)中有描述，例如，但不限于：sambrook等(1989)，同上；silhavy等(1984)experimentswithgenefusions，coldspringhaborlaboratorypress,coldspringharbor,ny；和ausubel等(1987)currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassoc.andwileyinterscience,newyork,ny。在將核酸導(dǎo)入到植物細(xì)胞中之后，可以使植物細(xì)胞生長，且當(dāng)分化的組織(例如芽和根)出現(xiàn)時(shí)，能夠產(chǎn)生成熟的植物。在一些實(shí)施方案中，可以產(chǎn)生多個(gè)植物。用于再生植株的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并可以在如下的文獻(xiàn)中找到：plantcellandtissueculture,1994,vasilandthorpeed.kluweracademicpublishers，和plantcellcultureprotocols(methodsinmolecularbiology111,1999halled.，humanapress)。本文所述的遺傳修飾植物可以在在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或者在合適的培養(yǎng)基例如土壤中生長。在一些實(shí)施方案中，用于高等植物的合適生長培養(yǎng)基可以是任何植物生長培養(yǎng)基，包括但不限于，土壤、砂、任何其它可支持根生長的顆粒介質(zhì)(例如蛭石、珍珠巖等)或水培養(yǎng)基，以及合適的光、水和促進(jìn)高等植物生長的營養(yǎng)補(bǔ)充劑。對于通過上述任何一種轉(zhuǎn)化技術(shù)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，可以進(jìn)行培養(yǎng)以再生具有轉(zhuǎn)化基因型、因而具有期望表型的完整植物。這種再生技術(shù)依賴于對組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中某些植物激素的操縱，典型地依賴于已經(jīng)與期望的核苷酸序列一起被引入的殺生物劑和/或除草劑標(biāo)記。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生植株在下列文獻(xiàn)中有描述：evans,etal.,"protoplastsisolationandculture"inhandbookofplantcellculture,124-176頁,macmillianpublishingcompany,newyork,1983；和binding,regenerationofplants,plantprotoplasts,21-73頁,crcpress,bocaraton,1985。再生也可以從植物愈傷組織、外植體、器官、花粉、胚或其部分獲得。這樣的再生技術(shù)在kleeetal.(1987)ann.rev.ofplantphys.38:467486中有一般性的描述。在其它實(shí)施方案中，被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞不能夠再生產(chǎn)生植物。這些細(xì)胞可用于，例如，開發(fā)具有相關(guān)表型(例如除草劑抗性)的植物細(xì)胞系。可以通過對工程化的植物材料進(jìn)行選擇或篩選，利用轉(zhuǎn)化dna上存在的標(biāo)記基因所編碼的性狀來鑒定和分離轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織、或植物。例如，可以通過在含有抑制量的抗生素或除草劑(轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建體提供對該抗生素或除草劑的耐受性)的培養(yǎng)基上培育工程化的植物材料來實(shí)施選擇。此外，還可以通過篩選重組核酸構(gòu)建體上存在的任何可見的標(biāo)記基因(例如β-葡糖苷酸酶、熒光素酶或gfp基因)的活性，來鑒定轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞。這些選擇和篩選方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。含有本文的異源分子的轉(zhuǎn)基因植物可以通過選擇性育種來產(chǎn)生，例如，通過含有該分子的第一親本植物與第二親本植物有性雜交，由此產(chǎn)生多個(gè)第一子代植物。然后選擇可以抵抗選擇標(biāo)記(例如草甘膦，本文的異源分子可以賦予子代植物對它的抗性)的第一子代植物。然后可以使第一子代植物自交，從而產(chǎn)生多個(gè)第二子代植物。然后，可以選擇可抵抗選擇標(biāo)記的第二子代植物。這些步驟可以進(jìn)一步包括使第一子代植物或第二子代植物與第二親本植物或第三親本植物回交。還應(yīng)當(dāng)理解，兩種不同的轉(zhuǎn)基因植物也可以交配以產(chǎn)生含有兩個(gè)獨(dú)立分離的、疊加的外源基因的后代。適當(dāng)后代的自交能夠產(chǎn)生對兩個(gè)疊加外源基因而言均為純合子的植物。還構(gòu)想了與親本植物的回交和與非轉(zhuǎn)化植物的異交(out-crossing)，以及無性繁殖。通常用于不同性狀和作物的其他育種方法是本領(lǐng)域已知的。回交育種已經(jīng)被用于將簡單遺傳的(simplyherited)、高度可遺傳的(highlyinheritable)性狀的基因轉(zhuǎn)移到合意的純合栽培種或近交系(即為輪回親本)中。所得的植物預(yù)期具有輪回親本(例如栽培種)的屬性以及從供體親本轉(zhuǎn)移來的期望性狀。初始雜交后，選擇具有供體親本表型的個(gè)體，并與輪回親本反復(fù)雜交(回交)。所得親本預(yù)期將具有輪回親本(例如栽培種)的屬性和從供體親本轉(zhuǎn)移來的期望性狀。核酸也可以通過同源重組被引入到植物基因組的預(yù)定區(qū)域內(nèi)。通過同源重組將多核苷酸序列穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞的特定染色體位點(diǎn)中的方法在本領(lǐng)域中已有描述。例如，在美國專利申請公開號no.2009/0111188a1中描述的位點(diǎn)特異性整合涉及使用重組酶或整合酶來介導(dǎo)將供體多核苷酸序列引入到染色體靶中。另外，國際專利申請?zhí)杗o.wo2008/021207描述了鋅指介導(dǎo)的同源重組，用來一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸序列穩(wěn)定地整合到基因組的特定位置內(nèi)。使用重組酶，例如美國專利no.6,720,475中描述的flp/frt，或美國專利no.5,658,772中描述的cre/lox，可用于將多核苷酸序列穩(wěn)定整合到特定的染色體位點(diǎn)。最后，在puchtaetal.,pnasusa93(1996)pp.5055-5060)中描述了使用大范圍核酸酶(meganuclease)將供體多核苷酸導(dǎo)向到特定的染色體位置。用于在植物細(xì)胞內(nèi)位點(diǎn)特異性整合的其它不同方法是公知的，并且可以適用(kumaretal.,trendsinplantsci.6(4)(2001)pp.155-159)。此外，在多種原核生物和低等真核生物中業(yè)已鑒定的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)可以在植物中應(yīng)用。這類系統(tǒng)的實(shí)例包括，但不限于：來自魯氏接合酵母psr1質(zhì)粒的r/rs重組酶系統(tǒng)(arakietal.(1985)j.mol.biol.182:191-203)，和噬菌體mu的gin/gix系統(tǒng)(maeserandkahlmann(1991)mol.gen.genet.230:170-176)。在一些實(shí)施方案中，編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽的異源核酸可以在宿主細(xì)胞和/或生物內(nèi)任選地與另一種核酸組合。例如，在某些實(shí)施方案中，編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽的異源核酸可以和另一種核酸組合或“疊加”，其中另一種核酸可以提供針對草甘膦或其它除草劑的額外的耐受性或抗性，和/或提供對選定的昆蟲或疾病的抗性，和/或提供營養(yǎng)強(qiáng)化，和/或提供改良的農(nóng)藝特征，和/或提供額外的可用于飼料、食物、工業(yè)、藥物或其它用途的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。植物基因組中兩個(gè)或多個(gè)感興趣的核酸序列的“疊加”可以通過例如下列手段來實(shí)現(xiàn)：使用兩個(gè)或更多個(gè)事件的常規(guī)植物育種、用含有核酸的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物、轉(zhuǎn)基因植物的再轉(zhuǎn)化、或通過借助同源重組的導(dǎo)向整合來添加新的性狀?？梢院途幋a與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽的異源核酸“疊加”的核酸包括，例如但不限于：賦予害蟲或疾病抗性的基因或編碼序列(例如irna)(a)植物疾病抗性基因。植物防御經(jīng)常通過植物中疾病抗性基因(r)的產(chǎn)物與病原體中相應(yīng)的無毒性(avr)基因的產(chǎn)物的特異相互作用而被激活?？梢杂每寺〉目剐曰蜣D(zhuǎn)化植物品種，從而工程構(gòu)建對特定病原體株有抗性的植物。這些基因的實(shí)例包括：提供黃枝孢霉(cladosporiumfulvum)抗性的番茄cf-9基因(jonesetal.,1994science266:789)；，提供丁香假單胞桿菌番茄致病變種抗性的番茄pto基因，其編碼一種蛋白激酶(martinetal.,1993science262:1432)，和提供丁香假單胞菌抗性的擬南芥rssp2基因(mindrinosetal.,1994cell78:1089)。(b)蘇云金芽孢桿菌蛋白質(zhì)、其衍生物或以其為模本的人造多肽，例如btδ-內(nèi)毒素基因的多核苷酸序列(geiseretal.,1986gene48:109)和植物殺蟲(vip)基因(見，例如，estruchetal.(1996)proc.natl.acad.sci.93:5389-94)。此外，編碼δ-內(nèi)毒素基因的dna分子可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(rockville,md.)購得，atcc登錄號為40098，67136，31995和31998。(c)植物凝集素，例如，多種君子蘭(cliviaminiata)甘露糖結(jié)合性植物凝集素基因的核苷酸序列(vandammeetal.,1994plantmolec.biol.24:825)。(d)維生素結(jié)合蛋白質(zhì)，例如親和素及親和素同源物，其可用作針對昆蟲類害蟲的殺幼蟲劑。見美國專利no.5,659,026。(e)酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。這些基因的實(shí)例包括水稻半胱氨酸蛋白質(zhì)酶抑制劑(abeetal.,1987j.biol.chem.262:16793)，煙草蛋白酶抑制劑i(huubetal.,1993plantmolec.biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制劑(sumitanietal.,1993biosci.biotech.biochem.57:1243)。(f)昆蟲特異性激素或信息素，例如蛻皮激素和保幼激素或其變體、基于它們的模擬物，或其拮抗劑或激動(dòng)劑，例如桿狀病毒表達(dá)的克隆保幼激素酯酶，保幼激素的失活子(hammocketal.,1990nature344:458)。(g)昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)時(shí)會(huì)擾亂受影響的害蟲的生理機(jī)能(j.biol.chem.269:9)。這些基因的實(shí)例包括昆蟲利尿激素受體(regan,1994)，在太平洋折翅蠊(diplopterapunctata)中鑒定的咽側(cè)體抑制素(allostatin)(pratt,1989)，和昆蟲特異性麻痹神經(jīng)毒素(美國專利no.5,266,361)。(h)在自然界中由蛇、馬蜂等產(chǎn)生的昆蟲特異性毒液，例如蝎子昆蟲毒性肽(pang,1992gene116:165)。(i)負(fù)責(zé)超富集單萜、倍半萜、甾體、異羥肟酸、苯丙烷衍生物或其它具有殺蟲活性的非蛋白質(zhì)分子的酶。(j)參與生物活性分子修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如糖酵解酶、蛋白質(zhì)水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶，無論是天然的還是人造的。這些基因的實(shí)例包括馬蹄蓮(callas)基因(pct公開的申請wo93/02197)，幾丁質(zhì)酶編碼序列(其可以從例如atcc以登錄號3999637和67152獲得)，煙草鉤蟲幾丁質(zhì)酶(krameretal.,1993insectmolec.biol.23:691)，和歐芹ubi4-2多聚泛素基因(kawallecketal.,1993plantmolec.biol.21:673)。(k)刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。這些分子的實(shí)例包括綠豆鈣調(diào)蛋白cdna克隆的核苷酸序列(botellaetal.,1994plantmolec.biol.24:757)，和玉米鈣調(diào)蛋白cdna克隆的核苷酸序列(griessetal.,1994plantphysiol.104:1467)。(l)疏水矩肽(hydrophobicmomentpeptide)。見例如美國專利nos.5,659,026和5,607,914，后者教導(dǎo)了賦予疾病抗性的人造抗微生物肽。(m)膜透性酶，通道形成劑或通道阻斷劑，例如殺菌肽-β裂解肽類似物(jaynesetal.,1993plantsci.89:43)，其使轉(zhuǎn)基因煙草植物對青枯病有抗性。(n)病毒侵襲性蛋白質(zhì)或由其衍生的復(fù)雜毒素。例如，在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中，病毒衣殼蛋白的積累可賦予針對該衣殼蛋白所來源的病毒以及相關(guān)病毒所致的病毒感染和/或疾病發(fā)展的抗性。已經(jīng)給轉(zhuǎn)化植物賦予了衣殼蛋白介導(dǎo)的，針對苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草條紋病毒、馬鈴薯x病毒、馬鈴薯y病毒、煙草蝕紋病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的抗性。參見，例如，beachyetal.(1990)ann.rev.phytopathol.28:451。(o)昆蟲特異性抗體或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆蟲腸道關(guān)鍵代謝功能的抗體可以使受影響的酶失活，殺死昆蟲。例如，taylor等人(1994)，在第七屆國際分子植物-微生物相互作用研討會(huì)(seventhint'l.symposiumonmolecularplantmicrobeinteractions)上的第497號摘要顯示了轉(zhuǎn)基因煙草中通過產(chǎn)生單鏈抗體片段的酶失活。(p)病毒特異性抗體。見例如tavladorakietal.(1993)nature266:469，其顯示了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物被保護(hù)免于病毒攻擊。(q)由病原體或寄生物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmental-arrestive)蛋白質(zhì)。因此，真菌內(nèi)切α-1,4-d多聚半乳糖醛酸酶通過溶解植物細(xì)胞壁的均聚-α-1,4-d-半乳糖醛酸而促進(jìn)真菌定殖和植物營養(yǎng)素釋放(lambetal.,1992)bio/technology10:1436。toubart等(1992plantj.2:367)描述了豆類內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的編碼基因的克隆和表征。(r)由植物自然產(chǎn)生的發(fā)育阻滯(developmental-arrestive)蛋白質(zhì)，例如大麥核糖體失活基因，其提供了增加的針對真菌疾病的抗性(longemannetal.,1992).bio/technology10:3305。(s)rna干擾，其中用rna分子抑制靶基因的表達(dá)。一個(gè)實(shí)施例中的rna分子是部分或完全雙鏈的，其觸發(fā)沉默響應(yīng)，導(dǎo)致dsrna被切割成小的干擾rna，它們隨后被納入到靶向復(fù)合體中，靶向復(fù)合體破壞同源的mrna。見例如fire等人，美國專利6,506,559；graham等人，6,573,099。賦予除草劑抗性的基因(a)編碼針對抑制生長點(diǎn)或分生組織的除草劑，例如咪唑啉酮類(imidazalinone)、磺酰苯胺類(sulfonanilide)或磺酰脲類除草劑的抗性或耐受性的基因。這類基因的實(shí)例編碼一種突變的als酶(leeetal.,1988emboj.7:1241)，其也被稱作ahal酶(mikietal.,1990theor.appl.genet.80:449)。(b)一種或多種額外的編碼針對草甘膦抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性是由突變體epsp合酶和aroa基因賦予的，或者是通過一些基因如gat(草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)或gox(草甘膦氧化酶)和其它膦酰基化合物，如草胺膦(pat和bar基因；dsm-2)，和芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酮(acc酶抑制劑編碼基因)所致的代謝失活而獲得的。見例如美國專利no.4,940,835，其公開了可賦予草甘膦抗性的epsp形式的核苷酸序列。編碼突變體aroa基因的dna分子能夠以atcc登錄號39256獲得，突變體基因的核苷酸序列在美國專利no.4,769,061中公開。歐洲專利申請no.0333033和美國專利no.4,975,374公開了可賦予除草劑如l-草銨膦抗性的谷氨酰胺合酶基因的核苷酸序列。歐洲專利申請no.0242246提供了草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。degreefetal.(1989)bio/technology7:61中描述了表達(dá)編碼草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。賦予針對芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酮如稀禾定和甲禾靈(haloxyfop)的抗性的示例性基因是accl-s1,accl-s2和accl-s3基因，如marshalletal.(1992)theor.appl.genet.83:435所述。(c)編碼針對可抑制光合作用的除草劑例如三嗪(psba和gs+基因)和芐腈(腈水解酶基因)的抗性的基因。przibillaetal.(1991)plantcell3:169描述了使用編碼突變體psba基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣藻。在美國專利no.4,810,648中公開了腈水解酶基因的核苷酸序列，含有這些基因的dna分子可以通過atcc登錄號53435、67441和67442獲得。hayesetal.(1992)biochem.j.285:173中描述了編碼谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶的dna的克隆和表達(dá)。(d)編碼針對可結(jié)合羥基苯基丙酮酸二加氧酶(hppd)的除草劑的抗性基因，hppd是催化對-羥基苯基丙酮酸(hpp)轉(zhuǎn)化形成尿黑酸的反應(yīng)的酶。這包括例如異噁唑(ep418175,ep470856,ep487352,ep527036,ep560482,ep682659,美國專利no.5,424,276)，特別是異噁唑草酮，其是玉米的選擇性除草劑，二酮腈(diketonitrile)(ep496630,ep496631)，特別是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-so2ch3-4-cf3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-so2ch3-4-2,3cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮類(ep625505，ep625508，美國專利no.5,506,195)，特別是磺草酮、和pyrazolinate等除草劑。在植物中產(chǎn)生過量hppd的基因能夠提供針對這些除草劑的耐受性或抗性，包括例如美國專利nos.6,268,549和6,245,968和美國專利申請公開no.20030066102中描述的基因。(e)編碼針對苯氧基生長素除草劑，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)的抗性或耐受性的基因，其也可以賦予針對芳氧基苯氧基丙酸類(aopp)除草劑的抗性或耐受性。這些基因的實(shí)例包括α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-1)基因，如美國專利no.7,838,733所述。(f)編碼針對苯氧基生長素除草劑如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)的抗性或耐受性的基因，其也可以賦予針對吡啶基氧基生長素除草劑，如氟草煙或綠草定的抗性或耐受性。這些基因的實(shí)例包括α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶(aad-12)基因，如wo2007/053482-a2所述。(g)編碼針對麥草畏的抗性或耐受性的基因(見例如美國專利公開no.20030135879)。(h)編碼針對抑制原卟啉原氧化酶(ppo)的除草劑的抗性或耐受性的基因(見美國專利no.5,767,373)。(i)提供針對可結(jié)合光系統(tǒng)ii反應(yīng)中心(psii)核心蛋白質(zhì)的三嗪除草劑(例如莠去津)和尿素衍生物(如敵草隆)除草劑的抗性或耐受性的基因。見brussianetal.,(1989)emboj.1989,8(4):1237-1245?？少x予或貢獻(xiàn)數(shù)量疊加性狀(valueaddedtrait)的基因(a)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用反義基因或硬脂酰-acp去飽和酶轉(zhuǎn)化玉米或蕓苔屬植物從而增加植物的硬脂酸含量(knultzonetal.,1992)proc.nat.acad.sci.usa89:2624。(b)降低的植酸含量(1)引入植酸酶編碼基因，如黑曲霉植酸酶基因(vanhartingsveldtetal.,1993gene127:87)，提高植酸降解，向被轉(zhuǎn)化植物添加更多游離磷酸鹽。(2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，這可以通過，例如，克隆然后重新導(dǎo)入如下所述的單個(gè)等位基因的相關(guān)dna來實(shí)現(xiàn)：該單個(gè)等位基因?qū)е乱灾菜崴降蜑樘卣鞯挠衩淄蛔凅w的原因(raboyetal.,1990maydica35:383)。(c)改良的碳水化合物組成，例如通過用編碼改變淀粉的分支模式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物而實(shí)現(xiàn)。這些酶的實(shí)例包括，粘液鏈球菌(streptococcusmucus)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(shirozaetal.,1988)j.bacteriol.170:810，枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(steinmetzetal.,1985mol.gen.genel.200:220)，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(penetal.,1992bio/technology10:292)，番茄轉(zhuǎn)化酶基因(elliotetal.,1993),大麥淀粉酶基因(sogaardetal.,1993j.biol.chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶ii(fisheretal.,1993plantphysiol.102:10450)。各種測定方法可以和本公開的某些實(shí)施方案中的核酸分子聯(lián)合使用。下面的技術(shù)在多種情況下有用，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，可用于檢測植物細(xì)胞中核酸分子和/或編碼多肽的存在。例如，分子的存在可以通過多種方法加以確定，包括使用序列的引物或探針、elisa測定檢測編碼的蛋白質(zhì)、western印跡檢測蛋白質(zhì)、或northern或southern印跡檢測rna或dna?？梢圆捎糜糜跈z測酶dgt-28的酶學(xué)測定。另外，可以使用本領(lǐng)域中確立的程序產(chǎn)生能夠檢測dgt-28蛋白質(zhì)存在的抗體。其它技術(shù)，例如原位雜交、酶染色和免疫染色，也可以用于檢測特定植物器官或組織中重組構(gòu)建體的存在或表達(dá)。轉(zhuǎn)基因可以在植物的一些組織或一定的發(fā)育階段中選擇性表達(dá)，或者轉(zhuǎn)基因可以在基本上所有植物組織中、基本上在其整個(gè)生命循環(huán)中表達(dá)。然而，任何組合表達(dá)模式也可以使用。southern分析是一種常用的檢測方法，其中dna用限制性內(nèi)切核酸酶切割，并在瓊脂糖凝膠上分級，以通過分子量分離dna，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。然后，用32p(或其它探針標(biāo)記)放射性標(biāo)記的探針片段雜交，并在sds溶液中洗滌。類似地，northern分析采用類似的方案，其中rna用限制性內(nèi)切核酸酶切割，并在瓊脂糖凝膠上分級，通過分子量分離rna，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。然后，用32p(或其它探針標(biāo)簽)放射性標(biāo)記的探針片段雜交，并在sds溶液中洗滌。對從感興趣的組織分離的rna(例如，mrna)的分析能夠指示相對表達(dá)水平。典型地，如果mrna存在或mrna的量增加，則可以假設(shè)相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因被表達(dá)。northern分析，或其他mrna分析方案，可以用于確定被引入的轉(zhuǎn)基因或天然基因的表達(dá)水平。在western分析中，不是分離dna/rna，而是提取感興趣的蛋白質(zhì)并置于丙烯酰胺凝膠上。隨后把蛋白質(zhì)印跡到膜上并與標(biāo)記底物接觸。參見，例如hood等,“commercialproductionofavidinfromtransgenicmaize；characterizationoftransformants,production,processing,extractionandpurification”molecularbreeding3:291306(1997)；towbin等(1979)“electrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:procedureandsomeapplications”procnatlacadsciusa76(9):4350-4354；renart等.“transferofproteinsfromgelstodiazobenzyloxymethylpaperanddetectionwithantisera:amethodforstudyingantibodyspecificityandantigenstructure”procnatlacadsciusa76(7):3116-3120。本文的核酸或其片段可用于設(shè)計(jì)用于pcr擴(kuò)增的引物。在進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)，引物與模板之間可以忍受一定程度的錯(cuò)配?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法在給定的引物中產(chǎn)生突變、插入和缺失。檢測方法的另一個(gè)實(shí)例是焦磷酸測序技術(shù)，如winge(innov.pharma.tech.00:1824,2000)所述。在該方法中，設(shè)計(jì)一個(gè)與相鄰的基因組dna和插入物dna接點(diǎn)重疊的寡核苷酸。將該寡核苷酸與來自感興趣的區(qū)域的單鏈pcr產(chǎn)物雜交(一個(gè)引物在插入序列內(nèi)，一個(gè)引物在側(cè)翼基因組序列內(nèi))，并在dna聚合酶、atp、硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、腺苷5'磷酰硫酸和熒光素的存在進(jìn)行溫育。各別地添加各種dntp，摻入產(chǎn)生光信號，測量該光信號。由于成功的擴(kuò)增、雜交和單堿基或多堿基延伸，該光信號指示轉(zhuǎn)基因插入物/側(cè)翼序列的存在。分子信標(biāo)已被描述用于序列檢測。簡要地說，設(shè)計(jì)與側(cè)翼基因組和插入物dna接點(diǎn)重疊的fret寡核苷酸探針。fret探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致它含有一種使熒光部分和淬滅部分保持非常靠近的二級結(jié)構(gòu)。對fret探針和pcr引物(一個(gè)引物在插入dna序列內(nèi)，一個(gè)引物在側(cè)翼基因組序列內(nèi))在熱穩(wěn)定聚合酶和dntp的存在下進(jìn)行循環(huán)。在成功的pcr擴(kuò)增之后，fret探針與靶序列的雜交導(dǎo)致探針的二級結(jié)構(gòu)被除去，并且熒光部分和淬滅部分空間分離。由于成功的擴(kuò)增和雜交，熒光信號指示側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。水解探針測定，或者也稱作(lifetechnologies,fostercity,calif.)，是一種檢測和定量dna序列之存在的方法。簡要地說，設(shè)計(jì)fret寡核苷酸探針，其具有一段在轉(zhuǎn)基因內(nèi)的寡聚體，一段在側(cè)翼基因組序列內(nèi)的寡聚體，用于事件特異性檢測。將fret探針和pcr引物(一個(gè)引物在插入dna序列內(nèi)，一個(gè)引物在側(cè)翼基因組序列內(nèi))在熱穩(wěn)定聚合酶和dntp的存在下進(jìn)行循環(huán)。fret探針的雜交導(dǎo)致熒光部分從fret探針上的淬滅部分被切斷并釋放。由于成功的擴(kuò)增和雜交，熒光信號指示側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。elisa或酶聯(lián)免疫法自1971年以來已為人所知。一般地，將溶解在緩沖液中的抗原包被在塑料表面上。當(dāng)添加血清時(shí)，抗體可以附著在固相上的抗原上。當(dāng)這些抗體與酶綴合時(shí)，抗體的存在與否可以得到展示。加入適當(dāng)?shù)牡孜锟梢詸z測結(jié)合的綴合物的量，后者可以被定量。一種常見的elisa測定法是使用生物素化的抗-(蛋白質(zhì))多克隆抗體和堿性磷酸酶綴合物的方法。例如，用于定量測定漆酶水平的eilsa可以是一種抗體夾心測定法，其采用商購的多克隆兔抗體。該抗體與堿性磷酸酶綴合以便于檢測。另一個(gè)實(shí)例中是用于檢測胰蛋白酶或胰蛋白酶原的elisa測定法，其使用生物素化的抗胰蛋白酶或抗胰蛋白酶原多克隆抗體、以及鏈霉親和素-堿性磷酸酶綴合物。某些實(shí)施方案涉及使用本公開的一個(gè)實(shí)施方案的植物作為至少一個(gè)親本來進(jìn)行雜交的過程。例如，特定的實(shí)施方案涉及f1雜交植物，它的一個(gè)親本是、或兩個(gè)親本都是任何本文所舉例的植物。其它實(shí)施方案涉及這種f1雜交體產(chǎn)生的種子。還有其它的實(shí)施方案涉及通過用不同的(例如自交親本)植物與示例的植物雜交，并收獲所得的雜交體種子，來產(chǎn)生f1雜交體種子的方法。其它實(shí)施方案涉及作為母本或父本的示例植物。通過仔細(xì)斟酌親本植物，可以改善所得植物的特征。v.-由dgt-28介導(dǎo)的草甘膦抗性與seqidno:1具有至少90％序列同一性的多肽可以具有epsps酶活性。因此，在一些實(shí)施方案中可以使用與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽，編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽的核酸(例如,seqidnos:2-4)，和在高嚴(yán)格度條件下與具有seqidno:2或seqidno:3的核酸雜交的核酸，來賦予細(xì)胞或生物(例如植物細(xì)胞或植物)草甘膦耐受性。，提供對草甘膦除草制劑有抗性的植物或植物細(xì)胞在很多應(yīng)用中是有用的，在這些應(yīng)用中，具有該耐受性的植物細(xì)胞能夠耐受足以控制栽培區(qū)域內(nèi)的至少一些雜草的量的草甘膦。草甘膦是一種含有n-(膦?；谆?甘氨酸的組合物，是一種廣泛應(yīng)用的除草劑組分。草甘膦通常配制成含水液態(tài)濃縮物中的鹽、固體濃縮物、乳液或微乳液。從發(fā)芽開始在植物發(fā)育的各個(gè)階段，草甘膦可以對植物過頂(over-the-top)施用。在美國和全世界，草甘膦耐受性植物品種與草甘膦除草制劑的組合使用已經(jīng)成為作物生產(chǎn)中雜草管理的標(biāo)準(zhǔn)程序。種植者使用草甘膦耐受性狀的首要優(yōu)勢是，它允許簡單而方便地施用草甘膦——一種廣譜、萌發(fā)后使用的除草劑——以控制不想要的植物和草(即“雜草”)，并具有優(yōu)秀的作物安全性，且對種植前(pre-plant)除草劑施用的依賴性較小。其它的好處包括與免耕和少耕系統(tǒng)更好地配合。耐草甘膦作物擴(kuò)展了雜草管理的選項(xiàng)，使雜草控制工作更容易、更便宜、更靈活。已經(jīng)有種植者報(bào)道，施用除草劑所需的田間行程減少，并使栽培行程也減少，從而節(jié)省燃料并減少土壤侵蝕。因此，耐草甘膦的作物降低了除草劑導(dǎo)致的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)增加了必要的化學(xué)劑控制雜草的效力。因此，本文的一些實(shí)施方案可用于在包含植物的栽培區(qū)域內(nèi)對雜草的選擇性控制，其中該植物含有與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽，編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽的核酸，和/或在高嚴(yán)格度條件下與具有seqidno:2或seqidno:3的核酸雜交的核酸，其中該植物與相同物種的不含該多肽和/或核酸的植物相比，具有增加的草甘膦耐受性。在一些實(shí)施例中，本文提供的方法包括向作物葉和雜草施用足夠量的除草劑草甘膦，以控制雜草的生長。本文特定的實(shí)施方案提供了一種用于在含有作物的栽培區(qū)域內(nèi)殺死或控制雜草或不想要的植被的方法，其中該作物例如是含有與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽、編碼與seqidno:1具有至少90％同一性的多肽的核酸、和/或可以在高嚴(yán)格度條件下與具有seqidno:2或seqidno:3的核酸雜交的核酸的植物。在一些實(shí)例中，該方法包括向作物和/或栽培區(qū)域施用草甘膦；例如向作物葉施用一定量的草甘膦，同時(shí)向緊鄰這些植物的雜草施用草甘膦，其中該量足以導(dǎo)致對雜草或不想要的植被的控制，而同時(shí)基本上不傷害作物?？梢杂米阋垣@得期望的生物結(jié)果(例如控制雜草生長同時(shí)不會(huì)顯著影響草甘膦耐受作物)的施用比率向植物施用草甘膦組合物。這些施用比率通常用每單位處理面積上草甘膦的量表示，例如克每公頃(g/ha)。什么構(gòu)成“顯著效果”取決于研究、開發(fā)、銷售和使用組合物的人員的標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)踐，選擇令組合物顯著有效的施用比率屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技藝。在某些實(shí)例中，用每單位面積上施用的、導(dǎo)致某種雜草受到85％控制(以生長降低或死亡率為度量)的草甘膦組合物的量來定義施用比率。選擇足以控制栽培區(qū)域內(nèi)的雜草的若干草甘膦除草劑施用比率屬于普通農(nóng)業(yè)科技工作者的技藝。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)類似地認(rèn)識到，個(gè)體植物的狀況、天氣和生長條件、以及組合物中具體的活性成分及其重量比，會(huì)在具體施用中影響除草劑的有效性程度。在一些實(shí)施方案中，可以向植物葉組織施用含水草甘膦組合物以殺死或控制多種多樣的不期望植物(包括一年生和多年生草及闊葉雜草)的生長，通過向葉片組織施用含水草甘膦組合物。在構(gòu)想的除草劑組合物(例如，粒狀固體濃縮物、液態(tài)濃縮物、即用型組合物和桶混(tank-mix)組合物)中存在的草甘膦的活性量可以隨著許多因素而改變，包括例如，待控制的雜草物種和施用方法。然而，一般而言，草甘膦的濃度、以及任選地，用于除草劑組合物中的表面活性劑和/或某些其他的佐劑或添加劑(如本文其它地方所述)，足以控制栽培區(qū)域內(nèi)的雜草。除草劑噴霧組合物可以作為含水溶液或分散液施用，無論該組合物是生產(chǎn)成即用型，還是通過液體草甘膦濃縮物的進(jìn)一步稀釋或者向顆粒狀固體草甘膦濃縮物中添加水而產(chǎn)生的。然而，如本文所使用的，術(shù)語“含水”包括這樣的組合物，其中含有若干量的非水溶劑，只要存在的主要溶劑是水即可。除草劑噴霧組合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適的方法施用到待處理植物的葉片，包括飛行施用和地面施用技術(shù)(例如，地面噴桿(groundboom)、手動(dòng)噴霧器、芯吸(rope-wick))。在一些實(shí)施例中，液態(tài)濃縮組合物配制成含有如下濃度的草甘膦：每升至少大約50克,至少大約75克，或至少大約100,125,150,175,200,225,250,275,300,310,320,330,340,350,360,370,380,390,400,410,420,430,440,450,460,470,480,490,500,510,520,530,540,550,560,570,580,590,600,610,620,630,640,650,660,670,680,690或700克(酸當(dāng)量或稱a.e.)，或者更多。草甘膦濃度范圍可以是，例如，約50至約680克(a.e.)每升(gpl)，約100至約600gpl，約250至約600gpl，和約360至約540gpl。當(dāng)用基于草甘膦濃縮物總重的重量百分比表示時(shí)，液態(tài)濃縮物可以含有，例如，至少約10wt.％草甘膦(a.e.),至少約15wt.％,和至少約20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,62,63,64,65,66,67,或68wt.％，或者更多。草甘膦濃度范圍可以是，例如，約10wt.％至約70wt.％a.e.，約20wt.％至約68wt.％，或者約25wt.％至約45wt.％。如果草甘膦作為即用型組合物施用，那么草甘膦濃度可以是，例如，約1wt.％至約3wt.％a.e.，和約1wt.％至約2wt.％。噴灑組合物可以被配制成以，例如，至少約1加侖噴灑組合物每英畝，至少約2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20加侖每英畝和更多來施用。噴灑組合物噴灑體積可以是，例如，對于空中施用，約1加侖至約100加侖每英畝，約2加侖至約40加侖每英畝，和約2加侖至約5加侖每英畝，對于地面施用，約5加侖至約20加侖每英畝。在一些實(shí)例中，可以使用這樣的液態(tài)濃縮物制劑，其具有水相，其中草甘膦主要以鹽的形式存在；和非水相，其可任選地含有相對水不溶性的第二除草活性成分。這些制劑可以包括，例如，乳劑(包括粗乳液和微乳液、油包水、水包油和水包油包水型)、懸浮液和懸乳劑。在某些情況下，非水相可以包括微囊組分(例如，微膠囊化的除草劑)。在具有非水相的制劑中，組合物中草甘膦a.e.的整體濃度可能仍然是本文中就水相濃縮物制劑所列舉的特定示例范圍?？梢愿鶕?jù)任何制劑使用的草甘膦的合適鹽形式包括，例如，堿金屬鹽，例如鈉鹽和鉀鹽，銨鹽，二銨鹽如二甲基銨，烷基胺鹽例如二甲基胺和異丙基胺鹽，烷醇胺鹽例如乙醇胺鹽，烷基锍鹽例如三甲基锍鹽，氧化锍鹽，以及它們的混合物或它們的組合。草甘膦的商業(yè)制劑示例包括，但沒有限制：glyphomaxtm,glyphomaxtmxrt,glyphomaxtmplus,durangotm,rounduptmultra,rounduptmultramak,rounduptmct,rounduptmextra,rounduptmbioactive,rounduptmbioforce,rodeotm,polaristm,sparktm,accordtmsp,accordtmxrt,和accordtm濃縮物，所有這些都包含草甘膦的異丙銨鹽(ipa)；rounduptmdry和rivaltm，其含有草甘膦的銨鹽；rounduptmgeoforce，一種草甘膦鈉鹽制劑；touchdowntm，一種草甘膦三甲基硫鹽制劑；touchdowntmiq，一種草甘膦二銨鹽制劑，touchdowntmtotaliq，一種草甘膦鉀鹽制劑，和rounduptmweathermax，一種草甘膦鉀鹽制劑。草甘膦制劑可包括安全劑(safeningagent)、表面活性劑、和/或佐劑。如果期望，在制備供施用的制劑時(shí)，使用者可以將一種或多種佐劑與草甘膦組合物和稀釋水混合。這些佐劑可以包括額外的表面活性劑和/或無機(jī)鹽(例如硫酸銨)，目的是進(jìn)一步提高除草劑效力。如果期望，使用者還可以在草甘膦制劑中使用合適的安全劑，以進(jìn)一步保護(hù)植物和/或增加對更多種除草劑的交叉抗性。安全劑是可以通過生理或分子機(jī)制降低除草劑對作物的植物毒性的化學(xué)劑，而不會(huì)降低雜草控制效力。安全劑通常用于通過激活或表達(dá)cp450增加植物的免疫系統(tǒng)。示例性安全劑包括，例如但不限于：解草嗪、解毒喹、解草胺腈、二氯丙烯胺、1-二氯乙酰基-六氫-3,3,8a-三甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-6(2h)-酮(dicyclonon)、o,o-二乙基二硫代磷酸酯(dietholate)、解草唑、解草啶、解草胺、氟草肟、解草惡唑、雙苯惡唑酸、吡咯二酸(mefenpyr)、4-氯苯基甲基氨基甲酸酯(mephenate)、萘二甲酸酐、和解草腈。安全劑可用于保護(hù)大種子的禾本科作物，例如但不限于，玉米、高粱和濕播種水稻，免于種植前摻入的(preplant-incorporated)或萌發(fā)前施用(preemergence-applied)的硫代氨基甲酸鹽和氯代乙酰苯胺家族除草劑的損傷。還已開發(fā)安全劑用來保護(hù)冬季谷類作物，例如小麥，免于萌發(fā)后施用芳氧基苯氧基丙酸和磺酰脲除草劑的損傷。安全劑保護(hù)玉米和水稻免于磺酰脲、咪唑啉酮、環(huán)己二酮、異噁唑、和三酮除草劑的損傷的應(yīng)用也已經(jīng)得到了確立。植物激活劑(一類可以通過激活植物防御機(jī)制而保護(hù)植物的新型化合物)也可以用于本文的實(shí)施方案中。植物激活劑的實(shí)例包括阿拉酸式苯(acibenzolar)和噻菌靈(probenazole)。本發(fā)明的實(shí)施方案在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步限定。但應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅作為舉例說明給出。從上面的討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的必要特征，并且在不背離本發(fā)明精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行各種改變和修改，以使其適應(yīng)各種用途和條件。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)前面的描述，容易想到除本文顯示并描述的實(shí)施方案之外的本發(fā)明實(shí)施方案的各種修改。這些修改也應(yīng)落入所附的權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。以下是作為舉例說明提供的，而非意在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1：材料和方法本公開的實(shí)施方案將在下面的實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步的描述，這些實(shí)施例是作為舉例提供的，并不以任何方式意圖限制本發(fā)明。大腸桿菌5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(epsp合酶)中的一個(gè)單氨基酸突變(g96a)會(huì)導(dǎo)致草甘膦不敏感性(padgetteetal.,(1991)；eschenburgetal.,(2002)；priestmanetal.,(2005)；haghanietal.,(2008))。盡管該突變會(huì)賦予對草甘膦的耐受性，但是已知它也會(huì)不利地影響epsp合酶與其天然底物磷酸烯醇式丙酮酸(pep)的結(jié)合。結(jié)果造成的底物結(jié)合效率的改變會(huì)導(dǎo)致突變酶不適合于在植物內(nèi)提供對草甘膦的耐受性。在計(jì)算機(jī)上從ncbigenbank數(shù)據(jù)庫篩選這樣的epsp合酶蛋白質(zhì)和多核苷酸序列：在該epsp合酶中與大腸桿菌epsp合酶中引入的g96a突變類似的位置上，該epsp合酶天然地含有丙氨酸(padgetteetal.,(1991)；eschenburgetal.,(2002)；priestmanetal.,(2005)；haghanietal.,(2008))。被鑒定出在該位置含有天然丙氨酸的一種酶是來自斯維鏈霉菌(streptomycessviceus)atcc29083的dgt-28(genbank登錄號no:zp_06917240.1)。進(jìn)一步的計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)挖掘顯示了另外3個(gè)獨(dú)特的鏈霉菌酶，它們與dgt-28具有更大的同源性：dgt-31(genbankaccno:yp_004922608.1)；dgt-32(genbankaccno:zp_04696613)；和dgt-33(genbankaccno:nc_010572)。這些酶都在epsp合酶中與大腸桿菌版本的epsp合酶中引入的g96a突變類似的位置上含有天然的丙氨酸。圖1。因?yàn)閬碜圆煌锏膃psp合酶蛋白質(zhì)具有不同的長度，所以對大腸桿菌版本的epsp合酶的突變編號不一定與來自其它生物的epsp合酶的突變編號相對應(yīng)。這些鑒定的epsp合酶的草甘膦耐受性或pep底物親和力先前并未得到過表征。而且，這些epsp合酶代表了一類新的epsp合酶，其不含有任何已經(jīng)用于表征先前描述的i類(植物來源序列，在美國專利no.re39247中進(jìn)一步描述)、ii類(細(xì)菌來源序列，在美國專利no.re39247中進(jìn)一步描述)、和iii類(細(xì)菌來源序列，在國際專利申請wo2006/110586中進(jìn)一步描述)epsp合酶的序列基序。對新型dgt-28、dgt-31、dgt-32和dgt-33酶的草甘膦耐受性和pep底物親和性進(jìn)行了表征，并與i類epsp合酶進(jìn)行了比較。使用如下的i類酶進(jìn)行比較：來自大豆的dgt-1，來自歐洲油菜的dgt-3(genbank登錄號no:p17688)，來自小麥的dgt-7(genbank登錄號no:eu977181)。人造并評估了i類epsp合酶及其突變體。這些植物epsp合酶中導(dǎo)入的一個(gè)突變是在與大腸桿菌版本epsp合酶的g96a突變類似的位置處引入的甘氨酸到丙氨酸的突變。此外，在這些i類epsp合酶中與funkeetal.,(2009)所述的大腸桿菌epsp合酶的氨基酸97(t變?yōu)閕)和氨基酸101(p變?yōu)閟)類似的位置處，引入了蘇氨酸到異亮氨酸和脯氨酸到絲氨酸的突變。圖1描繪了dgt-28、dgt-31、dgt-32、和dgt-33與其它epsp合酶的部分序列比對結(jié)果。所有4種dgt酶均在aroa-epsp合酶的氨基酸位置96處有一個(gè)保守的丙氨酸。該氨基酸的位置用星號指示，并且該氨基酸殘基用下劃線標(biāo)示。圖2顯示了dgt-1、dgt-3和dgt-7酶的比對結(jié)果。第一個(gè)星號指示了從甘氨酸變成丙氨酸的突變氨基酸殘基的位置。第二個(gè)星號指示了從蘇氨酸變成異亮氨酸的突變氨基酸殘基的位置。第三個(gè)星號指示了從脯氨酸變成絲氨酸的第三個(gè)突變氨基酸殘基的位置。這些突變被引入到dgt-1、dgt-3和dgt-7的不同版本。含有突變的這些基因的不同版本(v1,-v2,-v3…-vn)將下文有更詳細(xì)的描述。實(shí)施例2:用于植物和細(xì)菌表達(dá)的序列優(yōu)化植物優(yōu)化.計(jì)算單一密碼子相對于所有氨基酸的密碼子的使用頻率，來作為雙子葉植物和單子葉植物(玉米)的密碼子偏好。表1?；蛘?，可以計(jì)算編碼特定氨基酸的單個(gè)密碼子相對于該氨基酸的所有其它密碼子(同義密碼子)的使用頻率，來作為密碼子偏好。在設(shè)計(jì)用于植物表達(dá)的密碼子區(qū)時(shí)，當(dāng)存在多種選擇時(shí)，應(yīng)當(dāng)確定所述植物優(yōu)選的主要(“第一選擇”)密碼子、以及優(yōu)選密碼子的第二、第三、第四等選擇。對來自斯維鏈霉菌dgt-28編碼區(qū)序列的分析顯示存在多個(gè)被認(rèn)為不利于最優(yōu)植物表達(dá)的序列基序，以及對于雙子葉和單子葉植物中表達(dá)而言非最優(yōu)的密碼子組成。表1.-在d、e、i和j列中顯示來自單子葉(玉米％)和雙子葉(雙子葉植物％)植物基因編碼區(qū)的同義密碼子出現(xiàn)率(representation)。用于植物優(yōu)化人造基因設(shè)計(jì)的平衡化-偏好(balanced-biased)密碼子出現(xiàn)率組的值見c和h列*dnu＝不使用為了工程構(gòu)建編碼dgt-28蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因，利用冗余遺傳密碼設(shè)計(jì)了編碼氨基酸序列的dna序列，而冗余遺傳密碼是利用根據(jù)特定宿主植物的蛋白質(zhì)編碼序列匯編的密碼子偏好表確立的。在表1中，d列和i列提供了在單子葉植物(玉米)編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)的每種氨基酸的同義密碼子的分布(以該氨基酸的所有密碼子利用率的％計(jì))。e列和j列提供了在雙子葉植物編碼區(qū)中發(fā)現(xiàn)的每種氨基酸的同義密碼子的分布(以該氨基酸的所有密碼子利用率的％計(jì))。某些氨基酸的某些同義密碼子在植物基因中很少發(fā)現(xiàn)(例如cgg)。通常，如果在任一植物類型的基因中，密碼子編碼相關(guān)氨基酸的幾率為約10％或更低，則可以認(rèn)為該密碼子是稀有的(如表1中c和h列的dnu所示)。為了平衡某一氨基酸的其余密碼子選擇的分布，使用如下的公式為每個(gè)密碼子計(jì)算加權(quán)平均出現(xiàn)率(weightedaveragerepresentation)：c1的加權(quán)平均值％＝1/(％c1+％c2+％c3+等等)x％c1x100,(1)其中c1是所考慮的密碼子，％c2、％c3等代表其余的同義密碼子在雙子葉植物中的平均％值(相關(guān)密碼子的平均％值取自表1的c和h列)。每個(gè)密碼子的加權(quán)平均％值在表1的c和h列給出。使用前述的程序，使用在雙子葉植物基因中發(fā)現(xiàn)的頻繁使用的密碼子的平衡化密碼子分布，設(shè)計(jì)了用于在雙子葉植物中最優(yōu)表達(dá)的、基本上編碼dgt-28蛋白質(zhì)的氨基酸序列的新dna序列。使用在單子葉植物基因中發(fā)現(xiàn)的頻繁使用的密碼子的平衡化密碼子分布，設(shè)計(jì)了用于在單子葉植物中最優(yōu)表達(dá)的、基本上編碼dgt-28蛋白質(zhì)的氨基酸序列的第二個(gè)dna序列。這兩個(gè)新dna序列與編碼dgt-28的原始dna序列的區(qū)別在于，改用植物(第一優(yōu)選、第二優(yōu)選、第三優(yōu)選或第四優(yōu)選的)密碼子來指定蛋白質(zhì)氨基酸序列中每個(gè)位置上的合適氨基酸。植物優(yōu)化dna序列的設(shè)計(jì)從dgt-28蛋白質(zhì)序列(genbank登錄號no:-zp_06917240.1)的蛋白質(zhì)序列的逆翻譯開始。使用從表1的e和j列構(gòu)建的雙子葉植物密碼子偏好表對seqidno:1進(jìn)行逆翻譯。使用從表1的d和i列構(gòu)建的單子葉植物偏好表對seqidno:1實(shí)施另一個(gè)逆翻譯。然后，通過補(bǔ)償密碼子變化(同時(shí)保留整體加權(quán)平均密碼子出現(xiàn)率)以除去或添加限制酶識別位點(diǎn)，除去高穩(wěn)定的鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，和除去其它可能對克隆操作或工程化基因在植物內(nèi)的表達(dá)有害的序列，對最初的逆翻譯序列進(jìn)行修飾。然后，對dna序列再次進(jìn)行分析，尋找可能通過這些修飾產(chǎn)生的限制酶識別位點(diǎn)。對于鑒定出的位點(diǎn)進(jìn)一步進(jìn)行修飾，用優(yōu)選密碼子的第一、第二、第三或第四選擇代替相關(guān)的密碼子。序列中其它可能影響感興趣的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的位點(diǎn)包括外顯子:內(nèi)含子接點(diǎn)(5’或3’)，多聚a添加信號，和rna聚合酶終止信號。對經(jīng)過修飾的序列進(jìn)行進(jìn)一步的分析和進(jìn)一步的修飾，以降低ta或cg雙聯(lián)體的頻率，以及增加tg或ct雙聯(lián)體的頻率。除了這些雙聯(lián)體外，具有超過約6個(gè)連續(xù)[g+c]或[a+t]殘基的序列區(qū)塊也會(huì)影響序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯。因此，也要修飾這些序列區(qū)塊，將第一或第二選擇的密碼子替換為優(yōu)選密碼子的其它選擇?；蛟O(shè)計(jì)中不包含顯著量的稀有密碼子，只有在必要時(shí)，為了滿足除密碼子組成本身之外的不同設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)(例如添加或刪除限制酶識別位點(diǎn))方才使用。這種新設(shè)計(jì)的、雙子葉植物優(yōu)化的dgt-28v5多核苷酸序列在seqidno:2中列出。新設(shè)計(jì)的、單子葉植物優(yōu)化的dgt-28v6多核苷酸序列在seqidno:3中列出；該序列進(jìn)行了微小的修飾，在第二個(gè)氨基酸位置處包含一個(gè)丙氨酸，以便引入限制酶位點(diǎn)。所得的dna序列具有更高程度的密碼子多樣性，理想的堿基組成，含有策略性設(shè)置的限制酶識別位點(diǎn)，并且缺少可能干擾基因轉(zhuǎn)錄或產(chǎn)物mrna翻譯的序列。由商業(yè)供應(yīng)商(dna2.0,menlopark,ca)合成了含有seqidno:2和seqidno:3，且含有額外的序列的dna片段，額外的序列例如6-框終止子(添加在編碼序列的3’端的、位于全部6個(gè)閱讀框中的終止密碼子)，和用于克隆的5’限制位點(diǎn)。然后，如下面實(shí)施例所述地，將合成的核酸分子克隆到表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到植物或細(xì)菌中。使用相似的密碼子優(yōu)化策略設(shè)計(jì)dgt-1、dgt-3v2(g173a)、dgt-3v3(g173a；p178s)、dgt-3v4(t174i；p178s)、dgt-7v4(t168i；p172s)、dgt-32v3、dgt-33v3、和dgt-33v3。這些基因的密碼子優(yōu)化版本分別如seqidno:5,seqidno:6,seqidno:7,seqidno:8,seqidno:9,seqidno:10,seqidno:11,和seqidno:144所列。細(xì)菌優(yōu)化設(shè)計(jì)了用于在大腸桿菌細(xì)胞中最優(yōu)表達(dá)的、編碼seqidno:1dgt-28蛋白質(zhì)的新dna序列。大腸桿菌優(yōu)化的dna序列的設(shè)計(jì)最初是使用來自geneart的專有密碼子優(yōu)化規(guī)程(regensburg,germany)對seqidno:1的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行逆翻譯。通過補(bǔ)償密碼子變化(同時(shí)保留整體加權(quán)平均密碼子出現(xiàn)率)以除去或添加限制酶識別位點(diǎn)，除去高穩(wěn)定的鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，和除去其它可能對克隆操作或工程化基因在植物內(nèi)的表達(dá)有害的序列，對最初的逆翻譯序列進(jìn)行修飾。此類在編碼區(qū)中應(yīng)避免的有害序列的一個(gè)實(shí)例是16s核糖體rna結(jié)合序列(“shine-dalgarno序列”)，例如aggagg，其可能編碼例如兩個(gè)連續(xù)的精氨酸，但是也可能用作基因內(nèi)的(因此是不期望的)翻譯起始信號。seqidno:4給出了編碼seqidno:1蛋白質(zhì)的大腸桿菌偏好的dgt-28-dna序列(dgt-28v1)。為了方便克隆和確保高效的翻譯起始，在atg翻譯起始密碼子的上游設(shè)置了一個(gè)5'端ndei限制酶識別序列。同樣為了克隆和確保恰當(dāng)?shù)姆g終止，在編碼區(qū)3'端包含編碼兩個(gè)taa翻譯終止密碼子的堿基和一個(gè)xhoi限制酶識別位點(diǎn)的堿基。包含seqidno:4的dna片段的合成由供應(yīng)商genearttm實(shí)施。使用相似的大腸桿菌密碼子優(yōu)化策略設(shè)計(jì)dgt-1v5,dgt-1v6(g112a),dgt-1v7(g112a；p117s),dgt-1v8(t113i；p117s),dgt-3v6(g105a),dgt-3v7(g105a；p112s),dgt-3v8(t106i；p112s),dgt-7v5,dgt-7v6(g113a),dgt-7v7(g113a；p117s),dgt-7v8(t114i；p117s),dgt-32v5,和dgt-33v5。對于dgt-1、dgt-3和dgt-7序列版本，通過除去葉綠體導(dǎo)向序列而加以修飾。這些基因的大腸桿菌優(yōu)化的版本分別如seqidno:12,seqidno:13,seqidno:14,seqidno:15,seqidno:16,seqidno:17,seqidno:18,seqidno:19,seqidno:20,seqidno:21,seqidno:22,seqidno:23,和seqidno:24所列。實(shí)施例3:用于細(xì)菌表達(dá)草甘膦耐受基因的載體大腸桿菌表達(dá)用的pet表達(dá)載體dgt-28的構(gòu)建為了體外測試，由genearttm公司合成并克隆了dgt-28v1大腸桿菌優(yōu)化的基因序列(seqidno:4)，用于合成和克隆。利用添加的ndei和xhoi限制位點(diǎn)將合成的dgt-28v1基因序列克隆到pet28表達(dá)載體中。所得的構(gòu)建體引入了n端6xhis標(biāo)簽，并標(biāo)記為pdab100445。圖14。dgt-28v1的定點(diǎn)突變對dgt-28v1進(jìn)行定點(diǎn)誘變，以評估位置84處的丙氨酸對提供針草甘膦耐受性的作用。將該天然丙氨酸突變成甘氨酸，以確定該變化是否會(huì)降低酶對草甘膦的耐受性或?qū)ep的親和力。選擇該氨基酸殘基是因?yàn)樗c先前所述引入到大腸桿菌epsp合酶中的g96a突變相對應(yīng)。使用stratagenetm的quickchangeiitm試劑盒(santaclara,ca)進(jìn)行誘變。根據(jù)quickchangetm的方案設(shè)置pcr反應(yīng)，使用pdab100445(dgt-28v1)作為模板dna。含有突變的dgt-28v2基因序列的構(gòu)建體命名為pdab102946(圖15)，并通過dna測序加以確認(rèn)。設(shè)計(jì)了如下的引物來制造氨基酸轉(zhuǎn)變：dgt28mutf(seqidno:25；5’gatgtttattgccgtgatggtggaaccaccgcacgttttc)dgt28mutr(seqidno:26；5’gaaaacgtgcggtggttccaccatcacggcaataaacatc)對dgt-28v2進(jìn)行第二輪誘變，嘗試進(jìn)一步降低其對草甘膦的耐受性。在已經(jīng)被誘變的dgt-28v2中引入第二個(gè)突變t172a。haghanietal.,(2008)中已描述了在這個(gè)位點(diǎn)將epsp合酶相反地從丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，導(dǎo)致對草甘膦不敏感。最終的結(jié)果是產(chǎn)生了a84g、t172a雙突變體，其命名為dgt-28v3。根據(jù)quickchangetm的方案設(shè)置pcr反應(yīng)，并使用pdab102946(dgt-28v2)作為模板dna。含有突變的dgt-28v3基因序列的構(gòu)建體命名為pdab100469(圖16)。設(shè)計(jì)了如下的引物以產(chǎn)生t172a突變：dgt28mut2f(seqidno:27；5’gggtccgctggcacgtcagggtctgcgtattcg)dgt28mut2r(seqidno:28；5’cgaatacgcagaccctgacgtgccagcggacccagcagc)額外的大腸桿菌表達(dá)用構(gòu)建體,pet表達(dá)載體為了體外測試，合成并克隆(genearttm)了dgt-1v5,dgt-1v6,dgt-1v7,dgt-1v8,dgt-3v6,dgt-3v7,dgt-3v8,dgt-7v5,dgt-7v6,dgt-7v7,dgt-7v8,dgt-32v5,和dgt-33v5基因序列。將合成的基因克隆到pet28表達(dá)載體中。所得構(gòu)建體標(biāo)記為：pdab102028(圖17)，其含有dgt-1v5；pdab102029(圖18)，其含有dgt-1v6；pdab102032(圖19)，其含有dgt-1v7；pdab102034(圖20)，其含有dgt-1v8；pdab100429(圖21)，其含有dgt-3v6；pdab100442(圖22)，其含有dgt-3v7；pdab100430(圖23)，其含有dgt-3v8；pdab102036(圖24)，其含有dgt-7v5；pdab102038(圖25)，其含有dgt-7v6；pdab102040(圖26)，其含有dgt-7v7；和pdab102042(圖27)，其含有dgt-7v8。dgt-32和dgt-33的克隆為了體外測試，分別從二元載體pdab107532(圖11)和pdab107534(圖12)中擴(kuò)增出如下的植物優(yōu)化基因：dgt-32v3和dgt-33v3。使用如下的引物組：pmaldgt32f(seqidno:29；catatgaccgttattgaaattccggg)和pmaldgt32r(seqidno:30；gatatcctattattaacgaccttccag)；用于dgt-32,和pmaldgt33f(seqidno:31；catatgggtgcagttaccgttattga),pmaldgt33r(seqidno:32；gatatcctattattatgcctgcggac)；用于dgt-33。然后，將擴(kuò)增的序列亞克隆到pmalc5x中，從而使每一個(gè)基因與male編碼序列框內(nèi)融合。最終的表達(dá)構(gòu)建體為：含有dgt-32v3的pdab107713(圖29)，和含有dgt-33v3的pdab107714(圖30)。實(shí)施例4:體外生物化學(xué)酶動(dòng)力學(xué)測定重組dgt酶的過表達(dá)和純化在rosetta2tm(de3)細(xì)胞(novagentm,madison,wi)中從上述的構(gòu)建體過表達(dá)重組dgt蛋白質(zhì)。使用單集落接種在37℃過夜培養(yǎng)過的含有氯霉素(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的50mllb起始培養(yǎng)物。使用過夜培養(yǎng)物接種含有氯霉素(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的1llb。使培養(yǎng)物在37℃生長至o.d.600＝0.6，然后置于冰水浴中10分鐘。通過添加終濃度為500μm的iptg實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在20℃誘導(dǎo)過夜，隨后通過8,000rpm離心20分鐘進(jìn)行收集。將細(xì)胞沉淀物貯存在-80℃，直到需要進(jìn)行純化。所有純化步驟均在4℃下實(shí)施。將來自1升培養(yǎng)物的細(xì)胞沉淀重懸在20-30ml緩沖液a(50mmhepesph7.5，150mmkcl，2mmdtt，1mmedta，20mm咪唑，和5％甘油)中。然后添加completetm蛋白酶抑制劑混合物(1片/50ml，roche,indianapolis,in)和溶菌酶(1mg/ml,sigma-aldrich,st.louis,mo)，將懸浮液攪拌20分鐘。用bransontmsonifiertm250進(jìn)行細(xì)胞裂解(3x60秒沖擊)，隨后通過16,000rpm離心45分鐘除去細(xì)胞碎片。通過固定化金屬親和色譜(imac)，使用5mlhistrapff預(yù)裝柱(crudecolumn)將dgt酶一步純化為均質(zhì)。用緩沖液a平衡該柱，并在相同緩沖液中加載樣品。然后，用10倍柱體積的緩沖液a洗滌柱，隨后用0-100％緩沖液b(50mmhepesph7.5,200mmkcl,2mmdtt,1mmedta,500mm咪唑,和5％甘油)線性梯度進(jìn)行洗脫25個(gè)柱體積。將通過sdspage分析判斷為含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的級分用裝備有10kda分子量截留(mwco)的millipore超離心設(shè)備濃縮成2.5ml。將純化的dgt酶用pd-10柱(gehealthcare)交換緩沖液到50mmhepesph7.5,150mmkcl,2mmdtt,和5％甘油中，并隨后濃縮到～1ml。樣品通常1:50稀釋，并在cary50tmbiouv-可見光分光光度計(jì)上記錄240-700nm的uv-可見光光譜。然后，使用理論消化系數(shù)根據(jù)280nm的吸光度(expasy,geneva,switzerland)計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。重組dgt-32和dgt-33融合物的表達(dá)和純化dgt-32和dgt-33酶被構(gòu)建成在酶的氨基端含有一個(gè)麥芽糖融合標(biāo)簽。分離并確認(rèn)用pdab107712(圖28),pdab107713和pdab107714轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞。使用每個(gè)細(xì)菌菌株的單菌落接種含有100μg/μl羧芐青霉素和25μg/μl氯霉素的50mllb培養(yǎng)基。將起始培養(yǎng)物在37℃過夜生長，隨后用于接種補(bǔ)充有0.2％葡萄糖、100μg/μl羧芐青霉素和25μg/μl氯霉素的600mllb培養(yǎng)基。培養(yǎng)物在37℃生長至o.d.600＝0.4，此時(shí)添加iptg至終濃度為50μmiptg。培養(yǎng)物在18℃誘導(dǎo)15小時(shí)。第二天，通過8,000rpm離心20分鐘沉淀細(xì)胞來收集培養(yǎng)物。將細(xì)胞糊保存在-80℃，直至需要用于純化。將冷凍的離心沉淀物重懸浮在20-30ml緩沖液a(50mmhepesph7.5,100mmkcl,1mmedta,5％甘油,和1mmdtt)和1片蛋白酶抑制劑(rochecomplete)中。一旦離心沉淀物完全重溶，便添加1mg/ml溶菌酶，并將樣品在4℃混合15-20分鐘。用溶菌酶溫育后，將樣品轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，并置于冰上。然后，將樣品以1分鐘間隔隨后4分鐘冷卻進(jìn)行超聲破碎。該步驟再重復(fù)2次，總共3次超聲波循環(huán)。通過16,500rpm離心45分鐘除去細(xì)胞碎片，并將上清液加載到50ml注射環(huán)(injectionloop)中。將粗裂解液施用到直鏈淀粉柱上，用7倍柱體積的緩沖液a洗滌，并用100％緩沖液b(緩沖液a和10mm麥芽糖)洗脫。將目標(biāo)蛋白質(zhì)匯集并用30kdamwco的centricon濃縮至2.5ml。將純化的蛋白質(zhì)用pd-10凝膠過濾柱進(jìn)行交換緩沖液為50mmhepesph7.5，100mmkcl和5％甘油。通過bradford測定使用bsa作為標(biāo)準(zhǔn)確定蛋白質(zhì)濃度。將純蛋白質(zhì)在液氮中冷凍并貯存于-80℃。植物和細(xì)菌dgt酶的體外動(dòng)力學(xué)表征按照lanzettaetal.(1979)anal.bioch.100:957所述的改良程序，通過測量無機(jī)磷(pi)的產(chǎn)生來測量野生型(wt)和突變dgt的酶活性。測定按96孔板格式實(shí)施，在spectramax190酶標(biāo)儀(moleculardevices,sunnyvale,ca)上以總體積50μl進(jìn)行。典型的測定體系含有50mmhepesph7.5,150mmkcl,2mmdtt,和1mms3p。pep和草甘膦濃度按照指示改變。草甘膦作為游離酸從sigma獲得，并重懸在ddh2o中。通過添加koh溶解草甘膦，直至混合物的ph在中性。通過添加0.01-1μm濃度的dgt酶來起始測定。通過添加235μl孔雀石綠:鉬酸銨溶液的3:1混合物終止反應(yīng)。完全顯色(～1分鐘)之后，記錄660nm的吸光度，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算形成的pi量。使用缺少酶的對照反應(yīng)校正背景吸光度。使用本檢測方法，高濃度的pep(>2mm)和草甘膦(>30mm)會(huì)貢獻(xiàn)顯著量的背景吸光度。用數(shù)據(jù)擬合米氏方程，其允許確定km和vmax(公式3)，而ic50從公式4確定，其中y是相對活性，s是hill系數(shù)。使用grafittmversion5軟件(erithacussoftwarelimited,horley,u.k.)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。競爭性抑制劑的ic50值會(huì)隨著底物濃度的變化而改變，因此表2的ic50值是在1mmpep和60μmpep(植物中細(xì)胞內(nèi)pep濃度的估計(jì)值)下獲得的。應(yīng)該僅比較在相同濃度pep下測得的ic50值(dgt-32和dgt-33的km在100μmpep下確定)。此外，高耐受性酶的ic50值不能用lanzetta的方法精確地確定，因此是根據(jù)相對活性估測的。植物dgt的動(dòng)力學(xué)首先測試兩個(gè)具有非突變天然序列的酶，dgt-1v5和dgt-7v5，以建立草甘膦敏感性的基準(zhǔn)參數(shù)。兩種蛋白質(zhì)均顯示對pep的低km值(～70μm)，并且對草甘膦敏感，1mmpep下的ic50值為～20μm(表2)。如對dgt-1v6,dgt-3v6,和dgt-7v6所觀察到的，g到a的單個(gè)點(diǎn)突變導(dǎo)致對草甘膦的耐受性顯著提高(ic50值為8-21mm)，但是也令對pep的km值增加了～8倍。對于所有植物來源的dgt(dgt-1v7,dgt-3v7,和dgt-7v7)，雙突變也提高了草甘膦耐受性，但是同樣導(dǎo)致pepkm相當(dāng)大的提高。表2。tips突變體(dgt-1v8,dgt-3v8,和dgt-7v8)對中等濃度的草甘膦(3-6mm)耐受，但與ga和gaps突變體形成對照的是，km水平保持接近野生型蛋白質(zhì)，在60-200μm之間。圖31展示了引入載明的突變導(dǎo)致dgt-1(a)和dgt-7(b)的草甘膦耐受性偏移。對于產(chǎn)生圖31所示數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)，將pep濃度保持在1mm，其很可能導(dǎo)致dgt-7v8的ic50提高(>80mm)。實(shí)施進(jìn)一步的程序，以確定低水平的pep是否改變對草甘膦的相對耐受性。pep的生理相關(guān)水平在5-60μm范圍。使用60μmpep，ic50值顯著降低(3.6mm)，提示初始確定受到過量pep的影響，這一點(diǎn)從米氏動(dòng)力學(xué)可以預(yù)期，并在表2中示明。圖31顯示了在dgt-1(a)和dgt-7(b)中引入各種突變之后，用1mmpep獲得的ic50值。對于a和bic50曲線，實(shí)心三角形代表野生型，實(shí)心圓形代表ga突變體，空心方形代表gaps突變體，實(shí)心方形代表tips突變體。表2.dgt酶的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)。由于所用方法的限制，大于50的ic50值是估計(jì)值。*草甘膦的ic50是在100μmpep下確定的。細(xì)菌dgt的動(dòng)力學(xué)在細(xì)菌酶中，dgt-28v1具有最有利的整體動(dòng)力學(xué)參數(shù)(升高的ic50和kcat/km值)。該酶對>80mm濃度的草甘膦耐受，并顯示1.32x105m1s1的催化效率。dgt-28v2中的a→g突變將ic50降低到2.17mm(在60μmpep下)，并導(dǎo)致對pep的km有略微提高(161μm)。這種突變酶保留dgt-28v1所見的高催化效率。即使具有降低的ic50，在某些應(yīng)用中，該突變酶仍然適合于在植物內(nèi)(inplanta)提供對草甘膦的耐受性。數(shù)據(jù)提示，這種新類型的epsp合酶，丙氨酸不是草甘膦耐受性的唯一決定因素。為了探索其他可能的決定因素，構(gòu)建了額外的變體dgt-28v3(a84g-t172a雙突變體)。該酶顯示對草甘膦降低的耐受性，ic50值為5.15mm(在60μmpep下)。dgt-28v3ic50的降低伴隨著催化效率降低200倍，提示第二個(gè)突變導(dǎo)致了非預(yù)期的效果(表2)。具有更高同一性的dgt-28v1同源物(～75％氨基酸同一性)dgt-32和dgt-33具有對pep的低km(～114-139μm)，但是催化效率比dgt-28v1低100倍。這種催化效率的降低很可能是由于麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)融合。該酶也對草甘膦不敏感，顯示的ic50值大于50mm。這些體外測定表明各種dgt酶可提供對草甘膦的耐受性，于是將dgt酶在植物內(nèi)進(jìn)行測試。實(shí)施例5:植物轉(zhuǎn)化載體的克隆植物二元載體構(gòu)建使用通用克隆方法構(gòu)建入門載體，其含有與dgt-28框內(nèi)融合的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽多核苷酸序列。對于含有與dgt-28融合的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(trap)的入門載體，用in-fusiontmadvantagetechnology(clontech,mountainview,ca)進(jìn)行組裝。作為融合的結(jié)果，從dgt28中除去了第一個(gè)氨基酸——甲硫氨酸。通過dna2.0(menlopark,ca)分別合成轉(zhuǎn)運(yùn)肽trap4v2(seqidno:33),trap5v2(seqidno:34),trap8v2(seqidno:35),trap9v2(seqidno:36),trap12v2(seqidno:37),和trap13v2(seqidno:38)，并融合于dgt-28的5’端片段(到唯一的acci限制性核酸內(nèi)切酶識別位點(diǎn)為止并包含該位點(diǎn))。含有各種trap和dgt-28表達(dá)盒的二元質(zhì)粒由擬南芥泛素10啟動(dòng)子(atubi10-v2；callis,etal.,(1990)j.biol.chem.,265:1248612493)驅(qū)動(dòng)，并且側(cè)翼是根癌土壤桿菌開放閱讀框23的3’非翻譯區(qū)(atuorf233′utrv1；u.s.pat.no.5,428,147)。組裝好的trap和dgt-28表達(dá)盒使用技術(shù)(invitrogen,carlsbad,ca)改造后，通過土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化進(jìn)植物中。限制性核酸內(nèi)切酶從newenglandbiolabs(neb；ipswich,ma)獲得，dna連接使用t4dna連接酶(invitrogen)進(jìn)行。使用lr酶混合物(invitrogen)實(shí)施gateway反應(yīng)，將一個(gè)入門載體組裝到單一的目標(biāo)載體中，該目標(biāo)載體含有一個(gè)選擇標(biāo)記盒：木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子(csvmvv2；verdagueretal.,(1996)plantmol.biol.,31:11291139)—dsm-2(美國專利申請no.2007/086813)-根癌土壤桿菌開放閱讀框1的3’非翻譯區(qū)(atuorf13′utrv6；huangetal.,(1990)j.bacteriol.172:18141822)。使用質(zhì)粒試劑盒(machereynagelinc.,bethlehem,pa)或質(zhì)粒midi試劑盒(qiagen)按照供應(yīng)商的指導(dǎo)進(jìn)行質(zhì)粒制備。瓊脂糖tris乙酸凝膠電泳后，使用qiaquicktm凝膠提取試劑盒(qiagen)分離dna片段。通過小量制備(miniprep)dna的限制性消化初步篩選所有裝配的質(zhì)粒的集落。對選定克隆的質(zhì)粒dna，由商業(yè)測序公司(eurofinstmmwgoperon,huntsville,al)進(jìn)行測序。使用sequenchertm軟件(genecodescorp.,annarbor,mi)對序列數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝和分析。下列二元構(gòu)建體表達(dá)各種trap:dgt-28融合基因序列：pdab107527(圖3)，含有trap4v2:dgt-28v5(seqidno:79)；pdab105530(圖4)，含有trap5v2:dgt-28v5(seqidno:80)；pdab105531(圖5)，含有trap8v2:dgt-28v5(seqidno:81)；pdab105532(圖6)，含有trap9v2:dgt-28v5(seqidno:82)；pdab105533(圖7)，含有trap12v2:dgt-28v5(seqidno:83)；和pdab105534(圖8)，含有trap13v2:dgt-28v5(seqidno:84)。pdab105534的dgt-28v5序列被修飾，其中第一個(gè)密碼子(gca)變成(gct)。其它植物二元載體構(gòu)建使用與上述相似的克隆策略構(gòu)建含有dgt-31,dgt-32,dgt-33,dgt-1,dgt-3,和dgt-7的二元質(zhì)粒。如前所述地，將微生物來源的基因；dgt-31,dgt-32,和dgt-33，與不同的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合。使用如下的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽：trap14v2(seqidno:39),trap23v2(seqidno:40),trap24v2(seqidno:41)。pdab107532(圖11)含有與trap14v2(seqidno:42)融合的dgt-32v3，pdab107534(圖12)含有與trap24v2(seqidno:43)融合的dgt-33v3，pdab1017533(圖54)含有與trap23v2(seqidno:143)融合的dgt-33v1。dgt表達(dá)盒由擬南芥泛素10啟動(dòng)子(atubi10啟動(dòng)子v2)驅(qū)動(dòng)，并且側(cè)翼是根癌土壤桿菌開放閱讀框23的3’非翻譯區(qū)(atuorf233′utrv1)。在二元載體中還存在一個(gè)dsm-2選擇標(biāo)記盒，其含有木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子(csvmvv2)—dsm-2—根癌土壤桿菌開放閱讀框1的3’非翻譯區(qū)(atuorf13′utrv6)。構(gòu)建了其他的二元載體，其中dgt-31v3,dgt-32v3,和dgt-33v3與前述的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列融合。例如，trap8v2序列與dgt-31v3,dgt-32v3,和dgt-33v3融合，并被如上所述地克隆到二元載體中。構(gòu)建了含有i類基因(dgt-1,dgt-3,和dgt-7)的二元載體。構(gòu)建了如下的二元載體，并轉(zhuǎn)化進(jìn)植物中：pdab4104(圖9)，其含有如美國專利申請公開no.2011/0124503所述的dgt-1v4序列，該序列的側(cè)翼是如美國專利申請公開no.2009/0064376中所述的煙草osmotin序列；pdab102715(圖10)；pdab102716(圖45)；pdab102717(圖4611)；和pdab102785(圖13)。沒有將與dgt-28,dgt-31,dgt-32,和dgt-33融合的各種trap葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽添加到i類基因中，因?yàn)檫@些植物來源的序列具有天然的植物葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。這些載體在表3中有更詳細(xì)的描述。表3.含有i類epsp合酶基因(即dgt-1,dgt-3,或dgt-7)的二元載體描述實(shí)施例6:轉(zhuǎn)化到擬南芥中并篩選擬南芥轉(zhuǎn)化用clough和bent(1998)所述的花序浸漬法(floraldip)轉(zhuǎn)化擬南芥。使用含有上述二元質(zhì)粒其中之一的選定土壤桿菌菌落接種一個(gè)或多個(gè)100ml含有壯觀霉素(100mg/l)和卡那霉素(50mg/l)的yep肉湯預(yù)培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物在28℃、225rpm恒定攪拌下溫育過夜。在室溫下通過大約5000xg10分鐘沉淀細(xì)胞，并棄去所得上清液。將細(xì)胞沉淀物輕輕重懸在含有5％(w/v)蔗糖、10μg/l6-芐氨基嘌呤和0.04％silwettml-77的400ml浸漬培養(yǎng)基(dunkingmedia)中。將大約1個(gè)月大的植物浸漬在培養(yǎng)基中5-10分鐘，并輕輕攪拌。將植物側(cè)向放倒，用透明或不透明的塑料袋覆蓋2-3小時(shí)，然后直立放置。使植物在22℃，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期中生長。浸漬后大約4周，采收種子。轉(zhuǎn)化植物的選擇新鮮采收的t1種子(含有dgt和dsm-2表達(dá)盒)在室溫干燥7天。將t1種子播種在26.5x51-cm發(fā)芽托盤(germinationtray)中，每個(gè)盤放入200mg等份的層積(stratified)t1種子(～10,000個(gè)種子)，這些種子先前已經(jīng)懸浮于40ml0.1％瓊脂糖溶液中，并在4℃保存2天，以完成休眠要求并確保種子同步萌發(fā)。將sunshinemixlp5用細(xì)蛭石覆蓋，并用hoagland溶液從地下灌溉至濕潤，然后通過重力排水。用移液器將每個(gè)40ml等份的層積種子均勻播種在蛭石上，并用保濕蓋(humiditydome)覆蓋4-5天。除去保濕蓋1天后，利用草胺膦萌發(fā)后噴霧進(jìn)行初始轉(zhuǎn)化體篩選(篩選共轉(zhuǎn)化的dsm-2基因)。在種植后7天(dap)和11dap，使用devilbiss壓縮空氣噴嘴用0.2％liberty除草劑溶液(200gai/l草胺膦,bayercropsciences,kansascity,mo)噴灑t1植物(分別為子葉期和2-4葉期)，噴灑體積為10ml/盤(703l/ha)，每次施用提供280gai/ha有效比率的草銨膦。在最后一次噴灑4-7天后鑒定存活者(活躍生長的植物)，并移植到備有盆栽培養(yǎng)基(metromix360)的3英寸盆(pot)中。將移植的植物在溫室中培養(yǎng)(22±5℃,50±30％rh,14h光照:10黑暗,最低500μe/m2s1自然光+補(bǔ)充光)。對存活的t1植株進(jìn)行分子確認(rèn)分析，以確認(rèn)草甘膦耐受性基因已經(jīng)穩(wěn)定整合到植物的基因組中。分子確認(rèn)確認(rèn)了用pdab107527,pdab105530,pdab105531,pdab105532,pdab105533,或pdab105534轉(zhuǎn)化的擬南芥植株的基因組中存在dgt-28和dsm-2轉(zhuǎn)基因。這些多核苷酸序列的存在通過水解探針測定、基因表達(dá)盒pcr(也稱作植物轉(zhuǎn)錄單元pcr—ptupcr)、southern印跡分析和定量反轉(zhuǎn)錄pcr分析得到了確認(rèn)。首先通過一種與taqmantm類似的水解探針測定對t1擬南芥植物進(jìn)行篩選，確認(rèn)dsm-2和dgt-28轉(zhuǎn)基因的存在。通過基因表達(dá)盒pcr對事件進(jìn)行篩選，以確定dgt表達(dá)盒是否完全整合到植物基因組中而沒有重排。使用從這些研究所得的數(shù)據(jù)確定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，并甄別選定的擬南芥事件，用于自花授粉和產(chǎn)生t2代。對t2代擬南芥植物，也通過水解探針測定進(jìn)行篩選，以確認(rèn)植物染色體內(nèi)dsm-2和dgt基因的存在并估計(jì)拷貝數(shù)。最后，使用southern印跡分析對t1擬南芥植物中的一個(gè)子集確認(rèn)估算的拷貝數(shù)。使用類似的測定法確認(rèn)用pdab4101轉(zhuǎn)化的植物中dgt-1轉(zhuǎn)基因的存在，用pdab107532轉(zhuǎn)化的植物中dgt-32轉(zhuǎn)基因的存在，用pdab107534轉(zhuǎn)化的植物中dgt-33轉(zhuǎn)基因的存在，用pdab102715轉(zhuǎn)化的植物中dgt-3轉(zhuǎn)基因的存在，用pdab102716轉(zhuǎn)化的植物中dgt-3轉(zhuǎn)基因的存在，用pdab102717轉(zhuǎn)化的植物中dgt-3轉(zhuǎn)基因的存在，和用pdab102785轉(zhuǎn)化的植物中dgt-7轉(zhuǎn)基因的存在。水解探針測定使用下文所述的水解探針測定確定t1和t2擬南芥植物中的拷貝數(shù)。鑒定了具有不同數(shù)目的轉(zhuǎn)基因的植物，并進(jìn)行隨后的草甘膦耐受性研究。將組織樣品收集到96孔平板中，并凍干2天。用klecotm組織粉碎機(jī)和鎢珠(tungstenbead)(environmetalinc.,sweethome,oregon)進(jìn)行組織浸解(tissuemaceration)。組織浸解后，使用biosprinttm96孔板試劑盒(qiagentm,germantown,md)根據(jù)制造商建議的方案以高通量格式分離基因組dna。借助quant-ittmpicogreendna測定試劑盒(molecularprobes,invitrogen,carlsbad,ca)對基因組dna進(jìn)行定量。將經(jīng)過定量的基因組dna用biorobot3000tm自動(dòng)液體操作儀(qiagen,germantown,md)調(diào)整到大約2ng/μl，用于水解探針測定。通過水解探針測定法確定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的過程應(yīng)用實(shí)時(shí)定量pcr來實(shí)現(xiàn)，實(shí)時(shí)定量pcr使用480系統(tǒng)(rocheappliedscience,indianapolis,in)。為dsm-2,dgt-28和內(nèi)參基因tafii15(genbankid:nc003075；duarteetal.,(201)bmcevol.biol.,10:61)設(shè)計(jì)了測定法。為了擴(kuò)增，準(zhǔn)備1x終濃度的480probemastermix(rocheappliedscience)，其在10μl體積的多重反應(yīng)體系中含有每種dsm-2和dgt-28引物各0.1μm、每種tafii15引物各0.4μm、和0.2μm每種探針。表4。實(shí)施兩步擴(kuò)增反應(yīng)，60℃延伸40秒，同時(shí)進(jìn)行熒光捕獲。運(yùn)行所有樣品，并且對每個(gè)樣品的分析使用平均循環(huán)閾值(ct)值。使用lightcyclertm軟件1.5發(fā)布版進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr數(shù)據(jù)的分析，該分析使用相對定量模塊(relativequantmodule)，并且基于δδct方法。為此，每個(gè)運(yùn)行中包含一個(gè)來自單拷貝校準(zhǔn)品(calibrator)和已知的2拷貝檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(check)的基因組dna樣品。確定了t1和t2轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的水解探針篩選的拷貝數(shù)結(jié)果。表4.dsm-2,dgt-28和內(nèi)參基因(tafii15)水解探針測定的引物和探針信息通過southern印跡分析確認(rèn)dgt-28的整合使用southern印跡分析證實(shí)了插入的t-鏈dna片段的整合模式，并鑒定了含有dgt-28的事件。得到了展示擬南芥基因組中轉(zhuǎn)基因插入物的整合和完整性的數(shù)據(jù)。使用southern印跡數(shù)據(jù)鑒定了t-鏈dna的一個(gè)完整拷貝的簡單整合。使用一個(gè)pcr擴(kuò)增的、特異針對dgt-28基因表達(dá)盒的探針進(jìn)行了詳細(xì)的southern印跡分析。該探針與用特定限制性內(nèi)切酶消化過的基因組dna的雜交鑒定了具有特定分子量的基因組dna片段，利用這些片段的模式鑒定全長、單插入的t1轉(zhuǎn)基因事件，以便用于產(chǎn)生下一代。將組織樣本收集于2ml錐形管中(eppendorftm)并冷凍干燥2天。用kleckotm組織粉碎機(jī)和鎢珠進(jìn)行組織浸解。組織浸解后，用ctab分離程序分離基因組dna?；蚪Mdna進(jìn)一步用qiagentmgenomictips試劑盒進(jìn)行純化。通過quant-ittmpicogreendna測定試劑盒(molecularprobes,invitrogen,carlsbad,ca)對基因組dna進(jìn)行定量。將經(jīng)過定量的基因組dna調(diào)整到4μg以達(dá)到濃度一致。對于每個(gè)樣品，用限制酶swai(newenglandbiolabs,beverley,ma)完全消化4μg基因組dna，并在25℃溫育過夜，然后向反應(yīng)中添加nsii，并在37℃溫育6小時(shí)。用quickprecipitationsolutiontm(edgebiosystems,gaithersburg,md)根據(jù)制造商建議的規(guī)程，通過沉淀來濃縮經(jīng)過消化的dna。然后于65℃下將基因組dna重懸于25μl水中1小時(shí)。將重懸的樣品加載到在1xtae中制備的0.8％瓊脂糖凝膠上，并在1xtae緩沖液中以1.1v/cm電泳過夜。將凝膠依次進(jìn)行變性(0.2mnaoh/0.6mnacl)30分鐘，和中和(0.5mtris-hcl(ph7.5)/1.5mnacl)30分鐘。使用色譜紙捻(wick)和紙巾將20xssc緩沖液通過凝膠過夜被動(dòng)吸取(wicking)到經(jīng)過處理的immobilontmny+轉(zhuǎn)移膜(millipore,billerica,ma)，以將dna片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移后，將膜用2xssc短暫地清洗，與stratalinkertm1800(stratagene,lajolla,ca)交聯(lián)，并在80℃真空烘烤3小時(shí)。使用model400雜交培養(yǎng)箱(robbinsscientific,sunnyvale,ca)，在玻璃滾瓶中將印跡與預(yù)雜交液(perfecthybplus,sigma,st.louis,mo)一起65℃溫育1小時(shí)。從含有完整編碼序列的pcr片段制備探針。使用qiaextmii凝膠提取試劑盒純化pcr擴(kuò)增子，并借助randomrtprimeittm標(biāo)記試劑盒(stratagene,lajolla,ca)用α32p-dctp對pcr擴(kuò)增子進(jìn)行標(biāo)記。將變性探針直接添加到預(yù)雜交液中至大約200萬計(jì)數(shù)/印跡/ml，與印跡一起在65℃雜交過夜。雜交后，在65℃用0.1xssc/0.1％sds繼續(xù)清洗印跡40分鐘。最后，將印跡暴露于儲(chǔ)磷成像屏，并利用moleculardynamicsstorm860tm成像系統(tǒng)成像。使用在本研究中完成的southern印跡分析確定拷貝數(shù)，并確認(rèn)含有dgt-28轉(zhuǎn)基因的選定事件位于擬南芥的基因組中。通過pcr分析確認(rèn)dgt-28基因表達(dá)盒通過端點(diǎn)(endpoint)pcr反應(yīng)檢測在t1植物事件中所含的dgt-28基因表達(dá)盒的存在。使用特異針對dgt-28基因表達(dá)盒的atubi10啟動(dòng)子v2和atuorf233′utrv1區(qū)的引物(表5)進(jìn)行檢測。表5.用于dgt-28基因表達(dá)盒確認(rèn)的寡核苷酸引物引物名稱序列正向寡聚物(seqidno:52)5’ctgcaggtcaacggatcaggatat3’反向寡聚物(seqidno:53)5’tgggctgaattgaagacatgctcc3’pcr反應(yīng)需要一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的3步pcr循環(huán)規(guī)程來擴(kuò)增基因表達(dá)盒。所有pcr反應(yīng)均使用下述的pcr條件完成：94℃3分鐘，接著35個(gè)循環(huán)的94℃30秒，60℃30秒，和72℃3分鐘。該反應(yīng)用ex-taqtmpcr試劑盒(takarabiotechnologyinc.otsu,shiga,japan)按照制造商的說明完成。最后一個(gè)循環(huán)之后，將反應(yīng)在72℃溫育10分鐘。使用tae瓊脂糖凝膠電泳確定pcr擴(kuò)增子的大小。具有預(yù)期大小的pcr擴(kuò)增子的存在，表明在轉(zhuǎn)基因擬南芥事件的基因組中全長基因表達(dá)盒的存在。通過定量反轉(zhuǎn)錄pcr分析確認(rèn)dgt-28相對轉(zhuǎn)錄將dgt-28轉(zhuǎn)基因植物的組織樣品收集在96孔平板中，并冷凍于-80℃。用klecotm組織粉碎機(jī)和鎢珠(environmetalinc.,sweethome,oregon)進(jìn)行組織浸解。組織浸解后，使用qiagentmrneasy96試劑盒(qiagentm,germantown,md)根據(jù)制造商建議的方案以高通量格式分離總rna，該方案包括任選的柱上dna酶i處理。隨后對洗脫的總rna進(jìn)行額外的dna酶i(ambiontm,austin,tx)處理。使用總rna作為模板并用highcapacitycdnareversetranscriptiontm試劑盒(appliedbiosystems,austin,tx)按照制造商建議的方案，同時(shí)添加寡核苷酸t(yī)vn，進(jìn)行cdna合成。表達(dá)的定量用水解探針測定來實(shí)施，且使用480系統(tǒng)(rocheappliedscience,indianapolis,in)通過實(shí)時(shí)定量pcr來進(jìn)行。使用探針設(shè)計(jì)軟件2.0，為dgt-28和內(nèi)參基因“未知蛋白”(genbank登錄號：at4g24610)設(shè)計(jì)了測定法。為了擴(kuò)增，以1x終濃度準(zhǔn)備480probemastermix(rocheappliedscience)，其在10μl體積的多重反應(yīng)體系中含有每種引物各0.4μm和每種探針各0.2μm。表6。表6.用于dgt-28定量反轉(zhuǎn)錄pcr分析的pcr引物.引物名稱序列at26410lp(seqidno:54)5’cgtccacaaagctgaatgtg3’at26410rp(seqidno:55)5’cgaagtcatggaagccactt3’upl146cat#04694325001(roche,indianapolis,in)dgt28f(seqidno:56)5’cttcaaggagatttgggatttgt3’dgt28r(seqidno:57)5’gagggtcggcatcgtat3’upl154探針cat#04694406001(roche,indianapolis,in)實(shí)施兩步擴(kuò)增反應(yīng)，60℃延伸40秒，并進(jìn)行熒光捕獲。所有樣品運(yùn)行3個(gè)重復(fù)，使用平均循環(huán)閾值(ct)值分析每個(gè)樣品。每個(gè)樣品運(yùn)行負(fù)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(minusreversetranscription)，以確保不存在gdna污染?；讦摩腸t方法分析實(shí)時(shí)定量pcr數(shù)據(jù)分析。利用該測定確定了dgt-28在轉(zhuǎn)基因擬南芥事件(確定為半合和純合)中的相對表達(dá)。dgt-28mrna的相對轉(zhuǎn)錄水平比內(nèi)部對照高2.5-207.5倍。這些數(shù)據(jù)表明，dgt-28轉(zhuǎn)基因植物含有功能性dgt-28基因表達(dá)盒，并且植物能夠轉(zhuǎn)錄dgt-28轉(zhuǎn)基因。western印跡分析在從轉(zhuǎn)基因擬南芥植物獲得的葉片樣品中檢測dgt-28。將來自dgt-28轉(zhuǎn)基因植物的植物提取物和dgt-28蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用含有dtt的lds樣品緩沖液(invitrogen,carlsbad,ca)在90℃溫育10分鐘，并在丙烯酰胺預(yù)制膠中電泳分離。然后，使用制造商的方案將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用封閉混合物(invitrogen)封閉后，先后用抗-dgt-28抗血清和山羊抗兔磷酸酶檢測dgt-28蛋白。通過化學(xué)發(fā)光底物bcip/nbtwestern分析試劑(kpl,gaithersburg,md)將被檢測的蛋白可視化。western印跡產(chǎn)生完整dgt-28蛋白，表明接受測定的dgt-28轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)了dgt-28蛋白。實(shí)施例7:草甘膦耐受性用不同比率的草甘膦噴灑含有dgt-28轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因t1擬南芥植物。在本研究中采用增大的比率，以確定相對抗性水平(105,420,1,680或3,360gae/ha)。一個(gè)典型的草甘膦1x使用比率，它將會(huì)控制非轉(zhuǎn)化的擬南芥，是420gae/ha。用校準(zhǔn)為187l/ha的履帶式噴霧器將加硫酸銨的草甘膦制劑施用給t1植物。本研究中使用的t1擬南芥植物具有不同的dgt-28轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。將低拷貝dgt-28t1擬南芥植物自花授粉，并用于產(chǎn)生t2植物。表7顯示了具有草甘膦除草劑抗性基因的dgt-28轉(zhuǎn)基因植物、dgt-1、和野生型對照的比較。表8顯示了具有草甘膦除草劑抗性基因的dgt-32和dgt-33與dgt-1和野生型對照的比較。表9顯示了新型細(xì)菌epsp合酶與i類epsp合酶及對照在1,680gae/ha的草甘膦比率下的比較。轉(zhuǎn)化的dgt-28擬南芥植物的草甘膦選擇結(jié)果首先使用草甘膦篩選方案，以非轉(zhuǎn)化種子為背景選擇擬南芥t1轉(zhuǎn)化體。對每個(gè)t1構(gòu)建體分析3個(gè)淺箱或30,000個(gè)種子。對上面選出的t1植物進(jìn)行分子表征，隨后將具有可變(variable)拷貝數(shù)的代表性植物移植到單獨(dú)的盆中，并以如前所述的不同比率噴灑商業(yè)草甘膦。這些植物的響應(yīng)用處理2周后(wat)的％可見損傷表示。表中提供的數(shù)據(jù)顯示，展示很少或沒有損傷(<20％)、中等損傷(20～40％)或嚴(yán)重?fù)p傷(>40％)的個(gè)體植株。為每個(gè)用于擬南芥轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體提供了算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列中指示了針對每個(gè)比率和轉(zhuǎn)化的個(gè)體響應(yīng)的范圍。野生型，非轉(zhuǎn)化的擬南芥(哥倫比亞栽培種)，用作草甘膦敏感性對照。植物的響應(yīng)水平不同。該差異可以歸因于以下的事實(shí)，即每株植物代表一個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件，因此感興趣的基因的拷貝數(shù)在每個(gè)植物之間都有改變。我們注意到，一些含有轉(zhuǎn)基因的植物對草甘膦不耐受；對于這些植物是否表達(dá)轉(zhuǎn)基因，尚未進(jìn)行徹底的分析。很可能是由于t1擬南芥植物中存在的高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默或者表觀遺傳效應(yīng)，導(dǎo)致雖然存在dgt-28轉(zhuǎn)基因仍然對草甘膦敏感。表9中提供了針對1,680gae/ha比率的草甘膦的按比率區(qū)分的總體群體損傷平均值(overallpopulationinjuryaveragebyrate)，證明用dgt-3,dgt-7,dgt-28,dgt-32和dgt-33轉(zhuǎn)化的植物與dgt-1和野生型對照相比有顯著差異。由新的細(xì)菌epsp合成酶提供的耐受性因具體的酶而不同。dgt-28,dgt-32和dgt-33出人意料地提供了對草甘膦顯著的耐受性。對于測試的所有轉(zhuǎn)運(yùn)肽，dgt基因均賦予t1擬南芥植物個(gè)體除草劑抗性。由此可見，使用額外的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(即trap8—dgt-32或trap8—dgt-33)將會(huì)提供對草甘膦的保護(hù)，在給定的處理中損傷水平與報(bào)道的相似。表7.dgt-28轉(zhuǎn)化的t1擬南芥對萌發(fā)后施用的、比率在一定范圍內(nèi)的草甘膦的響應(yīng)，與dgt-1(t4)純合子抗性群體和非轉(zhuǎn)化對照比較。施用后14天的目測％損傷表8.dgt-32和dgt-33轉(zhuǎn)化的t1擬南芥對萌發(fā)后施用的一定范圍的比率的草甘膦的響應(yīng)，與dgt-1(t4)純合子抗性群體和非轉(zhuǎn)化對照比較。施用后14天的目測％損傷表9.dgt-28,dgt-32,dgt-33,dgt-3,和dgt-7轉(zhuǎn)化的t1擬南芥對萌發(fā)后施用的1,680gae/ha的草甘膦的響應(yīng)，與dgt-1(t4)純合子抗性群體和非轉(zhuǎn)化對照比較。施用后14天的目測％損傷dgt-28作為選擇標(biāo)記使用如上所述的擬南芥轉(zhuǎn)化植物，測試dgt-28作為草甘膦篩選劑的選擇標(biāo)記。將大約50個(gè)t4代擬南芥種子(對dgt-28是純合的)摻入(spikedinto)大約5,000個(gè)野生型(對草甘膦敏感)種子中。令種子萌發(fā)，并用選擇劑量的草甘膦噴灑幼苗。比較了數(shù)次草甘膦處理；對于每一盤(tray)植物，按照下列處理方案之一，接受一個(gè)或兩個(gè)施用期的草甘膦：7dap(種植后天數(shù)),11dap,或7dap和11dap。因?yàn)樗兄参镞€在同一個(gè)轉(zhuǎn)化載體內(nèi)含有草胺膦抗性基因，可以將用草甘膦選出的含dgt-28的植物與用草銨膦選出的含dsm-2或pat的植物直接進(jìn)行比較。如前所述地用devilbisstm噴頭施用草甘膦處理。在17dap，將含有dgt-28的轉(zhuǎn)基因植物鑒別為“抗性”或“敏感性”。種植后7和11天(dap)施用26.25-1680gae/ha草甘膦處理，顯示可以有效選擇含有dgt-28的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物。對敏感性和抗性植物計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)草甘膦抗性植物的數(shù)目與所種植的含有dgt-28轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因種子的原始數(shù)目相關(guān)。這些結(jié)果表明，dgt-28可以有效地用作經(jīng)轉(zhuǎn)化的擬南芥群體的替代選擇標(biāo)記?？蛇z傳性將已確認(rèn)的t1轉(zhuǎn)基因擬南芥事件自花授粉，產(chǎn)生t2種子。通過向100顆隨機(jī)的t2同胞施用含有草銨膦(200gae/ha)的ignitetm除草劑，對這些種子進(jìn)行后代測試(progenytest)。在噴灑施用(用履帶式噴霧器,以187l/ha比率施用)之前，將每個(gè)單獨(dú)的t2植物移植到7.5-cm方盆中。對于顯性遺傳的單個(gè)座位，t1家族(t2植物)以預(yù)期的3抗性:1敏感性的模式發(fā)生了分離，孟德爾遺傳性通過卡方分析確定(p>0.05)。表10示出了以預(yù)期的孟德爾遺傳分離的t1家族的百分比，證明dgt-28性狀是通過孟德爾遺傳傳遞給t2代的。從5-15個(gè)t2個(gè)體收集種子(t3種子)。如前所述地對來自3-4個(gè)隨機(jī)選擇的t2家族中每一個(gè)的25個(gè)t3同胞進(jìn)行后代測試。數(shù)據(jù)顯示沒有分離，因此證明dgt-28和dgt-3被穩(wěn)定整合在染色體內(nèi)，并以孟德爾方式遺傳至少3代。表10.100株植物后代測試中以單孟德爾遺傳分離的t1家族(t2植物)的百分比感興趣的基因在1座位分離的受測t1家族(％)dgt-3v264％dgt-3v360％dgt-3v480％dgt-7v463％trap5v2–dgt-28v5100％trap8v2–dgt-28v5100％trap9v2–dgt-28v5100％trap12v2–dgt-28v550％trap13v2–dgt-28v575％yfp轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参?00％t2擬南芥數(shù)據(jù)對含有低拷貝數(shù)dgt-28轉(zhuǎn)基因的選定t1擬南芥事件的第二代植物(t2)進(jìn)行進(jìn)一步的草甘膦耐受性表征。如前所述施用草甘膦。植物響應(yīng)用處理2周后(wat)的％可見損傷表示。用很少或沒有損傷(<20％)、中等損傷(20-40％)或嚴(yán)重?fù)p傷(>40％)的個(gè)體數(shù)的柱狀圖表示數(shù)據(jù)。給出了每個(gè)用于擬南芥轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列中指示了每個(gè)比率和每種轉(zhuǎn)化的個(gè)體響應(yīng)的范圍。野生型、非轉(zhuǎn)化的擬南芥(哥倫比亞栽培種)用作草甘膦敏感性對照。在t2代中，可以獲得用于測試每個(gè)事件的半合子和純合子植物，因此將它們包括在內(nèi)測試的每個(gè)草甘膦比率。半合子植物在一個(gè)座位上含有兩個(gè)不同的等位基因，相比之下，純合子植物在一個(gè)座位上含有兩個(gè)相同的等位基因。由于半合子和純合子植物相比在基因劑量(genedosage)上的差異，預(yù)期在t2代中存在對草甘膦響應(yīng)的差異性。對草甘膦響應(yīng)的差異性反映在標(biāo)準(zhǔn)差和響應(yīng)范圍上。在t2代中，對單拷貝和多拷貝dgt-28事件均表征了草甘膦耐受性。在一個(gè)事件中，各單拷貝植物顯示相似的草甘膦耐受性。表11提供了一個(gè)單拷貝t2事件的特征數(shù)據(jù)。含有與trap5v2連鎖的dgt-28的事件與含有其它trap轉(zhuǎn)運(yùn)肽的dgt-28構(gòu)建體相比，沒有提供強(qiáng)健的草甘膦耐受性。然而，與非轉(zhuǎn)化的哥倫比亞對照相比，dgt-28trap5構(gòu)建體確實(shí)提供了低水平的草甘膦耐受性。有些情況下，顯示含有2個(gè)或更多個(gè)拷貝的dgt-28的事件對高比率的草甘膦更加敏感(數(shù)據(jù)未顯示)。這種對草甘膦敏感性的增加與先前對同樣含有高拷貝數(shù)的dgt-28轉(zhuǎn)基因的t1植物描述的數(shù)據(jù)相似。這可能是由于擬南芥植物中存在的高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默或者表觀遺傳效應(yīng)，結(jié)果雖然存在dgt-28轉(zhuǎn)基因，仍然對草甘膦敏感。這些事件含有與trap5v2(pdab105530),trap12v2(pdab105533)和trap13v2(pdab105534)連鎖的dgt-28。除了dgt-28之外，表12還提供了用dgt-3轉(zhuǎn)化的t2擬南芥事件。如表11中關(guān)于dgt-28事件所述的，該數(shù)據(jù)表含有一個(gè)代表性事件，它反映了每個(gè)構(gòu)建體對草甘膦的響應(yīng)特征。為了表征dgt-3，將含有受atubi10啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的dgt-3基因的單個(gè)ptu(植物轉(zhuǎn)錄單元)的構(gòu)建體(pdab102716，圖45和pdab102715，圖10)，與含有該相同基因的2個(gè)ptu的構(gòu)建體(pdab102719，圖32；pdab102718，圖33)進(jìn)行比較。含有2個(gè)ptu的構(gòu)建體利用atubi10啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)基因的一個(gè)拷貝，而利用csvmv啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)另一個(gè)拷貝。采用兩個(gè)ptu是為了比較dgt-3轉(zhuǎn)基因植物與含有兩個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝的dgt-28轉(zhuǎn)基因植物。數(shù)據(jù)證明，僅含有一個(gè)單ptu的單拷貝t2dgt-3事件比所測試的單拷貝dgt-28事件對草甘膦更敏感，但是比非轉(zhuǎn)化對照更耐受。含有dgt-3基因的2個(gè)ptu的t1家族比含1個(gè)ptu的構(gòu)建體提供了更高水平的目測草甘膦耐受性。在兩種情況下，t1家族均與dgt-1和野生型對照進(jìn)行比較。t2數(shù)據(jù)證明，dgt-28作為單拷貝事件提供了強(qiáng)健的耐受性。表11.選定的含有dgt-28的個(gè)體t2擬南芥事件對萌發(fā)后以不同比率施用的草甘膦的響應(yīng)，與dgt-1(t4)純合子抗性群體和非轉(zhuǎn)化對照比較。施用后14天的目測％損傷表12.用dgt-3轉(zhuǎn)化的選定t2擬南芥事件對萌發(fā)后以不同比率施用的草甘膦的響應(yīng)。施用后14天的目測％損傷t3擬南芥數(shù)據(jù)對含有低拷貝數(shù)dgt-28轉(zhuǎn)基因的選定t2擬南芥事件的第三代植物(t3)進(jìn)行進(jìn)一步的草甘膦耐受性表征。如前所述地用草銨膦從每個(gè)品系選出25株植物，并且來自每個(gè)測試構(gòu)建體的品系對于選擇標(biāo)記基因均沒有分離。如前所述施用草甘膦。植物響應(yīng)用處理2周后(wat)的％可見損傷表示。用顯示很少或沒有損傷(<20％)、中等損傷(20-40％)或嚴(yán)重?fù)p傷(>40％)的個(gè)體數(shù)的柱狀圖來表示數(shù)據(jù)。提供了每個(gè)用于擬南芥轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。在最后一列中，還針對每個(gè)比率和每種轉(zhuǎn)化指示了個(gè)體響應(yīng)的范圍。將野生型、非轉(zhuǎn)化的擬南芥(哥倫比亞栽培種)用作草甘膦敏感性對照。表13.含有dgt-28的各個(gè)選定t3擬南芥事件對萌發(fā)后以不同比率施用的草甘膦的響應(yīng)，與dgt-1(t4)純合子抗性群體和非轉(zhuǎn)化對照比較。施用后14天的目測％損傷轉(zhuǎn)化植物的篩選將新鮮采收的t1種子[dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1基因]在室溫下干燥，并運(yùn)輸?shù)接〉诎布{波利斯進(jìn)行測試。將t1種子播種在26.5x51-cm發(fā)芽托盤(t.o.plasticsinc.,clearwater,mn)中，每盤放入200mg等份的層積t1種子(～10,000個(gè)種子)，其先前已經(jīng)被混懸于40ml0.1％瓊脂糖溶液中，并在4℃保存2天，以完成休眠要求并確保種子同步萌發(fā)。將sunshinemixlp5(sungrohorticultureinc.,bellevue,wa)用細(xì)蛭石覆蓋，并用hoagland溶液從地下灌溉至濕潤，然后通過重力排水。用移液器將每個(gè)40ml等份的層積種子均勻播種在蛭石上，并用保濕蓋(kordtmproducts,bramalea,ontario,canada)覆蓋4-5天。一旦植物萌發(fā)，除去保濕蓋，然后用草銨膦萌發(fā)后噴灑劑進(jìn)行初始轉(zhuǎn)化體選擇(選擇共轉(zhuǎn)化的dsm-2基因)。在種植后6天(dap)和10dap，使用devilbiss壓縮空氣噴嘴用0.1％ignitetm除草劑溶液(280gai/l草銨膦,bayercropsciences,kansascity,mo)噴灑t1植物(分別為子葉期和2-4葉期)，噴灑體積為10ml/盤(703l/ha)，每次施用提供200gae/ha有效比率的草銨膦。在最終噴灑4-7天后鑒定存活者(活躍生長的植物)。將存活的植物單獨(dú)移植到備有盆栽培養(yǎng)基(metromix360tm)的3英寸盆(pot)中。在組織采樣用于拷貝數(shù)分析之前，植物在溫室中培養(yǎng)至少1天。對t1植物采樣，并完成對dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1基因的拷貝數(shù)分析。然后，對t1植物分配不同比率的草甘膦，使得每個(gè)比率均包括一定范圍的拷貝。對于擬南芥，26.25gae/ha草甘膦是用于區(qū)分敏感性植物與具備有意義水平抗性的植物的有效劑量。施用更高的比率，用于確定相對抗性水平(105,420,1680,或3360gae/ha)。表15顯示了針對dgt-1的比較。所有草甘膦除草劑施用均用履帶式噴霧器以187l/ha的噴霧體積完成。所使用的草甘膦是商業(yè)durango二甲胺鹽制劑(480gae/l,dowagrosciences,llc)。對于顯示草銨膦或草甘膦耐受性的低拷貝t1植物，進(jìn)一步在t2代中進(jìn)行評估。第一個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)化用dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1實(shí)施。首先用草銨膦篩選方案將t1轉(zhuǎn)化體從未轉(zhuǎn)化種子的背景中選擇出來。對于每種t1構(gòu)建體，分析了3個(gè)淺箱(flat)或30,000個(gè)種子。計(jì)算了轉(zhuǎn)化頻率，表14列出了t1dgt-31,dgt-32,和dgt-33構(gòu)建體的結(jié)果。表14.用篩選選擇標(biāo)記基因dsm-2的草銨膦選出的t1dgt-31,dgt-32,和dgt-33擬南芥構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化頻率構(gòu)建體盒轉(zhuǎn)化頻率(％)pdab107532atubi10/trap14dgt-32v10.47pdab107533atubi10/trap23dgt-31v10.36pdab107534atubi10/trap24dgt-33v10.68將上面選出的t1植物隨后移植到單獨(dú)的盆中，并用不同比率的商業(yè)草甘膦噴灑。表15比較了dgt-31,dgt-32,和dgt-33v1和對照基因賦予擬南芥t1轉(zhuǎn)化體草甘膦抗性的響應(yīng)。植物響應(yīng)用2wat的％可見損傷表示。用展示很少或沒有損傷(<20％)、中等損傷(20-40％)或嚴(yán)重?fù)p傷(>40％)的個(gè)體數(shù)的柱狀圖表示數(shù)據(jù)。提供了每一處理的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列中指示了每個(gè)比率和每種轉(zhuǎn)化的個(gè)體響應(yīng)的范圍。野生型非轉(zhuǎn)化的擬南芥(哥倫比亞栽培種)用作草甘膦敏感性對照。與陰性對照相比，具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽trap23的dgt-31(v1)基因?qū)Ω鱾€(gè)t1擬南芥植物賦予了微弱的除草劑耐受性，但是具有轉(zhuǎn)運(yùn)肽trap8的基因展示了更好的耐受性。在用trap8測試的比率、以及用dgt-32和dgt-33各自不同的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(分別為trap14和trap24)測試的比率下，dgt-32和dgt-33都展示了強(qiáng)健的草甘膦耐受性。在給定的處理中，植物的響應(yīng)水平變化很大，該差異可能是由于以下的事實(shí)，即每株植物代表一個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件，因此感興趣的基因的拷貝數(shù)在每個(gè)植物之間有不同。重要的是，在所測試的每個(gè)草甘膦比率下，均有一些個(gè)體比其它個(gè)體更加耐受。表15提供的按比率區(qū)分的總?cè)后w損傷平均值表明，用dgt-31、dgt-32和dgt-33v1轉(zhuǎn)化的植物與dgt-1v1或者野生型對照相比存在顯著差異。表15.dgt-31、dgt-32和dgt-33v1轉(zhuǎn)化的t1擬南芥對萌發(fā)后以一定范圍的比率施用的草甘膦的響應(yīng)，與dgt-1(t4)純合子抗性群體和非轉(zhuǎn)化對照比較。施用后2周后的目測％損傷實(shí)施例8:dgt-32和dgt-33作為選擇標(biāo)記使用dgt-32和dgt-33v1作為選擇標(biāo)記，以草甘膦為選擇劑。用轉(zhuǎn)化的擬南芥分析這些標(biāo)記的性能。將大約50粒t4代擬南芥種子(對dgt-32和dgt-33v1是純合的)摻雜到大約5,000粒野生型(敏感型)種子中。比較了數(shù)個(gè)處理，對于每一盤(tray)植物,按照下列處理方案之一，接受一個(gè)或兩個(gè)施用期的草甘膦：7dap,11dap,或7dap然后11dap。因?yàn)樗械膫€(gè)體還在同一轉(zhuǎn)化載體中含有dsm-2基因，因此用草甘膦篩選的dgt-32和dgt-33能夠直接與用草銨膦篩選的dsm-2進(jìn)行比較。用devilbisstm噴頭施用處理。在17dap，將植物鑒定為耐受或敏感。在篩選頻率方面，在種植后7天和11天(dap)施用的26.25-280gae/ha2,4-d處理同樣有效。這些結(jié)果表明，dgt-32和dgt-33v1能夠有效地用作選擇標(biāo)記?？蛇z傳性將多種t1事件自花授粉，以產(chǎn)生t2種子。通過向100個(gè)隨機(jī)t2同胞施用ignitetm(200gae/ha)對這些種子進(jìn)行后代測試。將每個(gè)單株t2植物移植到7.5-cm方盆中，然后進(jìn)行噴灑施用(用履帶式噴霧器以187l/ha施用比率施用)。通過卡方分析(p>0.05)確定了按照孟德爾遺傳以預(yù)期對于顯性遺傳單座位的3耐受性:1敏感性模式分離的t1家族(t2植物)。從5-15個(gè)t2單株收集種子(t3種子)。對來自3個(gè)隨機(jī)選擇t2家族的每一個(gè)的25個(gè)t3同胞進(jìn)行后代測試。數(shù)據(jù)沒有顯示分離，表明dgt-32和dgt-33v1均被穩(wěn)定整合，并以孟德爾方式遺傳至少3代。t3dgt品系的其它除草劑耐受性表征將t3代擬南芥種子層積，并播種在選擇托盤內(nèi)。以相似的方式種植含有dgt-1的轉(zhuǎn)化對照品系和非轉(zhuǎn)化對照。將幼苗轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的3-英寸盆內(nèi)，置于溫室中。用履帶式噴霧器以187l/ha噴灑所有植物。用420-3360gae/ha范圍的草甘膦(durangotmdma,dowagrosciences)噴灑植物。所有的施用物均在水中配制。每個(gè)處理重復(fù)4次，并在處理后7和14天對植物進(jìn)行評估。實(shí)施例9:其它作物物種的轉(zhuǎn)化利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如與先前pct國際專利公開no.wo2007/053482中的實(shí)施例11或?qū)嵤├?3所述的基本上相同的技術(shù)，用dgt-28,dgt-31,dgt-32,和/或dgt-33(具有或沒有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)轉(zhuǎn)化大豆，以提供對除草劑草甘膦的高水平耐受性。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如與先前美國專利7,838,733的實(shí)施例14或pct國際專利公開no.wo2007/053482的實(shí)施例12所述的基本上相同的技術(shù)，用dgt-28,dgt-31,dgt-32,和/或dgt-33(具有或沒有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)轉(zhuǎn)化棉花，以提供對除草劑草甘膦的高水平耐受性。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如與先前美國專利7,838,733的實(shí)施例26或pct國際專利公開no.wo2007/053482的實(shí)施例22所述的基本上相同的技術(shù)，用dgt-28,dgt-31,dgt-32,和/或dgt-33(具有或沒有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽)轉(zhuǎn)化加拿大油菜，以提供對除草劑草甘膦的高水平耐受性。實(shí)施例10:玉米轉(zhuǎn)化用于玉米轉(zhuǎn)化的dna構(gòu)建體使用如上所述的標(biāo)準(zhǔn)克隆方法構(gòu)建用于根癌土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化的二元載體。表16列出了構(gòu)建用于玉米轉(zhuǎn)化的載體。在包含dgt-28載體中使用如下的基因元件；使用玉米泛素1啟動(dòng)子(zmubi1；美國專利no.5,510,474)驅(qū)動(dòng)dgt-28編碼序列，該編碼序列側(cè)翼是玉米脂肪酶3’非翻譯區(qū)(zmlip3′utr；美國專利no.7179902)，選擇標(biāo)記盒的組成為：玉米泛素1啟動(dòng)子，其被用于驅(qū)動(dòng)aad-1編碼序列(美國專利no.7,838,733)，該編碼序列側(cè)翼是玉米脂肪酶3’非翻譯區(qū)。aad-1編碼序列賦予苯氧基生長素除草劑例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)，以及對芳基氧基苯氧基丙酸(aopp)類除草劑的耐受性。dgt-28構(gòu)建體被構(gòu)建成標(biāo)準(zhǔn)二元載體和土壤桿菌超二元系統(tǒng)載體(japantobacco,tokyo,jp)。標(biāo)準(zhǔn)二元載體包括：pdab107663,pdab107664,pdab107665,和pdab107665。土壤桿菌超二元系統(tǒng)載體包括pdab108384,pdab108385,pdab108386,和pdab108387。還構(gòu)建了含有黃色熒光蛋白(yfp；美國專利申請2007/0298412)報(bào)告基因的構(gòu)建體。pdab109812含有一個(gè)yfp報(bào)告基因盒，其由玉米泛素1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，且側(cè)翼為玉米per53′非翻譯區(qū)(zmper53′utr；美國專利no.7179902)，選擇標(biāo)記盒的組成為：甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子(scbv；美國專利no.5,994,123)，其被用于驅(qū)動(dòng)aad-1表達(dá)，且其側(cè)翼是玉米脂肪酶3’非翻譯區(qū)。pdab101556含有一個(gè)yfp盒，其由玉米泛素1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，側(cè)翼為玉米per53′非翻譯區(qū)，選擇標(biāo)記盒的組成為：玉米泛素1啟動(dòng)子，其被用于驅(qū)動(dòng)aad-1表達(dá)，且其側(cè)翼是玉米脂肪酶3’非翻譯區(qū)。pdab107698含有一個(gè)dgt-28盒，其由玉米泛素1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，且其側(cè)翼為玉米脂肪酶3′非翻譯區(qū)；一個(gè)yfp盒，且由玉米泛素1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)并且側(cè)翼為玉米per53′非翻譯區(qū)，選擇標(biāo)記盒的組成為：甘蔗桿狀病毒啟動(dòng)子，其被用于驅(qū)動(dòng)aad-1表達(dá)，且其側(cè)翼是玉米脂肪酶3’非翻譯區(qū)。所有這三個(gè)構(gòu)建體均是標(biāo)準(zhǔn)的二元載體。表16.玉米轉(zhuǎn)化載體穗滅菌和胚分離為了獲得玉米的未成熟胚，在溫室中種植玉米近交系b104的植株，并自花授粉或同胞授粉(sib-pollinated)產(chǎn)生穗。在授粉后大約9-12天采集穗。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，對穗進(jìn)行表面滅菌：在20％次氯酸鈉(5％)溶液中浸泡穗，并震蕩20-30分鐘，隨后在無菌水中漂洗3次。滅菌后，從每個(gè)穗無菌解剖出未成熟的合子胚(1.5-2.4mm)，并隨機(jī)分配到含有液體感染培養(yǎng)基(ls基礎(chǔ)培養(yǎng)基,4.43gm/l；n6維生素溶液[1000x],1.00ml/l；l-脯氨酸,700.0mg/l；蔗糖,68.5gm/l；d(+)葡萄糖,36.0gm/l；10mg/ml2,4-d,150μl/l)的微離心管中。對于一套給定的實(shí)驗(yàn)，每次轉(zhuǎn)化使用從3個(gè)穗?yún)R集的胚。土壤桿菌起始培養(yǎng)物：將含有上述二元轉(zhuǎn)化載體的土壤桿菌甘油保存物在含有合適抗生素的ab基本培養(yǎng)基平板上劃線，并在20℃生長3-4天。挑取單菌落并在含有相同抗生素的yep平板上劃線，并在28℃溫育1-2天。土壤桿菌培養(yǎng)和共培養(yǎng)從yep平板獲取土壤桿菌克隆，懸浮在置于50ml一次性管中的10ml感染培養(yǎng)基中，使用分光光度計(jì)將細(xì)胞密度調(diào)整到od600nm為0.2-0.4。將土壤桿菌培養(yǎng)物置于旋轉(zhuǎn)搖床上，室溫125rpm振蕩，同時(shí)進(jìn)行胚解剖。從無菌玉米谷粒分離大小為1.5-2.4mm的未成熟合子胚，置于1ml感染培養(yǎng)基中，用相同培養(yǎng)基清洗1次。每個(gè)管中加入土壤桿菌懸液(2ml)，將管置于振蕩平臺(tái)上10-15分鐘。將胚轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(ms鹽，4.33gm/l，l-脯氨酸，700.0mg/l；肌醇，100.0mg/l，酪蛋白酶促水解物100.0mg/l，30mm麥草畏-koh，3.3mg/l；蔗糖，30.0gm/l；gelzantm,3.00gm/l；改良的ms-維生素[1000x]，1.00ml/l；8.5mg/mlagno3，15.0mg/l；dmso，100μm)，調(diào)整方向使胚盤朝上，并在25℃、24小時(shí)光照，50μmolem-2sec-1光強(qiáng)條件下溫育3天。愈傷組織篩選和假定事件(putativeenvents)的再生共培養(yǎng)期后，將胚轉(zhuǎn)移到?jīng)]有選擇劑的恢復(fù)培養(yǎng)基(restingmedia)(ms鹽，4.33gm/l；l-脯氨酸，700.0mg/l；1,2,3,5/4,6-六羥基環(huán)己烷，100mg/l；mes[(2-(n-嗎啉代)-乙磺酸),游離酸]0.500gm/l；酪蛋白酶水解物100.0mg/l；30mm的麥草畏-koh，3.3mg/l；蔗糖，30.0gm/l；gelzan2.30gm/l；改良的ms-維生素[1000x]，1.00ml/l；8.5mg/mlagno3，15.0mg/l；羧芐青霉素，250.0mg/l)，并在25℃、24小時(shí)光照，50μmolem-2sec-1光強(qiáng)條件下溫育3天。生長抑制劑量響應(yīng)實(shí)驗(yàn)提示，0.25mm和更高的草甘膦濃度足以抑制非轉(zhuǎn)化b104玉米品系的細(xì)胞生長。將胚轉(zhuǎn)移到含有0.5mm草甘膦的選擇1培養(yǎng)基(ms鹽，4.33gm/l；l-脯氨酸，700.0mg/l；肌醇，100.0mg/l；mes[(2-(n-嗎啉代)-乙磺酸)，游離酸]0.500gm/l；酪蛋白酶水解物100.0mg/l；30mm的麥草畏-koh，3.3mg/l；蔗糖，30.0gm/l；gelzantm2.30gm/l；改良的ms-維生素[1000x]，1.00ml/l；8.5mg/mlagno3，15.0mg/l；羧芐青霉素，250.0mg/l)，并在28℃，黑暗和/或24小時(shí)光照，50μmolem-2sec-1光強(qiáng)條件下溫育7-14天。將增殖中的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有1.0mm草甘膦的選擇2培養(yǎng)基(ms鹽，4.33gm/l；1,2,3,5/4,6-六羥基環(huán)己烷，100mg/l；l-脯氨酸，700.0mg/l；mes[(2-(n-嗎啉代)-乙磺酸)，游離酸]0.500gm/l；酪蛋白酶水解物100.0mg/l；30mm的麥草畏-koh，3.3mg/l；蔗糖，30.0gm/l；gelzantm2.30gm/l；改良的ms-維生素[1000x]，1.00ml/l；8.5mg/mlagno3，15.0mg/l；羧芐青霉素，250.0mg/l；r-吡氟氯禾靈酸(r-haloxyfopacid))，并在28℃、黑暗和/或24小時(shí)光照，50μmolem-2sec-1光強(qiáng)條件下溫育14天。這一選擇步驟允許轉(zhuǎn)基因愈傷組織進(jìn)一步增殖和分化。愈傷組織選擇期持續(xù)3-4周。將增殖中的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有0.5mm草甘膦的prereg培養(yǎng)基(ms鹽，4.33gm/l；1,2,3,5/4,6-六羥基環(huán)己烷，100mg/l；l-脯氨酸，350.0mg/l；mes[(2-(n-嗎啉代)-乙磺酸)，游離酸]0.250gm/l；酪蛋白酶水解物50.0mg/l；naa-naoh0.500mg/l；aba-etoh2.50mg/l；ba1.00mg/l；蔗糖，45.0gm/l；gelzantm2.50gm/l；改良的ms-維生素[1000x]，1.00ml/l；8.5mg/mlagno3，1.00mg/l；羧芐青霉素，250.0mg/l)，并在28℃，24小時(shí)光照，50μmolem-2sec-1光強(qiáng)條件下溫育7天。將具有抽芽狀芽(shoot-likebud)的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有0.5mm草甘膦的再生培養(yǎng)基(ms鹽，4.33gm/l；1,2,3,5/4,6-六羥基環(huán)己烷，100mg/l；蔗糖，60.0gm/l；gellan膠g434tm3.00gm/l；改良的ms-維生素[1000x]，1.00ml/l；羧芐青霉素，125.0mg/l)，并在24小時(shí)光照，50μmolem-2sec-1光強(qiáng)條件下培養(yǎng)7天。將具有初生根的小芽(smallshoot)轉(zhuǎn)移到含有生根培養(yǎng)基(ms鹽，4.33gm/l；改良的ms-維生素[1000x]，1.00ml/l；1,2,3,5/4,6-六羥基環(huán)己烷，100mg/l；蔗糖，60.0gm/l；gellan膠g434tm3.00gm/l；羧芐青霉素，250.0mg/l)的植物托盤(phytotray)中，并在27℃、16/8小時(shí)光照/黑暗、140-190μmolem-2sec-1光強(qiáng)條件下溫育7天。使用上述方案分析假定的轉(zhuǎn)基因小植物的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)并將其轉(zhuǎn)移到土壤中。玉米植物中dgt-28和aad-1轉(zhuǎn)基因存在的分子確認(rèn)通過水解探針測定確認(rèn)dgt-28和aad-1多核苷酸序列的存在。通過一種類似于taqmantm的水解探針測定法對分離的t0玉米植株進(jìn)行了初始篩選，以確認(rèn)dgt-28和aad-1轉(zhuǎn)基因的存在。這些研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)被用來確定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，并用于選擇轉(zhuǎn)基因玉米事件用于回交和進(jìn)行到t1代。將組織樣品收集在96孔板中，用klecotm組織粉碎機(jī)和不銹鋼珠(hooverprecisionproducts,cumming,ga)在qiagentmrlt緩沖液進(jìn)行組織浸解。組織浸解后，使用biosprinttm96孔板試劑盒(qiagentm,germantown,md)，根據(jù)制造商建議的方案以高通量格式分離基因組dna。用quant-ittmpicogreendna測定試劑盒(molecularprobes,invitrogen,carlsbad,ca)對基因組dna進(jìn)行定量。用biorobot3000tm自動(dòng)移液器(qiagen,germantown,md)將定量過的基因組dna調(diào)整到大約2ng/μl，用于水解探針測定。利用一種類似于測定的水解探針測定法來確定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，該測定通過使用480系統(tǒng)(rocheappliedscience,indianapolis,in)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr來實(shí)施。使用探針設(shè)計(jì)軟件2.0，為aad-1、dgt-28和內(nèi)參基因轉(zhuǎn)換酶(genbank登錄號no:u16123.1)設(shè)計(jì)了測定法。為了擴(kuò)增，在10μl體積的含有aad-1和dgt-28引物各0.4μm、和每種探針各0.2μm(表17)的多重反應(yīng)體系中制備1x終濃度的480probemastermix(rocheappliedscience)。實(shí)施兩步擴(kuò)增反應(yīng)，在60℃延伸40秒并獲取熒光。運(yùn)行所有樣品，并使用平均循環(huán)閾值(ct)值分析每個(gè)樣品。使用lightcyclertm軟件1.5發(fā)布版進(jìn)行實(shí)時(shí)定量pcr數(shù)據(jù)的分析，其使用相對定量模塊，并基于δδct方法。每次運(yùn)行中包含單拷貝校準(zhǔn)物(calibrator)和已知的二拷貝檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(check)，對照包括來自該校準(zhǔn)物和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的基因組dna樣品。表18列出了水解探針測定的結(jié)果。表17.用于aad-1，dgt-28和內(nèi)參(轉(zhuǎn)化酶)水解探針測定的引物和探針寡核苷酸名稱檢測基因seqidno:寡核苷酸序列g(shù)aad1faad-1正向引物58tgttcggttccctctaccaagaad1paad-1探針59cacagaaccgtcgcttcagcaacagaad1raad-1反向引物60caacatccatcaccttgactgaiv-probe轉(zhuǎn)化酶探針61cgagcagaccgccgtgtacttctaccivf-taq轉(zhuǎn)化酶正向引物62tggcggacgacgacttgtivr-taq轉(zhuǎn)化酶反向引物63aaagtttggaggctgccgtzmdgt28fdgt-28正向引物64ttcagcacccgtcagaatzmdgt28famdgt-28探針65tgccgagaacttgaggaggtzmdgt28rdgt-28反向引物66tggtcgccatagcttgt表18.dgt-28事件的t0拷貝量結(jié)果。低拷貝事件由1-2個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝組成，括號中列出了單拷貝數(shù)。高拷貝事件包含3個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因拷貝。用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒低拷貝事件數(shù)(單拷貝)高拷貝事件數(shù)pdab10766343(31)10pdab10766430(24)5pdab10766540(27)10pdab10766624(12)12pdab1098122(1)0pdab10155625(15)10pdab1076983(1)2實(shí)施例11:dgt-28轉(zhuǎn)化玉米的除草劑耐受性使玉米dgt-28轉(zhuǎn)化事件(t0)在溫室中馴化，并生長至植物從組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)向溫室生長條件(即，從輪生體(whorl)生出2-3片新的看上去正常的葉片)。植物在27℃，16小時(shí)光照:8小時(shí)黑暗條件的溫室中生長。然后，用durangodmatm商業(yè)制劑(含有除草劑草甘膦)并添加2％w/v硫酸銨對植物進(jìn)行處理。除草劑施用用履帶式噴霧器實(shí)施，噴霧體積為187l/ha，噴霧高度50cm。用280-4480gae/ha草甘膦的范圍對t0植物噴灑草甘膦，該范圍的草甘膦能夠?qū)Ψ寝D(zhuǎn)化玉米品系造成顯著損傷。致死劑量的定義為導(dǎo)致b104近交系>95％損傷的比率。t0dgt-28玉米植物的結(jié)果表明對比率最高達(dá)4480gae/ha的草甘膦實(shí)現(xiàn)了耐受性。在t0代中使用了一種特殊的培養(yǎng)基。與非轉(zhuǎn)化對照相比，轉(zhuǎn)化植物的生長停滯(stunting)極小且整體植物生長，這表明當(dāng)與trap5、trap8和trap23葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽連鎖時(shí)，dgt-28提供了強(qiáng)健的草甘膦耐受性。將選定的t0植物自交和回交，以便進(jìn)一步在下一代中進(jìn)行表征。用140-1120gae/ha草銨膦或105-1680gae/ha草甘膦噴灑100個(gè)含有t1植物的選定dgt-28品系。選擇標(biāo)記和草甘膦抗性基因二者被構(gòu)建在相同質(zhì)粒中。因此，如果通過噴灑除草劑選擇某一個(gè)除草劑抗性基因，則認(rèn)為這兩個(gè)基因同時(shí)存在。在14dat，對抗性和敏感植物進(jìn)行計(jì)數(shù)，用于確定如下品系的百分比：通過卡方分析確定，這些品系作為單座位、顯性孟德爾性狀(3r:1s)分離。這些數(shù)據(jù)證明，dgt-28作為一種強(qiáng)健的草甘膦抗性基因在單子葉物種中是可遺傳的。向t1或f1存活者施用更高比率的草甘膦，以進(jìn)一步表征由dgt-28基因提供的耐受性和保護(hù)。dgt-28轉(zhuǎn)化的t0玉米中的萌發(fā)后除草劑抗性通過土壤桿菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生與trap4,trap5,trap8和trap23連鎖的dgt-28的t0事件，并在受控的生長室條件下馴化，直至從輪生體(whorl)生出2-4片新的看上去正常的葉片。給植物指定個(gè)體鑒定編號，并對植物采樣用于進(jìn)行dgt-28和aad-1拷貝數(shù)分析。根據(jù)拷貝數(shù)分析，選出植物用于蛋白表達(dá)分析。將植物移植到含有新生長培養(yǎng)基的較大的盆中，在27℃，16小時(shí)光照:8小時(shí)黑暗的溫室條件下生長。然后用添加2％w/v硫酸銨的durangodmatm商業(yè)制劑(草甘膦)對沒有采樣用于蛋白表達(dá)的剩余植物進(jìn)行處理。處理的分布使得每組植物含有具有不同拷貝數(shù)的t0事件。除草劑的施用使用履帶式噴霧器，以187l/ha噴霧體積、50-cm噴霧高度來進(jìn)行。用280-4480gae/ha草甘膦的草甘膦范圍對t0植物進(jìn)行噴灑，該范圍能夠?qū)Ψ寝D(zhuǎn)化玉米品系造成顯著損傷。致死劑量的定義為導(dǎo)致b104近交系>95％損傷的比率。b104是轉(zhuǎn)化體的遺傳背景。t0dgt-28玉米植物的結(jié)果表明，對最高達(dá)4480gae/ha比率的草甘膦實(shí)現(xiàn)了耐受性。表19。與非轉(zhuǎn)化對照相比，轉(zhuǎn)化植物的生長停滯極小且整體植物生長，這表明當(dāng)與trap5,trap8,和trap23連鎖時(shí)，dgt-28提供了強(qiáng)健的的針對草甘膦的保護(hù)作用。表19.具有不同拷貝數(shù)的t0dgt-28事件在處理后14天對280-4480gae/ha不同比率草甘膦+2.0％w/v硫酸銨的響應(yīng)通過標(biāo)準(zhǔn)elisa進(jìn)行的蛋白表達(dá)分析證明，測試的所有構(gòu)建體的平均dgt-28蛋白范圍是12.6-22.5ng/cm2。確認(rèn)f1代在溫室條件下的草甘膦耐受性將沒有噴藥的單拷貝t0植物與非轉(zhuǎn)化背景b104回交，以便在下一代中進(jìn)行進(jìn)一步的表征。在t1代中，評估了草甘膦耐受性，以確認(rèn)dgt-28基因的遺傳。對于t1植物，在v1生長期施用除草劑assureiitm(35gae/ha喹禾靈-甲酯(quizalofop-methyl))，以選擇aad-1蛋白。將選擇標(biāo)記和草甘膦抗性基因構(gòu)建在同一質(zhì)粒上。因此，如果一個(gè)基因被選擇，則認(rèn)為兩個(gè)基因同時(shí)存在。7dat后，對抗性和敏感性植物進(jìn)行計(jì)數(shù)，并從群體中除去空植物。這些數(shù)據(jù)證明，dgt-28(v1)作為一種強(qiáng)健的草甘膦抗性基因在單子葉物種中是可遺傳的。對植物采樣，通過標(biāo)準(zhǔn)elisa和rna轉(zhuǎn)錄本水平表征dgt-28蛋白。如前所述地用560-4480gae/ha草甘膦噴灑抗性植物。數(shù)據(jù)表明，與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽trap4,trap5,trap8和trap23關(guān)聯(lián)的dgt-28對高達(dá)4480gae/ha草甘膦具有強(qiáng)健的耐受性。表20。表20.f1單拷貝dgt-28事件在處理后14天對560-4480gae/ha比率范圍的草甘膦+2.0％w/v硫酸銨的響應(yīng)蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)證明，在測試的所有t1事件和構(gòu)建體中均值dgt-28蛋白的范圍是42.2-88.2ng/cm2，這證明了t1代中的蛋白表達(dá)。田地條件下的dgt-28玉米的表征將單拷貝t1事件送至田間地點(diǎn)用于產(chǎn)生雜交半合和近交純合種子，以供進(jìn)一步的表征。雜交種子的產(chǎn)生是通過將玉米轉(zhuǎn)化系b104的t1事件與近交系4xp811雜交，產(chǎn)生該事件以1:1(半合子:空)分離的雜交群體。將所得的種子運(yùn)送到2個(gè)不同的地點(diǎn)。按照完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)(randomizedcompleteblockdesign)，每個(gè)構(gòu)建體在每個(gè)地點(diǎn)種植總共5個(gè)單拷貝事件，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。設(shè)計(jì)田地，使得草甘膦的施用在v4生長期發(fā)生，且一組單獨(dú)的植物在v8生長期被施用。用4xp811/b104常規(guī)雜交體作為陰性對照。實(shí)驗(yàn)行(experimentalrows)用184gae/haassureiitm(106gai/l喹禾靈-甲酯(quizalofop-methyl))處理，以消除空分離體。所有實(shí)驗(yàn)入選者相對于assureiitm施用均以1:1(敏感:抗性)發(fā)生了分離(p＝0.05)。對于選定的抗性植物，從每個(gè)事件采樣，通過標(biāo)準(zhǔn)elisa定量dgt-28蛋白。對于喹禾靈-甲酯抗性植物，在v4或v8生長期用商業(yè)除草劑durangodmatm(480gae/lglyphosate)加2.5％w/v硫酸銨進(jìn)行處理。使用噴管式噴霧器進(jìn)行除草劑施用，噴霧器校準(zhǔn)到輸送187l/ha的體積、50-cm噴霧高度。用1120-4480gae/ha草甘膦的范圍對植物噴灑草甘膦，該范圍而能夠?qū)Ψ寝D(zhuǎn)化玉米品系造成顯著損傷。致死劑量定義為導(dǎo)致4xp811近交系>95％損傷的比率。對下列各項(xiàng)進(jìn)行可見損傷評估：7、14和21dat(處理后天數(shù))時(shí)的目測失綠百分比、壞死百分比、生長抑制百分比和總可見損傷。將評估結(jié)果與每個(gè)品系的未處理檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和陰性對照進(jìn)行比較。所有評估期的可見損傷數(shù)據(jù)證明，在兩個(gè)地點(diǎn)和兩個(gè)施用期，對高達(dá)4480gae/hadurangodmatm具有強(qiáng)健的耐受性。提供了來自一個(gè)地點(diǎn)的針對v4施用的代表性事件，并且這些事件與其它事件、施用期和地點(diǎn)一致。表21。一個(gè)事件來自含有與trap23連鎖的dgt-28的構(gòu)建體(pdab107665)，該事件對assureiitm所致的aad-1蛋白選擇有耐受性，但是對施用的所有比率的草甘膦敏感。表21.dgt-28事件對v4生長期施用的1120-4480gae/ha范圍的草甘膦+2.5％w/v硫酸銨的響應(yīng)在生殖生長期對4480gae/ha草甘膦比率進(jìn)行了額外評估。對于所有構(gòu)建體、施用期和地點(diǎn)，抽穗、授粉期和穗充滿的目測評估均與每個(gè)品系的未處理檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(check)相似。dgt-28蛋白的定量結(jié)果證明，均值蛋白表達(dá)的范圍是186.4-303.0ng/cm2。數(shù)據(jù)證明，在田間條件下在整個(gè)生殖生長期內(nèi)，dgt-28轉(zhuǎn)化玉米對高達(dá)4480gae/ha的草甘膦都具有強(qiáng)健的耐受性?；趪姙⒛褪苄越Y(jié)果，數(shù)據(jù)還證明了dgt-28蛋白的檢出和功能。確認(rèn)dgt-28玉米在純合狀態(tài)下的可遺傳性和耐受性將來自t1s2的種子如前所述地在溫室條件下種植。對已在田間條件下表征過的5個(gè)單拷貝品系，在同質(zhì)狀態(tài)下再次進(jìn)行表征。植物生長至v3生長期，分配到3個(gè)草甘膦比率，范圍是1120-4480gae/ha草甘膦(durangodmatm)，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。如前所述地用履帶式噴霧器實(shí)施施用，在2.0％w/v硫酸銨中進(jìn)行配制。施用硫酸銨作為每個(gè)品系的未處理檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。如前所述地在處理后7和14天進(jìn)行目測評估。數(shù)據(jù)證明，所有測試事件對高達(dá)4480gae/ha草甘膦均具有強(qiáng)健的耐受性。表22。表22.純合子dgt-28事件對施用1120-4480gae/ha范圍的草甘膦+2.0％w/v硫酸銨的響應(yīng)來自在田間條件下不耐受的pdab107665的品系被證明對草甘膦無耐受性，因此與田間觀察結(jié)果一致(數(shù)據(jù)未顯示)。除了先前提到的一個(gè)品系之外，其它品系的所有用草甘膦處理的重復(fù)均對草甘膦不敏感。因此，數(shù)據(jù)證明了dgt-28玉米能夠以孟德爾方式遺傳到同質(zhì)群體。通過標(biāo)準(zhǔn)elisa確定的dgt-28蛋白的表達(dá)情況證明，在對草甘膦耐受的單拷貝事件中，均值蛋白表達(dá)范圍是27.5-65.8ng/cm2。數(shù)據(jù)證明了dgt-28蛋白在所有世代都是有功能的蛋白，并且穩(wěn)定。實(shí)施例12：使用草甘膦作為選擇標(biāo)記的萌發(fā)后除草劑耐受性如前所述，從組織培養(yǎng)物中除去t0轉(zhuǎn)化植物，并在溫室內(nèi)馴化。所測試的事件含有與trap5,trap8,和trap23葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽連鎖的dgt-28。已經(jīng)證明，這些t0植物提供了對最高達(dá)4480gae/ha草甘膦的強(qiáng)健耐受性，并且非轉(zhuǎn)化植物被低至280gae/ha的草甘膦濃度所控制。這些數(shù)據(jù)證明，在使用范圍為280-4480gae/ha的草甘膦濃度的情況下，dgt-28能夠用作選擇標(biāo)記。將若干來自含有dgt-28轉(zhuǎn)基因的玉米固定品系的種子摻雜到(spikedinto)若干非轉(zhuǎn)化玉米種子中。種植種子并使之生長至v1-v3發(fā)育期，此時(shí)用280-4480gae/ha范圍的選擇性劑量的草甘膦噴灑小植株。7-10天后，對敏感性和耐受性植株進(jìn)行計(jì)數(shù)，草甘膦耐受植株的量與所種植的含有dgt-28轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因種子的原始量相關(guān)。實(shí)施例13:dgt-28玉米的疊加出于研究目的，使用aad-1蛋白作為dgt-28轉(zhuǎn)化玉米中的選擇標(biāo)記。aad-1也可以在玉米中用作除草劑耐受性性狀，為作物提供強(qiáng)健的2,4-d耐受性，直至v8施用。對來自構(gòu)建體pdab107663(trap4::dgt-28),pdab107664(trap8::dgt-28)和pdab107666(trap5::dgt-28)的4個(gè)事件，表征了它們對草甘膦和2,4-d桶混合施用的耐受性。表征研究用f1種子在溫室條件下完成。施用如前所述地用履帶式噴霧器實(shí)施，使用如下的比率：1120-2240gae/ha草甘膦(對dgt-28基因選擇性),1120-2240gae/ha2,4-d(對aad-1基因選擇性)，或這兩種除草劑處于所述比率的桶混合物。在7和14dat對植物進(jìn)行評級。表23顯示了以2240gae/ha施用除草劑的噴灑結(jié)果。表23.f1aad-1和dgt-28玉米在處理后14天對噴灑2240gae/ha2,4-d、草甘膦、和兩種除草劑的桶混合物組合的響應(yīng)結(jié)果確認(rèn)，dgt-28能夠成功地與aad-1疊加，從而增加可用于感興趣的作物的除草劑譜(草甘膦+苯氧乙酸類，分別用于dgt-28和aad-1)。在難以控制闊葉雜草或存在抗性雜草生物型的作物生產(chǎn)中，該疊加可用作雜草控制和保護(hù)感興趣的作物的手段。在玉米和其它植物中，額外的輸入或輸出性狀也可以和dgt-28基因疊加。實(shí)施例14:其它作物的轉(zhuǎn)化使用已知的技術(shù)對其它作物進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。對于土壤桿菌介導(dǎo)的黑麥轉(zhuǎn)化，見例如popelkajc,xuj,altpeterf.,“generationofryewithlowtransgenecopynumberafterbiolisticgenetransferandproductionof(secalecerealel.)plantsinstantlymarker-freetransgenicrye,”transgenicres.2003oct；12(5):587-96.)。對于土壤桿菌介導(dǎo)的高粱轉(zhuǎn)化，見例如zhaoetal.,“agrobacterium-mediatedsorghumtransformation,”plantmolbiol.2000dec；44(6):789-98。對于土壤桿菌介導(dǎo)的大麥轉(zhuǎn)化，見例如tingayetal.,“agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation,”theplantjournal,(1997)11:1369–1376。對于土壤桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化，見例如chengetal.,“genetictransformationofwheatmediatedbyagrobacteriumtumefaciens,”plantphysiol.1997nov；115(3):971-980。對于土壤桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化，見例如hieietal.,“transformationofricemediatedbyagrobacteriumtumefaciens,”plantmol.biol.1997sep；35(1-2):205-18。其它(非土壤桿菌)轉(zhuǎn)化技術(shù)用于將dgt-28、dgt-32、或dgt-33轉(zhuǎn)化進(jìn)入，例如，玉米(zeamays)、小麥(triticumspp.)、水稻(oryzaspp.和zizaniaspp.)、大麥(hordeumspp.)、棉花(abromaaugusta和gossypiumspp.)、大豆(glycinemax)、糖用和菜用甜菜(betaspp.)、甘蔗(arengapinnata)、番茄(lycopersiconesculentum)和其它種、粘果酸漿(physalisixocarpa)、黃水茄(solanumincanum)和其它種、和樹番茄(cyphomandrabetacea)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、甘薯(ipomoeabatatas)、黑麥(secalespp.)、辣椒(capsicumannuum、chinense、和frutescens)、萵苣(lactucasativa、perennis、和pulchella)、卷心菜(brassicaspp.)、芹菜(apiumgraveolens)、茄子(solanummelongena)、花生(arachishypogea)、高粱(sorghumspp.)、苜蓿(medicagosativa)、胡蘿卜(daucuscarota)、豆類(phaseolusspp.和其它屬)、燕麥(avenasativa和strigosa)、豌豆(pisum、vigna、和tetragonolobusspp.)、向日葵(helianthusannuus)、南瓜(cucurbitaspp.)、黃瓜(cucumissativa).煙草(nicotianaspp.)、擬南芥(arabidopsisthaliana)、草坪草(lolium、agrostis、poa、cynodon、和其它屬)、三葉草(trifolium)、野豌豆(vicia)。由dgt-28、dgt-32和dgt-33賦予的草甘膦耐受性可提高草甘膦除草劑在許多落葉和常青木材種植系統(tǒng)中用于當(dāng)季使用(in-seasonuse)的應(yīng)用能力。草甘膦除草劑耐受性木材物種增加了這些除草劑過頂施用而無需擔(dān)憂損傷的適應(yīng)性。因此，dgt-28,dgt-32,和/或dgt-33被轉(zhuǎn)化進(jìn)入木材物種中：榿樹(alnusspp.),白蠟樹(fraxinusspp.),白楊和楊屬樹種(populusspp.),山毛櫸(fagusspp.),樺樹(betulaspp.),櫻桃樹(prunusspp.),桉樹(eucalyptusspp.),山核桃(caryaspp.),楓樹(acerspp.),橡樹(quercusspp.),和松樹(pinusspp.)。草甘膦除草劑耐受性可提高草甘膦除草劑在觀賞和荷果物種中選擇性控制雜草的應(yīng)用能力。因此，dgt-28、dgt-32和/或dgt-33被轉(zhuǎn)化進(jìn)入觀賞和荷果物種中：玫瑰(rosaspp.)、火焰衛(wèi)矛(burningbush)(euonymusspp.)、矮牽牛(petuniaspp.)、秋海棠(begoniaspp.)、杜鵑(rhododendronspp.)、海棠或蘋果(malusspp.)、梨(pyrusspp.)、桃(prunusspp.)、和金盞花(tagetesspp.)。實(shí)施例15:與其它性狀疊加含有昆蟲抗性(ir)性狀的轉(zhuǎn)基因作物在整個(gè)北美的玉米、大豆和棉花植物中普遍存在，并且對這些性狀的利用正擴(kuò)大到全球。許多種子公司已經(jīng)開發(fā)出了將昆蟲抗性和除草劑耐受性(ht)性狀相結(jié)合的商業(yè)轉(zhuǎn)基因作物。這些包括蘇云金芽孢桿菌性狀(例如，在網(wǎng)站lifesci.sussex.ac.uk，2006列出的bt毒素)，非bt昆蟲抗性性狀，以及任何或全部上述的ht性狀。通過ir性狀控制多個(gè)蟲害問題的能力是一個(gè)有價(jià)值的商業(yè)產(chǎn)品概念。然而，如果雜草控制和昆蟲控制是彼此相互獨(dú)立的，那么這種產(chǎn)品概念的便利性將受到限制。將dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33以單獨(dú)的或與一種或多種額外的ht性狀疊加的形式與一種或多種額外的輸入性狀(例如昆蟲抗性、真菌抗性、或脅迫耐受性等，見www.isb.vt.edu)疊加，疊加或是通過常規(guī)育種，或是聯(lián)合作為一個(gè)新的轉(zhuǎn)化事件。ir性狀與dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33疊加。一旦獲得ir性狀的編碼序列，即添加表達(dá)元件(例如啟動(dòng)子、內(nèi)含子、3'utr等)并通過重組dna方法將ir性狀與dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33分子疊加。ir性狀包括：cry1f(美國專利nos.5,126,133；5,188,960；5,691,308；6,096,708；6,573,240；和6,737,273)；cry1a(c)(美國專利nos.6,114,138；5,710,020；6,251,656；和6,229,004)；cry1f和cry1a(c)與dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33作為三重疊加；cry34ab(1)(美國專利nos.7,323,556；7,897,342；7,888,495；7,875,430；7,932,033；7,956,246；6,340,593),cry35ab(1)(美國專利no.6,340,593；7,323,556；7,897,342；7,888,495；7,875,430；7,932,033；7,956,246)；和/或cry35ab(1)和cry34ab(1)與dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33作為三重疊加。益處包括：由dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33提供改良的雜草控制，并且在先前實(shí)施例中所述，與管理蟲害和/或其他農(nóng)藝脅迫的能力聯(lián)合。含有這些與dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33疊加的性狀的植物可提供一套完整的改良的作物品質(zhì)的農(nóng)藝包，其具有靈活且成本高效地控制任何數(shù)量的農(nóng)藝問題的能力。ir和ht性狀的組合在大多數(shù)農(nóng)藝和園藝/觀賞作物和林業(yè)中具有應(yīng)用潛力。dgt-28,dgt-31,dgt-32或dgt-33與相稱的除草劑抗性和昆蟲耐受性的組合，這些除草劑抗性和昆蟲耐受性由任何bt或非btir基因(此類基因有多種)提供，可以用于本文列出的作物物種。通過常規(guī)育種或遺傳工程用dgt-28,dgt-31,dgt-32或dgt-33轉(zhuǎn)化并與相應(yīng)的ht性狀或ir性狀疊加，使得本文列出的各種商業(yè)除草劑均有可能在這類作物中應(yīng)用。這些化學(xué)的代表性除草劑的具體使用比率，由匯編于cpr(cropprotectionreference)一書中或類似結(jié)集中的除草劑標(biāo)簽、或在線匯編的標(biāo)簽(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)、或任何商業(yè)或?qū)W術(shù)的作物保護(hù)指南如美國農(nóng)業(yè)聯(lián)盟(agriliance)的作物保護(hù)指南(2005)來規(guī)定。實(shí)施例16:在任何作物中dgt性狀與aad性狀疊加通過疊加dgt性狀和aad性狀(例如,美國專利7,838,733中描述的aad-1；或pct國際專利公開no.wo2007/053482a2中描述的aad-12)，無論是通過常規(guī)育種還是聯(lián)合作為一種新轉(zhuǎn)化事件，可以提高雜草控制效率、改善靈活性、和提高管理雜草遷移和除草劑耐受性發(fā)生的能力。aad-1轉(zhuǎn)化作物允許種植者在單子葉作物中選擇性施用芳氧基鏈烷酸酯(aryloxyalkanoate)除草劑。這些單子葉作物可以具有更高的苯氧基生長素安全邊界。此外，可以對用aad-1轉(zhuǎn)化的雙子葉作物選擇性施用苯氧基生長素。用aad-12轉(zhuǎn)化作物允許種植者在雙子葉作物中選擇性施用吡啶氧基生長素和氧基鏈烷酸酯除草劑，以控制雜草物種。通過將dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33與aad-1或aad-12性狀疊加，可以給種植人提供更寬的用于管理雜草的除草劑譜。而且，使用除草劑組合可以更靈活地管理雜草物種內(nèi)的除草劑耐受性。為植物提供了下面的雜草控制選項(xiàng)，其中dgt性狀與aad性狀在任何單子葉或雙子葉作物物種中疊加：a.以標(biāo)準(zhǔn)萌發(fā)后施用比率(420-2160gae/ha,例如560-1120gae/ha)施用草甘膦，以控制大多數(shù)禾本科雜草(grass)和闊葉雜草物種。在這些草甘膦施用比率下，dgt性狀可提供耐受性。為了控制草甘膦耐受性闊葉雜草如飛蓬(conyzacanadensis)或本來就難以用草甘膦控制的雜草(例如，鴨跖草屬(commelinaspp))，將280-2240gae/ha(例如,560-1120gae/ha)的2,4-d與草甘膦一起順次施用、桶混合或預(yù)混合施用，以提供額外的控制。aad-1和aad-12均可提供對2,4-d的抗性。此外，aad-12還提供對吡啶氧基生長素除草劑，如氟草煙或綠草定的耐受性。施用吡啶氧基生長素除草劑以控制草甘膦抗性闊葉雜草，如飛蓬(conyzacanadensis)和鴨跖草屬(commelinaspp)。對于綠草定，施用比率范圍通常為70-1120gae/ha，例如140-420gae/ha。對于氟草煙，施用比率范圍通常為35-560gae/ha，例如70-280ae/ha。b.以標(biāo)準(zhǔn)萌發(fā)后施用比率(420-2160gae/ha,例如560-1120gae/ha)施用草甘膦，用于控制大多數(shù)禾本科草和闊葉雜草物種。為了控制草甘膦耐受性草如黑麥草(loliumrigidum)或牛筋草(eleusineindica)，將10-200gae/ha(例如,20-100gae/ha)的喹禾靈與草甘膦一起順次施用、桶混合或預(yù)混合施用，以提供有效的控制。aad-1提供對喹禾靈的耐受性。將aad-1與dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33在作物物種中疊加，可產(chǎn)生耐受上述除草劑的作物。c.草甘膦可以高效控制除闊葉雜草物種之外的禾本科雜草物種。aad-1與dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33的疊加性狀允許施用對禾本科草有效的比率的草甘膦(105-840gae/ha,例如210-420gae/ha)。然后與草有效比率的草甘膦一起順次、桶混合或預(yù)混合施用2,4-d(280-2240gae/ha,例如560-1120gae/ha)，從而提供必要的闊葉雜草控制。使用aopp除草劑如10-200gae/ha(例如,20-100gae/ha和20-35gae/ha)的喹禾靈，以實(shí)現(xiàn)更強(qiáng)力的禾本科雜草控制和/或延遲草甘膦耐受性禾本科草的出現(xiàn)。低比率的草甘膦也對闊葉雜草的控制提供一些好處；然而主要的控制來自于2,4-d。d.類似地，aad-12與dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33的疊加性狀允許施用對禾本科草有效的比率的草甘膦(105-840gae/ha,例如210-420gae/ha)。然后將2,4-d(280-2240gae/ha,例如560-1120gae/ha)與對禾本科草有效比率的草甘膦一起順次、桶混合或預(yù)混合施用，以提供必要的闊葉雜草控制。以前述的比率使用的綠草定和氟草煙也是處理方案中可以接受的組分。低比率的草甘膦也對闊葉雜草的控制提供一些好處；然而主要的控制來自于2,4-d、綠草定或氟草煙。向作物中轉(zhuǎn)化aad-12有助于單獨(dú)或組合(順次或獨(dú)立)使用一種或多種市售的芳氧基生長素除草劑。類似地，aad-1有助于單獨(dú)或組合(順次或獨(dú)立)使用一種或多種市售的苯氧基生長素除草劑和一種或多種商業(yè)aopp除草劑。將這些性狀中的任何一種與dgt-28、dgt-31、dgt-32或dgt-33疊加有助于更強(qiáng)力地管理雜草物種。這些化學(xué)的代表性除草劑的具體使用比率，由匯編于cpr(cropprotectionreference)一書中或類似結(jié)集中的除草劑標(biāo)簽、或在線編集的標(biāo)簽(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)、或任何商業(yè)或?qū)W術(shù)的作物保護(hù)指南如美國農(nóng)業(yè)聯(lián)盟(agriliance)的作物保護(hù)指南(2005)來規(guī)定。實(shí)施例17:dgt性狀與ahas性狀在任何作物中疊加編碼咪唑啉酮類除草劑耐受性的性狀(ahas)目前已經(jīng)在北美種植的許多作物中存在，包括，但不僅限于，玉米、水稻、向日葵和小麥。其它的咪唑啉酮耐受性作物(例如，棉花和甜菜)也已經(jīng)在研發(fā)中。許多咪唑啉酮類除草劑(例如，甲氧咪草煙、咪唑乙煙酸、滅草喹和甲基咪草煙)目前在各種常規(guī)作物中選擇性使用。咪唑啉酮耐受性性狀如ahas已經(jīng)促進(jìn)了咪唑乙煙酸、甲氧咪草煙、和非選擇性咪唑煙酸的應(yīng)用。到目前為止，咪唑啉酮耐受性htc具有非轉(zhuǎn)基因的優(yōu)勢。這種化學(xué)類型還具有顯著的土壤殘留活性，因此其提供的雜草控制能夠超出施用期，這不同于基于草甘膦或草銨膦的系統(tǒng)。然而，咪唑啉酮類除草劑控制雜草的譜不如草甘膦寬(agriliance,2003)。此外，咪唑啉酮類除草劑的作用方式(抑制乙酰乳酸合成酶，als)使得許多雜草產(chǎn)生了抗藥性(heapi(2004).theinternationalsurveyofherbicideresistantweeds,可以在www.weedscience.com獲得)。通過常規(guī)育種還是聯(lián)合作為一個(gè)新轉(zhuǎn)化事件使dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33與咪唑啉酮耐受性性狀疊加，可以改善雜草控制效率、增強(qiáng)靈活性、提高管理雜草遷移和除草劑耐受性發(fā)生的能力。為植物提供了如下的雜草控制選項(xiàng)，其中在任何單子葉或雙子葉作物物種中疊加dgt性狀和咪唑啉酮耐受性性狀：a.以標(biāo)準(zhǔn)萌發(fā)后施用比率(35-280gae/ha,例如70-140gae/ha)施用咪唑乙煙酸，用于控制任何禾本科草和闊葉雜草物種。i)通過桶混合420-2160gae/ha、例如560-1120gae/ha的草甘膦，控制als-抑制劑抗性闊葉雜草，如西部莧(amaranthusrudis)、三裂葉豚草(ambrosiatrifida)、藜(chenopodiumalbum)(及其它,heap,2004)。ii)通過桶混合420-2160gae/ha、例如560-1120gae/ha的草甘膦，控制本身對咪唑啉酮類除草劑更加耐受的闊葉雜草物種，如牽?；▽?ipomoeaspp)。iii)通過桶混合420-2160gae/ha,例如560-1120gae/ha的草甘膦，控制als-抑制劑抗性雜草，如石茅(sorghumhalepense)和黑麥草屬(loliumspp)。iv)通過桶混合420-2160gae/ha,例如560-1120gae/ha的草甘膦，控制本身耐受性的禾本科雜草物種(例如偃麥草(agropyronrepens))。通過常規(guī)育種或基因工程化用dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33轉(zhuǎn)化并與任何咪唑啉酮耐受性性狀疊加，有助于各種商業(yè)咪唑啉酮類除草劑或草甘膦除草劑的任何一種的應(yīng)用，無論是單獨(dú)應(yīng)用還是以多種組合應(yīng)用。這些化學(xué)的代表性除草劑的具體使用比率，由匯編于cpr(cropprotectionreference)一書中或類似結(jié)集中的除草劑標(biāo)簽、或在線編集的標(biāo)簽(例如cdms.net/manuf/manuf.asp)、或任何商業(yè)或?qū)W術(shù)的作物保護(hù)指南如美國農(nóng)業(yè)聯(lián)盟(agriliance)的作物保護(hù)指南(2005)來規(guī)定。實(shí)施例18:大豆轉(zhuǎn)化通過土壤桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)外植體(cotyledonarynodeexplant)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了含有穩(wěn)定整合的dgt-28轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因大豆(glycinemax)。使用攜帶含有功能性dgt-28的二元載體的卸甲(disarmed)土壤桿菌菌株起始轉(zhuǎn)化。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化用改良的zengetal.(zengp.,vadnaisd.a.,zhangz.,polaccoj.c.,(2004),plantcellrep.,22(7):478482)的半子葉節(jié)程序?qū)嵤?。簡而言之，使大豆種子(maverick栽培種)在基本培養(yǎng)基上萌發(fā)，分離子葉節(jié)，并用土壤桿菌感染。芽啟動(dòng)(shootinitiation)培養(yǎng)基、芽伸長(shootelongation)培養(yǎng)基、以及生根培養(yǎng)基添加有頭孢噻肟、特美汀和萬古霉素，用于去除土壤桿菌。通過除草劑進(jìn)行選擇，以抑制非轉(zhuǎn)化芽(non-transformedshoot)生長。將選出的芽(shoot)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基以生根，然后轉(zhuǎn)移到土壤混合物中以馴化幼苗。選定幼苗的頂生小葉(terminalleaflet)用除草劑局部處理(葉噴涂技術(shù)(leafpainttechnique)，以篩選假定的轉(zhuǎn)化體。將篩選到的幼苗轉(zhuǎn)移至溫室，馴化，然后用除草劑葉片噴涂以再確認(rèn)耐受性。從這些假定的轉(zhuǎn)化t0植物采樣，并使用分子分析確認(rèn)除草劑選擇標(biāo)記和dgt-28轉(zhuǎn)基因的存在。使t0植物在溫室中自花授粉，產(chǎn)生t1種子?？梢允褂玫诙N大豆轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生額外的轉(zhuǎn)基因大豆植物。使用攜帶含有功能性dgt-28的卸甲土壤桿菌菌株起始轉(zhuǎn)化。使用pazetal.,(pazm.,martinezj.,kalviga.,fongert.,andwangk.,(2005)plantcellrep.,25:206-213)的改良半種子程序?qū)嵤┩寥罈U菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。簡而言之，將成熟大豆種子用氯氣過夜滅菌，并用無菌h2o浸沒20小時(shí)，然后進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化。將種子沿種臍縱向?qū)Π肭虚_，分開種子并去除種皮。切下胚軸，并從子葉節(jié)點(diǎn)除去任何主苗/芽(axialshoot/bud)。所得的半種子外植體用土壤桿菌感染。芽啟動(dòng)培養(yǎng)基、芽伸長培養(yǎng)基、以及生根培養(yǎng)基添加有頭孢噻肟、特美汀和萬古霉素，用于去除土壤桿菌。利用除草劑選擇來抑制非轉(zhuǎn)化芽(non-transformedshoot)的生長。將選出的芽(shoot)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中以生根，然后轉(zhuǎn)移到土壤混合物中以馴化幼苗。從假定的轉(zhuǎn)化t0植物采樣，并使用分子分析來確認(rèn)除草劑選擇標(biāo)記和dgt-28轉(zhuǎn)基因的存在。數(shù)個(gè)事件被鑒定為含有所述轉(zhuǎn)基因。對這些t0植物進(jìn)行進(jìn)一步的分析，并允許它們在溫室中自花授粉，產(chǎn)生t1種子。確認(rèn)dgt-28向t1代的可遺傳性對dgt-28蛋白向t1代的可遺傳性，使用兩種方法中的一種進(jìn)行評估。第一種方法包括將t1種子種植到metro-mix培養(yǎng)基中，并在第1個(gè)三小葉(trifoliate)生長期在已萌發(fā)的植物上施用411gae/ha的ignitetm280sl。第二種方法是使用鋼珠(ballbearing)和genogrinder研磨機(jī)對總共8個(gè)重復(fù)的種子勻漿。然后利用用于檢測pat蛋白的elisa條測試(elisastriptest)來檢測可遺傳事件，這是因?yàn)檫x擇標(biāo)記與dgt-28位于相同質(zhì)粒上。對于任一種方法而言，如果有一個(gè)植物對草銨膦耐受或者被patelisa條測試所檢出，則該事件表現(xiàn)出遺傳到t1代的能力。如前所述地用總共5個(gè)構(gòu)建體進(jìn)行可遺傳性篩選。質(zhì)粒含有與trap4、trap8和trap23連鎖的dgt-28。所有構(gòu)建體中的事件證明，pat::dgt-28蛋白遺傳到t1代的可遺傳性為68％。dgt-28轉(zhuǎn)化的t1大豆的萌發(fā)后除草劑耐受性來自通過如前所述的篩選方法被確認(rèn)可遺傳的t1事件的種子在溫室條件下種植在metro-mix培養(yǎng)基中。讓植物生長至第1個(gè)三小葉(trifoliate)完全展開，如前所述地用411gae/ha的ignitetm280sl處理，以選擇pat基因。給來自每個(gè)事件的抗性植株提供唯一的標(biāo)識，并采樣用于dgt-28基因的配型分析。利用配型數(shù)據(jù)，為每個(gè)草甘膦施用比率指定2個(gè)半合子和2個(gè)純合子重復(fù)，從而在存在足夠植物時(shí)，為每個(gè)處理提供總共4個(gè)重復(fù)。這些植物與野生型petitehavana煙草進(jìn)行比較。對所有植物用設(shè)定為187l/ha的履帶式噴霧器進(jìn)行噴灑。對植物噴灑560-4480gae/ha范圍的durangotm二甲胺鹽(dma)。所有施用物均用水配制，并添加2％w/v硫酸銨(ams)。在處理后7和14天對植物進(jìn)行評估。給植物指定一個(gè)關(guān)于總體目測生長停滯、失綠、和壞死的損傷分級。t1代是有分離的，因此可以預(yù)期由于配型的不同會(huì)存在一些可變的響應(yīng)。表24.噴灑結(jié)果證明，每個(gè)被表征的構(gòu)建體至少有一個(gè)dgt-28事件在14dat(處理后天數(shù))對高達(dá)4480gae/ha草甘膦具有強(qiáng)耐受性。構(gòu)建體的代表性單拷貝事件與maverick陰性對照相比均提供了對高達(dá)4480gae/ha的耐受性dgt-28在t2代中對高比率草甘膦的保護(hù)對每個(gè)構(gòu)建體的2-5個(gè)t2品系進(jìn)行45株植物后代測試。根據(jù)在前一代中完成的配型分析選擇純合品系。如前所述地種植種子。然后如前所述地用411gae/ha的ignite280sl噴灑植物，以選擇pat選擇標(biāo)記。3dat后，對抗性和敏感性植物進(jìn)行計(jì)數(shù)。對于含有與dgt-28連鎖的trap4的構(gòu)建體(pdab107543和pdab107548)，所測試的12個(gè)品系中有9個(gè)沒有分離，從而確認(rèn)了t2代中的同質(zhì)品系。含有與dgt-28連鎖的trap8的品系(pdab107545)顯示4個(gè)品系中有2個(gè)沒有分離體，并且顯示dgt-28在大豆中以孟德爾遺傳方式遺傳至少2代。從抗性植物獲取組織樣品，并通過標(biāo)準(zhǔn)elisa方法對dgt-28蛋白進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)表明，dgt-28蛋白在測試的無分離t2品系中的平均值范圍是32.8-107.5ng/cm2。來自構(gòu)建體pdab107553(trap23::dgt-28)的品系先前沒有用草銨膦選擇，利用草甘膦劑量響應(yīng)來測試同質(zhì)性(homogenosity)和對高比率草甘膦的耐受性。來自構(gòu)建體pdab107553的品系的重復(fù)樣品對560-4480gae/ha范圍的草甘膦比率耐受，因此被確認(rèn)是一個(gè)同質(zhì)群體，并可以遺傳至少2代。如前所述地向2-3個(gè)三小葉大豆施用durangodma，其比率范圍是560-4480gae/ha的草甘膦。14dat的可見損傷數(shù)據(jù)確認(rèn)了在t1中證明的耐受性結(jié)果。表25.數(shù)據(jù)表明dgt-28煙草與非轉(zhuǎn)化對照相比，在兩代內(nèi)對高達(dá)3360gae/ha草甘膦均具有強(qiáng)健的耐受性實(shí)施例19:用dgt-28轉(zhuǎn)化水稻在一個(gè)示例方法中，通過土壤桿菌介導(dǎo)的無菌水稻種子轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了含有穩(wěn)定整合的dgt-28轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因水稻(oryzasativa)。使用攜帶含有功能性dgt-28的二元載體的卸甲土壤桿菌菌株來起始轉(zhuǎn)化。將培養(yǎng)基用1mkoh調(diào)節(jié)到ph5.8，并用2.5g/l植物凝膠(phytagel)(sigma-aldrich,st.louis,mo)固化。將胚性愈傷組織培養(yǎng)在含有30ml半固體培養(yǎng)基的100x20mm培養(yǎng)皿中。讓水稻幼苗在含有50ml培養(yǎng)基的magenta盒中生長。讓細(xì)胞懸浮液保持在含有35ml液體培養(yǎng)基的125ml錐形瓶中，并以125rpm旋轉(zhuǎn)。在25–26℃黑暗中進(jìn)行胚培養(yǎng)物的誘導(dǎo)和維持，在16-h光周期的光照室內(nèi)進(jìn)行植物再生和全株植物培養(yǎng)(zhangetal.1996)。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和維持在如前所述的改良nb基礎(chǔ)培養(yǎng)基(lietal.1993)中進(jìn)行，其中適應(yīng)性地修改該培養(yǎng)基使其含有500mg/l谷氨酰胺。在含有用30g/l蔗糖代替麥芽糖的sz液體培養(yǎng)基(zhangetal.1998)中啟動(dòng)并保持懸浮培養(yǎng)。滲透性培養(yǎng)基(nbo)是添加了甘露醇和山梨醇各0.256m的nb培養(yǎng)基。在補(bǔ)充了合適除草劑選擇劑的nb培養(yǎng)基上選擇除草劑抗性愈傷組織3-4周。在培養(yǎng)基(prh50)上實(shí)施預(yù)再生(pre-egeneration)1周，該培養(yǎng)基的組成是：nb培養(yǎng)基、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、1mg/lα-萘乙酸(naa)、5mg/l脫落酸(aba)和選擇性除草劑。在再生培養(yǎng)基(rnh50)上培養(yǎng)之后，進(jìn)行幼苗再生，直至再生出假定的轉(zhuǎn)基因芽(transgenicshoot)，其中再生培養(yǎng)基(rnh50)包含nb培養(yǎng)基(含2,4-d,0.5mg/lnaa，以及選擇性除草劑)。將芽(shoot)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，其具有半強(qiáng)度的murashige和skoog基本鹽和gamborg氏b5維生素，并補(bǔ)充有1％蔗糖和選擇性除草劑。對水稻粳稻品種taipei309的成熟干燥的種子進(jìn)行滅菌，如zhangetal.1996所述。通過在nb培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)無菌成熟水稻種子來誘導(dǎo)胚性組織。從盾片取出直徑大約1mm的初級愈傷組織，并用于在sz液體培養(yǎng)基中起始細(xì)胞懸浮。然后如zhang1996所述地維持懸浮液。在先前的亞培養(yǎng)之后3-5天，從液體培養(yǎng)物取出懸液衍生的胚性組織，并放置在nbo滲透性培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)皿中形成直徑大約2.5cm的圓環(huán)，培養(yǎng)4h后進(jìn)行轟擊。轟擊后16-20小時(shí)，將組織從nbo培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到nbh50選擇培養(yǎng)基上，確保被轟擊的表面朝上，并在黑暗中溫育14-17天。然后從原來的被轟擊的外植體分離出新形成的愈傷組織，并放置在相同培養(yǎng)基上的附近位置。再過8-12天后，目測鑒定相對緊湊的、不透明的愈傷組織，將它們轉(zhuǎn)移到prh50預(yù)再生培養(yǎng)基中，在黑暗中經(jīng)過7天。然后將生長中的愈傷組織，其已變得更加緊湊和不透明，亞培養(yǎng)到rnh50再生培養(yǎng)基上，在16小時(shí)光周期下經(jīng)過14-21天。將再生芽(regeneratingshoot)轉(zhuǎn)移到含有1/2msh50培養(yǎng)基的magenta盒中。從單個(gè)外植體再生的多個(gè)植株視為同胞，將它們作為一個(gè)獨(dú)立的植物品系對待。如果植株在1/2msh50培養(yǎng)基上產(chǎn)生厚實(shí)、白色的根并且生長旺盛，則將該植物評定為對dgt-28基因呈陽性。一旦幼苗達(dá)到magenta盒的頂部，便將它們轉(zhuǎn)移到6-cm盆的土壤中，在100％濕度下保持1周，然后移到生長室中，14-h光照下30℃和黑暗下21℃，保持2-3周，然后轉(zhuǎn)移到溫室的13-cm盆中。采集種子，并在37℃干燥1周，隨后在4℃保存。dgt-28水稻的t0分析將通過土壤桿菌轉(zhuǎn)化獲得的水稻轉(zhuǎn)化體移植到培養(yǎng)基中，并馴化適應(yīng)溫室條件。對所有植物進(jìn)行采樣用于pcr檢測dgt-28，結(jié)果表明，pdab110827(trap8::dgt-28)有22個(gè)pcr陽性事件，pdab110828(trap23::dgt-28)有最少16個(gè)pcr陽性事件。對pcr陽性事件的dgt-28的southern分析證明，兩個(gè)構(gòu)建體均為簡單(1-2個(gè)拷貝)事件。選定的t0事件的蛋白表達(dá)顯示，dgt-28的蛋白表達(dá)從低于檢測水平到130ng/cm2不等。如前所述地用2240gae/hadurangodmatm對從構(gòu)建體pdab110828選擇的t0事件進(jìn)行處理，并在處理后7和14天進(jìn)行評估。數(shù)據(jù)證明對所施用比率的草甘膦具有強(qiáng)耐受性。讓所有pcr陽性植株產(chǎn)生t1種子，用于進(jìn)一步的表征。dgt-28在水稻中的可遺傳性對來自含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽trap8的構(gòu)建體pdab110827的4個(gè)dgt-28t1品系進(jìn)行100株后代測試。將種子種植于填滿培養(yǎng)基的盆中。然后如前所述地用560gae/hadurangodmatm噴灑所有植物，以選擇dgt-28基因。7dat后，對抗性和敏感性植株進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過卡方分析確定，在對每個(gè)構(gòu)建體所測試的4個(gè)品系中，有2個(gè)株作為單座位、顯性孟德爾性狀(3r:1s)分離。dgt-28在多個(gè)物種中是一種可遺傳的草甘膦抗性基因。dgt-28轉(zhuǎn)化的t1水稻的萌發(fā)后除草劑耐受性為來自后代測試中使用的每個(gè)事件的t1抗性植株指定唯一的標(biāo)識，并采樣用于dgt-28基因的配型分析。利用配型數(shù)據(jù)為每個(gè)草甘膦施用比率指定2個(gè)半合子和2個(gè)純合子重復(fù)，從而為每個(gè)處理提供總共4個(gè)重復(fù)。這些植物與野生型kitaake水稻進(jìn)行比較。對所有植株用設(shè)定為187l/ha履帶式噴霧器進(jìn)行噴灑。用560-2240gae/ha范圍的durangodmatm噴灑植物。所有施用物用水配制，并添加2％w/v硫酸銨(ams)。在處理后7和14天對植物進(jìn)行評估。為植物指定對應(yīng)于總體目測生長停滯、失綠和壞死的損傷分級。t1代是有分離的，因此可以預(yù)期由于配型的不同存在一些可變的響應(yīng)。噴灑結(jié)果表明，在7dat(處理后天數(shù))，更高比率的草甘膦僅造成的微小的植物損傷(數(shù)據(jù)未顯示)。表26.14dat的目測損傷數(shù)據(jù)顯示對高達(dá)2240gae/ha草甘膦的平均目測損傷低于15％針對來自pdab110827的所有4個(gè)t1測試品系的重復(fù)樣品，進(jìn)行了dgt-28蛋白檢測。數(shù)據(jù)表明，對于半合子和純合子重復(fù)樣品，dgt-28均值蛋白的范圍分別為20-82ng/cm2和21-209ng/cm2。這些結(jié)果表明t1代中有穩(wěn)定的蛋白表達(dá)，并且dgt-28水稻在經(jīng)過施用560gae/ha草甘膦進(jìn)行選擇之后，可對高達(dá)2240gae/ha的草甘膦耐受。實(shí)施例20:用dgt-28轉(zhuǎn)化草坪草借助從種子(penn-a-4栽培種)生發(fā)的胚性愈傷組織，在匍匐剪股穎(creepingbentgrass)中實(shí)現(xiàn)了根癌土壤桿菌介導(dǎo)的dgt-28轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化。參見“efficiencyofagrobacteriumtumefaciens-mediatedturfgrass(agrostisstoloniferal)transformation”(luoet.al.,2004)。用攜帶超二元載體的根癌土壤桿菌菌株感染愈傷組織細(xì)胞，該超二元載體含有受單子葉植物特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的除草劑抗性轉(zhuǎn)基因(例如dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33)。整體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化效率的范圍是18％-45％。southern印跡和遺傳分析證實(shí)了轉(zhuǎn)基因被整合在匍匐翦股穎的基因組內(nèi)，并且轉(zhuǎn)基因正常傳遞到t1代中穩(wěn)定表達(dá)。所有的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件攜帶轉(zhuǎn)基因的1-3個(gè)拷貝，并且大多數(shù)(60–65％)只包含轉(zhuǎn)基因的1個(gè)單拷貝且沒有明顯的重排。成熟的種子用砂紙脫殼，并在10％(v/v)cloroxtm漂白劑(6％次氯酸鈉)加0.2％(v/v)吐溫20(polysorbate20)中劇烈震蕩90分鐘進(jìn)行表面滅菌。用無菌蒸餾水漂洗5次后，將種子置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(ms基本鹽和維生素，30g/l蔗糖，500mg/l酪蛋白水解物，6.6mg/l3,6二氯-鄰-茴香酸(麥草畏)，0.5mg/l6-芐氨基嘌呤(bap)和2g/l植物凝膠。培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)至5.7，隨后高壓滅菌120℃20分鐘)。將含有準(zhǔn)備好的種子外植體的培養(yǎng)平板在室溫下黑暗中保持6周。胚性愈傷組織通過目測選擇，并亞培養(yǎng)在新鮮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)，在室溫下黑暗中保持1周，隨后進(jìn)行共培養(yǎng)。在土壤桿菌介導(dǎo)感染前1天，將胚性愈傷組織分成1-2mm的薄片，并置于含有100μm乙酰丁香酮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。然后向每片愈傷組織施用10μl等份的攜帶dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33轉(zhuǎn)基因的土壤桿菌懸浮液(660nm的od＝1.0)，隨后在25℃黑暗中共培養(yǎng)3天。然后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加了125mg/l頭孢噻肟和250mg/l羧芐青霉素以抑制細(xì)菌生長的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并培養(yǎng)2周。當(dāng)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有250mg/l頭孢噻肟和除草劑的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基之上時(shí)，發(fā)生轉(zhuǎn)基因植物的選擇。愈傷組織材料在此培養(yǎng)基上保持8周，其中選擇亞培養(yǎng)的間隔為3周。選擇過程在室溫下黑暗中進(jìn)行。為了植物再生，首先將抗除草劑的增殖愈傷組織事件移至補(bǔ)充有頭孢噻肟和用于選擇的除草劑的再生培養(yǎng)基上(ms基本培養(yǎng)基、30g/l蔗糖、100mg/l肌醇、1mg/lbap和2g/l植物凝膠)。這些愈傷組織在室溫下黑暗中保持1周，然后移到光照下2-3周以產(chǎn)生芽(shoot)。將產(chǎn)生的芽(shoot)分離并轉(zhuǎn)移到?jīng)]有激素但含有除草劑和頭孢噻肟的再生培養(yǎng)基上以促進(jìn)根生長，同時(shí)維持選擇壓力并抑制任何殘余的土壤桿菌細(xì)胞。然后，將根發(fā)育良好的幼苗(3-5周)轉(zhuǎn)移到土壤中，并在溫室或田間生長。將轉(zhuǎn)基因植物保持在戶外的封閉苗床(containmentnursery)上(3-6個(gè)月)，直到12月的冬至。然后，將春化后的植物轉(zhuǎn)移到溫室中，保持在25℃，16/8h光周期，周圍用非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓臧鼑?，以將轉(zhuǎn)基因植物與其它花粉源物理隔離。在移回溫室后3-4周，轉(zhuǎn)基因植物開始開花。用來自周圍對照植物的花粉對這些植物進(jìn)行異交(out-cross)。使從每個(gè)單獨(dú)轉(zhuǎn)基因植物收集的種子在25℃的土壤中萌發(fā)，使t1植物在溫室中生長，用于進(jìn)一步的分析。按照該描述的方案用dgt-28轉(zhuǎn)化其它禾本科草類，包括早熟禾(poaannua)，百喜草，翦股穎，狗牙根，莓系屬的牧草(bluegrass)，須芒草(bluestems)，臂形草，雀麥草(bromegrass)，旱地翦股穎(browntopbent)(agrostiscapillaries)，野牛草，金絲雀草，地毯草，假儉草，紫羊茅(festucarubracommutate)，馬唐，翦股穎(agrostisstolonifera)，crestedhairgrass(koeleriamacrantha)，毛花雀稗，羊茅草，festolium，硬羊茅草/羊羊茅草(festucaovina)，格蘭馬草，印度草(indiangrass)，約翰遜草(johnsongrass)，畫眉草(lovegrass)，混合草(mixes)(馬用草(equine)，牧草(pasture)等)，原生草(nativegrasses)，鴨茅，多年生黑麥草(loliumperenne)，小糠草(redtop)，雀麥屬植物，一年生和多年生黑麥草，纖細(xì)的匍匐紫羊茅(festucarubratrichophylla)，加拿大早熟禾(poapratensis)，st.augustine，強(qiáng)匍匐型紫羊茅(festucarubrarubra)，蘇丹草，柳枝稷，高羊茅(festucaarundinacea)，發(fā)草(deschampsiacaespitosa)，草坪草，小麥草，和結(jié)縷草(zoysiagrass)。實(shí)施例21:用dgt性狀轉(zhuǎn)化蕓苔屬植物用土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，使用可賦予對草甘膦抗性的dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33基因轉(zhuǎn)化歐洲油菜(brassicanapus)nexeratm710栽培種。將歐洲油菜種子用10％市售漂白劑表面滅菌10分鐘，用無菌蒸餾水漂洗3次。然后，將種子置于半濃度的ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基(murashigeandskoog,1962)上，并維持設(shè)定為25℃、16hr光照/8hr黑暗的光周期的生長方案。從5-7日齡的幼苗切下下胚軸節(jié)段(3-5mm)，并置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基k1d1(ms培養(yǎng)基加1mg/l激動(dòng)素和1mg/l2,4-d)上3天，作為預(yù)處理。然后，將節(jié)段轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，用含有包含dgt-28的構(gòu)建體的根癌土壤桿菌菌株處理。根癌土壤桿菌在150rpm搖床上28℃黑暗生長過夜，隨后重懸在培養(yǎng)基中。用土壤桿菌處理下胚軸節(jié)段30分鐘后，將這些節(jié)段放回愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上3天。共培養(yǎng)后，將節(jié)段放在k1d1tc(含有250mg/l羧芐青霉素和300mg/l特美汀的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上，使其恢復(fù)1周?；蛘撸瑢⒐?jié)段直接置于選擇培養(yǎng)基k1d1h1上(含有除草劑的上述培養(yǎng)基)。羧芐青霉素和特美汀是用于殺死土壤桿菌的抗生素。選擇劑允許被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長。將來自分離的獨(dú)立事件的愈傷組織樣品用pcr進(jìn)行測試。對于dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33的存在測試呈陽性的樣品，進(jìn)行確認(rèn)并轉(zhuǎn)移到用于再生的培養(yǎng)基上。然后，將愈傷的(callused)下胚軸節(jié)段置于b3z1h1(ms培養(yǎng)基,3mg/l芐氨基嘌呤,1mg/l玉米素,0.5gm/lmes[2-(n-嗎啉代)乙磺酸],5mg/l硝酸銀,選擇性除草劑,羧芐青霉素和特美汀)芽再生培養(yǎng)基上。在3周之后芽(shoot)開始再生。將下胚軸節(jié)段和芽(shoot)一起轉(zhuǎn)移到b3z1h3培養(yǎng)基上(ms培養(yǎng)基,3mg/l芐氨基嘌呤,1mg/l玉米素,0.5gm/lmes[2-(n-嗎啉代)乙磺酸],5mg/l硝酸銀,選擇性除草劑,羧芐青霉素和特美汀)，再生長3周。從下胚軸節(jié)段切下芽(shoot)，并轉(zhuǎn)移到芽伸長培養(yǎng)基mesh10上(ms,0.5gm/lmes,選擇性除草劑,羧芐青霉素和特美汀)再生長2-4周。將細(xì)長芽(elongatedshoot)在msi.1(含有0.1mg/l吲哚基丁酸的ms)上培養(yǎng)以誘導(dǎo)根。一旦植物建立起根系統(tǒng)，便將植物移植到土壤中。植物在convirontm中在受控的環(huán)境條件下馴化1-2周，然后轉(zhuǎn)移至溫室。使轉(zhuǎn)化的t0植物在溫室中自發(fā)授粉，以獲得t1種子。用一定濃度范圍的草甘膦除草劑噴灑t0植物和t1后代，以確定由dgt-28,dgt-31,dgt-32,或dgt-33基因提供的保護(hù)水平。實(shí)施例22:用dgt-28轉(zhuǎn)化煙草用含有dgt-28轉(zhuǎn)基因的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化煙草(petithavana栽培種)葉片。將含有dgt-28轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒的單個(gè)菌落接種到4ml含有壯觀霉素(50μg/ml)和鏈霉素(125μg/ml)的yep培養(yǎng)基中，并在190rpm搖床上28℃過夜溫育。隨后使用4ml種子培養(yǎng)物接種125ml擋板錐形瓶中的25ml相同培養(yǎng)基的培養(yǎng)物。該培養(yǎng)物在28℃溫育，190rpm震蕩，直至達(dá)到od600～1.2。然后，將10ml土壤桿菌懸液置于無菌60x20mmpetritm盤中。從在phytatraystm(sigma,st.louis,mo)中含有30g/l蔗糖的ms培養(yǎng)基(phytotechnologylabs,shawneemission,ks)上無菌生長的植物新鮮切下葉片(0.5cm2)，并浸泡在10ml土壤桿菌過夜培養(yǎng)物中數(shù)分鐘，在無菌濾紙上吸干水分，然后置于添加了1mg/l吲哚乙酸和1mg/l6-芐氨基嘌呤的相同培養(yǎng)基上。3天后，將與攜帶有dgt-28轉(zhuǎn)基因的土壤桿菌共培養(yǎng)過的葉片轉(zhuǎn)移到含有5mg/lbastatm和250mg/頭孢噻肟的相同培養(yǎng)基。3周后，將個(gè)體t0幼苗轉(zhuǎn)移到含有10mg/lbastatm和250mg/l頭孢噻肟的ms培養(yǎng)基中，再經(jīng)過3周后，轉(zhuǎn)移到土壤中并移至溫室。使選定的t0植物(使用上述的分子分析規(guī)程鑒定的)自花授粉，在莢果完全干燥后從其收集種子。對t1苗篩選配型和報(bào)告基因表達(dá)(如下文所述)，并鑒定了含有dgt-28轉(zhuǎn)基因的選定植物。以如下方式將植物移至溫室：從根部洗掉瓊脂，移植到13.75cm方盆的土壤中，將盆置于袋(scjohnson&son,inc.)中，在袋子的底部放入自來水，并在30℃溫室中置于間接光下1周。3-7天后，打開袋子；給植物施肥，讓其在打開的袋子中生長，直至植物適應(yīng)溫室環(huán)境，此時(shí)移除袋子。讓植物在普通暖溫室條件下生長(白天27℃,夜晚24℃,16小時(shí)白天,最小自然光+輔助光＝1200μe/m2s1)。在繁殖前，從t0植物采樣進(jìn)行dna分析，通過實(shí)時(shí)定量pcr確定插入的dgt-28的拷貝數(shù)。將新鮮組織置于試管中，并在4℃凍干2天。在組織完全干燥后，在試管中放置鎢珠(valenite)，并用kelco珠磨機(jī)對樣品干磨1分鐘。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)dneasytmdna分離程序(qiagen,dneasy69109)。然后，用picogreen(molecularprobesp7589)對提取的dna等份進(jìn)行染色，并在具有已知標(biāo)準(zhǔn)品的熒光計(jì)(biotektm)中讀取，獲得以ng/μl為單位的濃度。使用總共100ng總dna作為模板。pcr反應(yīng)在9700geneamptm熱循環(huán)儀(appliedbiosystems)中實(shí)施，使樣品經(jīng)歷94℃3分鐘，35個(gè)94℃30秒、64℃30秒、和72℃1分45秒的循環(huán)，隨后是72℃10分鐘。通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳并用etbr染色對pcr產(chǎn)物進(jìn)行分析，并通過southern印跡進(jìn)行確認(rèn)。從3個(gè)含有不同葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(trap4、trap8和trap23)的構(gòu)建體再生5-9個(gè)pcr陽性事件，每個(gè)事件具有1-3個(gè)dgt-28基因拷貝，并移至溫室中。對所有pcr陽性植物進(jìn)行采樣，用于通過標(biāo)準(zhǔn)elisa定量dgt-28蛋白。在所有pcr陽性植物中均檢測到了dgt-28蛋白，并且注意到，隨著dgt-28拷貝數(shù)的增加，蛋白濃度有增加趨勢。aad-12(v1)在煙草中的可遺傳性對每個(gè)構(gòu)建體的5個(gè)dgt-28t1品系進(jìn)行100株后代測試。構(gòu)建體含有如下葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列之一：trap4,trap8或trap23。將種子層積、播種并移植，與上文舉例的擬南芥規(guī)程非常相似，只是在移植之前，不通過初始選擇除去空植物。隨后如前所述地用280gae/ha的ignite280sl噴灑所有植物，以選擇pat選擇標(biāo)記。3dat后，對抗性和敏感性植物進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過卡方分析確定，在對每個(gè)構(gòu)建體所測試的5個(gè)品系中，有4個(gè)作為單座位、顯性孟德爾性狀分離(3r:1s)。dgt-28是一種在多個(gè)物種中可遺傳的草甘膦抗性基因。dgt-28轉(zhuǎn)化的t1煙草的萌發(fā)后除草劑耐受性為來自后代測試中使用的每個(gè)事件的t1抗性植株指定唯一的標(biāo)識，并采樣用于dgt-28基因配型分析。利用配型數(shù)據(jù)，為每個(gè)草甘膦施用比率指定2個(gè)半合子和2個(gè)純合子重復(fù)，從而為每個(gè)處理提供總共4個(gè)重復(fù)。將這些植物與野生型petitehavana煙草進(jìn)行比較。對所有植株用設(shè)定為187l/ha履帶式噴霧器進(jìn)行噴灑。用560-2240gae/ha范圍的durangodmatm噴灑植物。所有施用物用水配制，并添加2％w/v硫酸銨(ams)。在處理后7和14天對植物進(jìn)行評估。給植物指定對應(yīng)于總體目測生長停滯、失綠和壞死的損傷分級。t1代是有分離的，因此可以預(yù)期由于配型的不同會(huì)存在一些可變的響應(yīng)。噴灑結(jié)果表明，在7dat(處理后天數(shù))，高比率的草甘膦造成的植物損傷極小(數(shù)據(jù)未顯示)。14dat后，可見損傷數(shù)據(jù)表明，含trap4的構(gòu)建體的單拷貝事件與來自含trap8和trap23的構(gòu)建體的單拷貝事件相比，損傷增加。表27。gae/ha草甘膦比率下，顯示含有trap4的事件的平均損傷為37.5％，而含有trap8和trap23的事件的平均損傷分別為9.3％和9.5％這些結(jié)果表明，dgt-28對高達(dá)4480gae/ha的草甘膦具有耐受性，并且顯示與dgt-28基因連鎖的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列提供的耐受性存在差異。dgt-28在t2代中對高比率草甘膦的保護(hù)對每個(gè)構(gòu)建體的2-3個(gè)t2品系進(jìn)行25株植物后代測試?；谠谇耙淮型瓿傻呐湫头治鲞x擇純合品系。如前所述地對種子進(jìn)行層積、播種和移植。然后如前所述地用280gae/ha的ignite280sl噴灑所有植物，以選擇pat選擇標(biāo)記。3dat后，對抗性和敏感性植物進(jìn)行計(jì)數(shù)。對每個(gè)構(gòu)建體測試的全部品系均沒有分離，從而確認(rèn)了t2代的同質(zhì)品系，并證明dgt-28在煙草中可以孟德爾遺傳至少2代。如前所述地對2-3葉煙草施用比率范圍為420-3360gae/ha草甘膦的durangodmatm。14dat的可見損傷數(shù)據(jù)確認(rèn)了在t1代中展示的耐受性結(jié)果。來自含有trap4的構(gòu)建體的2拷貝品系的葉數(shù)據(jù)表明，單拷貝的trap8和trap23品系具有相似的耐受性(數(shù)據(jù)未顯示)。表28.來自含有trap4與dgt-28的構(gòu)建體的單拷貝品系顯示與來自含有trap8和trap23與dgt-28的構(gòu)建體的品系相比損傷增加這些結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)化對照相比，dgt-28煙草在2代內(nèi)對高達(dá)3360gae/ha的草甘膦具有強(qiáng)耐受性。在施用草甘膦之前從每個(gè)事件的選定植株采樣，用于通過標(biāo)準(zhǔn)dgt-28elisa分析dgt-28蛋白。數(shù)據(jù)表明，所有各構(gòu)建體的簡單(1-2個(gè)拷貝)品系的dgt-28蛋白平均表達(dá)量范圍是72.8-114.5ng/cm2。數(shù)據(jù)表明，dgt-28在t2代轉(zhuǎn)化煙草中表達(dá)蛋白，并且耐受性數(shù)據(jù)確認(rèn)了有功能的dgt-28蛋白。疊加dgt-28以增加煙草(petithavana栽培種)除草劑譜對純合dgt-28(pdab107543和pdab107545)和aad-12v1(pdab3278)植物(對于后者，見pct/us2006/042133)進(jìn)行相互雜交，并收集f1種子。對來自每個(gè)基因的2次相互雜交的f1種子進(jìn)行層積，并用1120gae/ha草甘膦(對dgt-28基因具有選擇性),1120gae/ha2,4-d(對aad-12基因具有選擇性),或所述比率的兩種除草劑的桶混合物，對每個(gè)雜交的6個(gè)重復(fù)樣品進(jìn)行處理。植物在14dat進(jìn)行評級。噴灑結(jié)果如表29所示。表29.f1aad-12和dgt-28的響應(yīng)結(jié)果確認(rèn)dgt-28能夠與aad-12(v1)成功疊加，從而增加可用于感興趣的作物的除草劑譜(對于dgt-28和aad-12，分別為草甘膦+苯氧乙酸)。在難以控制闊葉雜草或者存在抗性雜草生物型的作物生產(chǎn)中，疊加可用作雜草控制和感興趣的作物保護(hù)的手段。其他的輸入或輸出性狀也可以和dgt-28基因疊加。實(shí)施例23:在小麥中對草甘膦的抗性編碼dgt-28的二元載體的產(chǎn)生用本領(lǐng)域公知的手段和技術(shù)設(shè)計(jì)并組裝了含有dgt-28表達(dá)盒和pat選擇盒的二元載體。每個(gè)dgt-28表達(dá)盒包含啟動(dòng)子、來自玉米泛素(ubi)基因的5’非翻譯區(qū)、和內(nèi)含子(tokietal.,plantphysiology1992,1001503-07)，隨后是編碼序列，該序列由4種轉(zhuǎn)運(yùn)肽(trap4,trap8,trap23或trap5)其中之一與人造版本的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因(dgt-28)的5’端融合而構(gòu)成，其經(jīng)過了密碼子優(yōu)化以便在植物中表達(dá)。dgt-28表達(dá)盒以3’非翻譯區(qū)(utr)終止，該3’utr包含來自玉米的脂肪酶基因(vp1)的轉(zhuǎn)錄終止子和多聚腺苷酸化位點(diǎn)(paeketal.,mol.cells199830；8(3)336-42)。pat選擇盒包括啟動(dòng)子、來自水稻肌動(dòng)蛋白(act1)基因的5’非翻譯區(qū)和內(nèi)含子(mcelroyetal.,theplantcell19902(2)163171)、隨后是從綠色產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesviridochromogenes)分離的草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(pat)的人造版本，其經(jīng)過了密碼子優(yōu)化以便在植物中表達(dá)。pat基因編碼一種蛋白質(zhì)，其賦予對谷氨酰胺合成酶抑制劑，包括草銨膦、草銨膦和雙丙氨磷的抗性(wohllebenetal.,gene1988,70(1),25-37)。該選擇盒用3′utr終止，該3′utr包含來自花椰菜花葉病毒(camv)35s基因的轉(zhuǎn)錄終止子和多聚腺苷酸化位點(diǎn)(chenaultetal.,plantphysiology1993101(4),1395-1396)。選擇盒由商業(yè)基因合成公司(geneart,lifetechnologies)合成，并克隆到gateway適能的(gateway-enabled)二元載體中。將dgt-28表達(dá)盒亞克隆到pdonr221中。使用所得的入門克隆與編碼草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(pat)表達(dá)盒的gateway適能二元載體進(jìn)行l(wèi)rclonaseii(invitrogen,lifetechnologies)反應(yīng)。通過使用從newenglandbiolabs(neb；ipswich,ma)和promega(promegacorporation,wi)獲得的限制性核酸內(nèi)切酶對純化dna進(jìn)行限制性消化，對所有組裝質(zhì)粒的菌落進(jìn)行初始篩選。質(zhì)粒dna的制備用qiaprepspinminiprep試劑盒(qiagen,hilden)或pureyieldplasmidmaxiprep系統(tǒng)(promegacorporation,wi)按照制造商的使用說明進(jìn)行。選定克隆的質(zhì)粒dna用abisanger測序和bigdyeterminatorv3.1循環(huán)測序規(guī)程(appliedbiosystems,lifetechnologies)進(jìn)行測序。序列數(shù)據(jù)使用sequenchertm軟件(genecodescorporation,annarbor,mi)組裝和分析。將所得的4個(gè)二元表達(dá)克?。簆das000122(trap4-dgt28),pdas000123(trap8-dgt28),pdas000124(trap23-dgt28)和pdas000125(trap5-dgt28)，分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入根癌土壤桿菌菌株eha105。用dgt-28表達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)录褂霉w小麥品系bobwhitempb26rh，按照與wuetal.,transgenicresearch2008,17:425-436相似的規(guī)程進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生表達(dá)4種dgt-28表達(dá)構(gòu)建體其中之一的轉(zhuǎn)基因小麥植物。對假定的t0轉(zhuǎn)基因事件選擇草銨膦(ppt)耐受性，該耐受性是由pat選擇標(biāo)記賦予的表型，并轉(zhuǎn)移到土壤中。將t0植物在溫室封閉(containment)條件下生長，并產(chǎn)生t1種子。總體上，為每個(gè)dgt-28表達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生了大約45個(gè)獨(dú)立的t0事件。t0小麥dgt-28小麥?zhǔn)录牟莞熟⒛褪苄宰宼0事件在溫室中馴化，生長至從輪生體生出2-4片新的、外觀正常的葉片(即植物已經(jīng)從組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)向溫室生長條件)。使植物在25℃溫室，12小時(shí)補(bǔ)光的條件下生長，直至成熟。如前所述地對在相同條件下生長的t1植物進(jìn)行草甘膦耐受性的初始篩選和taqman分析。數(shù)據(jù)允許確定可遺傳t1事件以供進(jìn)一步表征。將6個(gè)低拷貝(1-2個(gè)拷貝)和2個(gè)多拷貝t1事件在溫室條件下再次種植，并生長至3葉期。用420-3360gae/ha范圍的草甘膦商業(yè)制劑(durangodmatm)噴灑t1植物，該范圍能夠?qū)Ψ寝D(zhuǎn)化小麥品系造成顯著損傷。在施用物中添加了2％w/v硫酸銨。致死劑量的定義為導(dǎo)致bobwhitempb26rh非轉(zhuǎn)化對照>75％損傷的比率。施用除草劑。在本實(shí)施例中，利用草甘膦施用來確定dgt-28基因在t1代中的分離，并且證明對遞增水平的草甘膦的耐受性。用處理21天(dat)后可見損傷的量表來表示植物響應(yīng)。數(shù)據(jù)顯示為展示少于25％可見損傷(4)、25-50％可見損傷(3)、50-75％可見損傷(2)和大于75％可見損傷(1)的個(gè)體數(shù)的柱狀圖。為每個(gè)用于小麥轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體提供了算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列中為每個(gè)比率和每種轉(zhuǎn)化指示了個(gè)體響應(yīng)的評分范圍。用野生型，非轉(zhuǎn)化的小麥(bobwhitempb26rh栽培種)，作為草甘膦敏感性對照。在t1代中，有半合子和純合子植物可用于測試每個(gè)事件，因此每個(gè)測試的草甘膦比率都包含了它們。半合子植物所含的基因量將是純合子植物一半，因此可以預(yù)期在t1代中對草甘膦的響應(yīng)存在差異。t1dgt-28小麥植株的結(jié)果證明，用葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽trap4,trap5,trap8和trap23實(shí)現(xiàn)了對高達(dá)3360gae/ha的草甘膦比率的耐受性。表30是低拷貝t1事件的數(shù)據(jù)，但是代表了每個(gè)構(gòu)建體的群體。表30.低拷貝t1dgt-28小麥?zhǔn)录谔幚砗?1天對草甘膦的響應(yīng)在21dat，對抗性和敏感性植株進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定了通過卡方分析作為單一座位分離并顯示顯性孟德爾性狀(3r:1s)的品系的百分比。表31.這些數(shù)據(jù)證明，dgt-28是一種在單子葉物種中可以遺傳的強(qiáng)草甘膦抗性基因。表31.各構(gòu)建體的基于420-3360gae/ha范圍草甘膦選擇證明了孟德爾方式遺傳的t1dgt-28事件的百分比對t0轉(zhuǎn)基因植物整合編碼dgt-28的t-dna的分子確認(rèn)從所有假定t0小麥植株的冷凍干燥葉片材料提取基因組dna。將新鮮采集的葉組織在液氮中速凍，并在labconcofreezone(labconco,kansascity,mo)中在-40℃和133x10-3mbar壓力下冷凍干燥24h。使用植物dna微量提取試劑盒(qiagen)按照制造商的使用說明對凍干的材料進(jìn)行dna提取。對來自每個(gè)t0植物的dna測試是否有殘留的根癌土壤桿菌菌株，并確定編碼dgt-28的t-dna的整合拷貝數(shù)目。用雙重qpcr測定檢測根癌土壤桿菌的存在與否，從小麥基因組擴(kuò)增內(nèi)源泛素基因(正向和反向引物和探針如下)：5’gcgaagatccaggacaagga3’(seqidno:85；正向引物)5’ctgcttaccggcaaagatgag3’(seqidno:86；反向引物)5’ttcccccggaccagcagcgt3’(seqidno:87；探針)并從ptibo542擴(kuò)增virc：5’ccgacgagaaagaccagcaa3’(seqidno:88；正向引物)5’cttaagttgtcgatcgggactgt3’(seqidno:89；反向引物)5’tgagcctctcgtcgccgatcacat3’(seqidno:90；探針).按照livak和schmittgen(methods200125:402-8)的方法，通過雙重qpcr測定估計(jì)整合t-dna的拷貝數(shù)。該測定擴(kuò)增六倍體小麥d基因組上的內(nèi)源單拷貝嘌呤吲哚蛋白(puroindoline)-b(pinb)基因(gautieretal.plantscience2000153,81–91)：5’attttccattcacttggccc3’(seqidno:91；正向引物)5’tgctatctggctcagctgc3’(seqidno:92；反向引物)5’atggtggaagggcggttgtga3’(seqidno:93；探針)和存在于t-dna上的肌動(dòng)蛋白(act1)啟動(dòng)子的一個(gè)區(qū)域：5’ctcccgcgcaccgatctg3’(seqidno:94；正向引物)5’cccgcccctctcctctttc3’(seqidno:95；反向引物)5'aagccgcctctcgcccaccca3’(seqidno:96；探針).將如下所述的植物歸類為轉(zhuǎn)基因：該植物沒有擴(kuò)增出virc產(chǎn)物；并且使用針對內(nèi)源泛素和水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的引物從該植物擴(kuò)增出了正確的產(chǎn)物。根據(jù)livak和schmittgen(methods200125:402-8)，整合t-dna的數(shù)目從2δδc(t)進(jìn)行估算?？偟膩碚f，全部t0植物的大約95％具有至少一個(gè)t-dna的整合拷貝。表32表32.產(chǎn)生的獨(dú)立t0植株數(shù)目和編碼dgt-28的整合t-dna的估計(jì)數(shù)用于跟蹤轉(zhuǎn)基因遺傳的pcr配型測定法的開發(fā)通過用8種限制性內(nèi)切核酸酶消化經(jīng)純化的基因組dna，隨后連接特異針對由限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的突出端(overhang)的雙鏈銜接子，來鑒定t-dna整合位點(diǎn)的側(cè)翼序列。銜接子連接后，使用針對編碼dgt-28的t-dna的3’或5’端的生物素化引物、和針對每個(gè)銜接子的引物進(jìn)行pcr。將pcr產(chǎn)物捕獲并在ampure固相可逆固定化(solidphasereversibleimmobilization,spri)珠子(agencourtbiosciencecorporation,beckmancoultercompany)上純化。然后進(jìn)行巢式pcr，并用v3.1化學(xué)(appliedbiosystems)在自動(dòng)毛細(xì)管電泳平臺(tái)上對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行sanger測序。序列分析使用sequencher軟件(genecodes,annarbor,mi)實(shí)施，用于產(chǎn)生(如果有可能)共有序列。使用所得的共有序列和單個(gè)序列(singleton)作為blastn查詢項(xiàng)，搜索小麥品種中國春(chinesespring)的流式分選染色體臂的組裝基因組探查序列重疊群(www.wheatgenome.org)，以確定其中發(fā)生了t-dna整合的染色體，并幫助設(shè)計(jì)用于開發(fā)pcr配型測定的亞基因組特異性引物。為每個(gè)轉(zhuǎn)基因事件開發(fā)了兩種pcr測定法，以便于在后代中對轉(zhuǎn)基因遺傳進(jìn)行跟蹤。第一種測定(下文稱作出-出pcr(out-outpcr))被設(shè)計(jì)成擴(kuò)增整個(gè)t-dna整合位點(diǎn)。在該測定中通過開關(guān)pcr(on-offpcr)實(shí)現(xiàn)亞基因組特異性擴(kuò)增(sub-genome-specificamplification)，開關(guān)pcr所使用的引物被設(shè)計(jì)為將倒數(shù)第二個(gè)堿基(其含有硫代磷酸酯鍵)置于如下所述的核苷酸序列變異之上：該序列變異將靶座位與該座位在小麥基因組中他處的重復(fù)拷貝(同源物和旁系同源物)區(qū)分開來。第二種測定(下文稱作入-出pcr(in-outpcr))被設(shè)計(jì)成從t-dna到內(nèi)源序列的擴(kuò)增。該測定使用一個(gè)來自所述出-出pcr測定的引物，和一個(gè)設(shè)計(jì)為針對編碼dgt-28的t-dna的3’或5’端的引物。pcr引物設(shè)計(jì)成長度為18-27個(gè)核苷酸，熔點(diǎn)為60-65℃，最佳為63℃。出-出pcr)和入-出pcr測定均在25μl反應(yīng)體積中進(jìn)行，含有0.2mmdntp,1xphusionpcr緩沖液(newenglandbiolabs),1.5mmmgcl2,0.5u熱啟動(dòng)phusiondna聚合酶(newenglandbiolabs),25ng純化的基因組dna和0.4μm每種引物。pcr循環(huán)條件為98℃，30秒，然后(98℃，10秒，65℃20秒，72℃60秒)40個(gè)周期。轉(zhuǎn)基因植物配型的指定如表33所示。表33.用于pcr配型測定的轉(zhuǎn)基因事件和用于出-出和入-出pcr的引物序列*指示硫代磷酸酯鍵t1轉(zhuǎn)基因植物的草甘膦耐受性表型評估為了確定具有dgt-28表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因事件是否顯示草甘膦耐受性，在溫室封閉條件下對從單個(gè)事件衍生的t1植物進(jìn)行表型評估。實(shí)施了兩種表型篩選。在第一個(gè)(初步)篩選中，對轉(zhuǎn)基因事件(有充足的t1種子用于兩種表型篩選)的草銨膦和草甘膦耐受性進(jìn)行評估，以確認(rèn)dgt-28表達(dá)并確立各事件之間對除草劑耐受性的等級次序。在第二個(gè)(詳細(xì))篩選中，對于選定的轉(zhuǎn)基因事件，以不同的噴灑比率對草甘膦耐受性進(jìn)行評估，以證實(shí)事件內(nèi)和dgt-28表達(dá)構(gòu)建體之間被賦予的除草劑耐受性的水平。將每個(gè)選定事件的12粒t1種子和非轉(zhuǎn)化供體小麥品系bobwhitempb26rh的3個(gè)重復(fù)(每個(gè)12粒種子)播種在85mm盆中，并在25℃、補(bǔ)充光照以提供12小時(shí)光周期、充分澆水條件下，生長至2葉期。將各盆按照隨機(jī)設(shè)計(jì)放置，以便在數(shù)據(jù)分析過程中消除環(huán)境影響。所篩選的轉(zhuǎn)基因事件如表34所列。在2葉期，用420gai/ha劑量比率的草胺膦噴灑全部t1植物以及12個(gè)非轉(zhuǎn)化供體小麥植物的第一個(gè)重復(fù)。4天后對植物進(jìn)行目測檢查，并使用具有一定范圍表型響應(yīng)的代表性植物建立0-6的打分表。表35表34.初步篩選中測試的轉(zhuǎn)基因事件*根據(jù)多重qpcr測定。低拷貝和多拷貝分別表示≤3和≥4個(gè)整合t-dna表35.用于記錄噴灑4天后對草胺膦的表型響應(yīng)的評分量表得分描述0萌發(fā)延遲或植株建成差；不納入后續(xù)的分析1>75％葉壞死；芽(shoot)失綠/枯萎/死亡225-75％葉壞死；芽(shoot)/葉大部分失綠310-25％葉壞死；<50％葉片失綠；中等枯萎；微小失綠芽(shoot)4<10％葉壞死；微小枯萎；微小失綠5葉尖端壞死；其余植株健康6健康植物然后，對試驗(yàn)中的每個(gè)植物相對于打分量表進(jìn)行評分，評分者對于植物基因型是“盲目的”，以消除評分偏向性。草胺膦評分5天后，用420gai/ha劑量比率的草甘膦噴灑全部t1植物以及非轉(zhuǎn)化供體小麥植物的第一和第二重復(fù)。非轉(zhuǎn)化供體小麥品系剩余的第三重復(fù)(總共12株植物)不噴灑。在噴灑后7、14和21天，對植物進(jìn)行目測檢查。為每個(gè)時(shí)間點(diǎn)建立一個(gè)覆蓋表型響應(yīng)范圍的評分量表，并用于給整個(gè)試驗(yàn)評分。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，評分者對于植物基因型是“盲目的”。噴灑7天后的評分量表是0-7(表36)，噴灑14和21天后，評分量表是1-4。在草甘膦噴灑14天后，還為每個(gè)植物記錄植株高度、分蘗數(shù)和形態(tài)異常。萌發(fā)延遲或形態(tài)建成差的植物不納入隨后的分析。使用評分量表對噴灑草甘膦7天后的表型響應(yīng)進(jìn)行記錄。表36.用于記錄噴灑7天后對草甘膦表型響應(yīng)的評分表得分描述0植物死亡1>75％葉壞死；芽(shoot)失綠/枯萎/死亡250-75％葉壞死；嚴(yán)重失綠和枯萎325-50％葉壞死；<50％葉片失綠；中等枯萎410-25％葉壞死；<25％葉片失綠；微小枯萎5<10％葉壞死；微小失綠6葉尖端壞死；其余植株健康7健康植物表37.用于記錄噴灑14和21天后對草甘膦表型響應(yīng)的評分表得分描述1植物死亡250-75％葉片壞死；嚴(yán)重失綠和枯萎；植物瀕死3<25％葉片壞死；<25％葉片失綠；微小枯萎；生長跡象4健康植物草胺膦響應(yīng)分析未能顯示在被噴灑的非轉(zhuǎn)化供體小麥植物與未被噴灑的非轉(zhuǎn)化供體小麥植物之間有清楚的表型差異(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果，無法可靠地評估轉(zhuǎn)基因事件對草胺膦的耐受性。相反，噴灑21天后的草甘膦響應(yīng)分析顯示出了在被噴灑和未噴灑的非轉(zhuǎn)化供體植物之間有清楚的表型差異。表38。因此，根據(jù)噴灑21天后收集到的響應(yīng)得分對轉(zhuǎn)基因事件之間的草甘膦耐受性進(jìn)行分析。當(dāng)轉(zhuǎn)基因事件的12個(gè)t1植物中有4個(gè)或更多個(gè)具有大于或等于3的響應(yīng)得分時(shí)，則認(rèn)為該事件顯示出草甘膦耐受性。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是基于如下的預(yù)期，即每個(gè)事件在t1代中對該轉(zhuǎn)基因會(huì)以1:2:1(存在純合子:半合子:不存在純合子)分離，并使得具有微弱dgt28表達(dá)的事件能夠鑒定出。使用從單個(gè)耐受性植物計(jì)算出的任意定義的累積得分，對轉(zhuǎn)基因事件的觀察到的草甘膦耐受性進(jìn)行分級。累積得分根據(jù)14和21天的響應(yīng)得分和噴灑14天后記錄的植株長度、分蘗數(shù)和形態(tài)異常來結(jié)算。表38.非轉(zhuǎn)化供體小麥植株在噴灑后21天對除草劑處理的表型響應(yīng)噴灑草胺膦噴灑草甘膦存活比率重復(fù)1是是10/12死亡/瀕死重復(fù)2否是10/12死亡/瀕死重復(fù)3否否12/12健康總的來說，被篩選的92個(gè)轉(zhuǎn)基因事件中的67個(gè)顯示了草甘膦耐受性的證據(jù)。表39。為每個(gè)dgt-28表達(dá)載體選出6個(gè)估計(jì)具有≤3個(gè)轉(zhuǎn)基因整合拷貝的轉(zhuǎn)基因事件和2個(gè)估計(jì)具有4個(gè)或更多個(gè)整合轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因事件，用于第二次(詳細(xì))表型篩選。表39.轉(zhuǎn)基因事件對草甘膦處理的分級后的表型響應(yīng)*正得分指示較高的草甘膦耐受性。未處理的非轉(zhuǎn)化供體小麥植株的標(biāo)準(zhǔn)化累計(jì)得分為12.2詳細(xì)的表型篩選將含有每個(gè)選定事件的12粒t1種子的4個(gè)重復(fù)和非轉(zhuǎn)化供體小麥品系bobwhitempb26rh的8個(gè)重復(fù)(每個(gè)12粒種子)播種在85mm盆內(nèi)，并在25℃、補(bǔ)充光照以提供12小時(shí)光周期、充分澆水條件下，生長至2葉期。將各個(gè)盆按隨機(jī)設(shè)計(jì)放置，以便在數(shù)據(jù)分析過程中可以消除環(huán)境影響。所篩選的轉(zhuǎn)基因事件如表40所列。在2葉期，在用草甘膦噴灑前記錄每個(gè)植物的植株高度和葉數(shù)。對于每個(gè)選定事件以及非轉(zhuǎn)化供體小麥品系的t1植株的第一、第二、第三和第四重復(fù)，分別用420,840,1680和3360gai/ha的劑量比率進(jìn)行噴灑。非轉(zhuǎn)化供體小麥品系的第五、第六、第七和第八重復(fù)(總共48個(gè)植物)不噴灑。在噴灑后7、14和21天，使用表37中的評分量表對植物的植株長度、葉數(shù)和對草甘膦的表型響應(yīng)進(jìn)行評分。還記錄任何形態(tài)異常。為了評分，評分者對于植物基因型和噴灑劑量比率是“盲目的”，以防止評分偏向性。在噴灑前評分時(shí)具有萌發(fā)延遲和形態(tài)建成差(標(biāo)準(zhǔn)：植物長度<6cm)的植物，不納入隨后的分析。表40.在詳細(xì)表型篩選中測試的轉(zhuǎn)基因事件*基于多重qpcr測定。低拷貝和多拷貝分別表示≤3和≥4的整合t-dna噴灑7、14和21天后的草甘膦響應(yīng)分析顯示，被噴灑和未被噴灑的非轉(zhuǎn)化供體小麥植物之間有截然不同的表型差異。該區(qū)分在第21天時(shí)最大，并且在所有草甘膦劑量比率下均可觀察到。表41。為了評估轉(zhuǎn)基因事件對每個(gè)噴灑劑量比率的耐受性，將空t1植物(即沒有攜帶轉(zhuǎn)基因的植物)排除出隨后的分析。在噴灑21天后響應(yīng)得分小于3的t1植物被認(rèn)為具有空基因型?；谀褪苄员硇偷姆讲罘治?anova)揭示，dgt-28表達(dá)構(gòu)建體、轉(zhuǎn)基因事件和草甘膦噴灑劑量具有顯著影響。表42。然而，由于用于記錄個(gè)體植物的表型的響應(yīng)得分的范圍有限(即1-4，表40)，多重比較檢驗(yàn)未能對這些差異的來源提供有意義的生物學(xué)解釋。大體上，對每個(gè)dgt-28表達(dá)構(gòu)建體測試的8個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因事件在每個(gè)噴灑劑量比率下顯示出相似的草甘膦耐受性，表明所有4個(gè)dgt-28轉(zhuǎn)基因均賦予了顯性表型，并且單拷貝足以賦予草甘膦耐受性。每個(gè)dgt-28表達(dá)構(gòu)建體顯示對至少3360gai/ha的草甘膦具有有效的耐受性。表41.非轉(zhuǎn)化供體小麥植株對不同草甘膦處理在噴灑后21天的表型響應(yīng)表42.基于草甘膦耐受性植物的方差分析(anova)1自由度；2分別在0.001(***)和0.01(**)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著草甘膦耐受性t1植物中t-dna存在的分子確認(rèn)使用在實(shí)施例2中開發(fā)的pcr配型測定法確認(rèn)在預(yù)留用于產(chǎn)生t2種子的草甘膦耐受性t1植物(見實(shí)施例6)中編碼dgt-28的t-dna的存在?？偟膩碚f，對104個(gè)t1植物進(jìn)行pcr配型測試，其中89％被確認(rèn)為含有轉(zhuǎn)基因的至少1個(gè)拷貝。表43。這些結(jié)果確認(rèn)，所觀察到的草甘膦耐受性是被編碼dgt-28的t-dna的存在所賦予的。表43.在t1植物中觀察到的轉(zhuǎn)基因分離為草甘膦耐受性轉(zhuǎn)基因事件的產(chǎn)生t2種子從被選擇包含在詳細(xì)表型篩選中的32個(gè)轉(zhuǎn)基因事件中，通過表型篩選保留了大約8個(gè)草甘膦耐受性t1植物(表40)。將植物轉(zhuǎn)移到200mm盆中，并在25℃、補(bǔ)充光照以提供12小時(shí)光周期、充分澆水條件下生長。在開花之前，將每個(gè)植物上的穗單獨(dú)包裹，以防止異交。雖然本發(fā)明的各方面已經(jīng)在某些實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是它們在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以被進(jìn)一步進(jìn)行修改。因此，本申請意圖涵蓋使用其一般原理的本發(fā)明實(shí)施方案的任何變化、用途或修改。此外，本申請意圖涵蓋通過這些實(shí)施方案所涉及的領(lǐng)域中的已知或習(xí)慣做法可以獲得、并且落在附加權(quán)利要求的范圍之內(nèi)的對本公開的偏離。序列表<110>陶氏益農(nóng)公司lira,justincicchillo,robertyerkes,carlarobinson,andrew<120>草甘膦抗性植物和相關(guān)方法<130>2971-p10153.1us(68831)<160>145<170>patentinversion3.5<210>1<211>415<212>prt<213>streptomycessviceus<400>1metargglymetproalaleuserleuproglyserlysserilethr151015alaargalaleupheleualaalaalaalaaspglyvalthrthrleu202530valargproleuargseraspaspthrgluglyphealagluglyleu354045valargleuglytyrargvalglyargthrproaspthrtrpglnval505560aspglyargproglnglyproalavalalaglualaaspvaltyrcys65707580argaspglyalathrthralaargpheleuprothrleualaalaala859095glyhisglythrtyrargpheaspalaserproglnmetargargarg100105110proleuleuproleuserargalaleuargaspleuglyvalaspleu115120125arghisgluglualagluglyhishisproleuthrvalargalaala130135140glyvalgluglyglygluvalthrleuaspalaglyglnsersergln145150155160tyrleuthralaleuleuleuleuglyproleuthrargglnglyleu165170175argileargvalthraspleuvalseralaprotyrvalgluilethr180185190leualametmetargalapheglyvalgluvalalaarggluglyasp195200205valphevalvalproproglyglytyrargalathrthrtyralaile210215220gluproaspalaserthralasertyrphephealaalaalaalaleu225230235240thrproglyalagluvalthrvalproglyleuglythrglyalaleu245250255glnglyaspleuglyphevalaspvalleuargargmetglyalaglu260265270valservalglyalaaspalathrthrvalargglythrglygluleu275280285argglyleuthralaasnmetargaspileseraspthrmetprothr290295300leualaalailealaprophealaseralaprovalargilegluasp305310315320valalaasnthrargvallysglucysaspargleuglualacysala325330335gluasnleuargargleuglyvalargvalalathrglyproasptrp340345350ilegluilehisproglyproalathrglyalaglnvalthrsertyr355360365glyasphisargilevalmetserphealavalthrglyleuargval370375380proglyileserpheaspaspproglycysvalarglysthrphepro385390395400glyphehisglualaphealagluleuargargglyileglyser405410415<210>2<211>1248<212>dna<213>streptomycessviceus<400>2atgagagggatgccagccttgtctttacctggatcaaagagtatcacagctagggcactc60tttcttgctgctgctgctgatggggttactactttggtgaggccattgagaagtgacgac120acagaaggattcgctgaggggttagttcgtttaggctatcgtgtagggaggacacccgat180acttggcaagtcgatggcagaccacaaggaccagcagtggctgaggctgacgtctactgt240agagacggagcaaccaccgctagattcttgccaaccttagcagctgctggtcacggaaca300tacagatttgatgcttcaccacagatgaggagacgtcctcttttgcccttaagcagagcc360ttgagggatttgggtgtcgatcttagacacgaagaagctgaaggtcatcaccctctgact420gtccgtgctgctggggttgaaggaggagaggttactttggatgctggtcagtcaagtcag480tatctcactgccttgttgctccttggtccccttacaagacaaggactgaggataagggtt540actgatttggtgtcagcaccatacgtggagattacgcttgcaatgatgagggctttcgga600gttgaagtggcaagggagggagatgtgttcgttgttccacctggtggatatcgtgcaact660acgtatgctatagaacccgacgcaagtactgcttcttacttcttcgcagctgctgctttg720actcctggagctgaagtgactgtacctgggttaggcacgggagcacttcaaggagatttg780ggatttgtagatgtcttaaggagaatgggagccgaggtgtccgtaggagctgatgcaacc840actgttagaggaactggtgaattgcgtggccttacagccaacatgagagacataagtgat900acgatgccgaccctcgctgcaatagcaccctttgctagtgctccagttagaatcgaggat960gttgccaacactcgtgtcaaagaatgtgacagacttgaggcttgtgcagagaaccttagg1020aggttgggagtaagggttgcaacgggtccggactggattgagatacaccctggtccagct1080actggtgctcaagtcacaagctatggtgatcacagaattgtgatgtcatttgcagtgact1140ggacttcgtgtgcctgggatcagcttcgacgaccctggctgtgttcgtaagacttttcct1200gggtttcacgaggctttcgcagaattgaggcgtggcattgggagctga1248<210>3<211>1251<212>dna<213>streptomycessviceus<400>3atggcaagagggatgccagccttgtcgctgcctggctcaaagtcgatcacggctagagca60ctctttctcgcagcagcagccgacggagtcaccacgcttgtgagaccgctgcggtcagac120gacaccgagggttttgcggaaggcctcgtcagactgggctatcgggttgggaggactccc180gacacgtggcaagtggacggaaggccacaaggtccagcagttgccgaggctgatgtgtat240tgtagagacggtgcaacaacggctaggttcctccccacactcgcagctgctggacacggg300acctacagatttgatgcctctccccagatgaggagaaggccactgctgcctctttctagg360gctttgagggaccttggcgttgatcttcgccacgaggaagcggaagggcaccaccccttg420accgtgagagctgctggagtcgagggaggtgaggttacactcgatgctggacagtcctct480cagtacttgacggcactgctgctgctcggtccgctcacacgccaagggctgcggattcgc540gtcactgatctggttagcgctccgtacgtggagattacacttgcgatgatgagagctttt600ggggtcgaggttgcacgcgaaggcgacgttttcgtggtgcctcctggtggctacagagcg660actacgtacgcgattgagccagatgccagcaccgcaagctacttctttgcagctgctgcg720ttgacacctggagccgaggtcacagtgcctggactcgggaccggagcgcttcaaggggat780ctcggcttcgtggacgtgctgcggaggatgggtgccgaggtcagcgtgggagcagacgct840acgactgttagaggcacgggtgagcttagaggccttacagcaaacatgagggacatatcc900gacacgatgccgacgcttgctgccatcgctccgttcgcttcagcacccgtcagaattgaa960gatgtggcgaacactcgcgtcaaagagtgcgacagacttgaagcgtgtgccgagaacttg1020aggaggttgggagtgagagtcgcaactggtccagactggatcgagatccaccctggtcca1080gctactggagcgcaagtcacaagctatggcgaccataggattgttatgtcattcgcagtg1140accggactcagagttcctgggatctctttcgacgaccctggttgcgtgcggaaaacgttc1200cctggcttccacgaggcatttgcggagctgcggagaggaattggttcctga1251<210>4<211>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