本發(fā)明涉及腫瘤診斷、治療、預測預后領域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測sugct異常為手段的腫瘤診斷、預測預后方法；及激活sugct基因或蛋白質(zhì)的腫瘤治療劑。

背景技術：

結腸腺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率逐漸升高，占所有惡性腫瘤的第二位。

結腸腺癌的發(fā)生，發(fā)展是一個涉及多基因改變的復雜過程。其發(fā)病過程與細胞分裂、分化、基因群的時空表達異常及其蛋白質(zhì)的相互作用有關。鑒定與結腸腺癌發(fā)病相關的癌基因或抑癌基因，對研究結腸腺癌癌變機理及其診斷、治療和預防具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測sugct基因或蛋白表達差異來診斷結腸腺癌的方法。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測sugct基因或蛋白表達差異來預測結腸腺癌預后的方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過激活sugct基因或sugct蛋白來治療結腸腺癌的方法。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療結腸腺癌的藥物的方法。

本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療結腸腺癌的藥物。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：

本發(fā)明提供了檢測sugct的產(chǎn)品在制備結腸腺癌診斷工具中的應用。

進一步，所述檢測sugct的產(chǎn)品包括檢測sugct基因表達量的產(chǎn)品。

更進一步，所述檢測sugct的產(chǎn)品包括能夠定量sugct基因mrna的產(chǎn)品，和/或能夠定量sugct蛋白的產(chǎn)品。

本發(fā)明的定量sugct基因mrna的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。

包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。

進一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴增不應突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴增片段長度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構象多態(tài)性)法來檢測。

所述能夠定量sugct基因mrna的產(chǎn)品包括實時定量pcr中使用的特異擴增sugct基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

產(chǎn)品中包括的引物可以通過通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來適當?shù)卦O計，并通過化學合成來制備。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，并通過化學合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。

本發(fā)明的定量sugct蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學法、western印跡等。

本發(fā)明的定量sugct蛋白的產(chǎn)品包括特異性結合sugct蛋白的抗體或其片段?？梢允褂萌魏谓Y構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的定量sugct蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。

抗體可以通過本領域技術人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物后，從經(jīng)過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的sugct蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對sugct蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動物，從經(jīng)過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。

標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下熒光標記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-nh2、生物素標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-nh2、過氧化物酶標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標記試劑盒諸如熒光素標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標記試劑盒、qdot(tm)抗體標記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標記物蛋白質(zhì)標記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標記的抗體或其片段。

作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣品來自受試者的組織。

進一步，所述定量sugct基因或sugct蛋白的產(chǎn)品可以是檢測sugct基因或sugct蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。

本發(fā)明還提供了一種診斷結腸腺癌的工具，所述工具能夠檢測sugct基因表達量。

進一步，所述工具包括包括能夠定量sugct基因mrna的試劑，和/或能夠定量sugct蛋白的試劑。

更進一步，所述能夠定量sugct基因mrna的試劑是實時定量pcr中使用的特異擴增sugct基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

進一步，所述診斷結腸腺癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷結腸腺癌的工具，隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知sugct基因的異常與結腸腺癌相關也屬于sugct的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗sugct抗體或其片段所識別的氨基酸的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結合sugct即可。

本發(fā)明還提供了一種診斷結腸腺癌的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取受試者的樣品；

(2)檢測受試者樣品中sugct基因或蛋白的表達水平；

(3)將測得的sugct基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關聯(lián)起來。

(4)與對照相比，sugct基因或蛋白的表達水平降低，則該受試者被判斷患有結腸腺癌或者具有患有結腸腺癌的風險、或者結腸腺癌患者被判斷為復發(fā)、或者結腸腺癌患者被判斷為預后不良。

本發(fā)明還提供了一種結腸腺癌的治療方法，所述方法包括激活sugct基因或sugct蛋白。

進一步，所述方法包括促進sugct基因的表達，或促進sugct蛋白的表達或增強sugct蛋白的活性。

本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過在對癌細胞添加測試藥物后或在對腫瘤模型動物施用測試藥物后的某個時期測量sugct基因或者sugct蛋白的表達水平來測定腫瘤藥物改善腫瘤預后的效果。更具體地說，當sugct基因或者sugct蛋白的表達水平在添加或施用測試藥物后升高時或者恢復正常水平時，可選擇該藥物作為改善腫瘤預后的治療藥物。

本發(fā)明還提供了一種治療結腸腺癌的藥物，所述藥物包含sugct的激活劑。

發(fā)明的sugct的激活劑不受限制，只要所述激活劑能夠促進或增強sugct或涉及sugct上游或下游途徑的物質(zhì)的表達或活性，且對于治療腫瘤有效的藥物即可。

本發(fā)明還提供了上述激活劑在制備治療結腸腺癌的藥物中的應用。

進一步，所述激活劑包括sugct基因、sugct蛋白、促進型mirna、促進型轉錄調(diào)控因子、或促進型靶向小分子化合物。

本發(fā)明的激活劑一方面可以用于補充內(nèi)源性的sugct蛋白的缺失或不足，通過提高sugct蛋白的表達，從而治療因sugct蛋白缺乏導致的結腸腺癌。另一方面可以用于增強sugct蛋白的活性，從而治療結腸腺癌。

本發(fā)明的藥物可以作為醫(yī)藥單獨施用或與其它藥物一起施用。可以與本發(fā)明的藥物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預防性藥物的效果即可，優(yōu)選的是，用于治療或預防腫瘤的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、達卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司?。豢勾x物，諸如依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽(cytarabineocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奧替拉西鉀、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物堿，諸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和長春堿；抗癌抗生素，諸如放線菌素d、阿柔比星、氨柔比星、伊達比星、表柔比星、凈司他丁stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、吡柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素c、和米托蒽醌；基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達鉑；激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來曲唑；生物反應修飾劑，諸如干擾素α、干擾素β、干擾素γ、白介素、烏苯美司、干bcg、和香菇多糖；和分子靶向藥物，諸如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲妥單抗、維a酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。

本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。

本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預防效果即可，包括但不限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，動脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關節(jié)內(nèi)，心室內(nèi)，直腸，陰道，顱骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。

本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預防效果即可，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預防藥物的劑量可以使用例如對疾病的治療效果或者預防效果作為指標來確定。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷結腸腺癌”包括判斷受試者是否已經(jīng)患有結腸腺癌、判斷受試者是否存在患有結腸腺癌的風險、判斷結腸腺癌患者是否已經(jīng)復發(fā)與轉移、判斷結腸腺癌患者對藥物治療的反應性、或者判斷結腸腺癌患者的預后情況。

本文所用的“治療”涵蓋患有相關疾病或病癥的哺乳動物例如人類中治療相關的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：

(1)預防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動物中發(fā)生，尤其是當該哺乳動物易感于所述疾病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時；

(2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者

(3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。

術語“治療”通常涉及治療人類或動物(例如，被獸醫(yī)所應用)，其中可達到某些預期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止)、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預防措施(例如預防)的治療。對還沒有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危險的患者的用途，也包括在術語“治療”中。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷結腸腺癌的分子標志物，使用該分子標志物可以在結腸腺癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。

本發(fā)明的包括sugct基因或蛋白的激活劑的治療藥物可用作新的結腸腺癌的治療藥物。

附圖說明

圖1顯示利用qpcr檢測sugct基因在結腸腺癌組織與正常組織中的表達差異圖；

圖2顯示利用mtt法檢測sugct基因表達對結腸腺癌細胞增殖的影響；

圖3顯示利用流式細胞儀檢測sugct基因表達對結腸腺癌細胞凋亡的影響。

具體的實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選差異表達基因

1、實驗材料

選擇醫(yī)院行手術治療且病史資料完整的10例結腸癌患者的病灶切除組織標本，己經(jīng)經(jīng)病理科診斷為結腸腺癌，男5例、女5例；根據(jù)按美國癌癥聯(lián)合委員會(ajcc，2009)制定的結腸直腸癌分期標準：i-ii期6例，iii-iv期4例。組織學分級:高分化3例，中分化4例，低分化3例。術前均末行放療、化療及生物劑治療。正常對照組織為正常的遠端結腸黏膜組織10例，均來自健康腸鏡體檢者。

2、rna提取、cdna合成

按照trizol說明書操作抽提組織細胞總rna，然后按照逆轉錄試劑盒說明書將mrna反轉錄為cdna。

3、生物素標記crna雜交

以cdna為模板,應用messageamptmii-biotinarnaamplificationkit(ambion公司)體外轉錄合成生物素標記crna，純化后按affymetrix公司的真核生物表達譜單輪芯片擴增程序加入5×片段化緩沖液得到大小分布在35～200nt的片段化crna；靶標制備完成后,應用真核生物hybridizationcontrolkit(affymetrix公司)配制雜交液,注入雜交液的芯片平衡放置于雜交爐中,45℃,60r/min旋轉雜交16h(hybridizationoven640,affymetrix公司)，然后在affymetrix公司提供的洗滌工作站中(fluidicsstation450，affymetrix公司)完成芯片的清洗染色；

4、掃描和分析

應用scanner3000(affymetrix公司)掃描儀掃描圖像。掃描圖像首先用operatingsoftwareversion1.4(gcos1.4,affymetrix公司)軟件進行圖像到信號值的轉換,轉換成原始數(shù)據(jù)文件。然后使用軟件dchip2006中的invariantsetnormalization方法和model-baseexpressionindex模型對gcos輸出結果進行進一步的數(shù)據(jù)分析。根據(jù)在各芯片中檢測到的p值，當數(shù)據(jù)集的檢測值call值(absolutecall,abscall)為不存在a(absent)或者臨界值m(marginal)時,被視為不表達,只有abscall值為存在p(present)的數(shù)據(jù)集才被用于進一步的分析。

5、組織差異表達基因的篩選

差異表達基因的篩選利用significantanalysisofmicroarraysoftware(sam)算法進行。

6、結果

芯片共篩選出485個差異表達基因。與正常組織相比，結腸腺癌組織中表達上調(diào)的基因為289個，表達下調(diào)的基因為196個。

實施例2差異表達基因在大樣本中的驗證

1、研究對象

選擇醫(yī)院行手術治療且病史資料完整的50例結腸癌患者的病灶切除組織標本，己經(jīng)經(jīng)病理科診斷為結腸腺癌，男20例、女30例；根據(jù)按美國癌癥聯(lián)合委員會(ajcc，2009)制定的結腸直腸癌分期標準：i-ii期15例，iii-iv期35例。組織學分級：高分化17例，中分化15例，低分化18例。術前均末行放療、化療及生物劑治療。正常對照組織為正常的遠端結腸黏膜組織40例，均來自健康腸鏡體檢者。

2、rna提取和cdna合成

按照實施例1的方法進行rna提取和cdna合成。

3、qpcr

引物是由引物設計軟件primer5.0設計，大連寶生物公司與上海英駿公司合成。sugct基因及內(nèi)參基因所用引物序列如下：

sugct基因引物序列

5’-tgctgttaatatcaagga-3’(seqidno.1)，

5’-aatctcgtctatatcttcat-3’(seqidno.2)；

gapdh基因引物序列

5’-aaggtcggagtcaacggatttg-3’(seqidno.3)，

5’-ccatgggtggaatcatattggaa-3’(seqidno.4)。

采用cdna2.0μl進行qpcr反應。擴增程序為：95℃5min，(95℃10s，60℃60s)*42個循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標記物，在lightcycler熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應，δδct法進行相對定量。

4、westernblot檢測

提取細胞總蛋白。采用bca蛋白濃度試劑盒對提取的總蛋白進行定量。每個樣本取50μg總蛋白，12％sds-page電泳1.5h后，轉膜。5％脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育2h。電化學法發(fā)光ecl發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光顯色；灰度分析，目的蛋白的相對表達量取其與gapdh的灰度值比值。

5、結果

(1)qpcr結果

如圖1所示，與正常組織相比，結腸腺癌組織中sugct基因mrna水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

(2)westernblot結果

正常組織中sugct蛋白相對表達量為0.65±0.07，結腸腺癌組織中sugct蛋白相對表達量0.12±0.02，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例3sugct基因的表達對結腸腺癌細胞增殖能力的影響

1、sugct基因重組質(zhì)粒構建

(1)擴增sugct基因的編碼序列；

(2)設計擴增引物；

(3)將擴增后的sugct基因連接到表達載體pcdna3.0中，構建pcdna3.0-sugct重組表達載體。

1.2結腸腺癌細胞的培養(yǎng)與轉染

ht-29細胞于含10％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)參數(shù)：37℃、體積分數(shù)為5％co2飽和濕度。采用脂質(zhì)體lipofectamine2000為轉染試劑。實驗分2組：陰性對照組(轉染pcdna3.0)；實驗組(轉染pcdna3.0-sugct)。取對數(shù)生長期的ht-29細胞，接種于6孔細胞培養(yǎng)板。24h后細胞培養(yǎng)板覆蓋率約為70％-80％。轉染方式參照lipofectamine2000說明書進行。

1.3westernblot實驗檢測pcdna3.0-sugct的過表達效率

步驟同實施例2。

1.4結果

陰性對照組(轉染pcdna3.0)細胞中sugct蛋白相對表達量為0.15±0.04，實驗組(轉染pcdna3.0-sugct)細胞中sugct蛋白相對表達量1.21±0.15，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

2、mtt實驗分析細胞增殖活性

收集對數(shù)生長期的各組細胞，調(diào)整細胞密度為1*10⁴/ml，接種于96孔板中，每孔100μl，置于37℃、體積分數(shù)為5％co2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于24、48、72h后進行mtt檢測：每孔加mtt溶液10μl(5％)，置于37℃、體積分數(shù)為5％co2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)3h后，小心去除上清，每孔加150μl的dmso，水平搖床上放置30min。酶標儀測定波長490nm下的a值。

3、實驗結果

結果如圖2所示，與陰性對照組(轉染pcdna3.0)細胞相比，實驗組(轉染pcdna3.0-sugct)細胞增殖緩慢，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。上述實驗結果表明，sugct基因表達抑制了結腸腺癌細胞的增殖。

實施例4sugct基因的表達對結腸腺癌細胞凋亡的影響

1、步驟：收集轉染24h后的各組細胞，冰磷酸鹽緩沖液洗滌2次，1xbindingbuffer調(diào)整細胞濃度為10⁴/ml，加入5μl的annexinv稀釋液混勻后，再加入2.5μl的碘化丙啶，混勻。冰盒上避光靜置10min，加入1xbindingbuffer400μl，上機檢測凋亡比例。

2、實驗結果

結果如圖3所示，與陰性對照組(轉染pcdna3.0)細胞相比，實驗組(轉染pcdna3.0-sugct)細胞凋亡率升高，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。上述實驗結果表明，sugct基因表達促進了結腸腺癌細胞的凋亡。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術有限公司

<120>一種診治結腸腺癌的分子標志物

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgctgttaatatcaagga18

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aatctcgtctatatcttcat20

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

aaggtcggagtcaacggatttg22

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ccatgggtggaatcatattggaa23