本發(fā)明涉及腫瘤診斷、治療、預(yù)測(cè)預(yù)后領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測(cè)procr異常為手段的腫瘤診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后方法；及激活procr基因或蛋白質(zhì)的腫瘤治療劑。

背景技術(shù)：

結(jié)腸腺癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)，其發(fā)病率逐漸升高，占所有惡性腫瘤的第二位。

結(jié)腸腺癌的發(fā)生，發(fā)展是一個(gè)涉及多基因改變的復(fù)雜過(guò)程。其發(fā)病過(guò)程與細(xì)胞分裂、分化、基因群的時(shí)空表達(dá)異常及其蛋白質(zhì)的相互作用有關(guān)。鑒定與結(jié)腸腺癌發(fā)病相關(guān)的癌基因或抑癌基因，對(duì)研究結(jié)腸腺癌癌變機(jī)理及其診斷、治療和預(yù)防具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過(guò)檢測(cè)procr基因或蛋白表達(dá)差異來(lái)診斷結(jié)腸腺癌的方法。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過(guò)檢測(cè)procr基因或蛋白表達(dá)差異來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)腸腺癌預(yù)后的方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過(guò)激活procr基因或procr蛋白來(lái)治療結(jié)腸腺癌的方法。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療結(jié)腸腺癌的藥物的方法。

本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療結(jié)腸腺癌的藥物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測(cè)procr的產(chǎn)品在制備結(jié)腸腺癌診斷工具中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述檢測(cè)procr的產(chǎn)品包括檢測(cè)procr基因表達(dá)量的產(chǎn)品。

更進(jìn)一步，所述檢測(cè)procr的產(chǎn)品包括能夠定量procr基因mrna的產(chǎn)品，和/或能夠定量procr蛋白的產(chǎn)品。

本發(fā)明的定量procr基因mrna的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點(diǎn)雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測(cè)序平臺(tái)等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。

包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得，或通過(guò)從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸的引物擴(kuò)增它來(lái)獲得。

進(jìn)一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉(zhuǎn)錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴(kuò)增的核酸可以通過(guò)使用點(diǎn)印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來(lái)檢測(cè)。

所述能夠定量procr基因mrna的產(chǎn)品包括實(shí)時(shí)定量pcr中使用的特異擴(kuò)增procr基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

產(chǎn)品中包括的引物可以通過(guò)通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)恰當(dāng)設(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，或者可以通過(guò)從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸序列的引物擴(kuò)增它來(lái)制備。

本發(fā)明的定量procr蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測(cè)定法、免疫組織化學(xué)法、western印跡等。

本發(fā)明的定量procr蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合procr蛋白的抗體或其片段。可以使用任何結(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗體對(duì)抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的定量procr蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細(xì)胞。

抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)獲得。例如，制備保留整個(gè)或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免疫動(dòng)物后，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過(guò)使用被用作抗原的procr蛋白或其部分對(duì)獲得的抗體實(shí)施抗原特異性純化來(lái)獲得針對(duì)procr蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動(dòng)物，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對(duì)血清實(shí)施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^(guò)用酶處理獲得的抗體或通過(guò)使用獲得的抗體的序列信息來(lái)獲得抗體片段。

標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域普遍知道的方法來(lái)實(shí)施。例如，可以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準(zhǔn)備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-nh2、生物素標(biāo)記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒-nh2、過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標(biāo)記試劑盒諸如熒光素標(biāo)記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標(biāo)記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標(biāo)記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標(biāo)記試劑盒、qdot(tm)抗體標(biāo)記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)過(guò)標(biāo)記的抗體或其片段。

作為依照本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測(cè)定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過(guò)處理的材料。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣品來(lái)自受試者的組織。

進(jìn)一步，所述定量procr基因或procr蛋白的產(chǎn)品可以是檢測(cè)procr基因或procr蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。

本發(fā)明還提供了一種診斷結(jié)腸腺癌的工具，所述工具能夠檢測(cè)procr基因表達(dá)量。

進(jìn)一步，所述工具包括包括能夠定量procr基因mrna的試劑，和/或能夠定量procr蛋白的試劑。

更進(jìn)一步，所述能夠定量procr基因mrna的試劑是實(shí)時(shí)定量pcr中使用的特異擴(kuò)增procr基因的引物，所述引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。

進(jìn)一步，所述診斷結(jié)腸腺癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷結(jié)腸腺癌的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知procr基因的異常與結(jié)腸腺癌相關(guān)也屬于procr的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗procr抗體或其片段所識(shí)別的氨基酸的數(shù)目沒(méi)有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合procr即可。

本發(fā)明還提供了一種診斷結(jié)腸腺癌的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取受試者的樣品；

(2)檢測(cè)受試者樣品中procr基因或蛋白的表達(dá)水平；

(3)將測(cè)得的procr基因或蛋白的表達(dá)水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來(lái)。

(4)與對(duì)照相比，procr基因或蛋白的表達(dá)水平降低，則該受試者被判斷患有結(jié)腸腺癌或者具有患有結(jié)腸腺癌的風(fēng)險(xiǎn)、或者結(jié)腸腺癌患者被判斷為復(fù)發(fā)、或者結(jié)腸腺癌患者被判斷為預(yù)后不良。

本發(fā)明還提供了一種結(jié)腸腺癌的治療方法，所述方法包括激活procr基因或procr蛋白。

進(jìn)一步，所述方法包括促進(jìn)procr基因的表達(dá)，或促進(jìn)procr蛋白的表達(dá)或增強(qiáng)procr蛋白的活性。

本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過(guò)在對(duì)癌細(xì)胞添加測(cè)試藥物后或在對(duì)腫瘤模型動(dòng)物施用測(cè)試藥物后的某個(gè)時(shí)期測(cè)量procr基因或者procr蛋白的表達(dá)水平來(lái)測(cè)定腫瘤藥物改善腫瘤預(yù)后的效果。更具體地說(shuō)，當(dāng)procr基因或者procr蛋白的表達(dá)水平在添加或施用測(cè)試藥物后升高時(shí)或者恢復(fù)正常水平時(shí)，可選擇該藥物作為改善腫瘤預(yù)后的治療藥物。

本發(fā)明還提供了一種治療結(jié)腸腺癌的藥物，所述藥物包含procr的激活劑。

發(fā)明的procr的激活劑不受限制，只要所述激活劑能夠促進(jìn)或增強(qiáng)procr或涉及procr上游或下游途徑的物質(zhì)的表達(dá)或活性，且對(duì)于治療腫瘤有效的藥物即可。

本發(fā)明還提供了上述激活劑在制備治療結(jié)腸腺癌的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述激活劑包括procr基因、procr蛋白、促進(jìn)型mirna、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。

本發(fā)明的激活劑一方面可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的procr蛋白的缺失或不足，通過(guò)提高procr蛋白的表達(dá)，從而治療因procr蛋白缺乏導(dǎo)致的結(jié)腸腺癌。另一方面可以用于增強(qiáng)procr蛋白的活性，從而治療結(jié)腸腺癌。

本發(fā)明的藥物可以作為醫(yī)藥單獨(dú)施用或與其它藥物一起施用?？梢耘c本發(fā)明的藥物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預(yù)防性藥物的效果即可，優(yōu)選的是，用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司??；抗代謝物，諸如依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽(cytarabineocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奧替拉西鉀、去氧氟尿苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達(dá)拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物堿，諸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長(zhǎng)春瑞濱、長(zhǎng)春地辛、和長(zhǎng)春堿；抗癌抗生素，諸如放線菌素d、阿柔比星、氨柔比星、伊達(dá)比星、表柔比星、凈司他丁stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、吡柔比星、博來(lái)霉素、培洛霉素、絲裂霉素c、和米托蒽醌；基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達(dá)鉑；激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來(lái)曲唑；生物反應(yīng)修飾劑，諸如干擾素α、干擾素β、干擾素γ、白介素、烏苯美司、干bcg、和香菇多糖；和分子靶向藥物，諸如伊馬替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲妥單抗、維a酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。

本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。

本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即可，包括但不限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下的，通過(guò)皮膚，通過(guò)胸膜，局部的，吸入，通過(guò)粘膜，皮膚，腸胃，關(guān)節(jié)內(nèi)，心室內(nèi)，直腸，陰道，顱骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。

本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預(yù)防效果即可，可以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來(lái)恰當(dāng)?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的劑量可以使用例如對(duì)疾病的治療效果或者預(yù)防效果作為指標(biāo)來(lái)確定。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷結(jié)腸腺癌”包括判斷受試者是否已經(jīng)患有結(jié)腸腺癌、判斷受試者是否存在患有結(jié)腸腺癌的風(fēng)險(xiǎn)、判斷結(jié)腸腺癌患者是否已經(jīng)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、判斷結(jié)腸腺癌患者對(duì)藥物治療的反應(yīng)性、或者判斷結(jié)腸腺癌患者的預(yù)后情況。

本文所用的“治療”涵蓋患有相關(guān)疾病或病癥的哺乳動(dòng)物例如人類中治療相關(guān)的疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：

(1)預(yù)防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動(dòng)物中發(fā)生，尤其是當(dāng)該哺乳動(dòng)物易感于所述疾病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時(shí)；

(2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生；或者

(3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。

術(shù)語(yǔ)“治療”通常涉及治療人類或動(dòng)物(例如，被獸醫(yī)所應(yīng)用)，其中可達(dá)到某些預(yù)期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止)、改善病癥和治愈病癥。還包括作為預(yù)防措施(例如預(yù)防)的治療。對(duì)還沒(méi)有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危險(xiǎn)的患者的用途，也包括在術(shù)語(yǔ)“治療”中。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷結(jié)腸腺癌的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可以在結(jié)腸腺癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。

本發(fā)明的包括procr基因或蛋白的激活劑的治療藥物可用作新的結(jié)腸腺癌的治療藥物。

附圖說(shuō)明

圖1顯示利用qpcr檢測(cè)procr基因在結(jié)腸腺癌組織與正常組織中的差異表達(dá)；

圖2顯示利用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)procr基因在結(jié)腸腺癌組織與正常組織中的差異表達(dá)；

圖3顯示利用westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)procr基因的過(guò)表達(dá)效率；

圖4顯示利用mtt法檢測(cè)procr基因表達(dá)對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞增殖的影響；

圖5顯示利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)procr基因表達(dá)對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞凋亡的影響。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1篩選差異表達(dá)基因

1、實(shí)驗(yàn)材料

選擇醫(yī)院行手術(shù)治療且病史資料完整的10例結(jié)腸癌患者的病灶切除組織標(biāo)本，己經(jīng)經(jīng)病理科診斷為結(jié)腸腺癌，男5例、女5例；根據(jù)按美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(ajcc，2009)制定的結(jié)腸直腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)：i-ii期6例，iii-iv期4例。組織學(xué)分級(jí):高分化3例，中分化4例，低分化3例。術(shù)前均末行放療、化療及生物劑治療。正常對(duì)照組織為正常的遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜組織10例，均來(lái)自健康腸鏡體檢者。

2、rna提取、cdna合成

按照trizol說(shuō)明書(shū)操作抽提組織細(xì)胞總rna，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將mrna反轉(zhuǎn)錄為cdna。

3、生物素標(biāo)記crna雜交

以cdna為模板,應(yīng)用messageamptmii-biotinarnaamplificationkit(ambion公司)體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記crna，純化后按affymetrix公司的真核生物表達(dá)譜單輪芯片擴(kuò)增程序加入5×片段化緩沖液得到大小分布在35～200nt的片段化crna；靶標(biāo)制備完成后,應(yīng)用真核生物hybridizationcontrolkit(affymetrix公司)配制雜交液,注入雜交液的芯片平衡放置于雜交爐中,45℃,60r/min旋轉(zhuǎn)雜交16h(hybridizationoven640,affymetrix公司)，然后在affymetrix公司提供的洗滌工作站中(fluidicsstation450，affymetrix公司)完成芯片的清洗染色；

4、掃描和分析

應(yīng)用scanner3000(affymetrix公司)掃描儀掃描圖像。掃描圖像首先用operatingsoftwareversion1.4(gcos1.4,affymetrix公司)軟件進(jìn)行圖像到信號(hào)值的轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)換成原始數(shù)據(jù)文件。然后使用軟件dchip2006中的invariantsetnormalization方法和model-baseexpressionindex模型對(duì)gcos輸出結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。根據(jù)在各芯片中檢測(cè)到的p值，當(dāng)數(shù)據(jù)集的檢測(cè)值call值(absolutecall,abscall)為不存在a(absent)或者臨界值m(marginal)時(shí),被視為不表達(dá),只有abscall值為存在p(present)的數(shù)據(jù)集才被用于進(jìn)一步的分析。

5、組織差異表達(dá)基因的篩選

差異表達(dá)基因的篩選利用significantanalysisofmicroarraysoftware(sam)算法進(jìn)行。

6、結(jié)果

芯片共篩選出485個(gè)差異表達(dá)基因。與正常組織相比，結(jié)腸腺癌組織中表達(dá)上調(diào)的基因?yàn)?89個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因?yàn)?96個(gè)。

實(shí)施例2差異表達(dá)基因在大樣本中的驗(yàn)證

1、研究對(duì)象

選擇醫(yī)院行手術(shù)治療且病史資料完整的50例結(jié)腸癌患者的病灶切除組織標(biāo)本，己經(jīng)經(jīng)病理科診斷為結(jié)腸腺癌，男20例、女30例；根據(jù)按美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(ajcc，2009)制定的結(jié)腸直腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)：i-ii期15例，iii-iv期35例。組織學(xué)分級(jí)：高分化17例，中分化15例，低分化18例。術(shù)前均末行放療、化療及生物劑治療。正常對(duì)照組織為正常的遠(yuǎn)端結(jié)腸黏膜組織40例，均來(lái)自健康腸鏡體檢者。

2、rna提取和cdna合成

按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行rna提取和cdna合成。

3、qpcr

引物是由引物設(shè)計(jì)軟件primer5.0設(shè)計(jì)，大連寶生物公司與上海英駿公司合成。procr基因及內(nèi)參基因所用引物序列如下：

procr基因引物序列

5’-cgcactcggtatgaactg-3’(seqidno.1)，

5’-ttgtttggctccctttcg-3’(seqidno.2)；

gapdh基因引物序列

5’-aaggtcggagtcaacggatttg-3’(seqidno.3)，

5’-ccatgggtggaatcatattggaa-3’(seqidno.4)。

采用cdna2.0μl進(jìn)行qpcr反應(yīng)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min，(95℃10s，60℃60s)*42個(gè)循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標(biāo)記物，在lightcycler熒光實(shí)時(shí)定量pcr儀上進(jìn)行pcr反應(yīng)，δδct法進(jìn)行相對(duì)定量。

4、westernblot檢測(cè)

提取細(xì)胞總蛋白。采用bca蛋白濃度試劑盒對(duì)提取的總蛋白進(jìn)行定量。每個(gè)樣本取50μg總蛋白，12％sds-page電泳1.5h后，轉(zhuǎn)膜。5％脫脂奶粉封閉，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育2h。電化學(xué)法發(fā)光ecl發(fā)光液顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光顯色；

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將procr蛋白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、結(jié)果

(1)qpcr結(jié)果

如圖1所示，與正常組織相比，結(jié)腸腺癌組織中procr基因mrna水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

(2)westernblot結(jié)果

如圖2所示，與正常組織相比，結(jié)腸腺癌組織中procr蛋白水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

實(shí)施例3procr基因的表達(dá)對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

1、procr基因重組質(zhì)粒構(gòu)建

(1)擴(kuò)增procr基因的編碼序列；

(2)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物；

(3)將擴(kuò)增后的procr基因連接到表達(dá)載體pcdna3.0中，構(gòu)建pcdna3.0-procr重組表達(dá)載體。

1.2結(jié)腸腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

ht-29細(xì)胞于含10％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)參數(shù)：37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％co2飽和濕度。采用脂質(zhì)體lipofectamine2000為轉(zhuǎn)染試劑。實(shí)驗(yàn)分2組：陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0)；實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0-procr)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ht-29細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。24h后細(xì)胞培養(yǎng)板覆蓋率約為70％-80％。轉(zhuǎn)染方式參照l(shuí)ipofectamine2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pcdna3.0-procr的過(guò)表達(dá)效率

步驟同實(shí)施例2。

1.4結(jié)果

如圖3所示，與陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0)相比，實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0-procr)細(xì)胞中procr蛋白表達(dá)量顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

2、mtt實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖活性

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1*10⁴/ml，接種于96孔板中，每孔100μl，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％co2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于24、48、72h后進(jìn)行mtt檢測(cè)：每孔加mtt溶液10μl(5％)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％co2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)3h后，小心去除上清，每孔加150μl的dmso，水平搖床上放置30min。酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)490nm下的a值。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0)細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0-procr)細(xì)胞增殖緩慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，procr基因表達(dá)抑制了結(jié)腸腺癌細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例4procr基因的表達(dá)對(duì)結(jié)腸腺癌細(xì)胞凋亡的影響

1、步驟：收集轉(zhuǎn)染24h后的各組細(xì)胞，冰磷酸鹽緩沖液洗滌2次，1xbindingbuffer調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁴/ml，加入5μl的annexinv稀釋液混勻后，再加入2.5μl的碘化丙啶，混勻。冰盒上避光靜置10min，加入1xbindingbuffer400μl，上機(jī)檢測(cè)凋亡比例。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，與陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0)細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcdna3.0-procr)細(xì)胞凋亡率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，procr基因表達(dá)促進(jìn)了結(jié)腸腺癌細(xì)胞的凋亡。

上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>結(jié)腸腺癌診治標(biāo)志物

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