本發(fā)明屬于植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及一種提高小麥幼胚基因槍瞬時轉(zhuǎn)化效率的方法。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)亲詈笠粋€轉(zhuǎn)化成功的重要禾谷類糧食作物，一方面由于小麥屬于六倍體作物，遺傳背景復(fù)雜，基因組相對較大(約17gb)，是玉米的7倍，水稻的40倍；另一方面，小麥遺傳轉(zhuǎn)化過程中dna導(dǎo)入頻率低且轉(zhuǎn)化后再生能力不高，有較強的基因型依賴性。自1992年成功獲得第一例轉(zhuǎn)基因小麥以來，人們嘗試?yán)枚喾N轉(zhuǎn)化方法和多種外植體轉(zhuǎn)化小麥，轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌、基因槍、花粉管通道、超聲波法、離子束注入法、激光微束穿刺法和peg法等，外植體包括幼胚、成熟胚、花藥愈傷組織和幼穗等，在降低轉(zhuǎn)化的基因型依賴性、提高轉(zhuǎn)化效率等方面取得了一定的進展，但普遍存在的問題是轉(zhuǎn)化效率仍然很低，難以實現(xiàn)規(guī)?；?。

本發(fā)明對提高小麥幼胚基因槍的瞬時轉(zhuǎn)化方法的效率進行了探索，并建立了高效的小麥幼胚瞬時轉(zhuǎn)化體系，為后續(xù)小麥功能基因組學(xué)的研究和小麥分子育種，具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為提高小麥幼胚的基因槍瞬時轉(zhuǎn)化效率，進行了一系列的實驗摸索，提供了一種提高小麥瞬時轉(zhuǎn)化效率的培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基配方。

本發(fā)明提供的提高小麥基因槍瞬時轉(zhuǎn)化效率的方法，包括以下步驟:

a)幼胚取材；

b)將幼胚進行預(yù)培養(yǎng)處理；

c)高滲處理，將預(yù)培養(yǎng)后的幼胚在22℃黑暗條件下，在高滲培育基上培養(yǎng)4-6小時；和

d)基因槍轟擊。

本發(fā)明所述的提高小麥幼胚基因槍瞬時轉(zhuǎn)化效率的方法，其中所述的幼胚通過以下方法獲得并進行無菌化處理，剪取大田或生長室中生長健壯、病蟲害少的開花10—14天的小麥幼穗，剝?nèi)∮姿敕N子，用體積百分含量為75％的乙醇溶液消毒1min；無菌水沖洗3次；再用1％的硝酸銀溶液滅菌15-20min；無菌水沖洗3次。在超凈工作臺中用解剖刀切除胚芽后剝?nèi)〈笮?.8-2.0mm半透明的未成熟胚(即小麥幼胚)。

剝?nèi)〉奈闯墒炫?，預(yù)培養(yǎng)6-8天后，盾片朝上接種于按下述方法制備的高滲培養(yǎng)基上，依次排列放置在60×15mm的培養(yǎng)皿中央直徑為2.0—3.0cm的圓形區(qū)域內(nèi)，parafilm封口，22℃黑暗條件下高滲培養(yǎng)4-6小時。基因槍法轉(zhuǎn)化是利用物理方法將外源dna導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。基因槍轟擊前對受體材料進行高滲處理能夠降低轟擊過程對受體細(xì)胞的損傷。

本實施例中所用到的高滲培養(yǎng)基配方包含cacl22.99mm，kno318.79mm，nh4no320.61mm，kh2po41.25mm，mgso41.50mm，mnso41mm，znso430μm，h3bo3100μm，ki5μm，namoo41μm，cuso40.1μm，cocl60.1μm，feso4100μm，na2-edta100μm，煙酸8μm，肌醇0.56mm，鹽酸硫胺素30μm，鹽酸吡哆醇4.9μm，甘氨酸0.027mm，谷氨酰胺0.2mm，水解酪蛋白200mg/l，蔗糖30g/l，0.2～0.4m甘露醇，0.2m～0.4山梨醇。該配方可加入植物凝膠進行凝固，當(dāng)選用的植物凝膠為4g/l的phytagel時，培育基的ph調(diào)至5.8。在121℃，20min滅菌后加入dicamba2mg/l。

在進行基因槍轟擊前，金粉的處理步驟如下：

①稱取30mg金粉，將其放入1.5ml離心管中，加入1ml70％乙醇，vortex3-5min；

②靜置15min；

③離心約5s，棄上清；

④加入1ml無菌水，vortex1min，靜置1min，離心，棄上清；

⑤再用無菌水洗2次；

⑥加入500μl無菌水重懸，終濃度為60μg/μl。

微彈的制備的步驟如下：

①可以對之前處理好的金粉先進行渦旋或超聲處理，使其能均勻懸浮，濃度均一；

②吸取12.5-50μl金粉加入1.5ml離心管中，在渦旋混合器上震蕩混勻；

③加入5μldna(1μg/μl)，震蕩混勻；

④將50μl2.5mcacl2和20μl0.1m亞精胺先在另一離心管中混勻后加入到上述離心管中，震蕩混勻(2-3min)；

⑤離心3-5s，棄上清；

⑥加入140μl70％乙醇，離心3-5s，棄上清；

⑦加入140μl無水乙醇，離心3-5s，棄上清；

⑧加入48μl無水乙醇重懸，可進行6次轟擊，每次6μl。

本發(fā)明所提供的基因槍瞬時轉(zhuǎn)化方法，可以使用市面上的各種基因槍進行轟擊。在本發(fā)明的一種實施方式中，使用bio-red公司生產(chǎn)的pds1000/he基因槍，轟擊壓力1100psi，轟擊距離6cm，真空度26-28inhg，每皿材料轟擊一次。

將經(jīng)基因槍轟擊后的小麥幼胚繼續(xù)在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16-18小時，再將其移轉(zhuǎn)至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，盾片朝上，90×15mm每皿25粒，于24℃黑暗培養(yǎng)。

本發(fā)明所轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒中帶有熒光蛋白基因mcherry表達框作為選擇標(biāo)記，將暗培養(yǎng)24小時的幼胚愈傷放在熒光體視鏡下，觀察熒光，以有mcherry表達的愈傷占總愈傷數(shù)的比例作為質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)化效率。

實驗結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的高滲培育基，甘露醇的濃度從0.2～0.4m,山梨醇的濃度從0.2～0.4m，可以將小麥幼胚的瞬時轉(zhuǎn)化效率提高至53.5％～65.4％。其中，高滲培養(yǎng)基中終濃度為0.3m的甘露醇+0.3m的山梨醇處理的受體材料，瞬時轉(zhuǎn)化效率最高，為65.4％。說明在該濃度下，小麥幼胚的瞬時轉(zhuǎn)化效率最高。

具體實施方式

實施例1、幼胚取材

剪取大田或生長室中生長健壯、病蟲害少的開花10—14天的小麥幼穗，剝?nèi)∮姿敕N子，用體積百分含量為75％的乙醇溶液消毒1min；無菌水沖洗3次；再用1％的硝酸銀溶液滅菌15-20min；無菌水沖洗3次。在超凈工作臺中用解剖刀切除胚芽后剝?nèi)〈笮?.8-2.0mm半透明的未成熟胚(即小麥幼胚)。

實施例2、幼胚的瞬時轉(zhuǎn)化

取實施例1剝?nèi)〉奈闯墒炫?，預(yù)培養(yǎng)6-8天后，盾片朝上接種于按下述方法制備的高滲培養(yǎng)基上，依次排列放置在60×15mm的培養(yǎng)皿中央直徑為2.0—3.0cm的圓形區(qū)域內(nèi)，parafilm封口，22℃黑暗條件下高滲培養(yǎng)4-6小時?；驑尫ㄞD(zhuǎn)化是利用物理方法將外源dna導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法?；驑屴Z擊前對受體材料進行高滲處理能夠降低轟擊過程對受體細(xì)胞的損傷。

本實施例中所用到的高滲培養(yǎng)基配方及制備方法是：cacl22.99mm，kno318.79mm，nh4no320.61mm，kh2po41.25mm，mgso41.50mm，mnso41mm，znso430μm，h3bo3100μm，ki5μm，namoo41μm，cuso40.1μm，cocl60.1μm，feso4100μm，na2-edta100μm，煙酸8μm，肌醇0.56mm，鹽酸硫胺素30μm，鹽酸吡哆醇4.9μm，甘氨酸0.027mm，谷氨酰胺0.2mm，水解酪蛋白200mg/l，蔗糖30g/l，0.2～0.4m甘露醇，0.2m～0.4山梨醇，ph5.8，phytagel4g/l，121℃，20min，滅菌后加入dicamba2mg/l。

按以下步驟進行基因槍的轟擊準(zhǔn)備。

(1)金粉的處理

①稱取30mg金粉，將其放入1.5ml離心管中，加入1ml70％乙醇，vortex3-5min；

②靜置15min；

③離心約5s，棄上清；

④加入1ml無菌水，vortex1min，靜置1min，離心，棄上清；

⑤再用無菌水洗2次；

⑥加入500μl無菌水重懸，終濃度為60μg/μl。

(2)微彈的制備

①可以對之前處理好的金粉先進行渦旋或超聲處理，使其能均勻懸浮，濃度均一；

②吸取12.5-50μl金粉加入1.5ml離心管中，在渦旋混合器上震蕩混勻；

③加入5μldna(1μg/μl)，震蕩混勻；

④將50μl2.5mcacl2和20μl0.1m亞精胺先在另一離心管中混勻后加入到上述離心管中，震蕩混勻(2-3min)；

⑤離心3-5s，棄上清；

⑥加入140μl70％乙醇，離心3-5s，棄上清；

⑦加入140μl無水乙醇，離心3-5s，棄上清；

⑧加入48μl無水乙醇重懸，可進行6次轟擊，每次6μl。

(3)基因槍轟擊

使用bio-red公司生產(chǎn)的pds1000/he基因槍，轟擊壓力1100psi，轟擊距離6cm，真空度26-28inhg，每皿材料轟擊一次。

(4)愈傷組織的誘導(dǎo)

經(jīng)基因槍轟擊后的小麥幼胚繼續(xù)在高滲培養(yǎng)基上培養(yǎng)16-18小時，再將其移轉(zhuǎn)至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，盾片朝上，90×15mm每皿25粒，于24℃黑暗培養(yǎng)。

(5)瞬時轉(zhuǎn)化效率的統(tǒng)計

所轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒中帶有熒光蛋白基因mcherry表達框，將暗培養(yǎng)24小時的幼胚愈傷放在熒光體視鏡下，觀察熒光，以有mcherry表達的愈傷占總愈傷數(shù)的比例作為質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)化效率。

實施例3、瞬時轉(zhuǎn)化效率的檢測

由于不同受體材料適用的高滲培養(yǎng)基濃度和高滲處理時間有所不同，發(fā)明人將受體材料在上述培養(yǎng)基中不同濃度的甘露醇和山梨醇配比中質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)化效率進行了比較，高滲處理時間采用4-6小時，其中msv4培養(yǎng)基的配方是：cacl22.99mm，kno318.79mm，nh4no320.61mm，kh2po41.25mm，mgso41.50mm，mnso41mm，znso430μm，h3bo3100μm，ki5μm，namoo41μm，cuso40.1μm，cocl60.1μm，feso4100μm，na2-edta100μm，煙酸8μm，肌醇0.56mm，鹽酸硫胺素30μm，鹽酸吡哆醇4.9μm，甘氨酸0.027mm，谷氨酰胺0.2mm，水解酪蛋白200mg/l，蔗糖30g/l。結(jié)果如下表1所示，經(jīng)0.3m甘露醇+0.3m山梨醇處理的受體材料，瞬時轉(zhuǎn)化效率最高，為65.4％。說明在該濃度下，小麥幼胚的瞬時轉(zhuǎn)化效率最高。

表1.不同高滲培養(yǎng)基處理后轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)化效率