本發(fā)明屬于發(fā)酵產(chǎn)物的提取，特別是指一種從定優(yōu)膠發(fā)酵液中提取定優(yōu)膠的方法。

背景技術(shù)：

定優(yōu)膠是繼黃原膠、結(jié)冷膠、溫輪膠后的一種新型微生物多糖，是由微生物發(fā)酵生成的水溶性生物聚合物，具有優(yōu)良的增稠性、假塑性、耐高溫、耐高鹽及較寬范圍的ph適應(yīng)性等優(yōu)良特性，可廣泛用于石油、建材等行業(yè)，應(yīng)用前景廣闊。

現(xiàn)有利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)定優(yōu)膠的工藝包括發(fā)酵和后提取兩部分。申請(qǐng)人在專(zhuān)利號(hào)為201410541800.4的發(fā)明專(zhuān)利中公開(kāi)了一種鞘氨醇單胞菌以及利用其制取定優(yōu)膠發(fā)酵液的方法，其主要技術(shù)構(gòu)思是生產(chǎn)菌種選用鞘氨醇單胞菌(sphingomonassp.)，將菌種接種于含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水的無(wú)菌培養(yǎng)基中進(jìn)行需氧發(fā)酵制取含有定優(yōu)膠的發(fā)酵液，然后將含有定優(yōu)膠的發(fā)酵液進(jìn)行后提取，提取步驟通常借鑒黃原膠的后提取工藝，其主要技術(shù)路線(xiàn)包括：一是將定優(yōu)膠發(fā)酵液與乙醇進(jìn)行混合，使定優(yōu)膠在混合液中形成絮狀物料，二是采用板框過(guò)濾的方法進(jìn)行固液分離，固體物料再經(jīng)干燥機(jī)干燥、粉碎機(jī)粉碎制得定優(yōu)膠成品。

就申請(qǐng)人了解的范圍而言，定優(yōu)膠目前在國(guó)外的主要生產(chǎn)廠(chǎng)家有美國(guó)的kelco公司，國(guó)內(nèi)尚無(wú)可進(jìn)行規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)的廠(chǎng)家，定優(yōu)膠作為增稠劑在性能上要求產(chǎn)品的粘度越高越好，但定優(yōu)膠在發(fā)酵生產(chǎn)中由于發(fā)酵液黏度大，殘存在提取后的產(chǎn)品中的微生物菌體、以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如蛋白等不易去除的原因，導(dǎo)致成品定優(yōu)膠純度難于進(jìn)一步提高，上述因素直接影響定優(yōu)膠產(chǎn)品黏度。美國(guó)的產(chǎn)品質(zhì)量1％kcl黏度一般在2000-3000cp，純度不超過(guò)95％。申請(qǐng)人未在國(guó)內(nèi)專(zhuān)利文獻(xiàn)中檢索到有關(guān)改進(jìn)定優(yōu)膠后提取工藝以提高產(chǎn)品黏度及純度的文獻(xiàn)報(bào)道。

因目前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)定優(yōu)膠的性能指標(biāo)進(jìn)行限定，而定優(yōu)膠和黃原膠屬于性能相近的微生物多糖，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員一般借鑒《食品添加劑黃原膠》(gb1886.41-2015)的黏度評(píng)價(jià)方法對(duì)定優(yōu)膠成品黏度性能進(jìn)行檢測(cè)。而由于《食品添加劑黃原膠》(gb1886.41-2015)未見(jiàn)對(duì)其純度有規(guī)范的檢測(cè)方法，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員一般借鑒《食品添加劑結(jié)冷膠》(gb25535-2010)中結(jié)冷膠含量的檢測(cè)方法對(duì)定優(yōu)膠的純度進(jìn)行檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供從定優(yōu)膠發(fā)酵液中提取定優(yōu)膠的方法，所制備的定優(yōu)膠具有純度及黏度高等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是：

一種從定優(yōu)膠發(fā)酵液中提取定優(yōu)膠的方法,是將發(fā)酵液離心、萃取后從中提取定優(yōu)膠；包括如下工藝步驟：

a、發(fā)酵液預(yù)處理

a1、將含有定優(yōu)膠的發(fā)酵液在ph＝6-8時(shí)加入酶活為10萬(wàn)u/g的溶菌酶，溶菌酶在發(fā)酵液中的濃度為100-200ppm，攪拌均勻后維持反應(yīng)3-5小時(shí)；

a2、將步驟a1中反應(yīng)后的發(fā)酵液升溫至130℃-140℃維持5-8分鐘再降至60-70℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在發(fā)酵液中的濃度為200-400ppm，在ph＝3-4、溫度為50℃-60℃條件下，反應(yīng)2-4小時(shí)制成預(yù)處理后的發(fā)酵液；

b、一次萃?。喊凑疹A(yù)處理后的發(fā)酵液：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5-0.6的比例將二者混配后攪拌30-40分鐘，調(diào)混合液的ph＝8.0-9.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

c、一次離心：將步驟b中的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

d、二次萃取：按照步驟c中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.3-0.5的比例將二者混配后攪拌30-35分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

e、二次離心：將步驟d中制成的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

f、三次洗脫：按照步驟e中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.4-0.6的比例將二者混配后攪拌30-35分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀，將混合液固液分離得到纖維狀定優(yōu)膠。

本發(fā)明的具體技術(shù)構(gòu)思還有：

為便于定優(yōu)膠的儲(chǔ)存及穩(wěn)定性，保證產(chǎn)品的品質(zhì)，所述的步驟f后還包括一步驟g，是將步驟f中制成的纖維狀定優(yōu)膠在70℃-90℃條件下干燥。

為便于定優(yōu)膠的分裝運(yùn)輸，同時(shí)滿(mǎn)足其在應(yīng)用中能夠快速分散于水中，所述的步驟g后還包括一步驟h,是將步驟g中得到的干燥物粉碎，粉碎溫度不超過(guò)65℃，目數(shù)80-100目。

可以顯而易見(jiàn)的是，固液分離可以采用多種現(xiàn)有工藝進(jìn)行，其中包括但不局限于板框過(guò)濾、離心等，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的連續(xù)性，同時(shí)提高工作效率，優(yōu)選的技術(shù)實(shí)現(xiàn)方式是，所述的步驟c、e、f中的固液分離采用離心方法,離心在轉(zhuǎn)速為3000-5000轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行。

申請(qǐng)人對(duì)利用本發(fā)明的方法得到的產(chǎn)品(定優(yōu)膠)進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：

一、1％kcl黏度的檢測(cè)

1、儀器和設(shè)備：brookfield旋轉(zhuǎn)或其他同性能黏度計(jì)

2、測(cè)定條件：轉(zhuǎn)子型號(hào)為3號(hào)轉(zhuǎn)子

轉(zhuǎn)子速度為60rpm

測(cè)定溫度為24-25℃

3、分析步驟

(1)用潔凈、干燥的稱(chēng)量紙分別稱(chēng)取3g定優(yōu)膠樣品和氯化鉀(精確至0.01g)，混合均勻；量取300ml蒸餾水倒入400ml燒杯中；將該盛水的燒杯置于攪拌器下，開(kāi)啟攪拌器，將混合好的試樣慢慢向攪拌葉與杯壁之間的水中加入，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，800r/min連續(xù)攪拌2h，溫度保持24-25℃；停止攪拌，取出杯子，用攪拌棒或其他類(lèi)似物上下翻動(dòng)溶液幾下；取適量的含有1％試樣和1％氯化鉀的溶液，置于100ml高型燒杯中在規(guī)定條件下測(cè)定。

檢測(cè)結(jié)果為：采用本發(fā)明的后提取方法制備的定優(yōu)膠的黏度(1％的kcl黏度)為4000-5000cp。

二、純度的檢測(cè)

1、試劑和材料

a)硅藻土：色譜純

b)無(wú)水乙醇

c)乙醇溶液：78+22

2、儀器和設(shè)備

a)玻璃過(guò)濾器

b)干燥器(180mm)

3、分析步驟

稱(chēng)取1.0g色譜純的硅藻土，置于一個(gè)玻璃過(guò)濾器中，均勻鋪平，105℃下干燥5h，在干燥器內(nèi)冷卻后準(zhǔn)確稱(chēng)量。稱(chēng)取約0.2g干燥后(105℃,2.5h)的定優(yōu)膠試樣(精確到0.001g)，加50ml水，在約80℃水浴鍋中攪拌溶解30min，加入200ml預(yù)先加熱至60-70℃的無(wú)水乙醇，混合均勻，靜置12h，用上述裝有硅藻土的玻璃過(guò)濾器過(guò)濾，然后用乙醇溶液洗滌濾渣5次，前3次每次洗滌用量20ml，后2次每次洗滌用量10ml。在105℃下將濾渣干燥5h，在干燥器內(nèi)冷卻后準(zhǔn)確稱(chēng)量。

4、結(jié)果計(jì)算

定優(yōu)膠的含量x1按公式(a.1)計(jì)算：

x1＝m1/m0×100％……………(a.1)

式中：

x1―定優(yōu)膠的含量，％；

m1―殘?jiān)馁|(zhì)量，單位為克(g)；

m0―試樣的質(zhì)量：?jiǎn)挝粸榭?g)；

檢測(cè)結(jié)果為：采用本發(fā)明的后提取方法制備的定優(yōu)膠純度不低于98％。

本發(fā)明所取得的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步在于：

1、本發(fā)明通過(guò)酶解的方式去除產(chǎn)品中殘存的微生物菌體及蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因酶解反應(yīng)速度快、條件溫和、效果好且成本低，因此后提取工藝周期短、易于控制且生產(chǎn)成本低。

2、利用在充分研究發(fā)酵液中雜質(zhì)成分的基礎(chǔ)上，科學(xué)采用溶菌酶水解細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，將菌體水解；利用蛋白酶能有效的將發(fā)酵液中殘存的蛋白等水解成小分子可溶物，采用乙醇萃取時(shí)將水解后的產(chǎn)物隨著萃取劑帶出，從而使萃取后的定優(yōu)膠物料含菌體和殘存的雜質(zhì)少，有效提高了產(chǎn)品的純度及黏度等技術(shù)指標(biāo)，所制備的產(chǎn)品的純度及黏度指標(biāo)明顯優(yōu)于國(guó)外產(chǎn)品，從而進(jìn)一步提高了產(chǎn)品的品質(zhì)性能及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更為有利于其作為增稠劑的工業(yè)化應(yīng)用。

3、在對(duì)發(fā)酵液中的菌體、蛋白采用充分酶解預(yù)處理的基礎(chǔ)上，通過(guò)采用兩次萃取、三次洗脫的工藝步驟，將酶解后的可溶雜質(zhì)溶于乙醇溶液并隨著固液分離時(shí)去除，有效提高了定優(yōu)膠的純度及黏度。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說(shuō)明書(shū)做出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

一種從定優(yōu)膠發(fā)酵液中提取定優(yōu)膠的方法,是將發(fā)酵液離心、萃取后從中提取定優(yōu)膠；包括如下工藝步驟：

a、發(fā)酵液預(yù)處理

a1、將含有定優(yōu)膠的發(fā)酵液在ph＝6-8時(shí)加入酶活為10萬(wàn)u/g的溶菌酶，溶菌酶在發(fā)酵液中的濃度為100ppm，攪拌均勻后維持反應(yīng)5小時(shí)；

a2、將步驟a1中反應(yīng)后的發(fā)酵液升溫至130℃維持8分鐘再降至60℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在發(fā)酵液中的濃度為200ppm，在ph＝3-4、溫度為50℃條件下，反應(yīng)4小時(shí)制成預(yù)處理后的發(fā)酵液；

b、一次萃?。喊凑疹A(yù)處理后的發(fā)酵液：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5的比例將二者混配后攪拌30分鐘，調(diào)混合液的ph＝8.0-9.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

c、一次離心：將步驟b中的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

d、二次萃?。喊凑詹襟Ec中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.3的比例將二者混配后攪拌30分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

e、二次離心：將步驟d中制成的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

f、三次洗脫：按照步驟e中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.4的比例將二者混配后攪拌30分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀，將混合液固液分離得到纖維狀定優(yōu)膠。

g、將步驟f中制成的纖維狀定優(yōu)膠在70℃-90℃條件下干燥。

h、是將步驟g中得到的干燥物粉碎，粉碎溫度不超過(guò)65℃，目數(shù)80-100目。

所述的步驟c、e、f中的固液分離采用離心方法,離心在轉(zhuǎn)速為3000-5000轉(zhuǎn)/分的條件下進(jìn)行。

因定優(yōu)膠的發(fā)酵以及發(fā)酵液的獲得申請(qǐng)人在專(zhuān)利號(hào)為201410541800.4的專(zhuān)利文獻(xiàn)中已有詳細(xì)的記載，在此申請(qǐng)人對(duì)其不再贅述。

實(shí)施例2

本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于:

一種從定優(yōu)膠發(fā)酵液中提取定優(yōu)膠的方法,是將發(fā)酵液離心、萃取后從中提取定優(yōu)膠；包括如下工藝步驟：

a、發(fā)酵液預(yù)處理

a1、將含有定優(yōu)膠的發(fā)酵液在ph＝6-8時(shí)加入酶活為10萬(wàn)u/g的溶菌酶，溶菌酶在發(fā)酵液中的濃度為200ppm，攪拌均勻后維持反應(yīng)3小時(shí)；

a2、將步驟a1中反應(yīng)后的發(fā)酵液升溫至140℃維持5分鐘再降至70℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在發(fā)酵液中的濃度為400ppm，在ph＝3-4、溫度為60℃條件下，反應(yīng)2小時(shí)制成預(yù)處理后的發(fā)酵液；

b、一次萃?。喊凑疹A(yù)處理后的發(fā)酵液：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.6的比例將二者混配后攪拌40分鐘，調(diào)混合液的ph＝8.0-9.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

c、一次離心：將步驟b中的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

d、二次萃?。喊凑詹襟Ec中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5的比例將二者混配后攪拌35分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

e、二次離心：將步驟d中制成的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

f、三次洗脫：按照步驟e中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.6的比例將二者混配后攪拌35分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀，將混合液固液分離得到纖維狀定優(yōu)膠。

其余條件同實(shí)施例1。

實(shí)施例3

本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于:

一種從定優(yōu)膠發(fā)酵液中提取定優(yōu)膠的方法,是將發(fā)酵液離心、萃取后從中提取定優(yōu)膠；包括如下工藝步驟：

a、發(fā)酵液預(yù)處理

a1、將含有定優(yōu)膠的發(fā)酵液在ph＝6-8時(shí)加入酶活為10萬(wàn)u/g的溶菌酶，溶菌酶在發(fā)酵液中的濃度為150ppm，攪拌均勻后維持反應(yīng)4小時(shí)；

a2、將步驟a1中反應(yīng)后的發(fā)酵液升溫至135℃維持7分鐘再降至65℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在發(fā)酵液中的濃度為300ppm，在ph＝3-4、溫度為55℃條件下，反應(yīng)3小時(shí)制成預(yù)處理后的發(fā)酵液；

b、一次萃取：按照預(yù)處理后的發(fā)酵液：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.55的比例將二者混配后攪拌35分鐘，調(diào)混合液的ph＝8.0-9.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

c、一次離心：將步驟b中的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

d、二次萃?。喊凑詹襟Ec中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.4的比例將二者混配后攪拌32分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

e、二次離心：將步驟d中制成的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

f、三次洗脫：按照步驟e中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5的比例將二者混配后攪拌32分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀，將混合液固液分離得到纖維狀定優(yōu)膠。

其余條件同實(shí)施例1。

實(shí)施例4

本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于:

一種從定優(yōu)膠發(fā)酵液中提取定優(yōu)膠的方法,是將發(fā)酵液離心、萃取后從中提取定優(yōu)膠；包括如下工藝步驟：

a、發(fā)酵液預(yù)處理

a1、將含有定優(yōu)膠的發(fā)酵液在ph＝6-8時(shí)加入酶活為10萬(wàn)u/g的溶菌酶，溶菌酶在發(fā)酵液中的濃度為130ppm，攪拌均勻后維持反應(yīng)4.5小時(shí)；

a2、將步驟a1中反應(yīng)后的發(fā)酵液升溫至133℃維持6分鐘再降至62℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在發(fā)酵液中的濃度為250ppm，在ph＝3-4、溫度為52℃條件下，反應(yīng)3.5小時(shí)制成預(yù)處理后的發(fā)酵液；

b、一次萃?。喊凑疹A(yù)處理后的發(fā)酵液：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5的比例將二者混配后攪拌38分鐘，調(diào)混合液的ph＝8.0-9.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

c、一次離心：將步驟b中的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

d、二次萃?。喊凑詹襟Ec中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.35的比例將二者混配后攪拌33分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

e、二次離心：將步驟d中制成的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

f、三次洗脫：按照步驟e中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.45的比例將二者混配后攪拌33分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀，將混合液固液分離得到纖維狀定優(yōu)膠。

其余條件同實(shí)施例1。

實(shí)施例5

本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于:

一種從定優(yōu)膠發(fā)酵液中提取定優(yōu)膠的方法,是將發(fā)酵液離心、萃取后從中提取定優(yōu)膠；包括如下工藝步驟：

a、發(fā)酵液預(yù)處理

a1、將含有定優(yōu)膠的發(fā)酵液在ph＝6-8時(shí)加入酶活為10萬(wàn)u/g的溶菌酶，溶菌酶在發(fā)酵液中的濃度為180ppm，攪拌均勻后維持反應(yīng)3.5小時(shí)；

a2、將步驟a1中反應(yīng)后的發(fā)酵液升溫至138℃維持6分鐘再降至68℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在發(fā)酵液中的濃度為350ppm，在ph＝3-4、溫度為58℃條件下，反應(yīng)2.5小時(shí)制成預(yù)處理后的發(fā)酵液；

b、一次萃?。喊凑疹A(yù)處理后的發(fā)酵液：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.58的比例將二者混配后攪拌32分鐘，調(diào)混合液的ph＝8.0-9.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

c、一次離心：將步驟b中的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

d、二次萃?。喊凑詹襟Ec中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.45的比例將二者混配后攪拌34分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀；

e、二次離心：將步驟d中制成的混合液固液分離，得到纖維狀定優(yōu)膠；

f、三次洗脫：按照步驟e中制成的纖維狀定優(yōu)膠：體積百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.55的比例將二者混配后攪拌32分鐘，調(diào)混合液的ph值為6.0-6.5，使定優(yōu)膠呈絮狀沉淀，將混合液固液分離得到纖維狀定優(yōu)膠。

其余條件同實(shí)施例1。

申請(qǐng)人采用本發(fā)明中公開(kāi)的的檢測(cè)方法對(duì)利用實(shí)施例1-5中的方法所制備的定優(yōu)膠、先有后提取工藝制備的定優(yōu)膠以及國(guó)外定優(yōu)膠產(chǎn)品(購(gòu)自kelco公司)的黏度及純度進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如表一。

表一

從檢測(cè)結(jié)果可以看出，采用本發(fā)明的方法所制備的定優(yōu)膠產(chǎn)品純度及1％kcl黏度性能指標(biāo)明顯優(yōu)于現(xiàn)有后提取工藝所制備的產(chǎn)品及國(guó)外產(chǎn)品。