本發(fā)明涉及生物分子檢測裝置和測序方法，特別是涉及一種基于光誘導介電泳技術和納米孔的dna測序裝置和測序方法。

背景技術：

dna測序技術是現代生命科學研究的研究熱點技術之一。在所有以低成本、高通量、直接測序為目標的第三代測序技術中，基于納米孔的單分子測序技術被認為是最有發(fā)展?jié)摿拖Ｍ麑崿F上述目標的。然而基于納米孔的dna基因序列檢測發(fā)展到現在一直受到膜片鉗放大器掃描頻率的限制，現有的采樣頻率還遠遠不能達到精確測序的要求。因此研究者們采用了一系列方法來降低dna過孔的速度，有降低體系溫度和外加電壓，增加溶液粘度來降低dna的過孔速度，但這些方法只能很有限的降低dna的過孔速度，距離實現dna基因測序的目標甚遠；有提出采用聚合酶對dna的聚合作用來控制dna的遷移速度，雖然這樣可以降低dna的過孔速度，但聚合酶要求的測量條件非?？量?，不利于高效低成本的dna測序檢測；所有基于納米孔的測序方法目前還沒有有效的控制dna通過納米孔速度的方法，由于dna過孔速度太快，造成了單個堿基檢測識別率不高的問題。

因此研究開發(fā)一種可有效降低dna過孔速度的dna測序裝置極具意義，可大大推動高通量低成本基因測序技術在生物醫(yī)療檢測中的發(fā)展。

技術實現要素：

發(fā)明目的：為解決現有技術的不足，提供一種能夠控制dna過孔速度的基于光誘導介電泳技術和納米孔的dna測序裝置和測序方法。

技術方案：一種基于光誘導介電泳技術和納米孔的dna測序裝置，包括：

介電泳裝置；

納米孔單分子傳感器，該傳感器位于所述介電泳裝置的內部，將介電泳裝置分為左右兩個空腔，且該傳感器設有將所述左右兩個空腔連通的通孔；

隧穿電流信號檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)與所述納米孔單分子傳感器電連接；

離子電流信號檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)的兩端分別置于所述通孔左右兩側的空腔內；

激光系統(tǒng)，該系統(tǒng)位于介電泳裝置的外部，其發(fā)射的激光束照射于所述介電泳裝置上。

其中，所述介電泳裝置包括兩片導電玻璃，阿爾法氫化硅層以及交流信號發(fā)生器；所述兩片導電玻璃之間有一定的孔隙，其中，導電玻璃的導電層位于內側；所述阿爾法氫化硅層位于下片導電玻璃的導電層上；所述交流信號發(fā)生器的兩端分別連接至上、下兩片導電玻璃的導電層上。

納米孔單分子傳感器，該傳感器包括基底以及貼合在基底一側上的納米薄膜；其中，基底的上端與上片導電玻璃的導電層連接，下端與阿爾法氫化硅連接，將所述介電泳裝置分為左右兩個空腔，基底上設有一通孔，將所述兩個空腔連通；所述納米薄膜含有一納米孔，且該納米孔與所述基底上的通孔連通。

所述隧穿電流信號檢測系統(tǒng)包括兩個電極ⅱ、電源ⅱ以及微弱電流測量裝置ⅱ；所述兩個電極ⅱ分別設置于納米薄膜的納米孔上下兩側，上側電極ⅱ通過介電泳裝置外部的微弱電流測量裝置ⅱ與介電泳裝置外部的電源ⅱ的一端相連，電源ⅱ的另一端與下側電極ⅱ相連。

所述離子電流信號檢測系統(tǒng)包括兩個電極ⅰ、電源ⅰ以及微弱電流測量裝置??；所述兩個電極ⅰ分別設置于所述納米孔左右兩側的空腔內，右側電極ⅰ通過介電泳裝置外部的微弱電流測量裝置ⅰ與介電泳裝置外部的電源ⅰ的負極相連，電源ⅰ的正極與左側電極ⅰ相連。

所述激光系統(tǒng)設于所述介電泳裝置下層導電玻璃的下方，包括激光發(fā)射器和光學傳輸器件，所述激光發(fā)射器發(fā)射的激光束照射位于納米薄膜一側納米孔附近的阿爾法氫化硅。

進一步的，所述電極ⅰ為ag或agcl電極，所述電極ⅱ為pt或au電極。所述電源ⅰ的偏置電壓為0.05～2v，電源ⅱ的偏置電壓為0.05～10v。所述微弱電流測量裝置ⅰ和微弱電流測量裝置ⅱ均為皮安級電流表。所述含有納米孔的納米薄膜上的納米孔的直徑為1.5～10nm。

一種基于光誘導介電泳技術和納米孔的dna測序裝置的測序方法，包括以下步驟：

(1)搭建好所述介電泳裝置、納米孔單分子傳感器、隧穿電流信號檢測系統(tǒng)、離子電流信號檢測系統(tǒng)和激光系統(tǒng)，構成檢測平臺。

(2)配置適量濃度為0.1～2mol/l、ph值為6.0～8.0的氯化鈉溶液，分成兩份，其中一份加入適量待檢測dna，使得溶液中dna濃度為1～100μmol/l；在含有納米孔的納米薄膜的左右兩側分別加入氯化鈉溶液和含有待檢測dna的氯化鈉溶液。

(3)兩片導電玻璃的導電層分別連接至交流信號發(fā)生器的兩端，給交流信號發(fā)生器施加峰峰幅值為0～20v，頻率為0.1～10mhz的交流正弦信號；電源ⅰ的偏置電壓為0.05～2v，電源ⅱ的偏置電壓為0.05～10v。

(4)調節(jié)激光系統(tǒng)發(fā)射合適強度的激光束，并通過光學傳輸器件使得激光束照射在納米孔附近的阿爾法氫化硅區(qū)域，通過調節(jié)激光束照射區(qū)域來調節(jié)最終作用在dna上的介電泳力來實現對dna過孔速度的控制。

(5)通過離子電流信號檢測系統(tǒng)和隧穿電流信號檢測系統(tǒng)檢測dna穿過納米孔時的電流變化信號，并進行對比分析，找出四種堿基與信號之間的對應關系，完成測序。

有益效果：與現有技術相比，本發(fā)明將光誘導介電泳技術與基于電流信號檢測的納米孔單分子傳感器相結合應用于dna測序技術中，可通過相關參數調節(jié)dna所受的介電泳作用力大小來有效控制dna過孔速度，減慢了dna過孔速度，提高了測序精度，這些為實現單堿基分辨率、直接納米孔測序奠定了基礎，為實現新一代dna測序技術低成本、高通量和直接測序提供技術支撐。

附圖說明

圖1是本發(fā)明測序裝置的示意圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。

圖1所示的一種基于光誘導介電泳技術和納米孔的dna測序裝置，包括介電泳裝置、納米孔單分子傳感器、隧穿電流信號檢測系統(tǒng)、離子電流信號檢測系統(tǒng)以及激光系統(tǒng)。

介電泳裝置包括上下兩片導電玻璃1、阿爾法氫化硅2以及交流信號發(fā)生器3；上下兩片導電玻璃的導電層101朝里，上下兩片導電玻璃之間形成一個空腔；在下層導電玻璃的導電層上沉積有阿爾法氫化硅(ɑ-sih)，兩片導電玻璃的導電層均連接至交流信號發(fā)生器，交流信號發(fā)生器可產生峰峰幅值為0～20v，頻率為0.1～10mhz的交流正弦信號。

納米孔單分子傳感器包括基底4和納米薄膜5；基底設于介電泳裝置的空腔內，上端與上層導電玻璃的導電層連接，下端與阿爾法氫化硅連接，基底將介電泳裝置的空腔分為左右兩個空腔；基底上設有通孔401，該通孔將左右兩個空腔連通；納米薄膜含有納米孔501，納米薄膜貼合在基底的一側，且納米孔與基底上的通孔連通，納米孔直徑為1.5～10nm。

隧穿電流信號檢測系統(tǒng)包括兩個納米pt或au電極6、電源ⅱ7以及微弱電流測量裝置ⅱ8；其中一個電極設于納米薄膜的納米孔上側，另一個電極設于納米薄膜的納米孔下側；上側電極通過微弱電流測量裝置ⅱ與電源ⅱ的一端相連，電源ⅱ的另一端與下側電極相連；其中，電源ⅱ和微弱電流測量裝置ⅱ設于介電泳裝置外部，電源ⅱ的偏置電壓為0.05～10v，微弱電流測量裝置ⅱ為皮安級電流表。

離子電流信號檢測系統(tǒng)包括兩個ag或agcl電極9、電源ⅰ10以及微弱電流測量裝置ⅰ11；其中一個電極設于納米孔右側的空腔內，另一個電極設于納米孔左側的空腔內；右側電極通過微弱電流測量裝置ⅰ與電源ⅰ的負極相連，電源ⅰ的正極與左側電極相連；其中，電源ⅰ和微弱電流測量裝置ⅰ設于介電泳裝置外部，電源ⅰ的偏置電壓為0.05～2v，微弱電流測量裝置ⅰ為皮安級電流表。

激光系統(tǒng)包括激光發(fā)射器和光學傳輸器件；激光發(fā)射器用來產生激光束12，并通過光學傳輸器件使得激光束照射在納米孔附近的阿爾法氫化硅區(qū)域。

一種基于光誘導介電泳技術和納米孔的dna測序裝置的測序方法，包括以下步驟：

(1)按照圖1所示布局搭建好介電泳裝置、納米孔單分子傳感器、隧穿電流信號檢測系統(tǒng)、離子電流信號檢測系統(tǒng)和激光系統(tǒng)，構成檢測平臺。

(2)配置適量濃度為0.1～2mol/l、ph值為6.0～8.0的氯化鈉溶液，分為兩份；然后其中一份加入適量待檢測dna13，使得溶液中dna濃度為1～100μmol/l；在納米孔左右兩側分別加入氯化鈉溶液和含有待檢測dna的氯化鈉溶液。

(3)兩片導電玻璃的導電層連接至交流信號發(fā)生器，交流信號發(fā)生器產生峰峰幅值為0～20v，頻率為0.1～10mhz的交流正弦信號；電源ⅰ的偏置電壓為0.05～2v，置于納米薄膜所在的右側ag或agcl電極連接電源ⅰ負極，置于另一側的ag或agcl電極連接電源ⅰ正極；電源ⅱ的偏置電壓為0.05～10v。

(4)調節(jié)激光系統(tǒng)的激光發(fā)射器發(fā)射合適強度的激光束，并通過光學傳輸器件使得激光束照射在納米孔附近的阿爾法氫化硅區(qū)域，如圖1所示。可調節(jié)激光束照射區(qū)域來調節(jié)最終作用在dna上的介電泳力來實現對dna過孔速度的控制。

(5)通過離子電流信號檢測系統(tǒng)和隧穿電流信號檢測系統(tǒng)檢測dna穿過納米孔時的電流變化信號，并進行對比分析，找出四種堿基與信號之間的對應關系，完成測序。

本發(fā)明的工作原理如下：

含單鏈dna分子13的電解液位于測序反應腔右部，dna分子在溶液中帶負電，在靜電場的驅動作用下，單鏈dna分子成線狀通過納米孔到達測序反應腔左部。用激光束照射在納米孔右側附近的阿爾法氫化硅區(qū)域，利用阿爾法氫化硅的明暗電導差異產生非均勻電場，從而對單鏈dna分子產生介電泳力，減慢單鏈dna分子穿過納米孔的過孔速度?？赏ㄟ^調節(jié)交流信號發(fā)生器產生的交流信號的頻率和幅值、改變激光強弱及照射位置來調節(jié)介電泳力大小，從而控制dna分子穿過納米孔的過孔速度大小。在單鏈dna分子穿過納米孔時，對通過納米孔的電解液離子電流造成堵塞，導致離子電流急劇變化，由于單鏈dna分子中不同堿基結構不同，在穿越納米孔時造成的電流變化也不同；采用微弱電流測量裝置ⅰ對單鏈dna分子穿越納米孔過程中離子電流發(fā)生阻塞的時間間隔δt1、阻塞離子電流的大小ib1進行定量檢測；同時單鏈dna分子通過納米孔時，不同堿基也會相應的在納米孔處產生不同的隧穿電流，采用微弱電流測量裝置ⅱ對單鏈dna分子穿越納米孔過程中隧穿電流發(fā)生改變的時間間隔δt2、隧穿電流的大小ib2進行定量檢測，其中dna分子中堿基之間的間隔是一定的，所以時間間隔δt1＝δt2；通過對所測得的數據進行解析計算得dna分子序列sequence＝f(δt1,ib1,ib2)，即可得到所測dna分子的序列。