本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種dna剪接反應(yīng)的優(yōu)化方法。

背景技術(shù)：

dna剪接(dnasplicing)反應(yīng)是將兩條乃至更多的dna片段通過酶促反應(yīng)融合拼接成一整條較長的dna，廣泛應(yīng)用于合成生物學(xué)、基因工程和蛋白質(zhì)工程等領(lǐng)域，可以連接不同的基因，進(jìn)而表達(dá)具有復(fù)合功能的融合蛋白。作為dna剪接技術(shù)的一種，重疊延伸pcr技術(shù)(overlapextension-pcr，簡稱oe-pcr)由于采用具有互補(bǔ)末端的引物，使pcr產(chǎn)物間形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。此技術(shù)經(jīng)過兩步pcr就能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術(shù)很快獲得其它依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物。重疊延伸pcr在基因的定點突變、融合基因的構(gòu)建、長片段基因的合成、基因敲除等方面有廣泛而獨特的應(yīng)用。

不過，重疊延伸pcr技術(shù)也并非完美無缺，首先設(shè)計引物時具有一定的局限性，考慮到pcr產(chǎn)物末端的重疊互補(bǔ)，兩對引物中間需要共享一段至少10bp的序列。另外，兩步反應(yīng)的產(chǎn)物回收和再次混合進(jìn)行延伸及放大的過程需要精確控制，否則容易產(chǎn)生差錯影響效率。顯然，提升兩步法dna剪接反應(yīng)的效率是有必要的，而優(yōu)化這類dna剪接反應(yīng)的技術(shù)創(chuàng)新也在不斷努力中。

經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，申請?zhí)枮?00410099186.7的中國專利公開了一種“核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的優(yōu)化方法”，該方法通過向pcr體系中添加單質(zhì)金材料，包括金箔、金粉、金絲、膠體金等來實現(xiàn)對pcr擴(kuò)增的優(yōu)化。申請?zhí)枮?00810041931.0的中國專利公開了一種基于樹枝狀聚合物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)優(yōu)化方法，該專利也是針對pcr體系添加基于乙二胺核的聚酰胺-胺型樹枝狀聚合物，能夠提高擴(kuò)增效率，有效抑制非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)。然而，上述專利技術(shù)都是針對常規(guī)pcr擴(kuò)增反應(yīng)的，并不一定適用于dna剪接反應(yīng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種步驟簡單，成本低廉，易于保存，優(yōu)化材料易于從體系中分離的dna剪接反應(yīng)的優(yōu)化方法。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

一種dna剪接反應(yīng)的優(yōu)化方法，該方法通過向dna剪接反應(yīng)體系中添加單質(zhì)金材料，在單個反應(yīng)體系中同時完成多個dna片段的剪接反應(yīng)，具體包括以下步驟：

步驟(1)：制備單質(zhì)金材料；

步驟(2)：通過干熱空氣滅菌、飽和蒸汽滅菌、紫外線照射或放射線輻照對步驟(1)制得的單質(zhì)金材料進(jìn)行滅菌處理；

步驟(3)：將步驟(2)經(jīng)滅菌處理的單質(zhì)金材料加入到dna剪接反應(yīng)體系中進(jìn)行剪接反應(yīng)，制得dna產(chǎn)物；

步驟(4)：取步驟(3)制得的dna產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測目標(biāo)條帶，并與對照樣品進(jìn)行比較，后經(jīng)分離，即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。

步驟(1)所述的單質(zhì)金材料包括金箔、金片、金絲、金粉、金膜或膠體金溶液中的一種。

所述的單質(zhì)金材料為金箔或金片時，制備方法為：將金箔或金片剪成小于2mm×2mm的小片，而后浸入酸溶液中，浸洗5-10min，再依次用水、無水乙醇或丙酮漂凈，干燥后備用。

所述的單質(zhì)金材料為金絲時，制備方法為：將金絲剪成長度為2-8mm的小段，而后浸入酸溶液中，浸洗5-10min，再依次用水、無水乙醇或丙酮漂凈，干燥后備用。

所述的單質(zhì)金材料為金粉時，制備方法為：將金粉依次用水、無水乙醇或丙酮清洗，后經(jīng)離心，保留固體沉淀物，干燥后備用。

所述的單質(zhì)金材料為金膜時，制備方法為：采用片狀、層狀或不規(guī)則顆粒狀的基體材料，通過電鍍法、化學(xué)鍍法、真空蒸鍍法或離子濺射法在基體材料表面進(jìn)行鍍金，形成表面金膜，再將表面金膜浸入酸溶液中，浸洗5-10min，再依次用水、無水乙醇或丙酮漂凈，干燥后備用。

在金膜的制備過程中，對表面金膜的厚度沒有特別限制，以覆蓋基體材料為準(zhǔn)。

所述的膠體金溶液為無菌狀態(tài)下制備得到的膠體金溶液，該膠體金溶液中的金粒子粒徑為10-20nm。

步驟(3)所述的dna剪接反應(yīng)體系的總體積為25μl，包含：rtaq聚合酶2-3u，datp、dctp、dgtp及dttp底物各200nm，各待剪接dna片段的拷貝數(shù)為10⁷～10⁹，引物濃度為100nm。

所述的單質(zhì)金材料為金箔、金片、金絲或金膜時，金箔、金片、金絲或金膜的表面積≥4mm²；所述的單質(zhì)金材料為金粉時，金粉的質(zhì)量≥2mg；所述的單質(zhì)金材料為膠體金溶液時，膠體金溶液的加入體積為0.5-2.5μl，膠體金溶液在dna剪接反應(yīng)體系中的終濃度為0.4-1.0nm。

步驟(3)所述的剪接反應(yīng)的條件為：于95℃預(yù)熱2分鐘，然后進(jìn)行30-45個循環(huán)，最后于72℃延伸5分鐘即可；其中，每個循環(huán)包括：于95℃變性30秒，退火20秒，于72℃延伸1分鐘/kb產(chǎn)物長度。

步驟(4)所述的瓊脂糖凝膠電泳過程中，瓊脂糖的質(zhì)量百分濃度為0.8-1.5％，電泳緩沖液由0.045mtris-硼酸、0.001medta混合而成，電壓場強(qiáng)為1-5v/cm。

本發(fā)明中，所述的膠體金溶液的制備過程中，可通過白磷還原法、檸檬酸鈉還原法或檸檬酸鈉-鞣酸還原法等制備膠體金，也可采用市售膠體金試劑，如美國sigma公司出售的膠體金溶液(貨號為g1527)。在實際操作過程中，由于膠體金溶液是在無菌狀態(tài)下制備得到，所以無需再滅菌，使用前不需要進(jìn)行稀釋。

如果需要回收連接得到的目標(biāo)產(chǎn)物，則可以方便地從反應(yīng)結(jié)束體系中分離出所添加的優(yōu)化材料。對金片、金絲、金膜可直接吸取溶液即可達(dá)到分離目的，對金粉體系做低速離心，取上清即可達(dá)到分離目的。對膠體金體系做-20℃速凍待膠體金變性沉降后離心，吸取上清即可達(dá)到分離目的。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點：

1)單質(zhì)金可以長期保存，性質(zhì)穩(wěn)定，不易失活，使用壽命長，具有優(yōu)化效果顯著，操作簡便，成本低廉，易于保存，應(yīng)用廣泛，優(yōu)化材料易于從體系中分離的優(yōu)點；

2)可以準(zhǔn)確地在單個反應(yīng)體系中同時完成多個dna片段的剪接反應(yīng)，有效提高諸如基因剪接、定點突變等高難度實驗的效率，廣泛應(yīng)用于基因工程、蛋白質(zhì)工程等生物技術(shù)領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為膠體金溶液對含有2條dna片段剪接反應(yīng)的優(yōu)化效果圖；

圖2為金粉對含有2條dna片段剪接反應(yīng)的優(yōu)化效果圖；

圖3為膠體金溶液對含有4條dna片段剪接反應(yīng)的優(yōu)化效果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實施例1：

本實施例為膠體金溶液對含有2條dna片段剪接反應(yīng)的優(yōu)化。

針對兩條dna片段剪接反應(yīng)的優(yōu)化，包括下列步驟：

1、剪接反應(yīng)體系總體積為25μl，其中包含：rtaq聚合酶2.5u，dntp(datp，dctp，dgtp，dttp)底物200nm，兩條dna片段(長度分別為1.5k和2k)的拷貝數(shù)均為10⁹，引物濃度為100nm。

2、向以上體系中添加直徑為10nm的膠體金溶液至終濃度為0.38nm。同時做不加優(yōu)化材料的對照實驗。

3、剪接反應(yīng)過程為：95℃預(yù)熱2分鐘；25～45個循環(huán)，每個循環(huán)包括：95℃變性30秒，退火20秒，72℃延伸3.5分鐘；最后72℃延伸5分鐘。

4、取5μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

兩段dna剪接反應(yīng)后后的結(jié)果如圖1顯示：

中間是分子量標(biāo)記m(從上到下分別是4500bp,3000bp,2250bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。左側(cè)四條泳道為未添加膠體金的對照。右側(cè)四條泳道為添加了膠體金的反應(yīng)產(chǎn)物。泳道上方對應(yīng)的數(shù)字為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)?？梢钥闯黾尤雰?yōu)化材料膠體金的反應(yīng)體系中目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量明顯提高，且非特異性產(chǎn)物即雜質(zhì)很少。而未添加優(yōu)化材料膠體金的反應(yīng)體系中目標(biāo)產(chǎn)物量相對較少，且在500～750bp之間的范圍內(nèi)有一明顯雜帶。

實施例2：

本實施例為金粉對含有2條dna片段剪接反應(yīng)的優(yōu)化。

針對兩條dna片段剪接反應(yīng)的優(yōu)化，包括下列步驟：

1、剪接反應(yīng)體系總體積為25μl，其中包含：rtaq聚合酶2.5u，dntp(datp，dctp，dgtp，dttp)底物200nm，兩條dna片段(長度分別為1.5k和2k)的拷貝數(shù)均為10⁷，引物濃度為100nm。

2、向以上體系中添加處理過的優(yōu)化材料金粉，粒徑為200目，加入總量為1.5mg。同時做不加優(yōu)化材料的對照實驗。

3、剪接反應(yīng)過程為：95℃預(yù)熱2分鐘；30～45個循環(huán)，每個循環(huán)包括：95℃變性30秒，退火20秒，72℃延伸3.5分鐘；最后72℃延伸5分鐘。

4、取5μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

兩段dna剪接反應(yīng)后的結(jié)果如圖2顯示：

中間是分子量標(biāo)記m(從上到下分別是4500bp,3000bp,2250bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。左側(cè)四條泳道為未添加金粉的對照。右側(cè)四條泳道為添加了金粉的反應(yīng)產(chǎn)物。泳道上方對應(yīng)的數(shù)字為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。可以看出加入優(yōu)化材料金粉的反應(yīng)體系中目標(biāo)產(chǎn)物在40與45個循環(huán)時與未添加優(yōu)化材料金粉的反應(yīng)體系相比產(chǎn)量明顯提高。

實施例3：

本實施例為膠體金溶液對含有4條dna片段剪接反應(yīng)的優(yōu)化

針對4條dna片段剪接反應(yīng)的優(yōu)化，包括下列步驟：

1、剪接反應(yīng)體系總體積為25μl，其中包含：rtaq聚合酶3u，dntp(datp，dctp，dgtp，dttp)底物200nm，4條dna片段長度均為500bp，拷貝數(shù)均為10⁹，引物濃度為100nm。

2、向以上體系中添加直徑為10nm的膠體金溶液至終濃度為0.646nm。同時做不加優(yōu)化材料的對照實驗。

3、剪接反應(yīng)過程為：95℃預(yù)熱2分鐘；30～45個循環(huán)，每個循環(huán)包括：95℃變性30秒，退火20秒，72℃延伸2分鐘；最后72℃延伸5分鐘。

4、取5μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

四段dna剪接反應(yīng)后后的結(jié)果如圖3顯示：

中間是分子量標(biāo)記m(從上到下分別是4500bp,3000bp,2250bp,1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp)。左側(cè)三條泳道為未添加膠體金的對照。右側(cè)三條泳道為添加了膠體金的反應(yīng)產(chǎn)物。泳道上方對應(yīng)的數(shù)字為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)?？梢钥闯黾尤雰?yōu)化材料膠體金的反應(yīng)體系中目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量在45個循環(huán)時顯著提高，幾乎沒有非特異性產(chǎn)物。而未添加優(yōu)化材料膠體金的反應(yīng)體系在35或40個循環(huán)時目標(biāo)產(chǎn)物幾乎沒有，當(dāng)循環(huán)數(shù)增至45時僅有很少的目標(biāo)產(chǎn)物出現(xiàn)。

實施例4：

本實施例dna剪接反應(yīng)的優(yōu)化方法是通過向dna剪接反應(yīng)體系中添加單質(zhì)金材料，在單個反應(yīng)體系中同時完成多個dna片段的剪接反應(yīng)，具體包括以下步驟：

步驟(1)：制備單質(zhì)金材料；

步驟(2)：通過紫外線照射對步驟(1)制得的單質(zhì)金材料進(jìn)行滅菌處理；

步驟(3)：將步驟(2)經(jīng)滅菌處理的單質(zhì)金材料加入到dna剪接反應(yīng)體系中進(jìn)行剪接反應(yīng)，制得dna產(chǎn)物；

步驟(4)：取步驟(3)制得的dna產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測目標(biāo)條帶，并與對照樣品進(jìn)行比較，后經(jīng)分離，即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。

步驟(1)中，單質(zhì)金材料為金絲，其制備方法為：將金絲剪成長度為2-8mm的小段，而后浸入酸溶液中，浸洗5-10min，再依次用水、無水乙醇或丙酮漂凈，干燥后備用。

步驟(3)中，dna剪接反應(yīng)體系的總體積為25μl，包含：rtaq聚合酶2u，datp、dctp、dgtp及dttp底物各200nm，各待剪接dna片段的拷貝數(shù)為10⁸，引物濃度為100nm。浸入25μldna剪接反應(yīng)體系中的金絲的表面積為10mm²。

步驟(3)中，剪接反應(yīng)的條件為：于95℃預(yù)熱2分鐘，然后進(jìn)行30個循環(huán)，最后于72℃延伸5分鐘即可；其中，每個循環(huán)包括：于95℃變性30秒，退火20秒，于72℃延伸1分鐘/kb產(chǎn)物長度。

步驟(4)所述的瓊脂糖凝膠電泳過程中，瓊脂糖的質(zhì)量百分濃度為0.8％，電泳緩沖液由0.045mtris-硼酸、0.001medta混合而成，電壓場強(qiáng)為1v/cm。

實施例5：

本實施例dna剪接反應(yīng)的優(yōu)化方法是通過向dna剪接反應(yīng)體系中添加單質(zhì)金材料，在單個反應(yīng)體系中同時完成多個dna片段的剪接反應(yīng)，具體包括以下步驟：

步驟(1)：制備單質(zhì)金材料；

步驟(2)：通過放射線輻照對步驟(1)制得的單質(zhì)金材料進(jìn)行滅菌處理；

步驟(3)：將步驟(2)經(jīng)滅菌處理的單質(zhì)金材料加入到dna剪接反應(yīng)體系中進(jìn)行剪接反應(yīng)，制得dna產(chǎn)物；

步驟(4)：取步驟(3)制得的dna產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測目標(biāo)條帶，并與對照樣品進(jìn)行比較，后經(jīng)分離，即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。

步驟(1)中，單質(zhì)金材料為金膜，其制備方法為：采用片狀、層狀或不規(guī)則顆粒狀的基體材料，通過電鍍法在基體材料表面進(jìn)行鍍金，形成表面金膜，再將表面金膜浸入酸溶液中，浸洗5-10min，再依次用水、無水乙醇或丙酮漂凈，干燥后備用。

步驟(3)中，dna剪接反應(yīng)體系的總體積為25μl，包含：rtaq聚合酶2.4u，datp、dctp、dgtp及dttp底物各200nm，各待剪接dna片段的拷貝數(shù)為10⁷，引物濃度為100nm。浸入25μldna剪接反應(yīng)體系中的金膜的表面積為40mm²。

步驟(3)中，剪接反應(yīng)的條件為：于95℃預(yù)熱2分鐘，然后進(jìn)行35個循環(huán)，最后于72℃延伸5分鐘即可；其中，每個循環(huán)包括：于95℃變性30秒，退火20秒，于72℃延伸1分鐘/kb產(chǎn)物長度。

步驟(4)所述的瓊脂糖凝膠電泳過程中，瓊脂糖的質(zhì)量百分濃度為1.5％，電泳緩沖液由0.045mtris-硼酸、0.001medta混合而成，電壓場強(qiáng)為5v/cm。

實施例6：

本實施例dna剪接反應(yīng)的優(yōu)化方法是通過向dna剪接反應(yīng)體系中添加單質(zhì)金材料，在單個反應(yīng)體系中同時完成多個dna片段的剪接反應(yīng)，具體包括以下步驟：

步驟(1)：制備單質(zhì)金材料；

步驟(2)：通過干法對步驟(1)制得的單質(zhì)金材料進(jìn)行滅菌處理；

步驟(3)：將步驟(2)經(jīng)滅菌處理的單質(zhì)金材料加入到dna剪接反應(yīng)體系中進(jìn)行剪接反應(yīng)，制得dna產(chǎn)物；

步驟(4)：取步驟(3)制得的dna產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測目標(biāo)條帶，并與對照樣品進(jìn)行比較，后經(jīng)分離，即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。

步驟(1)中，單質(zhì)金材料為金箔，其制備方法為：將金箔剪成小于2mm×2mm的小片，而后浸入酸溶液中，浸洗5-10min，再依次用水、無水乙醇或丙酮漂凈，干燥后備用。

步驟(3)中，dna剪接反應(yīng)體系的總體積為25μl，包含：rtaq聚合酶2.7u，datp、dctp、dgtp及dttp底物各200nm，各待剪接dna片段的拷貝數(shù)為10⁹，引物濃度為100nm。浸入25μldna剪接反應(yīng)體系中的金膜的表面積為80mm²。

步驟(3)中，剪接反應(yīng)的條件為：于95℃預(yù)熱2分鐘，然后進(jìn)行40個循環(huán)，最后于72℃延伸5分鐘即可；其中，每個循環(huán)包括：于95℃變性30秒，退火20秒，于72℃延伸1分鐘/kb產(chǎn)物長度。

步驟(4)所述的瓊脂糖凝膠電泳過程中，瓊脂糖的質(zhì)量百分濃度為1.0％，電泳緩沖液由0.045mtris-硼酸、0.001medta混合而成，電壓場強(qiáng)為3v/cm。

實施例7：

本實施例dna剪接反應(yīng)的優(yōu)化方法具體包括以下步驟：

步驟(1)：制備單質(zhì)金材料；

步驟(2)：通過濕法對步驟(1)制得的單質(zhì)金材料進(jìn)行滅菌處理；

步驟(3)：將步驟(2)經(jīng)滅菌處理的單質(zhì)金材料加入到dna剪接反應(yīng)體系中進(jìn)行剪接反應(yīng)，制得dna產(chǎn)物；

步驟(4)：取步驟(3)制得的dna產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測目標(biāo)條帶，并與對照樣品進(jìn)行比較，后經(jīng)分離，即可得到目標(biāo)產(chǎn)物。

步驟(1)中，單質(zhì)金材料為金片，其制備方法為：將金片剪成小于2mm×2mm的小片，而后浸入酸溶液中，浸洗5-10min，再依次用水、無水乙醇或丙酮漂凈，干燥后備用。

步驟(3)中，dna剪接反應(yīng)體系的總體積為25μl，包含：rtaq聚合酶2.1u，datp、dctp、dgtp及dttp底物各200nm，各待剪接dna片段的拷貝數(shù)為10⁷，引物濃度為100nm。浸入25μldna剪接反應(yīng)體系中的金膜的表面積為50mm²。

步驟(3)中，剪接反應(yīng)的條件為：于95℃預(yù)熱2分鐘，然后進(jìn)行32個循環(huán)，最后于72℃延伸5分鐘即可；其中，每個循環(huán)包括：于95℃變性30秒，退火20秒，于72℃延伸1分鐘/kb產(chǎn)物長度。

步驟(4)所述的瓊脂糖凝膠電泳過程中，瓊脂糖的質(zhì)量百分濃度為1.2％，電泳緩沖液由0.045mtris-硼酸、0.001medta混合而成，電壓場強(qiáng)為3v/cm。

上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。