本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中，slc26a4基因捕獲探針及其在slc26a4基因突變檢測中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大前庭水管綜合征是兒童、青少年中較為常見的一種耳聾性疾病，可表現(xiàn)為先天性或后天性感音神經(jīng)性聾。近年來的多項研究表明，大前庭水管綜合征與slc26a4基因的突變關(guān)系密切。slc26a4基因含21個外顯子，除21號外顯子外，其他外顯子長度約為55-231bp；開放閱讀框架2343bp，起始于2號外顯子；編碼780個氨基酸的蛋白質(zhì)pendrin。據(jù)不完全統(tǒng)計，在各種slc26a4基因相關(guān)疾病中已檢測到堿基替換、堿基缺失、移碼突變3種方式的30多個基因突變位點。目前，用于大前庭水管綜合征基因診斷的方法主要包括芯片法、熒光探針法、arms-pcr法和測序法。其中，熒光探針法和arms-pcr法雖然成本低、不需特殊設(shè)備，但其操作繁瑣、易造成實驗室污染；芯片法成本高、需要基因芯片檢測的相關(guān)設(shè)備又易造成實驗室污染；而測序法在能檢測slc26a4多種突變類型的同時，還能確定基因突變的精確點與片段大小。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測slc26a4基因全基因的突變。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了slc26a4基因捕獲探針。所用slc26a4基因的序列為人類參考基因組版本hg19(更新日期為2015年8月6日)的chr7:107301080-107358252。本發(fā)明提供的slc26a4基因捕獲探針按照捕獲探針的制備方法制備，所述捕獲探針的制備方法包括：制備n個亞探針，連接所述n個亞探針，得到slc26a4基因捕獲探針；n為大于等于2的一個自然數(shù)；所述n個亞探針滿足所述n個亞探針能覆蓋所述slc26a4基因的全部序列。上述slc26a4基因捕獲探針中，在所述slc26a4基因上任何兩個相鄰的亞探針均可滿足上游亞探針的下游有一個或多個核苷酸與下游亞探針的上游重疊。在所述slc26a4基因上任何兩個相鄰的亞探針具體均可滿足上游亞探針的下游有3個核苷酸與下游亞探針的上游重疊。上述slc26a4基因捕獲探針中，所述n個亞探針的長度均可為50-150bp。所述n個亞探針的長度具體均可為108bp。所述n個亞探針可為545個亞探針。上述slc26a4基因捕獲探針中，所述n個亞探針的序列均可滿足：第1條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第1-108位；第2條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第106-213位；第3條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第211-318位；……第n條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第【105(n-1)+1】-【105(n-1)+108】位；……第543條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第56911-57018位；第544條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第57016-57123位；第545條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第57065-57172位；其中，n為1-544中的任一個自然數(shù)。上述slc26a4基因捕獲探針中，所述連接所述n個亞探針可包括下述a1)和a2)：a1)連接所述n個亞探針，得到長鏈dna和/或環(huán)狀dna；a2)將所述長鏈dna和/或所述環(huán)狀dna進(jìn)行擴(kuò)增，得到所述slc26a4基因捕獲探針。所述制備方法在連接所述n個亞探針前還可包括對所述n個亞探針進(jìn)行磷酸化修飾。對所述n個亞探針進(jìn)行磷酸化修飾具體可為在所述n個亞探針的5′端進(jìn)行磷酸化修飾。所述磷酸化修飾可利用t4多聚核苷酸激酶或neb的t4多聚核苷酸激酶試劑盒進(jìn)行。利用neb的t4多聚核苷酸激酶試劑盒進(jìn)行所述磷酸化修飾的反應(yīng)體系可為：所述n個亞探針10μl、10×反應(yīng)緩沖液5μl、10mmatp5μl、t4多聚核苷酸激酶2.5μl和h2027.5μl。所述反應(yīng)體系中所述n個亞探針的濃度可為5ng/μl。所述反應(yīng)體系中10×反應(yīng)緩沖液、atp和t4多聚核苷酸激酶均為neb的t4多聚核苷酸激酶試劑盒中試劑。所述磷酸化修飾的反應(yīng)條件可為37℃30min。所述連接所述n個亞探針可利用ssdna連接酶或epicentre的ssdna連接試劑盒(circligasetmiissdnaligase，epicentre)進(jìn)行。所述連接的反應(yīng)體系可為：所述n個亞探針的磷酸化產(chǎn)物或所述n個亞探針20μl、circligaseii10×reactionbuffer5μl、50mmmncl22.5μl、5mbetaine10μl、circligaseiissdnaligase(100u)2.5μl和h2o10μl。所述連接的反應(yīng)條件可為60℃60min。步驟a2)中，在進(jìn)行將所述長鏈dna或所述環(huán)狀dna進(jìn)行擴(kuò)增時還可包括利用生物素對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。進(jìn)行所述擴(kuò)增可采用隨機(jī)引物進(jìn)行。所述隨機(jī)引物可為由a、c、g和t這四個核苷酸隨機(jī)組成的長度均為6bp的46條單鏈dna所形成的混合物。所述隨機(jī)引物中所有單鏈dna的摩爾數(shù)均可相同。將所述長鏈dna和/或所述環(huán)狀dna進(jìn)行擴(kuò)增以及利用生物素對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記可利用qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行。利用qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)體系可為：所述長鏈dna和/或所述環(huán)狀dna10μl、2×反應(yīng)緩沖液25μl、bio-16-dutp5μl、replig_enzyme1μl和h2o9μl。其中，2×反應(yīng)緩沖液中含有所述隨機(jī)引物。利用qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)溫度可為37℃。利用qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行反應(yīng)的時間可不小于16小時。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述n個亞探針。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了slc26a4基因突變檢測系統(tǒng)。本發(fā)明所提供的slc26a4基因突變檢測系統(tǒng)，包括所述slc26a4基因捕獲探針或所述n個亞探針。上述系統(tǒng)可由所述slc26a4基因捕獲探針或所述n個亞探針與檢測基因突變所需的儀器和/或試劑組成。所述檢測基因突變所需的試劑不包括所述slc26a4基因捕獲探針或所述n個亞探針。所述檢測基因突變所需的儀器和/或試劑可為構(gòu)建全基因組文庫所需的儀器和/或試劑，和/或，捕獲slc26a4基因所需的儀器和/或試劑，和/或，進(jìn)行測序所需的儀器和/或試劑。所述捕獲slc26a4基因所需的儀器和/或儀器可為myone磁珠和/或邁基諾基因科技股份有限公司的緩沖液hy、2x結(jié)合緩沖溶液、wb1緩沖液、wb3緩沖液和/或稀釋緩沖溶液。所述進(jìn)行測序所需的儀器和/或試劑可為利用二代測序所需的儀器和/或試劑。所述二代測序可為利用illumina測序平臺或其他測序平臺進(jìn)行的測序，如illuminahiseq2000、illuminahiseq2500、hiseq4000、nextseq500或xten。所述系統(tǒng)可為僅包括相關(guān)試劑的試劑或試劑盒。所述系統(tǒng)也可為含有所述slc26a4基因捕獲探針或所述n個亞探針的生物芯片。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述捕獲探針的制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了slc26a4基因突變檢測方法。本發(fā)明所提供的slc26a4基因突變檢測方法，包括利用所述slc26a4基因捕獲探針捕獲待測樣本的slc26a4基因，然后對捕獲的slc26a4基因進(jìn)行測序，根據(jù)所述待測樣本的測序結(jié)果確定所述待測樣本的slc26a4基因的突變。上述slc26a4基因突變檢測方法中，所述確定所述待測樣本的slc26a4基因的突變可將所述待測樣本的測序結(jié)果與對照樣本的slc26a4基因的檢測結(jié)果進(jìn)行比較確定；所述對照樣本的slc26a4基因未發(fā)生突變。所述對照樣本的slc26a4基因的檢測結(jié)果的檢測方法可包括：利用所述slc26a4基因捕獲探針捕獲對照樣本的slc26a4基因，然后對捕獲的slc26a4基因進(jìn)行測序，得到所述對照樣本的測序結(jié)果。上述slc26a4基因突變檢測方法中，所述對捕獲的slc26a4基因進(jìn)行測序可利用現(xiàn)有技術(shù)中的測序方法(如二代測序的方法，但不僅限于二代測序的方法)進(jìn)行，只要能達(dá)到對捕獲的slc26a4基因測序的目的即可。所述二代測序可為利用illumina測序平臺或其他測序平臺進(jìn)行的測序，如illuminahiseq2000、illuminahiseq2500、hiseq4000、nextseq500或xten。所述slc26a4基因突變檢測方法可為非診斷目的的slc26a4基因突變檢測方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：x1、所述slc26a4基因捕獲探針或所述n個亞探針在檢測slc26a4基因突變中的應(yīng)用；x2、所述slc26a4基因捕獲探針或所述n個亞探針在制備檢測slc26a4基因突變產(chǎn)品中的應(yīng)用；x3、所述slc26a4基因捕獲探針或所述n個亞探針在診斷或輔助診斷大前庭水管綜合征中的應(yīng)用；x4、所述slc26a4基因捕獲探針或所述n個亞探針在制備診斷或輔助診斷大前庭水管綜合征產(chǎn)品中的應(yīng)用；x5、所述系統(tǒng)在檢測slc26a4基因突變中的應(yīng)用；x6、所述系統(tǒng)在制備檢測slc26a4基因突變產(chǎn)品中的應(yīng)用；x7、所述系統(tǒng)在診斷或輔助診斷大前庭水管綜合征中的應(yīng)用；x8、所述系統(tǒng)在制備診斷或輔助診斷大前庭水管綜合征產(chǎn)品中的應(yīng)用；x9、所述slc26a4基因突變檢測方法在診斷或輔助診斷大前庭水管綜合征中的應(yīng)用?，F(xiàn)有的檢測技術(shù)只能確定slc26a4基因外顯子是否發(fā)生突變，而利用本發(fā)明的slc26a4基因捕獲探針及slc26a4基因突變檢測方法既能準(zhǔn)確判斷外顯子的突變情況，又能精確定位至斷裂點區(qū)域和片段大小。因此，利用本發(fā)明的slc26a4基因捕獲探針及slc26a4基因突變檢測方法能夠一步檢測slc26a4基因突變攜帶者的全部突變情況，并對相關(guān)斷裂點進(jìn)行準(zhǔn)確定位，避免假陰性、假陽性出現(xiàn)，有利于分析slc26a4基因遺傳變異機(jī)制。另外，本發(fā)明的slc26a4基因捕獲探針對slc26a4基因的捕獲均達(dá)到了95％以上覆蓋，在沒有缺失的情況下最高達(dá)到了98.06％；其捕獲效率均在42％以上，從至少覆蓋到4x、10x和20x的參數(shù)來看，平均覆蓋比例分別達(dá)到94％、90％和89％以上，覆蓋率根據(jù)缺失情況表現(xiàn)不同，探針的整體均一性非常好，具有很好的穩(wěn)定性。表明，本發(fā)明的dmd基因捕獲探針可以用于捕獲dmd基因及dmd基因突變位點的檢測。附圖說明圖1為臨床樣本slc26a4基因高通量測序圖譜。其中，標(biāo)注區(qū)域為突變區(qū)域。圖2為樣本g161027c01501的檢測結(jié)果。圖3為樣本g161027c02001的檢測結(jié)果。圖4為樣本g161027c03801的檢測結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。實施例1、slc26a4基因捕獲探針的制備1、單鏈亞探針的序列設(shè)計及制備所用slc26a4基因的序列為人類參考基因組版本hg19(更新日期為2015年8月6日)的chr7:107301080-107358252。根據(jù)slc26a4基因序列設(shè)計slc26a4基因捕獲單鏈亞探針的序列，每條單鏈亞探針的長度為108bp，各單鏈亞探針的序列如下：第1條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第1-108位(即chr7:107301080-107301187)；第2條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第106-213位；第3條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第211-318位；……第n條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第【105(n-1)+1】-【105(n-1)+108】位；……第543條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第56911-57018位；第544條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第57016-57123位；第545條單鏈亞探針的序列為slc26a4基因的第57065-57172位(即chr7:107358145-107358252)。其中，n為1-544中的任一個自然數(shù)。利用原位合成的方法，根據(jù)序列分別為上述各探針序列在芯片合成寡核苷酸探針，得到捕獲slc26a4基因的545條單鏈亞探針。利用35％的氨水，將固定在芯片上的545條單鏈亞探針洗脫下來，收集到離心管中，利用真空濃縮儀濃縮后，加入超純水溶解，成為一個slc26a4基因的545條單鏈亞探針的混池；調(diào)整探針濃度到50ng/μl。2、可以捕獲slc26a4基因全基因的slc26a4基因捕獲探針的制備1)單鏈亞探針的5′磷酸化修飾：利用neb的t4多聚核苷酸激酶試劑盒進(jìn)行。5′磷酸化修飾的反應(yīng)體系如下：組分體積(μl)545條單鏈亞探針的混池(50ng/μl)1010×反應(yīng)緩沖液(reactionbuffer)510mmatp5t4polynucleotidekinase(t4多聚核苷酸激酶)2.5h2027.5總反應(yīng)體積50μl，該反應(yīng)體系中，除545條單鏈亞探針的混池和h2o外的試劑均為t4多聚核苷酸激酶試劑盒中試劑?；旌暇鶆蚝螅銣丶訜崞骰騪cr儀器上37℃恒溫孵育30min。反應(yīng)結(jié)束后，利用微量pcr產(chǎn)物回收試劑盒按照其操作流程進(jìn)行產(chǎn)物純化回收，洗脫體積20μl，得到磷酸化產(chǎn)物；2)連接反應(yīng)：將步驟1)得到的磷酸化產(chǎn)物，利用商業(yè)的ssdna連接試劑盒(circligasetmiissdnaligase，epicentre)連接，連接反應(yīng)體系如下：組分體積(μl)步驟1)得到的磷酸化產(chǎn)物20circligaseii10×reactionbuffer550mmmncl22.55mbetaine10circligaseiissdnaligase(100u)2.5h2o10總反應(yīng)體積為50μl，該反應(yīng)體系中，除步驟1)得到的磷酸化產(chǎn)物和h2o外的試劑均為ssdna連接試劑盒中試劑?；旌暇鶆蚝?，60℃反應(yīng)1小時。反應(yīng)產(chǎn)物利用微量dna回收試劑盒按照其操作流程進(jìn)行產(chǎn)物純化回收，回收產(chǎn)物，得到連接產(chǎn)物(長鏈dna和環(huán)狀dna)。通過凝膠電泳，鑒別連接產(chǎn)物片段，結(jié)果顯示，得到了成功連接的連接產(chǎn)物。3)標(biāo)記生物素與擴(kuò)增：利用qiagen公司的全基因組擴(kuò)增試劑盒，反應(yīng)體系如下：組分體積(μl)步驟2)得到的連接產(chǎn)物102×反應(yīng)緩沖液(2×reactionbuffer)25bio-16-dutp5replig_enzyme1h2o9總體積50μl，該反應(yīng)體系中，除步驟2)得到的連接產(chǎn)物和h2o外的試劑均為全基因組擴(kuò)增試劑盒中試劑，其中，2×反應(yīng)緩沖液中含有隨機(jī)引物，隨機(jī)引物為由a、c、g和t這四個核苷酸隨機(jī)組成的長度均為6bp的46條單鏈dna所形成的混合物，該混合物中所有單鏈dna的摩爾數(shù)均相同?；旌暇鶆蚝?，37度恒溫孵育16小時以上。反應(yīng)產(chǎn)物采用dna回收試劑盒，按照試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，進(jìn)行dna純化，得到slc26a4基因捕獲探針。采用nanodrop2000進(jìn)行定量，并將slc26a4基因富集探針稀釋到150ng/μl，形成最終的slc26a4基因捕獲探針溶液。實施例2、slc26a4基因突變檢測方法的建立1.待測樣本全基因組文庫構(gòu)建該步驟中用到的各試劑均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。⑴超聲片段化:用1×lowtebuffer(thermo)將樣本dna稀釋到30ng/μl。采用covaris超聲儀進(jìn)行超聲片段化，得到片段化的dna。(參數(shù)設(shè)定：6次循環(huán)×60s，水浴溫度:5℃,占空比:20％，強(qiáng)度:5,模式:frequencysweeping)⑵末端修復(fù)及末端加“a”:分別取30μl步驟⑴的片段化的dna、10μler-atreactionbuffer、3μler-atenzymemix、7μlh2o于同一離心管中，進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)程序為：20℃，30min；72℃，20min；65℃，10min；4℃，hold。⑶adapter的連接:分別取20μlligationreactionbuffer、2μladaper(50μm)、3μlt4dnaligaseenzymemix以及步驟⑵中的全部反應(yīng)產(chǎn)物于同一離心管中，充分混合后置于22℃的恒溫加熱器上恒溫,7min后純化。⑷pcr反應(yīng):分別取27μlpcrreactionbuffer、1μlpcrenzyme、1μlbarcode、1μlpe1.0、40μlh2o以及30μl的步驟⑶的純化產(chǎn)物于同一試管中，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增程序為：98℃2min，1個循環(huán)；98℃30s，8個循環(huán)；65℃30s，8個循環(huán)；72℃30s，8個循環(huán)；72℃5min，1個循環(huán)；4℃，hold。再將pcr產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到待測樣本的dna全基因組文庫。2.slc26a4基因全基因捕獲⑴取500ng步驟1得到的dna全基因組文庫(20μl,25ng/μl)，10μlbufferbl(邁基諾基因科技股份有限公司)，5μl的實施例1的slc26a4基因富集探針溶液，6μlblockingoligomix(邁基諾基因科技股份有限公司)于同一離心管中，進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95℃，7min；65℃，2min。再取已65℃預(yù)熱的bufferhy溶液(邁基諾基因科技股份有限公司)23μl加入到上述體系中，于pcr儀上65℃雜交22h，得到反應(yīng)產(chǎn)物。⑵取50μlmyonebeads(invitrogen)于新的1.5ml的離心管中，漩渦震蕩至少5s，使磁珠充分懸浮，短暫離心后放入磁力架上1min，離心管在磁力架上保持靜止(不要旋轉(zhuǎn)離心管)，吸棄上清。⑶取下離心管，加入50μl的1xbindingbuffer(binding緩沖液)(邁基諾基因科技股份有限公司)，旋窩震蕩至少5s，短暫離心后放入磁力架上靜止1min，吸棄上清。重復(fù)清洗兩次(一共三次)。取下離心管，加入100μl2xbindingbuffer(binding緩沖液)(邁基諾基因科技股份有限公司)，旋窩震蕩至少5s，短暫離心后將全部液體轉(zhuǎn)入一個新的離心管中。⑷將步驟⑴的反應(yīng)產(chǎn)物完全轉(zhuǎn)入磁珠的離心管中(總體積約200μl，同時處理多個樣本時，混合后輕彈幾下混勻)，旋窩震蕩至少5s(不用離心)，置于rotator上室溫旋轉(zhuǎn)1小時。⑸利用wb1buffer(邁基諾基因科技股份有限公司)室溫清洗磁珠一次，然后在wb3buffer(邁基諾基因科技股份有限公司)中洗3次，65℃，15min/次，磁珠上捕獲目的dna。⑹將磁珠上捕獲的dna利用bufferelute(邁基諾基因科技股份有限公司)洗脫。將洗脫后的dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下:98℃，30s(1cycle)；98℃，25s,；65℃，30s；72℃，30s(15cycles)；72℃，5min(1cycle)。所用引物為illumina通用引物。pcr產(chǎn)物利用spribeads(beckmancoulter)進(jìn)行純化，得到富集slc26a4基因片段文庫。其中，步驟2中所用各試劑的配方如下：3.步驟2中得到的富集slc26a4基因片段進(jìn)行高通量測序?qū)⒉襟E2中得到的富集slc26a4基因片段通過illuminahiseq2500/hiseq4000/nextseq500/xten，將得到測序數(shù)據(jù)進(jìn)行如下分析：⑴數(shù)據(jù)預(yù)處理：從測序儀中獲取原始短序列，再用fastq-mcf去除接頭、低質(zhì)量以及短序列(<40bp)數(shù)據(jù)；qc統(tǒng)計序列的數(shù)量及測序質(zhì)量。⑵mapping用bwa軟件將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)與人基因組(hg19)進(jìn)行比對，得到比對后的sam文件；samtools軟件可將sam文件轉(zhuǎn)換為bam文件并排序；bamtools軟件對bam文件進(jìn)行過濾(-ismappedtrue-ispairedtrue-isproperpairtrue)；用picard/markduplicates.jar工具去除(或mark)pcr擴(kuò)增產(chǎn)生的冗余序列，消除由文庫擴(kuò)增而導(dǎo)入的突變，降低假陽性發(fā)生概率。picard提供的多個工具可對bam文件進(jìn)行修改，使之適合于后續(xù)的gatk軟件包中的工具的處理。⑶indel區(qū)域的序列重新做局部多序列比對indel的邊緣存在一些錯配看起來很像是snp的序列，通過對dbsnp庫及bam文件檢測到的indel附件的序列進(jìn)行局部重比對，消除indel周邊的假陽性snp。此步驟需用gatk的realignertargetcreator和indelrealigner工具進(jìn)行。⑷堿基質(zhì)量值重新打分測序儀給出的序列中的堿基qual值存在一定的偏差，gatk的baserecalibrator工具通過經(jīng)驗的錯誤模型重新計算堿基qual值，對質(zhì)量值進(jìn)行校正。⑸callsnp和indelgatk的haplotypecaller檢測snp和indel；gatk的variantfiltration過濾snp和indel結(jié)果，參數(shù)–filterexpression"mq0>＝4&&((mq0/(1.0*dp))>0.1)"–filtername“hard_to_validate”–filterexpression"dp<5"–filtername"lowcoverage"–filterexpression"qual<30.0"–filtername"verylowqual"–filterexpression"qual>30.0&&qual<50.0"–filtername"lowqual"–filterexpression"qd<1.5"–filtername"lowqd"–filterexpression"fs>10.0"–filtername"strandbias"。用annovar和自編腳本對snp和indel結(jié)果進(jìn)行注釋，關(guān)聯(lián)到多個數(shù)據(jù)庫。實施例3、利用實施例1的捕獲探針與實施例2的方法檢測臨床樣本的基因突變經(jīng)知情同意，選擇大前庭水管綜合征臨床發(fā)病患者3例(sanger測序為陽性、q-pcr檢測陽性)，應(yīng)用本發(fā)明的實施例2的slc26a4基因突變檢測方法進(jìn)行檢測。3例檢測樣本的高通量測序圖見圖1，數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表1和表2。其中，對照樣本是指經(jīng)sanger測序的slc26a4基因未突變的陰性樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1例(樣本編號為g161027c02001)純合缺失突變，突變范圍chr7:107314280-107315730區(qū)域，該區(qū)域包括5-6號外顯子；1例(樣本編號為g161027c01501)點突變并伴有雜合缺失突變，點突變?yōu)椋篶.919-2a>g，即編碼區(qū)第919-2號核苷酸由腺嘌呤核苷酸變異為鳥嘌呤核苷酸，導(dǎo)致氨基酸改變splicing(剪接突變)，該變異不屬于多態(tài)性位點，在人群中發(fā)生頻率極低，雜合缺失范圍chr7:107303705-107313630區(qū)域，該區(qū)域包括3-4號外顯子；另1例(樣本編號為g161027c03101)包含1個純合突變和1個雜合缺失，雜合突變的核苷酸變化為c.1174a>t(編碼區(qū)第1174號核苷酸由腺嘌呤核苷酸變異為胸腺嘧啶核苷酸)，導(dǎo)致氨基酸改變p.n392y(第392號氨基酸由天冬酰胺變異為酪氨酸)，為錯義突變，該變異不屬于多態(tài)性位點，在人群中發(fā)生頻率極低；雜合缺失的區(qū)域為chr7:107318501-107331018區(qū)域(該區(qū)域包括7-10號外顯子)。上述結(jié)果與sanger測序和q-pcr結(jié)果一致，證明了本試劑盒的準(zhǔn)確性、有效性。其中sanger測序通過在各突變位點上下游設(shè)計引物，對相應(yīng)樣本的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。其中，q-pcr檢測突變的方法為通過在各突變位點上下游設(shè)計引物，對相應(yīng)樣本的基因組dna利用q-pcr進(jìn)行檢測，將待檢基因ct值與內(nèi)參基因ct值相減，得△ct值；再用實驗組的△ct減去對照組的△ct得到△△ct，根據(jù)公式計算結(jié)果，確定樣本相應(yīng)位點的突變情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果(圖2-圖4)與利用實施例2的方法檢測的突變的結(jié)果完全一致。表1、slc26a4基因突變檢測現(xiàn)有的檢測技術(shù)只能確定slc26a4基因外顯子是否發(fā)生突變，而本發(fā)明提供的slc26a4全基因突變檢測方法既能準(zhǔn)確判斷外顯子的突變情況，又能精確定位至斷裂點區(qū)域和片段大小。因此，本發(fā)明的捕獲探針與slc26a4基因突變方法，能夠一步檢測slc26a4基因突變攜帶者的全部突變情況，并對相關(guān)斷裂點進(jìn)行準(zhǔn)確定位，避免假陰性、假陽性出現(xiàn)，有利于分析slc26a4基因遺傳變異機(jī)制。表2、測序數(shù)據(jù)表2中參數(shù)說明：a.測序數(shù)據(jù)量是指完成slc26a4基因捕獲的樣本進(jìn)行測序時產(chǎn)生的總的測序數(shù)據(jù)；b.覆蓋率：覆蓋目的堿基數(shù)/目的堿基數(shù)；c.目的堿基數(shù)：指探針設(shè)計所要覆蓋到的目的區(qū)域的總堿基數(shù)；d.覆蓋目的堿基數(shù)：指經(jīng)過富集測序后，能夠成功比對到設(shè)計所要覆蓋的堿基區(qū)域的堿基數(shù)；e.捕獲效率(有效數(shù)據(jù)量)：覆蓋目的堿基數(shù)/測序數(shù)據(jù)量f.測序平均深度：指目的區(qū)域測序時，平均所讀取到的次數(shù)；g.平均覆蓋4x比例：指最少讀到4次以上的堿基數(shù)占比；h.平均覆蓋10x比例：指最少讀到10次以上的堿基數(shù)占比；i.平均覆蓋20x比例：指最少讀到20次以上的堿基數(shù)占比；探針質(zhì)量評估：slc26a4基因捕獲探針對slc26a4基因的捕獲均達(dá)到了95％以上覆蓋，最高達(dá)到了98.06％；其捕獲效率均在42％以上，從至少覆蓋到4x、10x和20x的參數(shù)來看，平均覆蓋比例分別達(dá)到94％、90％和89％以上，探針的整體均一性非常好，具有很好的穩(wěn)定性。表明，本發(fā)明的dmd基因捕獲探針可以用于捕獲dmd基因及dmd基因突變位點的檢測。當(dāng)前第1頁12