本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種多重pcr產(chǎn)物的定性、定量檢測方法，具體涉及一種編碼多重pcr的引物、繼而編碼引物擴增的pcr產(chǎn)物、并最終通過焦測序解碼相應的pcr產(chǎn)物是否存在的分析技術。

背景技術：

隨著社會的進步、人們生活水平的提高，人們對食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生的意識和要求越來越高。如何在食品安全檢測中，引起人類疾病和食物中毒的致病性微生物(如：沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌、變形桿菌、志賀氏菌、禽流感病毒、黃曲霉菌及病毒、口蹄疫病毒等)多種多樣，這些食品安全檢測可能涉及幾十種甚至更多種類的微生物鑒定，但一般情況下一種食品只可能存在幾種或者沒有受到污染，如何快速對對食品的安全進行準確的檢測對避免惡性事件發(fā)生，以及對惡性事件后續(xù)應急處理、越少對社會的負面影響無疑具有重要的意義。又如在疾病診斷和治療中，對病毒性肝炎、人乳頭瘤病毒等感染性疾病的診斷，其基因分型也可能涉及上百種類型，但到具體的某個患者則可能只有一種特定的基因型。如何快速、準確、便宜地實現(xiàn)這些傳染性疾病的診斷，為對患者贏得治療的寶貴時間、實施正確的治療方式、降低患者的醫(yī)療費用具有重要的現(xiàn)實意義。上述檢測均涉及到核酸分子的檢測，即從多個可能的候選特征dna序列中找出樣品中真實存在的特征dna模板序列。

多重pcr技術為不同dna模板擴增提供了一種快速可行途徑，多重pcr可以在同一反應體系中獲得不同dna模板，只要能夠?qū)@些不同dna模板一一實施分析，就能夠?qū)崿F(xiàn)多組分的檢測。然而，基于凝膠電泳分析多重pcr產(chǎn)物的方法依賴于pcr產(chǎn)物的，只有不同的pcr產(chǎn)物長度區(qū)分很明顯的情況下(一般兩個pcr片段相對大小需要相差幾十個堿基)才可能做出正確的判斷，因此凝膠電泳的分辨力不高造成了這種價格便宜的分析方法并不能滿足快速檢測于診斷的需求。因此，發(fā)展一種能夠準確分析這些多重不同pcr產(chǎn)物具有現(xiàn)實意義。

美國應用生物公司開發(fā)出一種分析多個pcr產(chǎn)物中snp位點的方法：多重分析試劑盒。利用不同長度延伸引物與包含多個snp位點得pcr產(chǎn)物雜交后、延伸四種熒光標記的ddntp，并經(jīng)類似于sanger測序分析后，根據(jù)針對每個位點設計的特定長度的延伸引物峰顏色可以實現(xiàn)每個snp位點得分型。在這一分析方法中，特定長度的延伸引物可以視為編碼，一個特定長度的延伸引物對應一個snp位點。這一方法能夠同時分析多重pcr產(chǎn)物，具有快速、準確、價格相對低廉的特征。然而，sanger毛細管測序儀被美國thermofisher公司旗下的life部門具有壟斷優(yōu)勢，價格昂貴，其分析成本居高不下，不容易推廣；且sanger測序只能提供定性分析，最大得不足是由于四種染料基線噪音得影響，對于含量低于10％的pcr產(chǎn)物的連定性分析也無能為力。

焦測序技術(pyrosequencing，又稱焦磷酸測序技術)是繼sanger測序后的一代測序技術。相對于sanger測序，除了測序長度處于弱勢外，其測序準確度與之相當、但在自動化程度，操作簡易、價格上均有優(yōu)勢、且檢測限更低和具有定量功能，容易推廣、十分適合臨床檢測上使用。然而，焦測序技術并不具備sanger測序能夠分析部分封閉的標記不同長度的測序引物延伸片段，類似于編碼技術并不適合分析多重pcr產(chǎn)物是混合產(chǎn)物，因為在焦測序解碼時會因不同pcr產(chǎn)物測序信息的干擾而無法獲得單個pcr產(chǎn)物的信息。然而，如果不像sanger測序采用的部分封閉，而是完全封閉的方式，那么每當編碼堿基被測序解碼后，其延伸引物被完全封閉、不再繼續(xù)參與任何核苷酸加入的測序反應，即對后續(xù)的解碼測序反應無影響。但按照一般的全編碼方式，最多也就只能對四種不同的堿基進行一次編碼、獲得四個不同的編碼。這無疑限制了編碼數(shù)目，使得分析的對象也受限于最多4個。如果四個不同的堿基采用不是全編碼，而是部分堿基編碼，雖然在同一位置編碼數(shù)目小于4個，但可以利用多個位置進行編碼，這樣就能提升編碼的數(shù)目、且用于編碼引物序列的堿基數(shù)目越多，編碼的數(shù)目也就越多。

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供一種基于編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序分析方法。該方法是對多重pcr產(chǎn)物的定性、定量檢測方法，尤其可以對pcr產(chǎn)物中多個pcr產(chǎn)物同時存在的情況進行檢測。

技術方案：為了實現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述一種基于編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序分析方法，包括如下步驟：

(1)提取血液、唾液等樣本的基因組dna；

(2)以樣本的基因組dna為模板通過編碼引物的多重pcr擴增，獲得含有待分析的目的片段的pcr產(chǎn)物；

(3)將步驟(2)獲得pcr產(chǎn)物制備成單鏈pcr產(chǎn)物，焦測序分析單鏈pcr產(chǎn)物的編碼引物中編碼區(qū)域的序列信息；

(4)根據(jù)焦測序列結(jié)果，確定編碼對應的pcr產(chǎn)物是否存在，實現(xiàn)該pcr產(chǎn)物特征dna序列的檢測。

其中，步驟(2)所述編碼引物是指擴增一個待分析目的片段的兩個pcr引物中一個被編碼的引物，且一個編碼對應一個pcr產(chǎn)物；另一個pcr引物為未編碼引物。

所述編碼引物由三部分區(qū)域序列組成，即特異雜交區(qū)域序列、編碼區(qū)域序列和通用區(qū)域序列；所述特異雜交區(qū)域序列用作特定pcr引物；所述編碼區(qū)域序列用于標記定pcr產(chǎn)物；所述通用區(qū)域序列用于焦測序分析(焦測序分析即為解碼)編碼區(qū)域序列的測序引物雜交區(qū)域；所述編碼區(qū)域序列由1個編碼堿基和若干個路徑堿基構(gòu)成，其中位于編碼區(qū)域序列中3’末端最后一個堿基用于編碼，稱為編碼堿基，序列其余堿基稱為路徑堿基。

所述編碼引物的特異雜交區(qū)域序列為待分析目的片段，是表征待分析對象(如某種微生物)的一段特征序列、具有唯一性；目的片段可以從現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫、或者文獻中檢索得到。如果樣本中含有待分析對象，則pcr產(chǎn)物中含有目的片段；否則，pcr產(chǎn)物中不含有目的片段。一個編碼引物的目的片段代表一個待分析對象，編碼引物至少為2個，即至少待分析的對象為2個，構(gòu)成多重pcr。

進一步地，所述編碼引物為10～20個。

其中，所述兩個pcr引物中另一個引物未被編碼，該未編碼引物的5’端被生物素修飾；所述未編碼引物可以與一個編碼引物構(gòu)成擴增一個待分析目的片段的兩個pcr引物，也可以作為多個編碼引物公用的另一個引物。若樣本基因組中存在特定的pcr模板序列被擴增、則未編碼引物pcr產(chǎn)物包括與編碼引物序列完全互補的一段序列，且pcr產(chǎn)物長度不超過500bp。

其中，步驟(3)的具體步驟為：

(3-1)制備單鏈pcr產(chǎn)物的dna模板：將步驟(2)獲得pcr擴增產(chǎn)物與鏈霉親和素包裹的磁珠反應，由5’端被生物素修飾的未編碼引物擴增的pcr產(chǎn)物dna鏈，固定到所述磁珠上，得到單鏈pcr產(chǎn)物單鏈的dna模板；其中由5’端被生物素修飾的未編碼引物擴增的pcr產(chǎn)物dna鏈即pcr引物中另一個未被編碼引物的5’端被生物素修飾，其擴增產(chǎn)物即為5’端被生物素修飾的dna鏈；

(3-2)測序引物雜交：將合成的測序引物(測序引物為焦測序引物，即一段已知序列，與被測序的dna模板序列中的一段完全互補，在這里其的序列與編碼引物序列中的通用區(qū)域序列完全相同)與單鏈pcr產(chǎn)物的dna模板結(jié)合；

(3-3)根據(jù)編碼區(qū)域序列設計核苷酸加入順序進行焦測序分析。

進一步地，步驟(3-3)所述編碼區(qū)域序列中的編碼堿基的信息是加入單個ddntp來實現(xiàn)解碼的；路徑堿基信息是通過加入單個dntp測序?qū)崿F(xiàn)的，當一個編碼區(qū)域序列的編碼堿基被測序完成后，這個編碼區(qū)域序列的后續(xù)堿基因測序引物被封閉，不在提供測序信息，按照核苷酸加入得順序，依次解碼，當路徑堿基無測序信息時，表明后續(xù)編碼區(qū)域序列無pcr產(chǎn)物，停止測序反應。

進一步地，步驟(4)所述根據(jù)焦測序列結(jié)果，若加入的ddntp有明顯的測序信號，則表明該編碼引物序列的pcr產(chǎn)物是存在的，表明樣本中含有該pcr產(chǎn)物的特征dna序列；若果加入的ddntp無明顯的測序信號，則表明該編碼引物序列的pcr產(chǎn)物是不存在的，表明樣本中不含有該pcr產(chǎn)物的特征dna序列。

本發(fā)明基于編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序分析方法，通過特定設計的編碼引物即編碼多重pcr引物，由編碼引物擴和未編碼引物增得到pcr產(chǎn)物。其中未編碼引物的5’端被生物素修飾，其擴增鏈為5’端被生物素修飾的dna鏈、且擴增鏈包含一段與編碼引物序列完全互補序列片段，最后采用焦測序依次測定多重pcr編碼引物的序列區(qū)域，確定編碼編碼引物是否擴增、判斷是否存在分析對象。由于每個編碼均具有唯一性、且解碼的信息也來自于特定的唯一pcr產(chǎn)物。因此，測序結(jié)果確定編碼是否存在，繼而判斷編碼相應的pcr產(chǎn)物是否存在。該編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序(解碼)分析方法可以對編碼的pcr產(chǎn)物依次逐個解碼確定。由于多重pcr產(chǎn)物是混合在一起的，因此不同的pcr產(chǎn)物對應唯一的編碼、且不能相互干擾。

有益效果：本發(fā)明方法通過一次連續(xù)的焦測序反應，可以實現(xiàn)多重pcr所有可能產(chǎn)物的定性、定量檢測，減少了檢測的工作量，縮短操作時間，尤其適合食品、衛(wèi)生等行業(yè)的微生物快速檢測與篩查。本發(fā)明的方法可以縮短檢測周期，對一些惡性事件(急性傳染性疾病等)真相查明越快，就越能贏得時間正確應對，對社會的負面影響就越少；同時減少工作量、降低檢測費用，如果針對每個可能的檢測對象實施一次檢測，那每個樣本需要實施幾十次、甚至上百次的檢測，無疑大大增加了工作量，也增加了檢測的費用；而多個檢測對象并行實施檢測明顯減少工作量、降低檢測費用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明的方法能夠?qū)Χ嘀豴cr的混合產(chǎn)物實施同時分析。

2、本發(fā)明與傳統(tǒng)凝膠電泳分析多重pcr產(chǎn)物相比，對多重pcr中不同產(chǎn)物的相對長度沒有限制。

3、本發(fā)明與現(xiàn)有多重分析試劑盒相比，對多重pcr能夠提供定量分析、且操作更為簡便，使用的儀器價格更為便宜，更適合臨床診斷等應用。

附圖說明

圖1是一種基于編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序分析方法編碼引物的構(gòu)成示意；

圖2是一種基于編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序分析方法編碼引物參與pcr反應及pcr產(chǎn)物的解碼示意；

圖3是一種基于編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序分析方法編碼引物中編碼區(qū)域序列的一種編碼方法的示意圖；

圖4是一種基于編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序分析方法據(jù)圖3編碼方式的焦測序解碼圖譜示意；

圖5是實施例2的焦測序列結(jié)果示意圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

基于編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序分析方法：

(1)提取樣本的基因組dna；

(2)以樣本的基因組dna為模板通過編碼引物的多重pcr擴增，獲得含有待分析目的片段的pcr產(chǎn)物。

編碼引物是指擴增一個待分析目的片段的兩個pcr引物中的一個被編碼引物，且一個編碼對應一個pcr產(chǎn)物。如圖1所示，編碼引物由三部分區(qū)域序列組成，即通用區(qū)域序列1、編碼區(qū)域序列2和特異雜交區(qū)域序列3。每個不同的編碼引物具有特定不同的特異雜交區(qū)域序列3和編碼區(qū)域序列2，所有編碼引物都具有相同的通用區(qū)域序列1。特異雜交區(qū)域序列3是待分析的目的片段，是表征待分析對象(如某種微生物)的一段特征序列、具有唯一性，用作特定pcr引物；編碼區(qū)域序列2用于標記定pcr產(chǎn)物；通用區(qū)域序列1用于編碼通過焦測序分析(解碼)編碼區(qū)域序列的測序引物雜交區(qū)域；編碼區(qū)域序列2由1個編碼堿基和若干個路徑堿基構(gòu)成，其中位于編碼區(qū)域序列2中3’末端最后一個堿基用于編碼，稱為編碼堿基，序列其余堿基稱為路徑堿基。編碼引物至少為2個，一般選用10～20個，且每個編碼引物序列均具有唯一性。

構(gòu)成兩個pcr引物中另一個引物未被編碼，該未編碼引物的5’端被生物素修飾；所述未編碼引物可以與一個編碼引物構(gòu)成擴增一個潛在目的片段的pcr產(chǎn)物的兩個pcr引物，也可以作為多個編碼引物的公用的另一個引物。若樣本基因組中存在特定的pcr模板序列被擴增、則未編碼引物pcr產(chǎn)物包括與編碼引物序列完全互補的一段序列，且pcr產(chǎn)物長度不超過500bp。

(3)將步驟(2)獲得pcr產(chǎn)物制備成單鏈pcr產(chǎn)物，焦測序分析單鏈pcr產(chǎn)物的編碼引物(中編碼區(qū)域)序列信息，具體步驟為：

(3-1)制備單鏈pcr產(chǎn)物的dna模板：將步驟(2)獲得pcr擴增產(chǎn)物與鏈霉親和素包裹的磁珠反應，由5’端被生物素修飾的未編碼引物擴增的dna鏈，固定到所述磁珠上，得到單鏈pcr產(chǎn)物的dna模板；

(3-2)測序引物雜交：將合成的測序引物與單鏈pcr產(chǎn)物的dna模板結(jié)合；測序引物為焦測序引物，它的序列與編碼引物中通用區(qū)域序列完全相同；

(3-3)根據(jù)編碼區(qū)域序列2設計核苷酸加入順序進行焦測序分析。編碼區(qū)域序列2中的編碼堿基的信息是加入單個ddntp來實現(xiàn)解碼的；路徑堿基信息是通過加入單個dntp測序?qū)崿F(xiàn)的，當一個編碼區(qū)域序列2的編碼堿基被測序完成后，這個編碼區(qū)域序列2的后續(xù)堿基因測序引物被封閉，不在提供測序信息，按照核苷酸加入得順序，依次解碼，當路徑堿基無測序信息時，表明后續(xù)編碼區(qū)域序列2無pcr產(chǎn)物，停止測序反應。

(4)根據(jù)焦測序列結(jié)果，確定編碼對應的pcr產(chǎn)物是否存在，實現(xiàn)該pcr產(chǎn)物特征dna序列的檢測。若加入的ddntp有明顯的測序信號，則表明該編碼引物序列的pcr產(chǎn)物是存在的，表明樣本中含有該pcr產(chǎn)物的特征dna序列；若果加入的ddntp無明顯的測序信號，則表明該編碼引物序列的pcr產(chǎn)物是不存在的，表明樣本中不含有該pcr產(chǎn)物的特征dna序列。

如圖2所示，4為編碼引物，5為基因組dna，6為另一pcr引物，其中5’被生物素7修飾，8為生物素修飾延伸鏈，9為鏈霉親和素包裹的磁珠，10為焦測序引物，它的序列與編碼引物中通用區(qū)域序列完全相同。a)含有編碼引物4、生物素7修飾引物6、基因組5，以及pcr需要的其他成分(包括聚合酶、緩沖溶液、mg²⁺)通過pcr反應，得到含有一條5’端生物素修飾延伸鏈8的pcr產(chǎn)物，其中延伸鏈8的3’包含一段與編碼引物完全互補的序列；b)將pcr擴增產(chǎn)物與鏈霉親和素包裹的磁珠反應，生物素修飾的飾延伸鏈8固定到磁珠9上，得到單鏈dna模板；c)雜交測序引物與測序，按照編碼區(qū)域序列設計核苷酸加入順序進行焦測序解碼編碼信息。由于延伸鏈5’包含一段與編碼引物完全互補的序列，因此，測序解碼加入的核苷酸順序就是按照編碼區(qū)域的順序依次加入，只是編碼堿基測定加入相應的ddntp，路標堿基測定加入相應的dntp。

如圖3所示，編碼區(qū)域序列由1個編碼堿基和若干個路標堿基構(gòu)成，其中編碼堿基為1個(圖中黑體字母)，其余為路徑堿基(圖中非黑體字母)。在圖3中，編碼1區(qū)域序列為5’-at-3’，其中a為路標堿基，t為編碼堿基、它編碼引物1；編碼8區(qū)域序列為5’-acacg-3’，其中a、c、a、c為路標堿基，g為編碼堿基、它編碼引物8；其他依次類推。可以發(fā)現(xiàn)，這種編碼產(chǎn)生的編碼數(shù)n與編碼引物序列堿基個數(shù)n的關系為：n＝2(n-1)。

解碼按不再繼續(xù)延伸核苷酸，不造成對后續(xù)分析的影響。解碼按照加入單個ddntp一個測序反應解碼一個編碼(堿基)，依據(jù)編碼的順序依次加入相應的單個ddntp測序解碼、直到無測序信息完成全部解碼，如圖4所示，首先加入datp進行測序反應，它的測序強度信息反應所有不同pcr產(chǎn)物的總量，可以作為定量分析的一個基準(100％)。然后依次，按照編碼區(qū)域序列設計核苷酸加入順序進行焦測序解碼編碼信息。需要注意的是編碼堿基測定加入相應的ddntp，路標堿基測定加入相應的dntp。

解碼編碼1是，加入ddttp進行測序反應：如果有大于背景的測序強度信息，則表明該編碼1的pcr產(chǎn)物存在，其含量為該次測序信息強度/第一個路標堿基測序信息強度；如無大于背景的測序強度信息，則表明該編碼的pcr產(chǎn)物不存在。同樣地，加入ddgtp測序可以解碼編碼2。很明顯，當編碼1、2解碼完成后，無論編碼1、2的pcr產(chǎn)物是否存在，這兩種編碼的pcr序列將不會對后續(xù)測序反應貢獻測序信息：如果編碼1、2的pcr產(chǎn)物不存在，則自然不會產(chǎn)生任何測序信息；如果編碼1、2的pcr產(chǎn)物存在，由于加入的ddttp、ddgtp，所有與編碼1、2的pcr產(chǎn)物雜交的測序引物均被封閉，不會繼續(xù)發(fā)生延伸反應，自然也不會再產(chǎn)生測序信號。當編碼1、2完成解碼后，加入dctp測定一個路標堿基；然后再分別加入ddttp、ddgtp可以解碼編碼3、4。這樣，在路標堿基指引下，更多的編碼便可以被解碼、并通過信息強度計算相應的含量。當路標堿基的測序信息與背景的測序強度一致時，表明后續(xù)編碼的pcr產(chǎn)物軍部存在，完成所有編碼的被解碼。

實施例2

一種基于編碼多重pcr產(chǎn)物的hpv分型方法：

(1)用專用宮頸刷置于宮頸口，輕輕搓動宮頸刷使其順時針旋轉(zhuǎn)5圈，慢慢取出宮頸刷，將其放入標有患者編號的取樣管中，完成樣本采集，采用試劑盒提取樣本中dna；

(2)以樣本的dna為模板通過編碼引物的多重pcr擴增，獲得含有待分析目的片段的pcr產(chǎn)物：將15種hpv基因型作為待分析對象，每種編碼引物編碼一種hpv基因型，包括三部分：通用區(qū)域序列、編碼區(qū)域序列和特異雜交區(qū)域序列，其中特異雜交區(qū)域序列是待分析hpv基因型的目的片段，是表征特定hpv基因型的一段特征序列、具有唯一性，并被編碼區(qū)域序列編碼。每種編碼引物與5’修飾生物素的非編碼引物seqidno16(5’-gaaaaataaactgtaaatca-3’)構(gòu)成pcr的兩個擴增引物。

編碼引物的具體編碼方式如下：

50μl的pcr擴增體系包含：200ng樣本dna，0.8mmdntps，10pmol的每種編碼引物和0.8μm的5’修飾生物素的非編碼引物seqidno16(5’-gaaaaataaactgtaaatca-3’)，1utaqdna聚合酶,1×擴增緩沖液,2.5mmmgcl2。擴增條件：94℃預變性10分鐘，45個熱循環(huán)：945℃變性30秒～52℃退火45秒～72℃延伸30秒，最后72℃延伸7分鐘。

(3)將pcr產(chǎn)物與鏈霉親合素修飾的磁珠反應，獲取單鏈pcr產(chǎn)物的dna模板，將測序引物(即與編碼引物序列中通用序列區(qū)域完全相同的序列)與磁珠固定的單鏈pcr的dna模板在80℃下反應5分鐘，然后自然冷卻至室溫。根據(jù)編碼區(qū)域序列設計核苷酸加入順序進行焦測序分析，如圖4所示，按照datp、ddttp、ddgtp、dctp、ddttp、ddgtp、datp、ddttp、ddgtp、dctp、ddttp、ddgtp、datp、ddttp、ddgtp、dctp、ddttp、ddgtp順序依次加入核苷酸進行測序，解碼編碼，確定樣本的hpv分型。圖4中橫坐標為(測序)信號強度，縱坐標為(測序)加入的測序反應液或者核苷酸，其中e為緩沖反應液，s為酶反應液，黑色字體為相應的ddntp，非黑色字體為相應的dntp。ddntp的測序信息解碼一個編碼是否存在，dntp測序信息表示路徑是否存在，其中第一個路徑堿基的測序強度信息反應所有不同pcr產(chǎn)物的總量，作為定量分析的一個基準(100％)

(4)根據(jù)焦測序列結(jié)果，確定編碼對應的pcr產(chǎn)物是否存在，實現(xiàn)該pcr產(chǎn)物特征dna序列的檢測：焦測序列結(jié)果如圖5所示。當加入datp時，出現(xiàn)明顯的測序峰，表明pcr產(chǎn)物存在；當加入ddttp進行測序反應解碼編碼1hpv16，其測序強度與背景相當、表明編碼1的pcr產(chǎn)物不存在；同樣地，加入ddgtp測序可以解碼編碼2hpv66，其測序強度與也背景相當、表明編碼2的pcr產(chǎn)物也不存在；當加入dctp進行測序反應，出現(xiàn)明顯的測序峰，表明pcr產(chǎn)物存在；當加入ddttp進行測序反應解碼編碼3hpv59，其測序強度與背景相當、表明編碼3的pcr產(chǎn)物不存在；加入ddgtp測序可以解碼編碼4，其測序強度明顯強于背景、表明編碼4的pcr產(chǎn)物存在，即表明樣本中含有編碼4對應的特征序列hpv56病毒；當加入datp進行測序反應，其測序強度與背景相當、表明后續(xù)pcr產(chǎn)物全部不存在，完成所有編碼的被解碼。因此，樣本從待分析的15個檢測對象中只檢測出編碼引物序列4代表的特征序列hpv56病毒，而其它14種則未檢出。

sequencelisting

<110>東南大學

<120>一種基于編碼多重pcr產(chǎn)物的焦測序分析方法

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