本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及殺鮭氣單胞菌噬菌體、包含其的殺菌組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大西洋殺鮭氣單胞菌(aeromonassalmonicida)屬于變形菌門下氣單胞菌屬的革蘭式陰性桿菌，在水環(huán)境中分布極為廣泛，尤其是水生動物的腸道中，是導(dǎo)致鮭鱒魚類發(fā)生癤瘡病及潰腸病的主要致病菌。殺鮭氣單胞菌的宿主范圍廣，在某些情況下，能引發(fā)讓人和動物腸道內(nèi)外的多種感染性疾病。在高密度養(yǎng)殖的條件下，由于殺鮭氣單胞菌具有很高的致死性和發(fā)病率，該類致病菌被認為是引起多種水生動物爆發(fā)性死亡的主要原因之一，每年對鮭鱒魚類造成十分嚴重的損失。此外，該類致病菌能感染非鮭科魚類，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

臨床上由于對發(fā)病魚的病因沒有明確的認識，導(dǎo)致抗生素的濫用，既造成養(yǎng)殖戶經(jīng)濟損失，也影響了水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。針對水產(chǎn)養(yǎng)殖中鮭鱒魚類出現(xiàn)的癤瘡病及潰腸病，采用的主要預(yù)防和控制方式即大量投入使用抗生素。雖然使用抗生素被認為是當(dāng)前治療細菌感染最有效的方式，但龐大的抗生素生產(chǎn)和消耗模式同時也極大助長了耐藥菌的形成，并使得致病菌的耐藥性問題日益嚴重。目前報道，在罹患病的動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)一株廣譜耐藥性殺鮭氣單胞菌，其耐藥性范圍多達9種以上。

噬菌體是一類能感染細菌的病毒，在環(huán)境中廣泛存在。噬菌體具有極高的宿主特異性，通過感染特定靶向宿主實現(xiàn)自我生長和繁殖，并最終導(dǎo)致宿主菌的裂解死亡，而對其他菌群和人體無影響。噬菌體療法是指利用噬菌體專一裂解性殺死病原菌以治療病原菌感染導(dǎo)致的疾病的治療手段。利用噬菌體控制致病菌的理論，早在噬菌體被發(fā)現(xiàn)后不久即被提出，并成功用于細菌感染性疾病的治療案例中。然而，由于抗生素的發(fā)現(xiàn)，削弱了噬菌體在這方面的應(yīng)用，但在東歐國家噬菌體作為抗菌劑的應(yīng)用一直持續(xù)至今。

近十年來，由于抗生素濫用導(dǎo)致大量耐藥菌甚至超級細菌的出現(xiàn)，針對細菌感染性疾病的噬菌體療法又重新回歸人們的視線，并逐漸受到高度重視。當(dāng)前，在大部分東歐國家及美國，噬菌體已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、工業(yè)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，尤其是食品加工生產(chǎn)過程中對食源性疾病的預(yù)防控制。此外，當(dāng)前各國科學(xué)家致力于通過構(gòu)建模型研究噬菌體侵染宿主菌的機理特性，并試圖將噬菌體產(chǎn)品應(yīng)用于臨床上預(yù)防控制流行病學(xué)的研究中。作為應(yīng)對抗生素抗性的重要武器之一，噬菌體的臨床應(yīng)用潛力巨大。但就其當(dāng)前單一噬菌體療法的應(yīng)用而言，其在應(yīng)用過程中逐漸出現(xiàn)一些潛在的缺點，如可裂解宿主譜范圍窄，裂解一定量宿主需要的劑量高，宿主短時間內(nèi)進化出噬菌體的抗性等。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一方面提供除了專一性裂解氣單胞菌屬例如殺鮭氣單胞菌外，還對腸桿菌科例如沙門氏桿菌、弧菌及大腸桿菌有一定裂解性的噬菌體。

本發(fā)明一方面涉及殺鮭氣單胞菌噬菌體(aeromonassalmonicidaphage)，保藏名為as-zj，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：cctccno:m2017091；保藏時間為：2017年3月6日。

該噬菌體均保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏時間為：2017年3月6日。經(jīng)保藏中心于2017年3月16日檢測為存活菌株。

本發(fā)明的噬菌體不僅能裂解氣單胞菌屬例如殺鮭氣單胞菌，而且還能裂解腸桿菌科例如沙門氏桿菌、弧菌及大腸桿菌。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例中的噬菌體篩選流程圖；

圖2為殺鮭氣單胞菌噬菌體的噬菌斑形態(tài)；

圖3為殺鮭氣單胞菌噬菌體的吸附曲線；

圖4為殺鮭氣單胞菌噬菌體的一步生長曲線；

圖5為宿主與單株殺鮭氣單胞菌噬菌體混合的感染曲線圖；a：moi＝0.1；b：moi＝1；

圖6為宿主與殺鮭氣單胞菌噬菌體雞尾酒混合的感染曲線圖。

本發(fā)明所提供的殺鮭氣單胞菌噬菌體as-yj(aeromonassalmonicidaphageas-yj)，保藏號為cctccno:m2017095；

本發(fā)明所提供的殺鮭氣單胞菌噬菌體as-gz(aeromonassalmonicidaphageas-gz)，保藏號為cctccno:m2017094；

本發(fā)明所提供的殺鮭氣單胞菌噬菌體as-sw(aeromonassalmonicidaphageas-sw)，保藏號為cctccno:m2017093；

本發(fā)明所提供的殺鮭氣單胞菌噬菌體as-szw(aeromonassalmonicidaphageas-szw)，保藏號為cctccno:m2017092；

本發(fā)明所提供的殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj(aeromonassalmonicidaphageas-zj)，保藏號為cctccno:m2017091；

上述菌株的保藏地址均為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路珞珈山，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏時間均為：2017年3月6日。均經(jīng)保藏中心于2017年3月16日檢測為存活菌株。

具體實施方式

本發(fā)明的第一方面提供除了專一性裂解殺鮭氣單胞菌屬例如殺鮭氣單胞菌外，還對腸桿菌科例如沙門氏桿菌、弧菌及大腸桿菌裂解性的噬菌體。

本發(fā)明一方面涉及殺鮭氣單胞菌噬菌體(aeromonassalmonicidaphage)，保藏名為as-zj，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：cctccno:m2017091；保藏時間為：2017年3月6日。

含有如上所述噬菌體的殺菌組合物。

本發(fā)明建立了一種可行的方法從環(huán)境中高效快速的分離廣譜耐藥大西洋殺鮭氣單胞菌的噬菌體。在一種實施方式中，通過認識單一噬菌體對于侵染宿主的特性，評估單一噬菌體的感染能力，采用一定的混合方法構(gòu)建噬菌體雞尾酒，最后通過特定指標確定最佳的雞尾酒組成，該噬菌體雞尾酒既具有噬菌體的專一性特征，又彌補了單一噬菌體療法易導(dǎo)致宿主菌抗性的不足，應(yīng)用前景廣泛。

本發(fā)明提供的噬菌體殺菌組合物可在短時間內(nèi)快速抑制大西洋殺鮭氣單胞菌的生長，并抑制該病原菌噬菌體抗性的產(chǎn)生。此外，該噬菌體雞尾酒安全、有效，且特異性強，生產(chǎn)成本低，在致病菌的控制過程中彌補了單一噬菌體療法的不足。

本發(fā)明還涉及一種含有如上所述噬菌體和/或其突變體的殺菌組合物，用于治療和/或預(yù)防動物例如魚類癤瘡病或潰瘍病。

本發(fā)明還涉及一種含有如上所述噬菌體和/或其突變體的殺菌組合物，用于殺滅和/或預(yù)防殺鮭氣單胞菌、沙門氏桿菌、弧菌及大腸桿菌。

優(yōu)選的，所述殺菌組合物還包括殺鮭氣單胞菌噬菌體as-gz，保藏號為：cctccno:m2017094；

殺鮭氣單胞菌噬菌體as-sw，保藏號為cctccno:m2017093；

殺鮭氣單胞菌噬菌體as-yj，保藏號為cctccno:m2017095；以及

殺鮭氣單胞菌噬菌體as-szw，保藏號為cctccno:m2017092中的一種或多種；

上述噬菌體均保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間為：2017年3月6日。經(jīng)保藏中心于2017年3月11日檢測為存活菌株。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj以及as-gz。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-gz以及as-yj。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-gz以及as-sw。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-gz以及as-szw。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-gz、as-sw以及as-yj。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-gz、as-sw以及as-szw。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-gz、as-yj以及as-szw。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-gz、as-sw、as-szw以及as-yj。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj以及as-yj。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj以及as-sw。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj以及as-szw。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-sw以及as-yj。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-sw以及as-szw。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-yj以及as-szw。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物中的有效成分主要為殺鮭氣單胞菌噬菌體as-zj、as-sw、as-yj以及as-szw。

在本發(fā)明的一些實施方式中，所述殺菌組合物還包括as-gz的突變體、as-szw的突變體、as-yj的突變體、as-zj的突變體以及as-sw的突變體中的一種或多種

優(yōu)選的，所述突變體序列至少90％與相應(yīng)的噬菌體的天然序列相同。

由于病毒在復(fù)制過程中非常容易發(fā)生突變，因而優(yōu)選的，上述噬菌體的突變體也在本申請請求保護的范圍內(nèi)。as-gz、as-szw、as-yj、as-zj、as-sw的突變體至少90％與所述噬菌體的天然序列相同；且所述突變體具有與最初的噬菌體大致相同的滅殺病原菌的功能。更優(yōu)選的，突變體有92％、94％、96％、98％或99％與各自對應(yīng)的噬菌體的天然序列相同。

噬菌體as-gz、as-szw、as-yj、as-zj、as-sw的突變體可為點突變、缺失突變或添加突變，相對于最初的噬菌體序列，有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多堿基可發(fā)生變化。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，根據(jù)本發(fā)明提供的噬菌體篩選出與其性狀相似的突變體并不需要付出創(chuàng)造性的勞動。

如上所述，噬菌體可以以足夠高的濃度存在以誘導(dǎo)溶菌作用，當(dāng)混配成混合物時，優(yōu)選的，如上所述的殺菌組合物，所述組合物中每種殺鮭氣單胞菌噬菌體的含量≥10⁶pfu/ml；

優(yōu)選的，如上所述的殺菌組合物，所述組合物中每種殺鮭氣單胞菌噬菌體的含量為10⁶pfu/ml～10¹⁰pfu/ml，更優(yōu)選為10⁶pfu/ml～10⁹pfu/ml，更優(yōu)選為10⁶pfu/ml～10⁸pfu/ml，更優(yōu)選為10⁶pfu/ml～10⁷pfu/ml，還可以取2×10⁶pfu/ml，3×10⁶pfu/ml，4×10⁶pfu/ml，5×10⁶pfu/ml，6×10⁶pfu/ml，7×10⁶pfu/ml，8×10⁶pfu/ml，9×10⁶pfu/ml，5×10⁷pfu/ml，5×10⁸pfu/ml，5×10⁹pfu/ml等中間數(shù)值。

優(yōu)選的，當(dāng)as-zj與as-gz，as-sw，as-yj，as-szw中的一種或多株進行混配時，按感染復(fù)數(shù)等比的方式進行混合。

優(yōu)選的，如上所述的殺菌組合物，所述殺菌組合物還包括輔料；

所述輔料為sm緩沖液、海藻酸鈉、蔗糖、麥芽糖糊精、葡萄糖中的一種或多種；

sm緩沖液的配制方法為常規(guī)方法，例如：nacl5.8g，mgso4·7h2o2g，1mol/l的tris·hcl50ml(ph＝7.0)，5ml2％gelatin，加入純凈水補足至1000ml。

優(yōu)選的，所述殺菌組合物還包括不同種類細菌的特定病原菌的噬菌體。

上述殺菌組合物可作為病毒制劑使用，所用劑型可為各種常見劑型，例如粉劑、水劑、凍干劑、凝膠劑、霜劑、膏劑等。

優(yōu)選的，如上所述的殺菌組合物在殺滅殺鮭氣單胞菌、沙門氏桿菌、弧菌及大腸桿菌中的應(yīng)用；所述應(yīng)用為治療用途或非治療用途。

優(yōu)選的，如上所述的殺鮭氣單胞菌噬菌體、或殺菌組合物在制備用于防治動物癤瘡病或潰瘍病的藥物中的應(yīng)用；

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述動物包括：溫血性動物和部分冷血性動物

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述動物為魚類；

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述魚類為鮭科魚類；

更優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述鮭科魚類包括馬蘇大麻哈魚、駝背大麻哈魚、大麻哈魚、石川哲羅魚，哲羅魚、虎嘉魚、細鱗鮭、白斑紅點鮭、花羔紅點鮭、北鮭、烏蘇里白鮭、卡達白鮭，大西洋鮭、太平洋鮭、銀鮭、虹鱒、河鱒、金鱒。

一種防治魚類癤瘡病或潰瘍病的方法，將如上所述的殺菌組合物作為藥物添加到魚飼料中，或?qū)︳~類體表噴霧，或給魚類灌服，或給魚類注射，或?qū)⑺鰵⒕M合物溶于水中再與魚類接觸。

優(yōu)選的，如上所述的方法，所述魚類為鮭科魚類；

更優(yōu)選的，如上所述的方法，所述鮭科魚類包括馬蘇大麻哈魚、駝背大麻哈魚、大麻哈魚、石川哲羅魚，哲羅魚、虎嘉魚、細鱗鮭、白斑紅點鮭、花羔紅點鮭、北鮭、烏蘇里白鮭、卡達白鮭，大西洋鮭、太平洋鮭、銀鮭、虹鱒、河鱒、金鱒。

在一些實施方式中，本發(fā)明針對由大西洋殺鮭氣單胞菌導(dǎo)致水產(chǎn)品鮭鱒魚類發(fā)生癤瘡病及潰腸病的問題，在抗生素濫用引起的殺鮭氣單胞菌耐藥性出現(xiàn)及單一噬菌體應(yīng)用缺陷的基礎(chǔ)上，以從皮膚潰爛的大西洋鮭肌肉、肝、腎病灶中分離得到的一株致病性殺鮭氣單胞菌為宿主，采用雙層平板法，從水環(huán)境中分離得到10株裂解性噬菌體，通過認識單一噬菌體的侵染特性，從而評估其對宿主菌的感染能力，最后采用一定的混合方法構(gòu)建并確定最佳的雞尾酒組成。該噬菌體雞尾酒可在短時間內(nèi)快速抑制大西洋殺鮭氣單胞菌的生長，并抑制該病原菌噬菌體抗性的產(chǎn)生。該噬菌體雞尾酒安全、有效，且特異性強，生產(chǎn)成本低，在致病菌的控制過程中彌補了單一噬菌體療法的不足。

實施例

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明公開了一種用于高效裂解大西洋殺鮭氣單胞菌噬菌體雞尾酒制劑研究。以從皮膚潰爛的大西洋鮭肌肉、肝、腎分離的一株廣譜耐藥的致病性殺鮭氣單胞菌為宿主，從水環(huán)境中分離得到10株裂性噬菌體，裂解直徑均大于0.3mm，以單株噬菌體裂解效率評價得到最佳感染比例moi為0.1，參考單株噬菌體的吸附曲線、一步生長曲線和最高效價等指標篩選可加入噬菌體雞尾酒的單株噬菌體為as-szw，as-yj，as-zj，as-sw，as-gz。通過排列組合，以宿主菌與噬菌體共培后宿主菌的裂解量及裂解時間為依據(jù)，得到一組短時間內(nèi)高效裂解大西洋殺鮭氣單胞菌的噬菌體雞尾酒組合。此外，為進一步分析該噬菌體雞尾酒的環(huán)境耐受性分析，確定了從以上兩組噬菌體雞尾酒組合的ph耐受性范圍為3～11，70℃溫度下仍具有一定的活性，且海水中培養(yǎng)7d效價略有降低，約為80％。采用常規(guī)液體混合的方式，該噬菌體雞尾酒可快速抑制大西洋殺鮭氣單胞菌的生長，在80h范圍內(nèi)生長曲線od600值為0.05以下。以上五株噬菌體as-szw，as-yj，as-zj，as-sw，as-gz均保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2017年3月6日，保藏編號分別為cctccno:m2017092、cctccno:m2017095、cctccno:m2017091、cctccno:m2017093、cctccno:m2017094。本發(fā)明噬菌體的篩選流程圖如圖1所示。具體的，本發(fā)明以市面上常用抗生素種類為基礎(chǔ)，采用擴散法(k-b法)檢測該致病菌對氯霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢噻肟、多西環(huán)素、吡哌酸、諾氟沙星、氧氟沙星、頭孢唑肟、頭孢唑啉、慶大霉素、復(fù)方新諾明、利福平、萬古霉素、紅霉素、鏈霉素、新霉素、卡納霉素、妥布霉素、青霉素、新霉素、呋喃唑酮、呋喃妥因等24種藥物的藥敏試驗，確認該致病性殺鮭氣單胞菌對前11種抗生素具有很強的耐藥性。

以上步中確認的殺鮭氣單胞菌為宿主，采用雙層平板法并結(jié)合樣品特征從海水樣品中分離噬菌體，通過多次感染確定透明斑，挑取單一噬菌斑進行分離純化，最終于-80℃甘油(20％)保存。本次分離及后續(xù)分析所用培養(yǎng)基均為lb肉湯/瓊脂培養(yǎng)基，雙層平板中，底層為1.5％lb瓊脂培養(yǎng)基，上層為0.7％瓊脂培養(yǎng)基。

采用噬菌體基因組抽提試劑盒(aidlab,dn22)提取各噬菌體的基因組，后用miseq平臺進行全基因組測序，對測序結(jié)果進行序列的拼接及注釋，序列經(jīng)blastn比對后確定as-szw，as-yj，as-zj，as-sw和as-gz五株噬菌體均為殺鮭氣單胞菌噬菌體，其中前4株噬菌體與已報道的aeromanasphagecc2全基因組序列相似性分別為97％，97％，96％，96％，as-gz與已報道的殺鮭氣單胞菌噬菌體phias4的相似性為97％。

單一噬菌體形態(tài)學(xué)和微生物學(xué)水平的評價：1)形態(tài)觀察：單一噬菌體感染宿主菌后，鋪雙層平板，30℃培養(yǎng)12h后，用游標卡尺測定原始透明斑大小，得到噬菌體as-szw，as-yj，as-zj，as-sw，as-gz的大小分別為0.83mm，0.48mm，0.5mm，0.5mm，1mm。噬菌斑形態(tài)如圖2所示。2)吸附能力的測定：以moi＝0.005混合噬菌體與對數(shù)期的宿主菌(殺鮭氣單胞菌)，按照預(yù)設(shè)置時間點(0，1，2，3，4，5，6，10，20，30min)取混合培養(yǎng)液，16000g離心后，采用雙層平板法測定游離態(tài)噬菌體，根據(jù)減法得到as-szw，as-yj，as-zj，as-sw，as-gz吸附時間分別為5min，10min，10min，5min，20min；噬菌體的吸附曲線如圖3所示。3)噬菌體一步生長曲線的測定，moi為0.01(宿主od600＝0.5)，宿主菌與噬菌體預(yù)先30℃下孵育5min，然后12000r/min離心30s，去掉清液，加入5mllb懸浮，最后30℃下培養(yǎng)，每隔10min取樣，共培養(yǎng)90min(as-sw為120min)。測定樣品的效價，得到as-szw，as-yj，as-zj，as-sw，as-gz的裂解周期分別為80min、40min、40min、100min和60min，裂解量分別為145、98、86、86和135；噬菌體的一步生長曲線如圖4所示。4)宿主譜的測定，并根據(jù)感染培養(yǎng)后雙層平板上透明斑形成的特征，評價噬菌體對選定的40株指示菌的敏感性(表1所示)，得到以上5株噬菌體除能專一性裂解氣單胞菌屬下的殺鮭氣單胞菌外，對腸桿菌科下的部分沙門氏桿菌、弧菌及大腸桿菌具有微弱的裂解性。此外，采用通用方法測定上述實驗結(jié)果中確定的最佳噬菌體雞尾酒as-cocktail2-2,5的宿主譜范圍，得到宿主譜為單株噬菌體as-yj和as-gz的疊加。

表1本發(fā)明提供的5株噬菌體及最佳雞尾酒組合的宿主譜

注：“-”表示不具有感染性，“+”表示有感染性，形成透明圈，但未形成透明斑，“++”表示有強烈的感染性，能形成透明斑；“*”表示為本專利內(nèi)容噬菌體的宿主菌

噬菌體雞尾酒的組合方法：以四種感染復(fù)數(shù)(moi＝0.01，0.1，1或10)混合單株噬菌體與宿主菌，根據(jù)宿主菌感染噬菌體后的生長曲線(圖5)測定(od600值)評價噬菌體裂解效率，確定最佳moi值，并根據(jù)最佳moi進行宿主菌的噬菌體感染，以排列組合方式將預(yù)選噬菌體進行混合，各組合按照1:1，1:1:1，1:1:1:1或1:1:1:1:1進行混合后，將對數(shù)期的宿主菌與噬菌體進行混合共培養(yǎng)。

最佳噬菌體雞尾酒的確定：噬菌體與宿主菌混合共培養(yǎng)后，通過測定培養(yǎng)液od600值的變化，繪制宿主菌的生長曲線(圖6)，確定最佳噬菌體雞尾酒組合；其中圖中標號1、2、3、4、5依次代表as-szw，as-yj，as-zj，as-sw和as-gz五株噬菌體。測定時長為80h。得到最佳噬菌體雞尾酒組合為cocktail2-2,5(即as-yj與as-gz)，其在80h范圍內(nèi)生長曲線od600值為0.01以下

最佳噬菌體雞尾酒環(huán)境因子耐受性的評價：測定上述實驗結(jié)果中最佳雞尾酒組合的ph、溫度及在海水中的耐受性。其中ph、溫度耐受性的測定為：一定量效價的噬菌體(100ul，10⁸pfu/ml)加入到含900ul液體(lb液體培養(yǎng)基)的1.5ml的ep管中，在不同ph(ph＝2，4，6，8，10，12；用0.1mol的hcl或naoh調(diào)節(jié)至指定ph)和溫度(4℃，20℃，37℃，60℃，80℃)下培養(yǎng)，后取樣稀釋適當(dāng)倍數(shù)并立刻鋪雙層平板確定效價。其中ph的測定時間為3h，溫度設(shè)置時間為每隔15min取樣，共測定45min。海水環(huán)境中的耐受性測定與溫度測定一致，一定量效價的噬菌體(100ul，10⁸pfu/ml)加入到含900ul海水(海水樣品取自深圳灣、深圳大梅沙、惠州巽寮灣和珠?？诎叮?000r/min離心10min，0.22μm過濾)的1.5ml的ep管中，于20℃下培養(yǎng)，每隔1d取樣，培養(yǎng)一周(7d)，測定噬菌體活性，測定噬菌體活性。得到該噬菌體雞尾酒在ph3～11之間仍具有活性，其最適ph值為8，在60℃溫度下30min仍保持一定的裂解活性，約為70％，37℃及以下溫度對其活性影響不大，80℃下30min失活，其裂解活性低于檢測線，海水中培養(yǎng)7d中的效價無顯著降低，且各海水樣品之間無差異。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。