本發(fā)明涉及農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
：丁醇是一種重要的化工原料和生物燃料，與乙醇相比，丁醇的能量密度高，具有較低的飽和蒸汽壓，熱值與汽油接近，可以作為燃料添加到汽油中，甚至完全代替汽油使用?，F(xiàn)有的丁醇生產(chǎn)方法主要有合成法和發(fā)酵法。近年來，隨著石油價格的攀升和環(huán)境問題的日益嚴峻，采用廉價的可再生生物質(zhì)(植物秸稈、農(nóng)業(yè)殘余物、農(nóng)副產(chǎn)品廢料等纖維素質(zhì)原料)為發(fā)酵底物產(chǎn)丁醇已成為一個研究熱點。而研究現(xiàn)狀表明，丁醇發(fā)酵存在問題包括發(fā)酵液的丁醇濃度較低，丁醇的選擇性不高。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決現(xiàn)有丁醇發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的丁醇濃度較低，丁醇的選擇性不高的問題，而提供一種利用外源電子載體提高農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法。一、玉米秸稈水解液的制備：將質(zhì)量百分數(shù)為0.5％～1.5％的硫酸與玉米秸稈進行混合，并在溫度為110℃～130℃的條件下，酸處理1h～3h，再以去離子水為洗滌液，將玉米秸稈水洗至洗滌液為中性，然后烘干至恒重，得到酸處理后的玉米秸稈，將ph為4.8～5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、纖維素酶及酸處理后的玉米秸稈混合，纖維素酶解45h～50h，得到酶解后的玉米秸稈水解液，將ca(oh)2加入到酶解后的玉米秸稈水解液中進行脫毒0.5h～1h并過濾，然后在溫度為110℃～130℃及壓力為0.05mpa～0.15mpa的條件下，高溫高壓滅菌15min～25min，得到玉米秸稈水解液；所述的質(zhì)量百分數(shù)為0.5％～1.5％的硫酸的體積與玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:(0.05～0.15)g；所述的ph為4.8～5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的體積與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:(0.05～0.15)g；所述的纖維素酶與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1:(8～12)；所述的ca(oh)2的質(zhì)量與酶解后的玉米秸稈水解液的體積比為1g:(650～700)ml；二、含有芐基紫精的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備及發(fā)酵：向玉米秸稈水解液培養(yǎng)基中加入芐基紫精，得到混合物，然后向混合物中接種4％～6％的丁醇發(fā)酵菌液，在溫度為35℃～40℃的條件下，發(fā)酵72h～96h，即完成利用外源電子載體提高農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法；所述的混合物中芐基紫精的濃度為10mg/l～100mg/l；所述的玉米秸稈水解液培養(yǎng)基是按以下步驟制備的：(1)、將nh4ac、k2po4·3h2o及kh2po4加入到水中，得到溶液②；所述的溶液②中nh4ac的濃度為215g/l～225g/l；所述的溶液②中k2po4·3h2o的濃度為45g/l～55g/l；所述的溶液②中kh2po4的濃度為45g/l～55g/l；(2)、將mgso4·7h2o、mnso4·h2o、nacl及feso4·7h2o加入到水中，得到溶液③；所述的溶液③中mgso4·7h2o的濃度為15g/l～25g/l；所述的溶液③中mnso4·h2o的濃度為0.5g/l～1.5g/l；所述的溶液③中nacl的濃度為0.5g/l～1.5g/l；所述的溶液③中feso4·7h2o的濃度為0.5g/l～1.5g/l；(3)、將維生素b1、生物素h及對氨基苯甲酸加入到水中，得到溶液④；所述的溶液④中維生素b1的濃度為0.05g/l～0.15g/l；所述的溶液④中生物素h的濃度為0.5mg/l～1.5mg/l；所述的溶液④中對氨基苯甲酸的濃度為0.05g/l～0.15g/l；(4)、將玉米秸稈水解液在溫度為110℃～130℃及壓力為0.05mpa～0.15mpa的條件下，高溫高壓滅菌15min～25min，滅菌后冷卻，將溶液②、溶液③和溶液④分別通過0.45μm濾膜過濾除菌，然后取溶液②、溶液③及溶液④加入到滅菌后的玉米秸稈水解液中，得到玉米秸稈水解液培養(yǎng)基；所述的滅菌后的玉米秸稈水解液與溶液②的體積比為97:1；所述的滅菌后的玉米秸稈水解液與溶液③的體積比為97:1；所述的滅菌后的玉米秸稈水解液與溶液④的體積比為97:1。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明涉及一種利用外源電子載體提高農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法。通過添加微量的外源電子載體可以促進丁醇的轉(zhuǎn)化率，縮短反應(yīng)周期，同時強烈抑制丙酮合成。向玉米秸稈水解液中加入芐基紫精(bv)，秸稈水解液產(chǎn)生的丁醇含量可達6.49g/l，較傳統(tǒng)的發(fā)酵丁醇含量4.52g/l提高了43.6％，實現(xiàn)了秸稈水解液的高效產(chǎn)發(fā)酵丁醇。本發(fā)明用于一種利用外源電子載體提高農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法。附圖說明圖1為秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇濃度隨時間的變化圖，1為實施例一秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇濃度，2為對比實驗一秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇濃度。具體實施方式具體實施方式一：本實施方式的一種利用外源電子載體提高農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法是按照以下步驟進行的：一、玉米秸稈水解液的制備：將質(zhì)量百分數(shù)為0.5％～1.5％的硫酸與玉米秸稈進行混合，并在溫度為110℃～130℃的條件下，酸處理1h～3h，再以去離子水為洗滌液，將玉米秸稈水洗至洗滌液為中性，然后烘干至恒重，得到酸處理后的玉米秸稈，將ph為4.8～5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、纖維素酶及酸處理后的玉米秸稈混合，纖維素酶解45h～50h，得到酶解后的玉米秸稈水解液，將ca(oh)2加入到酶解后的玉米秸稈水解液中進行脫毒0.5h～1h并過濾，然后在溫度為110℃～130℃及壓力為0.05mpa～0.15mpa的條件下，高溫高壓滅菌15min～25min，得到玉米秸稈水解液；所述的質(zhì)量百分數(shù)為0.5％～1.5％的硫酸的體積與玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:(0.05～0.15)g；所述的ph為4.8～5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的體積與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:(0.05～0.15)g；所述的纖維素酶與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1:(8～12)；所述的ca(oh)2的質(zhì)量與酶解后的玉米秸稈水解液的體積比為1g:(650～700)ml；二、含有芐基紫精的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備及發(fā)酵：向玉米秸稈水解液培養(yǎng)基中加入芐基紫精，得到混合物，然后向混合物中接種4％～6％的丁醇發(fā)酵菌液，在溫度為35℃～40℃的條件下，發(fā)酵72h～96h，即完成利用外源電子載體提高農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法；所述的混合物中芐基紫精的濃度為10mg/l～100mg/l；所述的玉米秸稈水解液培養(yǎng)基是按以下步驟制備的：(1)、將nh4ac、k2po4·3h2o及kh2po4加入到水中，得到溶液②；所述的溶液②中nh4ac的濃度為215g/l～225g/l；所述的溶液②中k2po4·3h2o的濃度為45g/l～55g/l；所述的溶液②中kh2po4的濃度為45g/l～55g/l；(2)、將mgso4·7h2o、mnso4·h2o、nacl及feso4·7h2o加入到水中，得到溶液③；所述的溶液③中mgso4·7h2o的濃度為15g/l～25g/l；所述的溶液③中mnso4·h2o的濃度為0.5g/l～1.5g/l；所述的溶液③中nacl的濃度為0.5g/l～1.5g/l；所述的溶液③中feso4·7h2o的濃度為0.5g/l～1.5g/l；(3)、將維生素b1、生物素h及對氨基苯甲酸加入到水中，得到溶液④；所述的溶液④中維生素b1的濃度為0.05g/l～0.15g/l；所述的溶液④中生物素h的濃度為0.5mg/l～1.5mg/l；所述的溶液④中對氨基苯甲酸的濃度為0.05g/l～0.15g/l；(4)、將玉米秸稈水解液在溫度為110℃～130℃及壓力為0.05mpa～0.15mpa的條件下，高溫高壓滅菌15min～25min，滅菌后冷卻，將溶液②、溶液③和溶液④分別通過0.45μm濾膜過濾除菌，然后取溶液②、溶液③及溶液④加入到滅菌后的玉米秸稈水解液中，得到玉米秸稈水解液培養(yǎng)基；所述的滅菌后的玉米秸稈水解液與溶液②的體積比為97:1；所述的滅菌后的玉米秸稈水解液與溶液③的體積比為97:1；所述的滅菌后的玉米秸稈水解液與溶液④的體積比為97:1。本實施方式的有益效果是：本實施方式涉及一種利用外源電子載體提高農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法。通過添加微量的外源電子載體可以促進丁醇的轉(zhuǎn)化率，縮短反應(yīng)周期，同時強烈抑制丙酮合成。向玉米秸稈水解液中加入芐基紫精(bv)，秸稈水解液產(chǎn)生的丁醇含量可達6.49g/l，較傳統(tǒng)的發(fā)酵丁醇含量4.52g/l提高了43.6％，實現(xiàn)了秸稈水解液的高效產(chǎn)發(fā)酵丁醇。具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述的纖維素酶為羧甲基纖維素酶，所述的羧甲基纖維素酶的酶活為10000u/g～50000u/g。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二之一不同的是：步驟一中將質(zhì)量百分數(shù)為1％的硫酸與玉米秸稈進行混合，并在溫度為121℃的條件下，酸處理2h，再以去離子水為洗滌液，將玉米秸稈水洗至洗滌液為中性，然后烘干至恒重，得到酸處理后的玉米秸稈。其它與具體實施方式一或二相同。具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：步驟一中將ph為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、纖維素酶及酸處理后的玉米秸稈混合，纖維素酶解48h，得到酶解后的玉米秸稈水解液。其它與具體實施方式一至三相同。具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：步驟一中將ca(oh)2加入到酶解后的玉米秸稈水解液中進行脫毒0.5h并過濾，然后在溫度為121℃及壓力為0.1mpa的條件下，高溫高壓滅菌20min，得到玉米秸稈水解液。其它與具體實施方式一至四相同。具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：步驟一中所述的質(zhì)量百分數(shù)為1％的硫酸的體積與玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:0.1g；步驟一中所述的ph為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的體積與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:0.1g；步驟一中所述的纖維素酶與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1:10；步驟一中所述的ca(oh)2的質(zhì)量與酶解后的玉米秸稈水解液的體積比為1g:667ml。其它與具體實施方式一至五相同。具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至六之一不同的是：步驟二中然后向混合物中接種5％的丁醇發(fā)酵菌液，在溫度為37℃的條件下，發(fā)酵72h。其它與具體實施方式一至六相同。具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一至七之一不同的是：步驟二中所述的混合物中芐基紫精的濃度為20mg/l。其它與具體實施方式一至七相同。具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式一至八之一不同的是：步驟二中所述的丁醇發(fā)酵菌液為拜氏梭菌液、丙酮丁醇梭菌液、糖丁酸梭菌液或糖乙酸多丁醇梭菌液。其它與具體實施方式一至八相同。具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式一至九之一不同的是：步驟二中所述的丁醇發(fā)酵菌液是按以下步驟制備的：將1ml丁醇發(fā)酵菌接種到50mlrcm梭菌強化培養(yǎng)基中，然后在溫度為37℃的條件下，厭氧活化培養(yǎng)24h，得到活化好的菌種，然后將活化好的菌種以5％的接種量接種于裝有50ml的玉米秸稈水解液的厭氧瓶中，充氮氣10min，最后在溫度為37℃的條件下，培養(yǎng)24h～48h；所述的玉米秸稈水解液是按以下步驟制備的：將質(zhì)量百分數(shù)為0.5％～1.5％的硫酸與玉米秸稈進行混合，并在溫度為110℃～130℃的條件下，酸處理1h～3h，再以去離子水為洗滌液，將玉米秸稈水洗至洗滌液為中性，然后烘干至恒重，得到酸處理后的玉米秸稈，將ph為4.8～5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、纖維素酶及酸處理后的玉米秸稈混合，纖維素酶解45h～50h，得到酶解后的玉米秸稈水解液，將ca(oh)2加入到酶解后的玉米秸稈水解液中進行脫毒0.5h～1h并過濾，然后在溫度為110℃～130℃及壓力為0.05mpa～0.15mpa的條件下，高溫高壓滅菌15min～25min，得到玉米秸稈水解液；所述的質(zhì)量百分數(shù)為0.5％～1.5％的硫酸的體積與玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:(0.05～0.15)g；所述的ph為4.8～5.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的體積與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:(0.05～0.15)g；所述的纖維素酶與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1:(8～12)；所述的ca(oh)2的質(zhì)量與酶解后的玉米秸稈水解液的體積比為1g:(650～700)ml。其它與具體實施方式一至九相同。采用以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：實施例一：本實施例所述的一種利用外源電子載體提高農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法是按照以下步驟進行的：一、玉米秸稈水解液的制備：將質(zhì)量百分數(shù)為1％的硫酸與玉米秸稈進行混合，并在溫度為121℃的條件下，酸處理2h，再以去離子水為洗滌液，將玉米秸稈水洗至洗滌液為中性，然后烘干至恒重，得到酸處理后的玉米秸稈，將ph為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、纖維素酶及酸處理后的玉米秸稈混合，纖維素酶解48h，得到酶解后的玉米秸稈水解液，將ca(oh)2加入到酶解后的玉米秸稈水解液中進行脫毒0.5h并過濾，然后在溫度為121℃及壓力為0.1mpa的條件下，高溫高壓滅菌20min，得到玉米秸稈水解液；所述的質(zhì)量百分數(shù)為1％的硫酸的體積與玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:0.1g；所述的ph為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的體積與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:0.1g；所述的纖維素酶與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1:10；所述的ca(oh)2的質(zhì)量與酶解后的玉米秸稈水解液的體積比為1g:667ml；二、含有芐基紫精的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備及發(fā)酵：向玉米秸稈水解液培養(yǎng)基中加入芐基紫精，得到混合物，然后向混合物中接種5％的丁醇發(fā)酵菌液，在溫度為37℃的條件下，發(fā)酵72h，即完成利用外源電子載體提高農(nóng)作物秸稈水解液發(fā)酵丁醇產(chǎn)量的方法；所述的混合物中芐基紫精的濃度為20mg/l；所述的玉米秸稈水解液培養(yǎng)基是按以下步驟制備的：(1)、將nh4ac、k2po4·3h2o及kh2po4加入到水中，得到溶液②；所述的溶液②中nh4ac的濃度為220g/l；所述的溶液②中k2po4·3h2o的濃度為50g/l；所述的溶液②中kh2po4的濃度為50g/l；(2)、將mgso4·7h2o、mnso4·h2o、nacl及feso4·7h2o加入到水中，得到溶液③；所述的溶液③中mgso4·7h2o的濃度為20g/l；所述的溶液③中mnso4·h2o的濃度為1g/l；所述的溶液③中nacl的濃度為1g/l；所述的溶液③中feso4·7h2o的濃度為lg/l；(3)、將維生素b1、生物素h及對氨基苯甲酸加入到水中，得到溶液④；所述的溶液④中維生素b1的濃度為0.1g/l；所述的溶液④中生物素h的濃度為1mg/l；所述的溶液④中對氨基苯甲酸的濃度為0.1g/l；(4)、將玉米秸稈水解液在溫度為121℃及壓力為0.1mpa的條件下，高溫高壓滅菌20min，滅菌后冷卻，將溶液②、溶液③和溶液④分別通過0.45μm濾膜過濾除菌，然后取溶液②、溶液③及溶液④加入到滅菌后的玉米秸稈水解液中，得到玉米秸稈水解液培養(yǎng)基；所述的滅菌后的玉米秸稈水解液與溶液②的體積比為97:1；所述的滅菌后的玉米秸稈水解液與溶液③的體積比為97:1；所述的滅菌后的玉米秸稈水解液與溶液④的體積比為97:1；步驟一中所述的纖維素酶為羧甲基纖維素酶，所述的羧甲基纖維素酶的酶活為20000u/g；步驟二中所述的丁醇發(fā)酵菌液是按以下步驟制備的：將1ml丁醇發(fā)酵菌接種到50mlrcm梭菌強化培養(yǎng)基中，然后在溫度為37℃的條件下，厭氧活化培養(yǎng)24h，得到活化好的菌種，然后將活化好的菌種以5％的接種量接種于裝有50ml的玉米秸稈水解液的厭氧瓶中，充氮氣10min，最后在溫度為37℃的條件下，培養(yǎng)24h；所述的丁醇發(fā)酵菌為拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)atcc55025；所述的rcm梭菌強化培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為5g/l，淀粉的濃度為1g/l，酵母粉的濃度為3g/l，蛋白胨的濃度為10g/l，乙酸鈉的濃度為3g/l，氯化鈉的濃度為3g/l，半胱氨酸的濃度為0.5g/l，rcm梭菌強化培養(yǎng)基的ph為6.8，然后在溫度為121℃及壓力為0.1mpa的條件下，高溫高壓滅菌20min；所述的玉米秸稈水解液是按以下步驟制備的：將質(zhì)量百分數(shù)為1％的硫酸與玉米秸稈進行混合，并在溫度為121℃的條件下，酸處理2h，再以去離子水為洗滌液，將玉米秸稈水洗至洗滌液為中性，然后烘干至恒重，得到酸處理后的玉米秸稈，將ph為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、纖維素酶及酸處理后的玉米秸稈混合，纖維素酶解48h，得到酶解后的玉米秸稈水解液，將ca(oh)2加入到酶解后的玉米秸稈水解液中進行脫毒0.5h并過濾，然后在溫度為121℃及壓力為0.1mpa的條件下，高溫高壓滅菌20min，得到玉米秸稈水解液；所述的質(zhì)量百分數(shù)為1％的硫酸的體積與玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:0.1g；所述的ph為4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的體積與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1ml:0.1g；所述的纖維素酶與酸處理后的玉米秸稈的質(zhì)量比為1:10；所述的ca(oh)2的質(zhì)量與酶解后的玉米秸稈水解液的體積比為1g:667ml。實施例二：本實施例與實施例一不同的是：步驟二中所述的混合物中芐基紫精的濃度為10mg/l。其它與實施例一相同。對比實驗一：本對比實驗與實施例一不同的是：步驟二中所述的混合物中芐基紫精的濃度為0mg/l。其它與實施例一相同。圖1為秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇濃度隨時間的變化圖，1為實施例一秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇濃度，2為對比實驗一秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇濃度。發(fā)酵72h結(jié)束后，對比實驗一的丁醇產(chǎn)量為4.52g/l，而加入芐基紫精(bv)的秸稈水解液產(chǎn)生的丁醇含量為6.49g/l，較對比實驗一提高了43.6％，效果顯著；消耗還原糖量g/l產(chǎn)丁醇量g/l丁醇產(chǎn)率g/g對比試驗一12.664.520.36實施例一15.916.490.41實施例二15.235.460.36當(dāng)加入20mg/l的bv時，丁醇產(chǎn)率由0.36g/g提高到0.41g/g。當(dāng)加入10mg/l的bv，最終的產(chǎn)丁醇量為5.46g/l，較對照組提高了20.8％。此外，加入bv不僅使丁醇的濃度提高，通過對拜氏梭菌的代謝影響，改變了丁醇在總?cè)軇┑乃急壤?，?dāng)bv濃度為20mg/l時，丁醇的比例由58.07％提高到79.74％，同時降低了產(chǎn)物中丙酮的濃度，有助于最后產(chǎn)物的分離。當(dāng)前第1頁12