本發(fā)明涉及一種egcg的制備方法，具體涉及一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)高純度egcg的制備方法，屬于植物單體分離純化領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

egcg(epigallocatechingallate)中文名表沒食子兒茶素沒食子酸酯，是綠茶茶多酚(teapolyphenols，tp)的主要組成成分和活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗突變等活性。egcg為白色無定形的結(jié)晶狀物質(zhì)，易氧化聚合，一般呈現(xiàn)淡黃色至褐色；略帶茶香，有澀味；易溶于水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等，微溶于油脂，不溶于苯和氯仿等有機溶劑；可與鐵離子生成綠黑色化合物。

在茶鮮葉中，水分含量約占75％，干物質(zhì)為25％。在干物質(zhì)中糖類約占茶葉干物重的20～25％，主要是纖維素、果膠、淀粉等；蛋白質(zhì)約占20～30％，主要有谷蛋白、白蛋白等；脂肪及類脂物質(zhì)在茶葉中約為8％。次級代謝產(chǎn)物中，茶多酚類占20～35％，主要是兒茶素，占總量70％以上，生物堿占3～5％，由咖啡堿、茶葉堿、可可堿組成，氨基酸占1～4％，芳香物質(zhì)0.005～0.030％，以及茶皂素等。兒茶素類化合物主要包括兒茶素(c)、表兒茶素(ec)、沒食子兒茶素(egc)、兒茶素沒食子酸酯(ecg)和沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)等幾種物質(zhì)，其中egcg占兒茶素類化合物含量的50～60％。

egcg的分離純化是根據(jù)其與雜質(zhì)的差異，結(jié)合工程實際來進行的。主要方法如有機溶劑提取法、金屬離子鹽沉淀法、高效液相色譜法、高速逆流色譜法等。目前，工業(yè)化的egcg制備方法主要是有機溶劑提取法，其優(yōu)點是萃取工藝成熟，容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化；缺點是需要使用大量的有機溶劑反復除雜，工藝繁瑣復雜，產(chǎn)品可能存在有機溶劑的殘留，不夠安全環(huán)保。

目前，從綠茶中分離純化的egcg單體純度普遍為低于98％，較高純度egcg的制備也僅限于實驗室規(guī)模，且工藝方法復雜、成本高，因此，開發(fā)一種適于工業(yè)化生產(chǎn)高純度、低成本、綠色安全的egcg單體的制備方法具有較大的技術(shù)先進性和經(jīng)濟社會效益。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對目前有機溶劑提取法制備egcg工藝復雜、生產(chǎn)過程中使用大量有機溶劑、不夠安全環(huán)保的問題，提供了一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)高純度egcg的制備方法，生產(chǎn)過程中減少了大量有機溶劑的使用，綠色環(huán)保，并且提高了產(chǎn)品的純度。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種egcg的制備方法，包括以下步驟：

(1)綠茶粉碎，裝入提取罐，按照固液比1：8～10加入去離子水，溫度70～90℃，攪拌轉(zhuǎn)速50～60r/min，0.08～0.12mpa真空提取20～30min；

(2)將提取罐內(nèi)1/4～1/2提取液抽出，按照抽出提取液的體積補入去離子水，按照步驟(1)重復提取1～2次；

(3)合并步驟(1)和(2)的提取液，冷卻至40～50℃，采用孔徑為0.2～0.8μm的無機陶瓷膜0.15～0.3mpa過濾，得濾液和濾渣；

(4)取步驟(3)濾液，導入真空濃縮機，40～60℃、0.09～0.12mpa真空濃縮60～90min，得濃縮提取液；

(5)采用大孔吸附樹脂對步驟(4)濃縮提取液進行兒茶素富集，上樣流速1～2bv/h，再依次使用10％、25％、40％、95％乙醇以1～2bv/h流速洗脫4～5個柱體積，根據(jù)薄層色譜跟蹤檢測結(jié)果，收集兒茶素混合物；

(6)采用真空濃縮機50～55℃、0.09～0.12mpa真空濃縮至無醇味，得富集后兒茶素濃縮物；

(7)將步驟(6)兒茶素濃縮物用純水溶解，采用反相色譜填料rp-c18為固定相，以1～2bv/h的流速上樣，采用純水為流動相，3～4bv/h流速洗脫3～4個柱體積，根據(jù)薄層色譜跟蹤檢測結(jié)果，收集egcg餾分；

(8)采用真空濃縮機溫度45～55℃、0.09～0.12mpa濃縮30～60min，再采用真空凍干機進行冷凍干燥，水分含量控制在6％以下，得egcg凍干粉。

步驟(3)所述無機陶瓷膜為al2o3陶瓷膜。

步驟(5)所述大孔吸附樹脂為d101型，粒徑范圍為0.3～1.2mm。

步驟(7)所述反相色譜填料的粒度為20～60μm。

本發(fā)明取得的技術(shù)效果為：

(1)采用去離子水替代乙醇或者丙酮等有機溶劑對綠茶進行浸提，既保證了較高的提取率，又減少了大量有機溶劑的使用和回收，大大降低成本，更加適用于大規(guī)模egcg生產(chǎn)。

(2)采用真空減壓浸提工藝，egcg不縮聚、不氧化，不僅增加了穩(wěn)定性，而且提高了提取率，終產(chǎn)物制備量達到公斤級。

(3)采用無機陶瓷膜對茶葉原料提取物在上柱之前進行錯流過濾，在一定操作壓差的作用下，膜穩(wěn)定性更好、孔徑分布窄、機械強度高、不易被污染堵孔，小于膜孔徑的物質(zhì)通過膜孔進入滲透側(cè)成為濾液，而大于孔徑的物質(zhì)則被膜截流而成為濃縮液，從而達到分離、濃縮的目的，可以去除懸浮顆粒、細菌、大分子多糖、蛋白質(zhì)、膠質(zhì)等物質(zhì)，增強后續(xù)樹脂柱床對兒茶素的吸附和交換，減少堵柱現(xiàn)象發(fā)生，提高工作效率，相比傳統(tǒng)膜過濾方法更適于大規(guī)模生產(chǎn)。

(4)從茶多酚中分離純化egcg，egcg與ecg的分離一直是分離純化的難點，本發(fā)明直接使用純水作為洗脫劑，充分發(fā)揮反相填料對于物質(zhì)極性大小差異的辨別能力，利用過載效應，大大提高了上樣量和分離效果，而且無需處理試劑，降低工藝成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

(5)采用無機陶瓷膜-大孔吸附樹脂-反向c18柱層析聯(lián)用，提高egcg純度，純度高達99.5％以上。在整個制備工藝過程中只采用水和含水乙醇等溶劑，能做到無毒、安全、工藝簡單，而且陶瓷膜、樹脂和反向色譜柱填料可再生利用，降低生產(chǎn)成本，適于工業(yè)化生產(chǎn)高質(zhì)量egcg。

附圖說明

圖1為對照品溶液hplc色譜圖，峰1為egcg。

圖2為供試品i溶液hplc色譜圖，峰1為egcg。

圖3為供試品ii溶液hplc色譜圖，峰1為egcg。

具體實施方法

下面結(jié)合實施例進一步詳細說明本發(fā)明技術(shù)方案。

實施例1工業(yè)級高純度egcg的制備

(1)采用粉碎機將綠茶粉碎，稱取100kg綠茶粉末，裝入1200l提取罐中，加入800l去離子水，升溫至70℃，攪拌轉(zhuǎn)速60r/min，0.08mpa真空提取30min。

(2)用抽濾管將提取罐內(nèi)400l提取液抽出，向罐內(nèi)補入400l離子水按照步驟(1)重復提取1次。

(3)合并步驟(1)和(2)的提取液，冷卻至40℃，采用孔徑為0.2μm的al2o3陶瓷膜過濾器0.3mpa過濾，得濾液和濾渣，棄掉濾渣。

(4)取步驟(3)濾液，導入真空濃縮機，60℃、0.12mpa真空濃縮60min，得濃縮提取液160l；取提取液樣品干燥稱重，計算提取率為28.2％。

(5)稱取粒徑范圍為0.3～1.2mm的d101型大孔吸附樹脂(科海思北京科技有限公司)15kg，加入30l95％乙醇室溫下超聲溶脹60min；樹脂充分溶脹后濕法裝柱，柱高2m，柱直徑15cm，用去離子水平衡3個柱體積；取步驟(4)濃縮提取液，1bv/h流速上樣；帶樣品進入柱體后，依次用10％、25％、40％、95％乙醇以2bv/h流速洗脫4個柱體積；根據(jù)薄層色譜跟蹤檢測結(jié)果，收集兒茶素混合物50l。

(6)采用真空濃縮機50℃、0.09mpa真空濃縮至無醇味，得富集后兒茶素濃縮物1.35kg。

(7)將步驟(6)兒茶素濃縮物用3l純水溶解，采用粒度為20～40μm反相色譜填料rp-c18(sigma公司)為固定相，柱高1m，柱直徑8cm，1bv/h的流速上樣；再采用純水為流動相，4bv/h流速洗脫，洗脫3倍柱體積，根據(jù)薄層色譜跟蹤檢測結(jié)果，收集egcg餾分；

(8)采用真空濃縮機45℃、0.12mpa濃縮30min；采用真空冷凍干燥機凍干，水分含量控制在6％以下，得到egcg凍干粉0.96kg；經(jīng)hplc檢測分析(如圖2)，制備的egcg純度為99.6％。

實施例2工業(yè)級高純度egcg的制備

(1)采用粉碎機將綠茶粉碎，稱取100kg綠茶粉末，裝入1200l提取罐中，加入1000l去離子水，升溫至90℃，攪拌轉(zhuǎn)速50r/min，0.12mpa真空提取20min。

(2)用抽濾管將提取罐內(nèi)250l提取液抽出，向罐內(nèi)補入250l離子水按照步驟(1)重復提取2次。

(3)合并步驟(1)和(2)的提取液，冷卻至50℃，采用孔徑為0.8μm的al2o3陶瓷膜過濾器0.15mpa過濾，得濾液和濾渣，棄掉濾渣。

(4)取步驟(3)濾液，導入真空濃縮機，40℃、0.09mpa真空濃縮90min，得濃縮提取液120l；取提取液樣品干燥稱重，計算提取率為29.6％。

(5)取粒徑范圍為0.3～1.2mm的d101型大孔吸附樹脂(科海思北京科技有限公司)15kg，加入30l95％乙醇室溫下超聲溶脹60min；樹脂充分溶脹后濕法裝柱，柱高2m，柱直徑15cm，用去離子水平衡3個柱體積；取步驟(4)濃縮提取液，2bv/h流速上樣；帶樣品進入柱體后，依次用10％、25％、40％、95％乙醇以1bv/h流速洗脫5個柱體積；根據(jù)薄層色譜跟蹤檢測結(jié)果，收集兒茶素混合物80l。

(6)采用真空濃縮機55℃、0.12mpa真空濃縮至無醇味，得富集后兒茶素濃縮物1.42kg。

(7)將步驟(6)兒茶素濃縮物用3l純水溶解，采用粒度為40～60μm反相色譜填料rp-c18(sigma公司)為固定相，柱高1m，柱直徑8cm，2bv/h的流速上樣；再采用純水為流動相，3bv/h流速洗脫，洗脫4倍柱體積，根據(jù)薄層色譜跟蹤檢測結(jié)果，收集egcg餾分；

(8)采用真空濃縮機55℃、0.09mpa濃縮60min；采用真空冷凍干燥機凍干，水分含量控制在6％以下，得到egcg凍干粉1.05kg；經(jīng)hplc檢測分析(如圖3)，制備的egcg純度為99.5％。

實施例3采用hplc法檢測egcg純度

(1)檢測條件

儀器型號：液相色譜儀agilent1260

色譜柱：agilentporoshell120sb-c18(4.6×100mm,2.7μm)

流動相：乙腈-0.1％甲酸水

流速：1.0ml/min

檢測波長：280nm

柱溫：30℃

進樣量：5μl

梯度洗脫條件：流動相a為乙腈，流動相b為0.1％甲酸水

(2)溶液的制備

對照品溶液的制備：取egcg對照品(中國藥品生物檢定所提供，純度≥98％)適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋成濃度為2.3mg/ml的對照品儲備液。精密量取1ml，置10ml量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得濃度為0.23mg/ml的對照品溶液。

供試品i溶液的制備：取實施例1制備的egcg凍干粉約143mg，精密稱定，置20ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，甲醇定容，0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

供試品ii溶液的制備：取實施例2制備的egcg凍干粉約23mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，甲醇定容，0.22μm微孔濾膜過濾，即得。

(3)系統(tǒng)適用性試驗

按上述色譜條件分析，表沒食子兒茶素沒食子酸酯色譜峰對稱因子在0.95～1.15之間，與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，色譜峰的理論塔板數(shù)大于60000。取對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣5次，計算表沒食子兒茶素沒食子酸酯峰面積的rsd％為0.7％，表明儀器精密度良好。對照品溶液和供試品溶液色譜圖見附圖1、圖2和圖3。

(4)樣品測定

按上述溶液制備方法平行制備供試品、對照品溶液，在上述色譜條件下測定，每份供試品進樣2針，按外標法以峰面積計算egcg的含量。

計算公式：

式中：

供試品溶液中主成分的峰面積均值

對照品溶液中主成分的峰面積均值

v：供試品溶液的體積

d：供試品溶液的稀釋倍數(shù)

w：供試品的稱樣量

(5)測定結(jié)果

標準溶液濃度：0.23mg/ml

標準溶液峰面積平均值：1854.55

供試品測定結(jié)果：