本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及一種檢測流行性乙型腦炎病毒的等溫擴增技術與封閉式側向流層析技術相結合的試劑盒及應用。

背景技術：

流行性乙型腦炎又稱日本乙型腦炎(japaneseencephalitis，je)，簡稱乙腦，是由流行性乙型腦炎病毒(japaneseencephalitisvirus，jev)引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性人畜共患傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(oie)列為二類動物疫病，被我國衛(wèi)生部列為乙類傳染病。該傳染病主要以三帶緣庫蚊(culextritaeniorhynchus)作為主要的傳播媒介，以高熱和狂暴或者沉郁等神經(jīng)癥狀為主要特征。流行性乙型腦炎的爆發(fā)具有明顯的季節(jié)性和一定的地理分布區(qū)，多發(fā)生于夏秋季節(jié)蚊類孳生的季節(jié)，屬于自然疫源性蟲媒傳染病。

乙型腦炎主要流行于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，特別是亞洲東部、東南部的水稻產(chǎn)區(qū)，氣候溫暖、潮濕多雨，蚊蟲大量孳生時最為流行，故該病大規(guī)模流行呈現(xiàn)一定的周期性。乙型腦炎流行初期主要發(fā)生在日本、朝鮮和中國等溫帶地區(qū)，日本于1924年首次證實該病，并分離到病毒。如今，乙型腦炎已經(jīng)擴展到北起俄羅斯、西伯利亞，南至澳大利亞，東抵美國關島，西達印度西海岸，而其流行區(qū)域還在逐漸擴大。我國處于乙腦病毒流行區(qū)域，是乙腦發(fā)病人數(shù)最多的國家，先后爆發(fā)過三次乙腦流行，除了青海、新疆、西藏以外的各省市均有發(fā)病的報道。乙型腦炎的流行呈明顯的季節(jié)性，發(fā)病的高峰期在7、8月之間。隨著乙腦疫苗的推廣和規(guī)范，乙腦的發(fā)病率明顯下降，局部區(qū)域時有爆發(fā)，疫區(qū)主要分布在河南、安徽、江蘇、江西等地，尤其是海南、廣東、臺灣以及福建。

流行性乙型腦炎病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，乙型腦炎病毒粒子為球形，二十面體對稱，直徑約35-40nm，分子量為4.2×106d。jev基因組全長約11kb，由5′-utr(untranslatedregion,utr)、3′-utr以及僅有的一個開放讀碼框(openreadingframe，orf)共同組成一個開放式閱讀框(orf)，編碼大小為3432個多聚蛋白體。其中，e蛋白是jev最重要的結構蛋白，也是目前研究最廣泛和充分的蛋白。e蛋白分子量為53kda，含有500個氨基酸殘基，其對應的基因組也是相對保守的區(qū)域。

目前常用于檢測流行性乙型腦炎的方法包括病原的分離鑒定、血清學方法和rt-pcr、熒光定量pcr。其中病原的分離鑒定是最傳統(tǒng)的檢測方法，其結果準確可靠，但其影響因素多，實際操作起來相當費時費力，因此在臨床應用中有一定的局限性；血凝抑制試驗、補體結合試驗、中和試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等血清學試驗的敏感性及特異性較低，操作也比較麻煩；而rt-pcr、熒光定量pcr技術需要特殊的儀器設備(如pcr儀和凝膠成像系統(tǒng)等)和專業(yè)人員進行相關的操作，顯然無法滿足基層和現(xiàn)場檢測的需求。

重組酶聚合酶等溫擴增技術(recombinaseploymeraseamplication,rpa)是由重組酶聚合酶介導的擴增原理，模擬生物體內dna復制，在常溫下即可對目標片段進行等溫擴增。該技術主要依賴于三種酶：t4噬菌體編碼的重組酶蛋白uvsx和uvsy、單鏈結合蛋白gp32及bsudna聚合酶。其中，重組酶蛋白可以與引物結合，形成dna核蛋白微絲，微絲可以結合匹配的dna片段，并緊密結合發(fā)生重組，在單鏈結合蛋白的幫助下,模板dna開始解鏈,在bsudna聚合酶的作用下進行復制延伸,對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。整個過程僅需在37-42℃下反應20-40分鐘即可。與pcr相比，整個過程不需要高溫變性和低溫退火，反應簡單、快速高效。目前，該技術已經(jīng)成功應用于各種病原檢測以及轉基因、癌癥等多個領域。ahmedabdeiwahed等應用rt-rpa設計了禽流感(h7n9)病毒的便攜式診斷方法，同時，也開發(fā)了埃博拉病毒的便攜式rt-pcr裝置；chien-chungchao等研發(fā)了立克次體的rpa檢測方法。但目前沒有將該技術應用到流行性乙型腦炎上。

本發(fā)明針對流行性乙型腦炎病毒的e基因，建立并評估了基于rt-rpa核酸試紙條檢測試劑盒。與常規(guī)pcr引物不同，rpa所需的引物長度為30-35bp，探針序列的長度為46-52bp,引物設計時為了避免形成引物內部及之間的二級結構，其長度的增加也使引物設計及選擇難度的增加，因此，引物的設計和選擇對rpa的結果至關重要。rpa技術正處于起步研究階段，尚無專門的引物、探針設計軟件，也沒有大量的數(shù)據(jù)為其引物設計原則提供依據(jù)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一具有高靈敏度、高特異性、可視化的、操作方法簡單、密閉的檢測流行性乙型腦炎病毒的rt-rpa核酸試紙條試劑盒。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種檢測流行性乙型腦炎病毒的rt-rpa核酸試紙條試劑盒，包含如下引物組、探針和核酸檢測試紙條：

所述的引物組的核苷酸序列如下所示：

jev-rpa-f：5’-(biotin)cggaaaaccatgggaattactcagcgcaa-3’

jev-rpa-r：5’-catgtgcctcttcaaattccatgaggagttc-3’

jev-rpa-p：5’-(fitc(fam))ctccttggttcacaatccagtgtgacttct

c(thf)cataatcaccaagct(c3spacer)-3’

引物jev-rpa-f的5’端修飾了biotinlabel；探針jev-rpa-p的5’端修飾了6-carboxyfluorescein(fam)label,中間修飾了abasictetrahydrofuran(thf)residue,3’端修飾了c3spacer。

所述的核酸檢測試紙條為通用型核酸檢測試紙條；

所述的檢測流行性乙型腦炎的rt-rpa核酸試紙條試劑盒包含上述引物組、探針、twistamptmnfokit和全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置；

所述的全封閉式靶核酸擴增物快速檢測裝置為杭州優(yōu)思達生物技術有限公司產(chǎn)品；該檢測裝置為將通用型核酸檢測試紙條置入一個掌上塑料檢測裝置內得到；

所述的twistamptmnfokit即重組酶聚合酶等溫擴增技術，購自英國twistdx公司；試劑盒包括重組酶聚合酶凍干酶粉、水解緩沖液rehydrationbuffer、280mm醋酸鎂溶液。

所述的檢測流行性乙型腦炎的rt-rpa核酸試紙條試劑盒的應用，包含以下步驟：

(1)配置rt-rpa反應體系，在rpa凍干顆粒中加入29.5μlrehydrationbuffer，2.1μl10μmprimera，2.1μl10μmprimerb，0.6μl10μm探針，9.2μl雙蒸水，4μl病毒dna模板，在反應管蓋上加280mm醋酸鎂溶液2.5μl，上下顛倒反應管使之充分混勻后離心；恒溫反應；

(2)反應：將步驟(1)恒溫反應后的產(chǎn)物用核酸檢測試紙條檢測,2-5min觀察結果；

(3)結果判讀：直接肉眼判讀

①陰性：僅在質控區(qū)一條紅色條帶，在檢測區(qū)內無紅色條帶出現(xiàn)，證明所檢測的樣本沒有流行性乙型腦炎病毒感染；

②陽性：出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測區(qū)內，另一條位于質控區(qū)內，證明所檢測的樣本為流行性乙型腦炎病毒感染；

③無效：質控區(qū)和檢測區(qū)內均無紅色條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。

擴增反應在溫度設定為37-42℃的水浴鍋中進行，反應時間15-30min，結束后通過側向流動層析試紙條對結果進行檢測。

更優(yōu)選的，擴增反應在溫度設定為37℃的水浴鍋中進行，反應時間為20min,結束后通過側向流動層析試紙條對結果進行檢測。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益結果：

(1)本發(fā)明系首次采用rt-rpa核酸檢測試紙條建立快速檢測jev的方法，并通過特異性和靈敏度評價，可用于臨床現(xiàn)場檢測，為jev的現(xiàn)場檢測提供了一種靈敏、可靠的新方法。本發(fā)明的引物和探針組合是需要從靶標序列兩端設計多對引物進行優(yōu)化、篩選才能得到。

(2)采用本發(fā)明的引物和探針組合，通過rpa技術對流行性乙型腦炎病毒進行檢測的方法具有較高的靈敏度、特異性和重復性。

本發(fā)明選用的流行性乙型腦炎e基因引物是經(jīng)過大量試驗篩選獲得的，特異性好，與豬的其他病毒包括豬瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細小病毒、豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒ⅰ型、豬圓環(huán)病毒ⅱ型無交叉反應。rpa能夠將痕量的核酸模板擴增到可以檢測的水平；本發(fā)明所建立的檢測方法可檢測到的100pgcdnajev病毒。

(3)本發(fā)明的rpa技術并結合核酸試紙條技術檢測流行性乙型腦炎病毒的方法，既具有分子生物學檢測的高靈敏、高通量，又具有免疫學檢測的特異性好、操作簡便的優(yōu)點，還不需復雜儀器，尤其適于基層實驗室和現(xiàn)場的流行性乙型腦炎病毒的檢測。

(4)檢測速度快：與常規(guī)pcr相比，不用經(jīng)過變性、退火、延伸三個步驟，rpa最適溫度在37-42℃之間，無需變性，在常溫下20min左右即可完成反應。

(5)不需要復雜的儀器設備，適用于現(xiàn)場檢測，本發(fā)明所建立檢測方法可以在常溫等溫條件下擴增、試紙條可視化檢測，不需要pcr儀、熒光定量pcr儀、電泳儀、電泳槽等復雜的儀器設備，且rpa不需要復雜的樣品處理，可以真正實現(xiàn)便攜式的現(xiàn)場快速核酸檢測。

附圖說明

圖1為jevrt-rpa凝膠檢測體系的建立及引物篩選結果圖，其中：

a為篩選上游引物電泳亮度關系圖，以r1為下游引物，上游引物為f1-f4，泳道1～4依次對應上游引物f1、f2、f3、f4，得出f2為最佳上游。

b為篩選上游引物電泳亮度關系圖，以f2為上游引物，下游引物為r1-r4，泳道1～4依次對應上游引物r1、r2、r3、r4，得出r1為最佳上游。

圖2為jevrt-rpa-lfd檢測方法的建立以及不同jev毒株rt-rpa-lfd檢測方法分析，其中：

a為jevrt-rpa-lfd檢測方法建立結果圖，分別表示為1:ddh2o(空白對照)；2:陰性細胞液(控制對照)；3:陰性血液(控制對照)；4:陰性腦組織(控制對照)；5:陰性蚊子(控制對照)6:jev/sw/gd/2009株陽性對照。

b為不同jev毒株rt-rpa-lfd檢測方法分析：分別表示為1：空白對照；2：jev/sw/gd/2009株；3：p3株；4：sa14-14-2株

圖3為檢測本發(fā)明試劑盒特異性的結果圖，其中：

第一個檢測裝置是以ddh2o為模板的rt-rpa反應產(chǎn)物；第二個檢測裝置是以csfv(豬瘟病毒)石門株基因組為模板的rt-rpa反應產(chǎn)物；第三個檢測裝置是以pedv(豬流行性腹瀉病毒)基因組為模板的rt-rpa反應產(chǎn)物；第四個檢測裝置是以prrsv(豬繁殖與呼吸綜合征)為模板的rt-rpa反應產(chǎn)物；第五個檢測裝置是以ppv(豬細小病毒)為模板的rt-rpa反應產(chǎn)物；第六個檢測裝置是以prv(偽狂犬病毒)為模板的rt-rpa反應產(chǎn)物；第七個檢測裝置是以pcv-i(豬圓環(huán)病毒-ⅰ型)為模板的rt-rpa反應產(chǎn)物；第八個檢測裝置是以pcv-ii(豬圓環(huán)病毒-ⅱ型)為模板的rt-rpa反應產(chǎn)物；第九個檢測裝置是以jev(流行性乙型腦炎病毒)為模板的rt-rpa反應產(chǎn)物。

圖4為jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr的敏感性檢測結果圖，其中：

a為jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr電泳凝膠檢測體系cdna含量敏感性結果圖，圖中均為：1的模板是ddh2o(空白對照)；2的模板是含量1ug的jevcdna；3的模板是含量為100ng的jevcdna；4的模板是含量為10ng的jevcdna；5的模板是含量為1ng的jevcdna；6的模板為含量為100pg的jevcdna；7的模板是含量為10pg的jevcdna；8的模板是含量為1pg的jevcdna；9的模板是含量為100fg的jevcdna；10的模板是含量為10fg的jevcdna。

b為jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr電泳凝膠檢測體系毒株梯度稀釋敏感性結果圖，圖中均為：1的模板是ddh2o(空白對照)；2的模板是毒株濃度為107.5tcid50/ml；3的模板是毒株濃度為106.5tcid50/ml；4的模板是毒株濃度為105.5tcid50/ml；5的模板是毒株濃度為104.5tcid50/ml；6的模板是毒株濃度為103.5tcid50/ml；7的模板是毒株濃度為102.5tcid50/ml；8的模板是毒株濃度為101.5tcid50/ml；9的模板是毒株濃度為100.5tcid50/ml。

c為jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr電泳凝膠檢測體系豬腦模型臨床模擬梯度稀釋敏感性結果圖，將tcid50/ml是107.5的jev/sw/gd/2009株作為初始毒株，用豬腦組織稀釋液對初始毒株進行10倍梯度進行稀釋(100～10-6)，圖中均為：1的模板是陰性豬腦組織研磨液(空白對照)；2的模板是稀釋梯度100即tcid50/ml為107.5；3的模板是稀釋梯度10-1即tcid50/ml為106.5；4的模板是稀釋梯度10-2即tcid50/ml為105.5；5的模板是稀釋梯度10-3即tcid50/ml為104.5；6的模板是稀釋梯度10-4即tcid50/ml為103.5；7的模板是稀釋梯度10-5即tcid50/ml為102.5；8的模板是稀釋梯度10-6即tcid50/ml為101.5。

d為jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr電泳凝膠檢測體系蚊子模型臨床模擬梯度稀釋敏感性結果圖，將tcid50/ml是107.5的jev/sw/gd/2009株作為初始毒株，用蚊子組織稀釋液對初始毒株進行10倍梯度進行稀釋(100～10-6)，圖中均為：1的模板是陰性豬腦組織研磨液(空白對照)；2的模板是稀釋梯度100即tcid50/ml為107.5；3的模板是稀釋梯度10-1即tcid50/ml為106.5；4的模板是稀釋梯度10-2即tcid50/ml為105.5；5的模板是稀釋梯度10-3即tcid50/ml為104.5；6的模板是稀釋梯度10-4即tcid50/ml為103.5；7的模板是稀釋梯度10-5即tcid50/ml為102.5；8的模板是稀釋梯度10-6即tcid50/ml為101.5。

e為jevrt-rpa-lfd和jevrt-pcr電泳凝膠檢測體系重組質粒標準品梯度稀釋敏感性結果圖，圖中均為：1的模板是ddh2o(空白對照)；2的模板是1010拷貝/μl；3的模板是109拷貝/μl；4的模板是108拷貝/μl；5的模板是107拷貝/μl；6的模板是106拷貝/μl；7的模板是105拷貝/μl；8的模板是104拷貝/μl；9的模板是103拷貝/μl；10的模板是102拷貝/μl；11的模板是101拷貝/μl；12的模板是10-1拷貝/μl。

具體實施方式

下面結合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內容進行限定。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或者替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。

以下實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

twistampnofkits購自twistdx公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；提取病毒dna/rna試劑盒購自omegabio-tek公司；m-mlv反轉錄酶，rna酶抑制劑、2×taqpcrmixdna聚合酶、隨機引物、dntp(2.5mm)、瓊脂糖購自takara公司；全封閉式靶核酸擴增產(chǎn)物快速檢測裝置購自杭州優(yōu)思達生物技術有限公司。

實施例1快速檢測流行性乙型腦炎病毒的rt-rpa核酸試紙條試劑盒及檢測方法的建立。

一、引物及探針序列的設計及制備

本發(fā)明發(fā)明人通過對genbank中的jev基因同源序列進行對比分析，確定了流行性乙型腦炎病毒e基因的保守區(qū)域，根據(jù)rpa引物設計原則，針對該區(qū)域設計了引物和探針，以期能夠檢測到盡可能多的流行性乙型腦炎病毒。rpa對引物長度的要求是30-35bp，擴增產(chǎn)物在500bp之內，擴增效率較高。要建立一種快速、靈敏的檢測方法，需要進行多次引物的篩選，引物個別堿基差異會對擴增效果產(chǎn)生影響，所以，在保守基因區(qū)域，設計一系列梯度候選引物，再根據(jù)rt-rpa凝膠檢測的結果，從中選擇最佳引物。針對jeve基因的保守區(qū)域序列，應用引物設計軟件primepremier5.0進行rpa引物設計，同時應用生物軟件oligo7.0對引物進行初步篩選，以確保各引物對之間產(chǎn)生的二聚體較少為原則。設計引物對，并由上海生工生物工程技術服務有限公司對所設計的引物進行合成與標記。本發(fā)明分別設計合成了四條上游引物、四條下游引物、一條探針，如下表所示：

二、流行性乙型腦炎病毒rt-rpa反應

1、病毒rna的抽提：

取本實驗室保藏jev/sw/gd/2009株、p3株，使用omegaviralrnaextractionkitver.5.0抽提rna，所用離心管等耗材均經(jīng)0.1﹪depc處理，確保無rna酶污染，按照以下步驟進行抽提：

(1)配置qvlbuffer：每管(即每個樣品)含有560μlqvlbuffer，添加5.6μlcarrierrna，10μlβ-巰基乙醇，現(xiàn)配現(xiàn)用；

(2)添加140μl樣品，充分混勻30s；

(3)室溫孵育5-10min；

(4)添加560μl無水乙醇，充分混勻30s；

(5)加650μl混合物至hibindrna,操作要仔細而迅速，10000g,30s棄濾液；

(6)重復步驟(5)至所有的液體全部經(jīng)過濾柱；

(7)換新的2ml收集管，加500μlrwa，10000g離心30s后，棄濾液；

(8)換新的2ml收集管，加500μlrwb,，10000g離心30s后，棄濾液；

(9)空管10000g離心3min后，棄濾液；

(10)換新的1.5mlep管加30-50μldepc水，靜置3-5min，10000g離心1min。

2、cdna合成

以提取的rna為模板，用mlv酶進行反轉錄反應，反應體系如下：

(1)配置rna反轉錄反應預體系，將提取的rna吸取5.75μl于新的1.5mlep管中，再加入1μl隨機引物，70℃水浴10min后立即冰浴2min。

(2)配置rna反轉錄反應體系，rna引物混合液6.75μl，5×buffer2μl，dntpmix0.5μl，rnaseinhibitor0.25μl，m-mlv0.5μl，充分混勻，然后30℃水浴10min，42℃水浴1h。

3、jevrt-rpa凝膠檢測體系的建立及引物篩選：

我們以提取純化的病毒dna為模板進行擴增，并對設計引物進行篩選，篩選出最優(yōu)引物。實驗步驟如：

①以r1為下游引物，篩選上游引物f1-f4。

(1)配置rt-rpa初始反應體系：29.5μl水解緩沖液(rehydrationbuffer,twistampnofkit)，9.2μl的ddh2o,2.4μl上游引物(10μm)，2.4μl下游引物(10μm)，4μl的病毒dna模板；

(2)rt-rpa凝膠檢測反應步驟：將上述47.5μl緩沖液轉移到含有凍干酶粉的0.2ml的twistampnofkit反應管中，經(jīng)移液器反復吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μl的280mm的醋酸鎂溶液，混勻后反應即刻發(fā)生；

(4)將反應管放入37℃的金屬恒溫箱中，處理5min；

(5)反應5min后，取出反應管，再次混勻后繼續(xù)放入37℃的金屬恒溫箱中反應20min；

(6)反應結束后，用2％的瓊脂糖電泳鑒定,得出f2為最佳下游。試驗結果如圖1a所示；

②以f2為上游引物，篩選下游引物r1-r4，得出r1為最佳上游，試驗結果如圖1b所示，結果確定jevrt-rpa凝膠反應體系最優(yōu)引物。

4、jevrt-rpa試紙條檢測體系的建立

①探針設計，探針5’端標記fam基團，中間thf替代g或c(dspacer)，且dspacer兩側盡量避免g、c，dspacer與5’端至少30堿基，與3’端至少15堿基，3’端c3-spacer修飾。

②在篩選出的最佳引物中，將探針相對應的引物的5’標記生物素(biotin)。rt-rpa-lfd反應體系引物與探針序列如下所示：

jev-rpa-f：5’-(biotin)cggaaaaccatgggaattactcagcgcaa-3’

jev-rpa-r：5’-catgtgcctcttcaaattccatgaggagttc-3’

jev-rpa-p：5’-(fitc(fam))ctccttggttcacaatccagtgtgacttct

c(thf)cataatcaccaagct(c3spacer)-3’

③具體實現(xiàn)步驟如下所示：

(1)以病毒cdna為模板作為陽性對照，以ddh2o為陰性對照，以陰性細胞液、陰性血液、陰性腦組織、陰性蚊子為控制對照，；分別加入下列組分：29.5μl水解緩沖液(rehydrationbuffer,twistampnofkit)，9.2μl的ddh2o，2.1μl上游引物(10μm)，2.1μl下游引物(10μm)，0.6μl探針(10μm)，4μl模板；

(2)rt-rpa凝膠檢測反應步驟：將上述47.5μl緩沖液轉移到含有凍干酶粉的0.2ml的twistampnofkit反應管中，經(jīng)移液器反復吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μl的280mm的醋酸鎂溶液，混勻后反應即刻發(fā)生；

(4)將反應管放入37℃的金屬恒溫箱中，處理5min；

(5)反應5min后，取出反應管，再次混勻后繼續(xù)放入37℃的金屬恒溫箱中反應20min；

(6)反應結束后，用核酸試紙條密閉反應裝置進行檢測，通過試紙條的顯色進行判讀。試驗結果如圖2a所示。

5、不同jev毒株rt-rpa-lfd方法分析，包括jev/sw/gd/2009株、p3株、sa14-14-2株，其中jev/sw/gd/2009株、p3株由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室保藏；日本乙型腦炎活疫苗(日本乙型腦炎病毒(jev)sa14-14-2株)由武漢科前生物技術有限公司生產(chǎn)，具體操作如4jevrt-rpa試紙條檢測體系的建立所要求，試驗結果如圖2b所示。

6、檢測體系特異性、敏感性分析

為了檢驗jevrt-rpa-lfd檢測方法的特異性，本試驗選擇豬瘟病毒(csfv)、流行性腹瀉病毒(pedv)、豬藍耳病毒(prrsv)的cdna，豬細小病毒(ppv)、偽狂犬病毒(prv)、豬圓環(huán)病毒1型(pcv-1)、豬圓環(huán)病毒2型(pcv-2)的dna作為特異性對照組，用rt-rpa-lfd方法進行檢測。試驗結果表明，只有jev陽性模板呈現(xiàn)質(c)、檢(t)兩條紅線，檢測結果是陽性，其他病毒均只有質控線(c)一條紅線，檢測結果是陰性。試驗結果如圖3所示，該結果表明所建立的jevrt-rpa-lfd檢測方法具有良好的特異性。

jevrt-rpa-lfd方法的敏感性分析：

①jevrt-rpa-lfd方法的cdna敏感性分析，抽提jev/sw/gd/2009株的rna模板并反轉錄成cdna，制備出jev的cdna標準品(1μg/μl)作為初始模板，將初始模板進行10倍梯度稀釋(10-1～10-9)，反應產(chǎn)物分別用常規(guī)rt-pcr凝膠電泳、rt-rpa-lfd方法進行檢測。試驗結果如圖4a顯示，常規(guī)rt-rcr瓊脂糖凝膠電泳法可以檢測到的cdna最低檢測限為100fg,rt-rpa-lfd檢測方法最低檢測限為100fg，兩者敏感性一致。

②jevrt-rpa-lfd方法的毒株濃度敏感性分析，將tcid50是107.5/ml的jev/sw/gd/2009株作為初始毒株濃度，將初始毒株濃度進行10倍梯度稀釋(100～10-7)，每個濃度分別進行rna模板并反轉錄成cdna，再用常規(guī)rt-pcr凝膠電泳、rt-rpa-lfd方法進行檢測。試驗結果如圖4b所示，常規(guī)rt-rcr瓊脂糖凝膠電泳法可以檢測到的jevtcid50/ml最低檢測限達104.5,rt-rpa-lfd檢測方法最低檢測限也為104.5，兩者敏感性一致。

③豬腦模型jevrt-rpa-lfd方法的臨床模擬試驗敏感性分析，將tcid50/ml是107.5的jev/sw/gd/2009株作為初始毒株，用豬腦組織稀釋液對初始毒株進行10倍梯度稀釋(100～10-6)，制成不同濃度的臨床jev豬腦模型，每個模型分別進行rna模板并反轉錄成cdna，再用常規(guī)rt-pcr凝膠電泳、rt-rpa-lfd方法進行檢測。試驗結果如圖4c所示，常規(guī)rt-rcr瓊脂糖凝膠電泳法可以檢測到的jevtcid50/ml最低檢測限達103.5,rt-rpa-lfd檢測方法最低檢測限也為103.5，兩者敏感性一致。

④蚊子模型jevrt-rpa-lfd方法的臨床模擬試驗敏感性分析，將tcid50/ml是107.5的jev/sw/gd/2009株作為初始毒株，用蚊子組織液對初始毒株進行10倍梯度稀釋(100～10-6)，制成不同濃度的臨床jev蚊子模型，每個模型分別進行rna模板并反轉錄成cdna，再用常規(guī)rt-pcr凝膠電泳、rt-rpa-lfd方法進行檢測。試驗結果如圖4d所示，常規(guī)rt-rcr瓊脂糖凝膠電泳法可以檢測到的jevtcid50/ml最低檢測限達104.5,rt-rpa-lfd檢測方法最低檢測限也為104.5，兩者敏感性一致。

⑤根據(jù)jeve基因保守區(qū)域，設計構建重組質粒標準品的上下游引物，通過病毒rna抽提，反轉錄，pcr反應，pcr產(chǎn)物膠回收，連接，轉化等步驟將目的片段克隆到pmd18-t載體形成重組質粒，按照omega質粒抽提試劑盒提取重組質粒。通過紫外分光光度計測定濃度計算出拷貝數(shù)，分別稀釋出濃

所述的檢測流行性乙型腦炎病毒的rt-rpa核酸試紙條試劑盒，還包含200u/μl的m-mlv反轉錄酶、5倍反應緩沖液(5×rtbuffer)、dntp(10mm)、rnaseinhibitor均購自takara公司。

所述的試劑盒更優(yōu)選為包含濃度為5u/μl的amv逆轉錄酶、10倍反應緩沖液(10×thermopolreactionbuffer)、濃度為8u/l的鏈置換dna聚合酶、濃度為2.5mmol/l的dntp混合物溶液、濃度為100mmol/l的mgso4溶液、濃度為10μmol/l的引物fip、濃度為10μmol/l的引物bip、濃度為10μmol/l的引物f3、濃度為10μmol/l的引物b3、濃度為10μmol/l的引物loopf和濃度為10μmol/l的引物loopb；

所述的檢測流行性乙腦病毒的rt-rpa核酸試紙條試劑盒的應用，包含以下步驟：

(1)配制jev反轉錄體系，①按終濃度計算，隨機引物50-250ng/ul、jevrna，70℃水浴10min，立即冰浴2min；②上述混合液、m-mlv反轉錄酶為100u/μl、5倍反應緩沖液(5×rtbuffer)為1倍(1×)、dntp混合物為0.4～0.6mmol/l、rnaseinhibitor，30℃水浴10min，42℃水浴1h。

(2)配制jev-rt-rpa反應體系，按終濃度計算,

(3)配制rt-lamp反應體系，按終濃度計算，amv逆轉錄酶為105u/l、10倍反應緩沖液(10×thermopolreactionbuffer)為1倍(1×)、鏈置換dna聚合酶為0.32u/l、dntp混合物為0.4～0.6mmol/l、甜菜堿為1～2mol/l、mgso4為0～3mmol/l、fip引物為1.6μmol/l、bip引物為1.6μmol/l、f3引物為0.2μmol/l、b3引物為0.2μmol/l、loopf引物為0.6μmol/l、loopb引物為0.6μmol/l，待測樣品rna為12ng/μl；恒溫反應；

(4)反應：將步驟(1)恒溫反應后的產(chǎn)物用核酸檢測試紙條檢測，10min觀察結果；

(5)結果判讀：直接肉眼判讀，

①陰性(－)：僅在質控區(qū)(c)出現(xiàn)一條紅色條帶，在檢測區(qū)(t)內無紅色條帶出現(xiàn)，證明所檢測的樣本沒有豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染；

②陽性(+)：出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測區(qū)(t)內，另一條位于質控區(qū)(c)內，證明所檢測的樣本為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染；

③無效：質控區(qū)(c)和檢測區(qū)(t)內均無紅色條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。