本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物及其制備方法，以及抗腫瘤藥物和中子俘獲治療的硼劑。
背景技術(shù)：
：隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，輻射殺滅腫瘤的技術(shù)也從無(wú)選擇性的x，γ輻射(普通的醫(yī)用加速器)到具有一定縱向能量選擇(博拉格峰)的質(zhì)子、重離子輻射治療。尤其利用10b分子俘獲超熱低能中子(1ev～10kev)在腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生核反應(yīng)(～3mev)具有更高量級(jí)選擇性殺滅腫瘤的硼中子俘獲療法(bnct)，更是近來(lái)世界上研究的熱點(diǎn)。bnct是把與腫瘤有特異性親和力的硼(10b)化合物攜帶劑注入人體,選擇性富集于腫瘤細(xì)胞,然后用超熱低能中子局部照射,使具有超大中子俘獲截面的10b俘獲中子形成局部核反應(yīng)殺死腫瘤細(xì)胞。如果10b化合物能特異性完全富集于腫瘤細(xì)胞中，則bnct殺滅腫瘤的選擇性將是其他輻射治療的百倍以上。然而目前經(jīng)美國(guó)食品及藥物管理局(fda)認(rèn)證的第2代硼劑低分子硼化合物十一氫巰基十二硼化二鈉(bsh)和對(duì)二羥苯基丙氨酸硼(bpa)盡管與第1代硼劑相比性能有了較大改進(jìn)，其能在腫瘤細(xì)胞中滯留較長(zhǎng)的時(shí)間，對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的選擇性親和力，腫瘤與正常組織中的硼濃度比值(t/n)，以及腫瘤與血液中硼濃度比值(t/b)均能達(dá)到＞1。但仍不能滿(mǎn)足bnct的基本要求，即t/n或t/b≥3，因此目前bnct治療腦腫瘤的效果并不十分理想。篩選和合成能特異性富集于腫瘤細(xì)胞的10b化合物已經(jīng)成為這一技術(shù)推廣的重要瓶頸。近年來(lái)，第3代硼攜帶劑的研究也在快速發(fā)展，主要特點(diǎn)是能通過(guò)和腫瘤特異性表達(dá)的抗原或受體結(jié)合，使硼劑被腫瘤細(xì)胞靶向攝取，從而達(dá)到較高的t/n或t/b值。其中研究較為廣泛的有表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)介導(dǎo)的能和表皮生長(zhǎng)因子(egf)結(jié)合的bpa,葉酸受體(fr)介導(dǎo)的和葉酸能結(jié)合包含硼劑的脂質(zhì)體和碳納米顆粒,以及具有較高的親水性,能被膠質(zhì)瘤細(xì)胞t98g選擇性攝取，并具有更高親和力的結(jié)合了卟啉的硼酸鹽。目前，利用這些腫瘤選擇性吸收的硼劑，bnct在腦膠質(zhì)瘤中取得了一定的療效,通過(guò)fr介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞,能把含硼藥物運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，以及fr靶向的含硼碳納米顆粒能夠被高表達(dá)fr的hela細(xì)胞靶向攝取等相關(guān)研究也有報(bào)道?？傊?，現(xiàn)有的利用硼劑(10b)運(yùn)用bnct進(jìn)行輻射殺滅腫瘤，雖然能一定程度上提高10b在腫瘤細(xì)胞的濃度，但僅僅是提高其bnct中能選擇性吸收中子能量來(lái)殺滅腫瘤單方面效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞殺滅效率低，選擇性差。上述內(nèi)容僅用于輔助理解本發(fā)明的技術(shù)方案，并不代表承認(rèn)上述內(nèi)容是現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及抗腫瘤藥物和bnct的硼劑，旨在解決現(xiàn)有的針對(duì)目前bnct中的硼劑大部分僅僅具有單一的功能，僅僅是提高其bnct中能選擇性吸收中子能量來(lái)殺滅腫瘤單方面效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞殺滅效率低，選擇性差問(wèn)題。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，其特征在于，包括：優(yōu)選地，所述環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物的絡(luò)合形式如下：此外，為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明還提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物的制備方法，包括：將的溶液和包含h3bo3的溶液按照預(yù)設(shè)比例混合得到環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。優(yōu)選地，所述和所述h3bo3的預(yù)設(shè)比例為1：32。優(yōu)選地，所述和所述h3bo3的混合時(shí)間為24小時(shí)。優(yōu)選地，所述將和h3bo3混合，即得之后，還包括：利用液相色譜質(zhì)譜分析儀，在260nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下，流動(dòng)相為a相0.1％甲酸水溶液和b相100％甲醇，運(yùn)用c18色譜柱在預(yù)設(shè)梯度洗脫比例下進(jìn)行梯度洗脫。優(yōu)選地，所述預(yù)設(shè)梯度洗脫比例為：0min-2minb相0％，2min-16minb相0％-30％，16min-20minb相30％-90％，20min-25minb相90％，25min-25.1minb相90％-0％，25.1min-30minb相0％。進(jìn)一步的，為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明還提供一種抗腫瘤藥物，包括表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑；所述表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。進(jìn)一步的，為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明還提供一種中子俘獲治療的硼劑，所述硼劑包括含硼皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑；所述含硼皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。優(yōu)選地，所述硼劑還包括含硼核苷類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑；所述含硼核苷類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。本發(fā)明提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及抗腫瘤藥物和中子俘獲治療的硼劑，所述環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，作為含硼化合物、含硼的表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑，以及含硼核苷表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑，綜合利用腫瘤細(xì)胞吸收硼劑，以及腫瘤細(xì)胞繁殖需要大量核苷的特性，使藥物富集于腫瘤細(xì)胞并通過(guò)輻射殺死腫瘤細(xì)胞，提高了藥物的選擇性，進(jìn)而極大提高了腫瘤細(xì)胞的殺滅效率，避免了現(xiàn)有的針對(duì)目前中子俘獲治療中的硼劑大部分僅僅具有單一的功能，僅僅是提高其中子俘獲治療中能選擇性吸收中子能量來(lái)殺滅腫瘤單方面效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞殺滅效率低，選擇性差問(wèn)題。本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)、功能特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)將結(jié)合實(shí)施例，參照附圖做進(jìn)一步說(shuō)明。附圖說(shuō)明應(yīng)當(dāng)理解的是，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實(shí)施例，因此不應(yīng)被看作是對(duì)范圍的限定，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。圖1為本發(fā)明環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及一種抗腫瘤藥物和bnct的硼劑的0.06mmcamp及含不同濃度h3bo3在0.06mmcamp中的lc-ms色譜圖；圖2為本發(fā)明環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及一種抗腫瘤藥物和bnct的硼劑的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物抑制egfr的自磷酸化32p-atp放射自顯影圖；圖3為本發(fā)明環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及一種抗腫瘤藥物和bnct的硼劑的裸鼠腫瘤組織切片的tunel檢測(cè)圖。具體實(shí)施方式下面根據(jù)具體實(shí)施例就本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，其特征在于，包括：本發(fā)明提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物中，包含有h3bo3和等化合物。其中，是一種camp(cyclicadenosinemonophosphate)“腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸”的簡(jiǎn)稱(chēng)。亦稱(chēng)“環(huán)磷酸腺苷”“環(huán)化腺核苷一磷酸”，“環(huán)腺一磷”。以微量存在于動(dòng)植物細(xì)胞和微生物中。體內(nèi)多種激素作用于細(xì)胞時(shí)，可促使細(xì)胞生成此物，轉(zhuǎn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動(dòng)與物質(zhì)代謝。作為一種環(huán)狀的核苷酸類(lèi)化合物，camp的細(xì)胞毒性和抗藥性較小。上述，h3bo3為硼酸，亦稱(chēng)為pt，白色粉末狀結(jié)晶或三斜軸面的鱗片狀帶光澤結(jié)晶。水中呈弱酸性。有滑膩手感，無(wú)臭味。溶于水、酒精、甘油、醚類(lèi)及香精油中。無(wú)氣味。味微酸苦后帶甜。與皮膚接觸有滑膩感。露置空氣中無(wú)變化。能隨水蒸氣揮發(fā)。0.1mol/l水溶液ph為5.1。1g能溶于18ml冷水、4ml沸水、18ml冷乙醇、6ml沸乙醇和4ml甘油。在水中溶解度能隨鹽酸、檸檬酸和酒石酸的加入而增加。相對(duì)密度1.4347。熔點(diǎn)184℃(分解)。沸點(diǎn)300℃。上述，是camp與h3bo3的合成產(chǎn)物，在水中以絡(luò)合鹽的形式存在，為一種含硼的egfr抑制劑，也是一種含硼核苷類(lèi)egfr抑制劑。本發(fā)明中，所使用的camp為南京澳多福尼生物科技有限公司、純度>98％的camp，所使用的h3bo3為生工生物科技有限公司、純度>98％的h3bo3。本發(fā)明提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物和制備方法，以及抗腫瘤藥物和bnct的硼劑，所述環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，作為含硼化合物、含硼的egfr抑制劑，以及含硼核苷類(lèi)egfr抑制劑，綜合利用腫瘤細(xì)胞吸收硼劑，以及腫瘤細(xì)胞繁殖需要大量核苷的特性，使藥物富集于腫瘤細(xì)胞并通過(guò)輻射殺死腫瘤細(xì)胞，提高了藥物的選擇性，進(jìn)而極大提高了腫瘤細(xì)胞的殺滅效率，避免了現(xiàn)有的針對(duì)目前bnct中的硼劑大部分僅僅具有單一的功能，僅僅是提高其bnct中能選擇性吸收中子能量來(lái)殺滅腫瘤單方面效應(yīng)，腫瘤細(xì)胞殺滅效率低，選擇性差問(wèn)題。優(yōu)選地，所述環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物的絡(luò)合形式如下：camp，即為腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸，其結(jié)構(gòu)式為camp與h3bo3在水溶液中形成環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。需要理解的是，絡(luò)合物是由一定數(shù)量的配體(陰離子或分子)通過(guò)配位鍵結(jié)合于中心離子(或中性原子)周?chē)纬傻母瓉?lái)組分性質(zhì)不同的分子或離子。需要理解的是，分子或者離子與金屬離子結(jié)合，形成很穩(wěn)定的新的離子的過(guò)程就叫絡(luò)合反應(yīng)，生成的物質(zhì)叫絡(luò)合物。絡(luò)合物通常指含有絡(luò)離子的化合物，例如絡(luò)鹽ag(nh3)2cl、絡(luò)酸h2ptcl6、絡(luò)堿cu(nh3)4(oh)2等；也指不帶電荷的絡(luò)合分子，例如fe(scn)3、co(nh3)3cl3等。配合物又稱(chēng)絡(luò)合物。本發(fā)明中，在水溶液中的camp和h3bo3發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)最終達(dá)到平衡狀態(tài)，形成絡(luò)合鹽，進(jìn)而成為溶液中包含有camp、h3bo3和的絡(luò)合物。上述，進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)的溶劑為水溶液，水作為載體使水溶性的camp和h3bo3進(jìn)行反應(yīng)。此外，也可使用其他溶劑進(jìn)行本發(fā)明中的絡(luò)合反應(yīng)，例如甲醇、甲酸水溶液等。本發(fā)明中采用的藥物反應(yīng)載體為水。本發(fā)明還提供一種環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物的制備方法，包括：將包含的溶液和包含h3bo3的溶液按照預(yù)設(shè)比例混合得到環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。在本發(fā)明中，將camp與h3bo3進(jìn)行混合后，經(jīng)過(guò)絡(luò)合反應(yīng)，形成絡(luò)合物。具體的，當(dāng)h3bo3可以與具有多羥基的化合物進(jìn)行反應(yīng)并形成具有高絡(luò)合常數(shù)的絡(luò)合形式。camp上的環(huán)戊糖只有一個(gè)同側(cè)羥基，不能在此處進(jìn)行絡(luò)合，但camp的堿基中的氨基具有堿性性質(zhì)，對(duì)硼酸中氫離子進(jìn)行吸附從而形成絡(luò)合反應(yīng)并成為絡(luò)合鹽的形式。優(yōu)選地，所述和所述h3bo3的預(yù)設(shè)比例為1:32。上述，camp與h3bo3預(yù)設(shè)比例可以為1:1～1:300，在本發(fā)明中，優(yōu)選比例為1:32，摩爾濃度的優(yōu)選比例為0.06mm：1.92mm。優(yōu)選地，所述和所述h3bo3的混合時(shí)間為24小時(shí)。優(yōu)選地，所述將包含的溶液和包含h3bo3的溶液按照預(yù)設(shè)比例混合得到環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物之后，還包括：利用液相色譜質(zhì)譜分析儀，在260nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下，流動(dòng)相為a相0.1％甲酸水溶液和b相100％甲醇，運(yùn)用c18色譜柱在預(yù)設(shè)梯度洗脫比例下進(jìn)行梯度洗脫。優(yōu)選地，所述預(yù)設(shè)梯度洗脫比例為：0min-2minb相0％，2min-16minb相0％-30％，16min-20minb相30％-90％，20min-25minb相90％，25min-25.1minb相90％-0％，25.1min-30minb相0％。將一定比例的camp與h3bo3進(jìn)行混合后，進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，在經(jīng)過(guò)預(yù)設(shè)的反應(yīng)時(shí)間后，通過(guò)lc-ms(液相色譜質(zhì)譜分析儀)對(duì)絡(luò)合物的絡(luò)合情況進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)儀器和材料：lc-ms：安捷倫6120lc/ms系統(tǒng)(三重四極桿質(zhì)譜儀)(安捷倫、ca、美國(guó))；數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)：安捷倫masshunter軟件walkuplc/ms和lc系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集；色譜柱：c18色譜柱，250mm×4.6mm(廣州綠百草生物科技有限公司，中國(guó))；有機(jī)溶劑：甲酸(lc/ms級(jí))、甲醇(lc/ms級(jí))；水：超純水，通過(guò)milli-q自制；實(shí)驗(yàn)條件：室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；流動(dòng)相：a相為0.1％甲酸水溶液；b相為100％甲醇；實(shí)驗(yàn)方法：制備不同濃度的樣品，分別為：0.06mmcamp、0.06mmcamp+0.48mmh3bo3、0.06mmcamp+0.96mmh3bo3、0.06mmcamp+1.92mmh3bo3；將以上樣品利用lc-ms按表1中梯度洗脫時(shí)間和比例進(jìn)行洗脫。表1利用lc-ms對(duì)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物絡(luò)合物進(jìn)行梯度洗脫的時(shí)間及比例檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，圖1為0.06mmcamp及含不同濃度h3bo3在0.06mmcamp中的lc-ms色譜圖。由圖1中可見(jiàn)，隨著硼酸濃度的逐漸增加，主峰(保留時(shí)間9.9-10.1min)峰面積相應(yīng)地發(fā)生逐漸減小的變化。此外環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物包含有更多的羥基且更容易通過(guò)甲醇洗脫出來(lái)，則導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物在lc-ms中具有較小的保留時(shí)間。另外，環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物在由camp和h3bo3進(jìn)行絡(luò)合后，極性變大，從而導(dǎo)致樣品在260nm下的吸收變小的情況，由于camp堿基中的氨基具有堿性，能對(duì)硼酸中氫離子進(jìn)行吸附從而形成絡(luò)合鹽的形式。導(dǎo)致硼酸的濃度對(duì)具有紫外吸收部分的堿基有影響。綜合以上信息，判斷經(jīng)過(guò)絡(luò)合反應(yīng)的絡(luò)合物的已經(jīng)形成。此外，也可通過(guò)毛細(xì)管電泳分離法進(jìn)行對(duì)環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物的絡(luò)合情況進(jìn)行驗(yàn)證，camp在h3bo3中，毛細(xì)管電泳的遷移率也隨硼酸濃度而變化,可以判斷camp和h3bo3經(jīng)過(guò)絡(luò)合反應(yīng)后形成了絡(luò)合物的形式。本發(fā)明還提供一種抗腫瘤藥物，包括表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑；所述表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。表皮生長(zhǎng)因子是一種小肽，由53個(gè)氨基酸殘基組成，是類(lèi)egf大家族的一個(gè)成員，是一種多功能的生長(zhǎng)因子，在體內(nèi)體外都對(duì)多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈的促分裂作用。表皮生長(zhǎng)因子受體，也稱(chēng)為egfr(epithelialgrowthfactorreceptor)，本身具有酪氨酸激酶活性，一旦與表皮生長(zhǎng)因子(egf)組合可啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)的有關(guān)基因，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。胃癌、乳腺癌、膀胱癌和頭頸部鱗癌的egfr表達(dá)增高。本發(fā)明中所提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，包括以絡(luò)合鹽的形式存在。而環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物物中的camp和屬于表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑(egfr抑制劑)，在中子獲取療法中，可具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，可以抑制egfr修復(fù)輻射誘導(dǎo)的dna損傷。本發(fā)明還提供一種中子俘獲治療的硼劑，所述硼劑包括含硼表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑；所述含硼表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。bnct為中子治療即硼中子俘獲治療(boronneutroncapturetherapy，簡(jiǎn)稱(chēng)bnct)。硼中子俘獲治療通過(guò)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的原子核反應(yīng)來(lái)摧毀癌細(xì)胞。它的原理是這樣的：先給病人注射一種含硼的特殊化合物，這種化合物與癌細(xì)胞有很強(qiáng)的親和力，進(jìn)入人體后，迅速聚集于癌細(xì)胞內(nèi)，而其他組織內(nèi)分布很少。一般地，這種含硼化合物對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害，本身韓鵬化合物對(duì)癌癥也無(wú)治療作用。這時(shí)，用一種中子射線(xiàn)進(jìn)行照射，這種射線(xiàn)對(duì)人體的損傷不大，但中子與進(jìn)入癌細(xì)胞里的硼能發(fā)生很強(qiáng)的核反應(yīng)，釋放出一種殺傷力極強(qiáng)的射線(xiàn)，這種射線(xiàn)的射程很短，只有一個(gè)癌細(xì)胞的長(zhǎng)度。所以只殺死癌細(xì)胞，不損傷周?chē)M織。這種有選擇的只殺死形狀復(fù)雜的癌細(xì)胞而不損傷正常組織的技術(shù)，稱(chēng)為硼中子俘獲治療技術(shù)。如果10b化合物能特異性完全富集于腫瘤細(xì)胞中，則bnct殺滅腫瘤的選擇性將是其他輻射治療的百倍以上。本發(fā)明所提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，包括在水中以絡(luò)合鹽的形式存在。作為為一種含硼egfr抑制劑，可實(shí)現(xiàn)直接與跨膜蛋白egfr結(jié)合，在bnct中硼俘獲中子產(chǎn)生的能量將直接破壞重要的細(xì)胞膜通道位點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。優(yōu)選地，所述硼劑還包括含硼核苷類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑；所述含硼核苷類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑包括權(quán)利要求1或2所述的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物。本發(fā)明所提供的環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物，為camp與h3bo3發(fā)生絡(luò)合的產(chǎn)物，其中camp為腺苷-3',5'-環(huán)化一磷酸，亦稱(chēng)為環(huán)磷酸腺苷，是一種核苷類(lèi)核苷類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑，通過(guò)絡(luò)合反應(yīng)得到環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物，屬于一種含硼核苷類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑。需要理解的是，目前，提高硼劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性選擇的方法包括一種通過(guò)核苷進(jìn)入腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞同步繁殖，從而提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力的方法。該方法利用腫瘤細(xì)胞繁殖時(shí)需要大量核苷的原理，將10b連接到核苷上，就能使10b更多進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的dna中，由于腫瘤細(xì)胞的繁殖速率遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞，這樣硼化合物聚積將在腫瘤細(xì)胞的濃度不僅高于正常細(xì)胞，而且能聚積在腫瘤細(xì)胞核之一關(guān)鍵靶點(diǎn)，這將極大提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。本發(fā)明提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，在溶劑中以絡(luò)合鹽的形式存在。將10b連接至核苷類(lèi)egfr抑制劑camp上，從而形成了含硼核苷類(lèi)egfr抑制劑，可使腫瘤細(xì)胞對(duì)含硼核苷類(lèi)egfr抑制劑具有選擇性，當(dāng)腫瘤細(xì)胞將含硼核苷類(lèi)egfr抑制劑吸收后，形成多基因靶點(diǎn)破壞，從而達(dá)到選擇性輻射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。綜上，本發(fā)明所提供的環(huán)磷酸腺苷硼酸絡(luò)合物，作為一種egfr抑制劑，本身可以特異性直接降低腫瘤細(xì)胞增殖，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性，從而極大加強(qiáng)輻射產(chǎn)生的自由基誘導(dǎo)的凋亡作用；作為一種含硼egfr抑制劑，直接與egfr結(jié)合，在bnct中硼俘獲中子產(chǎn)生的能量直接破壞重要的細(xì)胞膜通道位點(diǎn)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；作為一種含硼核苷類(lèi)egfr抑制劑，使腫瘤細(xì)胞對(duì)含硼核苷類(lèi)egfr抑制劑具有選擇性，將含硼核苷類(lèi)egfr抑制劑吸收進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核中，繼而形成多基因靶點(diǎn)破壞，達(dá)到選擇性輻射誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。綜合以上三點(diǎn)的效應(yīng)，極大的提高硼中子俘獲選擇性殺滅腫瘤的效率，繼而極大的降低輻射劑量。由于大部分腫瘤細(xì)胞膜的egfr遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，因此特異性含硼egfr抑制劑將選擇性的富集在腫瘤細(xì)胞膜上，達(dá)到t/n或t/b≥3。并由于其多重誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，因此富集在腫瘤細(xì)胞上的含硼egfr抑制劑可以在較低的濃度達(dá)到理想的效果。通過(guò)32p-atp同位素示蹤技術(shù)確定環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物抑制egfr自身磷酸化能力為了確定環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物抑制egfr自身磷酸化能力，本發(fā)明中對(duì)通過(guò)32p-atp同位素示蹤技術(shù)篩選egfr自磷酸化抑制效果好的核苷類(lèi)含硼絡(luò)合劑，通過(guò)比較，了解和驗(yàn)證抑制劑的抑制效力情況。實(shí)驗(yàn)儀器和材料：egfr/her1/erbb1(aa668-1210)(重組人表皮生長(zhǎng)因子受體/gst嵌合體，由780個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量89.1kda，sino生物公司(pa，美國(guó))；[γ32p]-atp(3000ci/毫摩爾，10mci/ml，perkinelmer公司，ca，美國(guó))；反應(yīng)緩沖液(10倍t4pnk反應(yīng)緩沖液)；camp(生工生物科技有限公司，純度>98％)；環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物，自制；fla7000激光掃描儀(ge，英國(guó))。實(shí)驗(yàn)方法：1、將含2μl0.52mg/ml人類(lèi)egfr/her1/erbb1反應(yīng)(aa668-1210)重組人表皮生長(zhǎng)因子受體/gst嵌合體，由780個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量89.1kda，sino生物公司(pa，美國(guó))(>85％純度))，1μl[γ32p]-atp(3000ci/毫摩爾，10mci/ml，perkinelmer公司，ca，美國(guó))和1.2μl反應(yīng)緩沖液(10倍t4pnk反應(yīng)緩沖液)加或不加不同濃度的camp(2μl，4μl和8μl5μmcamp(生工生物科技有>98％、純度)以及不同濃度環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物(1μl，2μl和3μl5mmh3bo3+2μl5μmcamp)。每個(gè)反應(yīng)溶液保持12μl體積(去離子水調(diào)節(jié))。2、在37℃孵育24h后，各反應(yīng)液5μl加入7m尿素變性凝膠電泳(15cm×15cm)使用1xtbe緩沖液與10w功率常溫1-2h。3、分離后的凝膠覆蓋著熒光屏的成像板收集32pγ輻射激發(fā)光，暴露3h后，熒光屏是利用fla7000激光掃描儀讀取(ge，英國(guó))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖2所示；1道顯示egfr+γ-32p-atp；2-4道顯示egfr+32p-atp+camp(不同濃度)反應(yīng)后；5-7道，顯示egfr+32p-atp+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物(不同濃度)反應(yīng)后放射自顯影圖；8道顯示酶活性示蹤對(duì)照?qǐng)D(poly(5tyr)標(biāo)記；9道顯示放射自顯影強(qiáng)度對(duì)照?qǐng)D(20b的32p-rna，是由rna(20b)和t4pnk在γ-32p-atp存在下反應(yīng)得到的)。放射自顯影結(jié)果如圖2所示，camp和環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物均能抑制egfr自身磷酸化，環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物具有更強(qiáng)的抑制效果。這是由于egfr與atp結(jié)合口袋也能與camp結(jié)合，導(dǎo)致camp類(lèi)似化合物能競(jìng)爭(zhēng)性抑制egfr自磷酸化過(guò)程。而由于硼酸是多元弱酸能與堿性的氨基絡(luò)合，因此能對(duì)camp有一定的絡(luò)合作用，同時(shí)也能和egfr與atp結(jié)合口袋位點(diǎn)的氨基結(jié)合，導(dǎo)致環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物更牢固的吸附在egfr與atp結(jié)合口袋位點(diǎn)上，從而環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物能更強(qiáng)地競(jìng)爭(zhēng)性抑制egfr自磷酸化過(guò)程?？鼓[瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)免疫組化分析：實(shí)驗(yàn)材料：裸小鼠移植瘤模型使用非小細(xì)胞肺癌a549細(xì)胞具有野生型egfr表達(dá)的模型(已由廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心造模)。腫瘤移植后達(dá)到5至6mm的直徑，該載瘤裸鼠被用于抗腫瘤實(shí)驗(yàn)。所有裸鼠為雌性，體重19-20g；甲狀腺素鈉(生工生物科技有限公司，純度>98％)；動(dòng)物分組：上述小鼠隨機(jī)分為3個(gè)不同給藥劑量的組別：a組：去離子水，即為陰性對(duì)照組；b組：去離子水+(環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物溶液)；c組：去離子水+(甲狀腺素鈉+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物溶液)。所有治療持續(xù)四周?？诜┝?b組：camp濃度為1.6mg/ml和h3bo3濃度為16mg/ml(環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物飲用溶液，ph＝7，用naoh溶液，調(diào)節(jié)ph)；c組：甲狀腺素鈉濃度0.010mg/ml(甲狀腺素鈉+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物溶液，ph＝7，用naoh溶液調(diào)節(jié)ph。a組自由飲用水和食物。b組c組為給藥組，飲用藥液保持0.20-0.30ml/天，每只裸鼠控制給藥時(shí)間和給藥量。通過(guò)環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞a549對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響：口服4周后，小鼠體重、體溫、腫瘤組織重量等指標(biāo)見(jiàn)表2。由表1可知，在實(shí)驗(yàn)期間的3組小鼠的體重沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的變化。其中，c組、b組腫瘤組織質(zhì)量顯著低于a組，且c組明顯低于b組。c組腫瘤ca含量顯著高于b組和a組。結(jié)果表明，環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。c組ca含量較高，在一定程度上，可能由于細(xì)胞凋亡的引起鈣流失，導(dǎo)致抑制腫瘤生長(zhǎng)。表2腫瘤生長(zhǎng)抑制裸鼠移植模型(n＝5)使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有p值均為雙側(cè)p≤0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從表2腫瘤生長(zhǎng)抑制率可以得出，c組與a組進(jìn)行對(duì)比，腫瘤生長(zhǎng)抑制率為2.8(1.50/0.53)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于其他egfrtkis報(bào)道(solitdb2005，boehrers2008)的腫瘤抑制劑的腫瘤生長(zhǎng)抑制率(2.1，921/438)。從表2中可以得出，ca在c組甲狀腺素鈉+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物處理的腫瘤組織中的含量顯著提高。細(xì)胞內(nèi)鈣離子與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。由甲狀腺素鈉-解偶聯(lián)劑誘導(dǎo)較高的體溫將導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞更容易凋亡。因此用甲狀腺素鈉+環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制更有利于腫瘤細(xì)胞凋亡。免疫組化凋亡化分析：通過(guò)給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行治療4周后，小鼠體重在同一時(shí)間進(jìn)行稱(chēng)重記錄于表2中。所有的腫瘤細(xì)胞移植瘤在切除后，稱(chēng)重，并進(jìn)行比較。部分腫瘤組織通過(guò)免疫組化分析的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)的dutp缺口末端標(biāo)記(tunel)法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡。部分腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)ca含量，測(cè)定結(jié)果記錄在表2中。圖3為裸鼠腫瘤組織切片的免疫組化圖。從圖3中可以得出，tunel陽(yáng)性細(xì)胞在c組腫瘤細(xì)胞顯著增加，說(shuō)明細(xì)胞凋亡的過(guò)程可以通過(guò)egfr抑制劑與解偶聯(lián)劑協(xié)同增強(qiáng)，從而進(jìn)一步抑制腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤組織中鈣含量的icp-ms分析：磨碎的腫瘤組織樣本0.2g加入聚四氟乙烯(ptfe)消化容器。一個(gè)體積8ml硝酸加入到每一個(gè)樣本，然后，他們被放置在室溫下30分鐘。標(biāo)本采用微波消解系統(tǒng)消解(ethosone；里程碑，意大利)。消化后的溶液，用去離子水稀釋至50毫升的總量。進(jìn)一步的分析進(jìn)行了使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(nexion300x；珀金埃爾默，美國(guó))。詳細(xì)的過(guò)程可以參考我們以前的工作(25)。bnct實(shí)驗(yàn)比較：上述a組和c組各3只腫瘤直徑約8mm，停藥12小時(shí)后，分別固定腫瘤部位于鈹镅中子源(105個(gè)中子/cm2s)1厘米處輻照24小時(shí)，吸收劑量根據(jù)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(ansi/ans-6.1.1-1977)轉(zhuǎn)化劑量率為1.25×10-6gy/n/cm2shr；因此24小時(shí)1cm處裸鼠吸收劑量為1.25×10-6×105×24/(4×3.14×12)＝2.4x10-1gy,由于屏蔽窗作用裸鼠其余部位收到輻射較小。輻照后3天后均不給藥自由食物，比較其輻照前后腫瘤體積變化。表3.輻照前后腫瘤體積變化(n＝3)組別腫瘤組織體積cm3a組0.25±0.08b組0.03±0.10pac<0.05使用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有p值均為雙側(cè)p≤0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。輻照后a組裸鼠(去離子水，即為陰性對(duì)照組)3天后腫瘤直徑接近增長(zhǎng)1mm，而b組合c組作為給藥組，腫瘤直徑未見(jiàn)明顯變化。說(shuō)明前期給藥加輻照更能誘導(dǎo)腫瘤凋亡。綜上，環(huán)磷酸腺苷-硼酸絡(luò)合物作為含硼抑制劑，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。統(tǒng)計(jì)分析：統(tǒng)計(jì)分析采用t-test；p值進(jìn)行雙邊比較，p≤0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并非因此限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
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