本發(fā)明屬于微生物領域，具體涉及一種發(fā)酵巨菌草生物基及其制備方法。
背景技術：
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巨菌草(pennisetumgiganteumz.x.lin)是多年生禾本科直立叢生型植物，粗蛋白和糖分含量高。巨菌草經(jīng)過接種植物乳桿菌、副干酪乳桿菌等菌種發(fā)酵后，ph值降低、乳酸、乙酸等成分增加，乳酸菌菌數(shù)同時大量增加，有效的提高了巨菌草的使用價值。發(fā)酵后的巨菌草可整包投入養(yǎng)殖水體中，其作用是，發(fā)酵巨菌草含有大量兼性厭氧的益生菌，在水體環(huán)境中可利用巨菌草中的蛋白質(zhì)、糖分以及池塘中有機物等成分進行繁殖生長，有效降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽、抑制水體中藻類生長，同時促進水體中其他微生物的生長，改善水質(zhì)。
植物乳桿菌和副干酪乳桿菌是我國農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的菌株之一,其已被越來越多地研制成飼用微生物制劑。
發(fā)酵巨菌草生物基是以具有活性乳酸菌的巨菌草為主要成分，通過簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)的生產(chǎn)工藝，制備一種水產(chǎn)養(yǎng)殖用益生菌制劑。本發(fā)明創(chuàng)造的產(chǎn)品能有效降解養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸鹽，抑制水體中藻類生長，減少抗生素的使用，促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的是提供一種有效活性乳酸菌菌數(shù)高的發(fā)酵巨菌草生物基及其制備方法。
本發(fā)明的發(fā)酵巨菌草生物基是通過以下方法制備的，其包括以下步驟：
將混合菌液添加到巨菌草草料上，接種量為每kg草料30-100g混合菌液，密封發(fā)酵，在溫度為20-35℃下發(fā)酵10-30天，至發(fā)酵草料的ph值達到3.5-4.5之間時，發(fā)酵結束，由此得到發(fā)酵巨菌草生物基；
所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳桿菌5×107-1×109個和植物乳桿菌9×107-1.25×109個。
所述的巨菌草草料是將新鮮收割的巨菌草成熟菌株粉碎至3-10cm而得到。
本發(fā)明的發(fā)酵巨菌草生物基，其有效活性乳酸菌菌數(shù)在5×108-5×109cfu/g，能夠在養(yǎng)殖水體中利用巨菌草中的蛋白質(zhì)、糖分以及池塘中有機物等成分進行繁殖生長，有效降解水體中的氨氮、亞硝酸鹽、抑制水體中藻類生長，改善水質(zhì)，減少抗生素的使用，促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
具體實施方式：
以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
實施例1發(fā)酵巨菌草生物基的制備方法
(1)副干酪乳桿菌菌液的制備
從斜面上挑取副干酪乳桿菌菌種的單菌落，分別接種至一個裝有100ml改良mc培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)24h，進行活化；再將活化后的菌液以體積分數(shù)4％接種量，接種到三個裝有350ml的500ml三角瓶中37℃靜置培養(yǎng)24h，制備搖瓶種子液。
將上述搖瓶種子液以體積分數(shù)5％的接種量接到裝有糖蜜液體培養(yǎng)基的30l種子罐中進行發(fā)酵，裝液量為體積分數(shù)75％，發(fā)酵溫度37℃，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至發(fā)酵液ph為4.0左右，此發(fā)酵液即為第二級種子液。
將上述30l的第二級種子液以8％的接種量接到裝有糖蜜液體培養(yǎng)基的300l種子罐中進行發(fā)酵，裝液量為體積分數(shù)80％，發(fā)酵溫度37℃，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至發(fā)酵液ph為4.0，得到副干酪乳桿菌菌液，檢測發(fā)酵液活菌數(shù)。
(2)按照與上述副干酪乳桿菌菌液同樣的方法制備植物乳桿菌菌液
1、改良mc培養(yǎng)基：
加水至1000ml，調(diào)節(jié)ph至6.0±0.2。固體培養(yǎng)基加質(zhì)量分數(shù)2％瓊脂。滅菌備用
2、糖蜜液體培養(yǎng)基：
加水至1000ml，調(diào)節(jié)ph至6.8±0.2，滅菌備用。
(3)發(fā)酵巨菌草的制備
取新鮮收割的巨菌草成熟菌株，鮮重約2000kg，將巨菌草粉碎至3cm左右，然后將副干酪乳桿菌菌液和植物乳桿菌菌液按體積比1：9比例混合的混合菌液接種到粉碎后的草料上，所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳桿菌5×107個，植物乳桿菌9×107個，接種量為每kg草料接種30g混合菌液，攪拌均勻，立即裝入專用的發(fā)酵袋，每袋裝30kg，置于20攝氏度下發(fā)酵30天。期間檢測物料ph值以及活菌數(shù)。待ph4.5時發(fā)酵結束，由此得到發(fā)酵巨菌草生物基，最后成品陰涼處儲存。測得植物乳桿菌和副干酪乳桿菌活菌總數(shù)達到5×108cfu/g，
(4)發(fā)酵巨菌草生物基活菌數(shù)的測定
1平板菌落計數(shù)法
1.1稱取發(fā)酵巨菌草生物基樣品10g，放入盛有90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，搖床200rpm振蕩20min，靜置20～30s，制成樣品懸液。
1.2用1ml無菌吸管吸取1ml樣品懸液，放入盛有9ml滅菌水的試管中，充分振搖使混合均勻，即制成1：100均勻稀釋液。
1.3用1ml無菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌水試管內(nèi)，振搖試管，混合均勻，做成1：1000的稀釋液。另取1ml滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋液，分別制成10-4、10-5、10-6……10-9梯度稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1ml滅菌吸管。
1.4選擇2-3個適宜稀釋度(一般取10-6、10-7、10-8)，用滅菌100μl微量移液器，各取0.1ml注射至滅菌的空白平板上，用無菌推棒均勻涂于整個表面，然后倒入已經(jīng)冷卻至45℃左右的改良mc培養(yǎng)基，每個稀釋度做3個平板。
1.5將平皿倒置于37℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h后，選取菌落數(shù)在30-300之間的平板計數(shù)。
2植物乳桿菌、副干酪乳桿菌菌落形態(tài)
形態(tài)特征：植物乳桿菌落凸起，呈圓形，表面光滑，細密，呈米白色或淺黃色；副干酪乳桿菌菌落白色或灰白色，圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊、凸起。
3菌落計數(shù)
3.1稀釋度的選擇
3.1.1應選擇平均菌落在30-300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之
3.1.2若有兩個稀釋度。其生長的菌落數(shù)均在30-300之間，則視兩者之間如何來決定若其比小于或等于2，應報告其平均數(shù)；若大于2，則報告其中較小的數(shù)字。
3.1.3若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300。則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。
3.1.4若所有稀釋度平均菌落數(shù)均小于30，則應按稀釋度最低平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。
3.2計算：
植物乳桿菌和副干酪乳桿菌活菌總數(shù)(cfu/g)＝同一稀釋度三個平板菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10
(5)發(fā)酵巨菌草生物基在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用效果
將上述所得的發(fā)酵巨菌草生物基按10kg/畝·米水深的用量投入黃顙魚養(yǎng)殖塘中，每個月使用一次，養(yǎng)殖池塘水深1.5m，面積10畝，在投入巨菌草前測得水樣ph8.2，氨氮初始濃度為0.55mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.65mg/l，第90天取水樣分析，氨氮濃度為0.2mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.1mg/l，氨氮降解率為63.63％，亞硝酸鹽降解率為84.61％。
實施例2發(fā)酵巨菌草生物基的制備方法
(1)副干酪乳桿菌菌液的制備
從斜面上挑取菌種的副干酪乳桿菌單菌落，分別接種至一個裝有100ml改良mc培養(yǎng)基(同實施例1)的250ml三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)24h，進行活化；再將活化后的菌液以體積分數(shù)4％接種量，接種到三個裝有350ml的500ml三角瓶中37℃靜置培養(yǎng)24h，制備搖瓶種子液。
將上述搖瓶種子液以體積分數(shù)5％的接種量接到裝有糖蜜液體培養(yǎng)基的30l種子罐中進行發(fā)酵，裝液量為體積分數(shù)75％，發(fā)酵溫度37℃，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至發(fā)酵液ph為4.0左右，得到第二級種子液。
將上述30l的第二級種子液以體積分數(shù)8％的接種量接到裝有糖蜜液體培養(yǎng)基的300l種子罐中進行發(fā)酵，裝液量為體積分數(shù)80％，發(fā)酵溫度37℃，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至發(fā)酵液ph為4.0，得到副干酪乳桿菌菌液，檢測發(fā)酵液活菌數(shù)。
(2)按照與副干酪乳桿菌菌液同樣的方法制備植物乳桿菌菌液
(3)發(fā)酵巨菌草的制備
取新鮮收割的巨菌草成熟菌株，鮮重約2000kg，將巨菌草粉碎至6cm左右，然后將副干酪乳桿菌菌液和植物乳桿菌菌液按體積比3：7的混合菌液接種到粉碎后的草料上，所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳桿菌3×108個，植物乳桿菌7×108個，接種量每kg草料接種60g混合菌液，攪拌均勻，立即裝入專用的發(fā)酵袋，每袋裝40kg，置于28攝氏度下發(fā)酵20天。期間檢測物料ph值以及活菌數(shù)。待ph4.0時發(fā)酵結束，由此得到發(fā)酵巨菌草生物基，最后成品陰涼處儲存。測得發(fā)酵巨菌草生物基中植物乳桿菌和副干酪乳桿菌活菌總數(shù)達到1.0×109cfu/g。
(4)發(fā)酵巨菌草生物基在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用效果
將上述所得的發(fā)酵巨菌草生物基按10kg/畝·米水深的用量投入草魚養(yǎng)殖塘中，每個月使用一次，養(yǎng)殖池塘水深1m，面積10畝，在投入巨菌草前測得水樣ph8.0，氨氮初始濃度為0.52mg/l，亞硝酸鹽濃度為1.65mg/l，第90天取水樣分析，氨氮濃度為0.1mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.3mg/l，氨氮降解率為80.76％，亞硝酸鹽降解率為81.82％。
實施例3發(fā)酵巨菌草生物基的制備方法
(1)副干酪乳桿菌菌液的制備
從斜面上挑取菌種的副干酪乳桿菌單菌落，分別接種至一個裝有100ml改良mc培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)24h，進行活化；再將活化后的菌液以體積分數(shù)4％接種量，接種到三個裝有350ml的500ml三角瓶中37℃靜置培養(yǎng)24h，制備搖瓶種子液。
將上述搖瓶種子液以體積分數(shù)5％的接種量接到裝有糖蜜液體培養(yǎng)基的30l種子罐中進行發(fā)酵，裝液量為體積分數(shù)75％，發(fā)酵溫度37℃，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至發(fā)酵液ph為4.0左右，由此得到第二級種子液。
將上述30l的種子液以體積分數(shù)8％的接種量接到裝有糖蜜液體培養(yǎng)基的300l種子罐中進行發(fā)酵，裝液量為體積分數(shù)80％，發(fā)酵溫度37℃，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至發(fā)酵液ph為4.0，由此得到副干酪乳桿菌菌液，檢測發(fā)酵液活菌數(shù)。
(2)按照與副干酪乳桿菌菌液同樣的方法制備植物乳桿菌菌液
(3)發(fā)酵巨菌草的制備
取新鮮收割的巨菌草成熟菌株，鮮重約2000kg，將巨菌草粉碎至10cm左右，然后將副干酪乳桿菌菌液和植物乳桿菌菌液按體積比5：5的混合菌液接種到粉碎后的草料上，所述的混合菌液每毫升含有副干酪乳桿菌1×109個，植物乳桿菌1.25×109個，接種量每kg草料接種100g混合菌液，攪拌均勻，立即裝入專用的發(fā)酵袋，每袋裝50kg，置于35攝氏度下發(fā)酵10天。期間檢測物料ph值以及活菌數(shù)。待ph3.5發(fā)酵結束，由此得到發(fā)酵巨菌草生物基，測得此發(fā)酵巨菌草生物基植物乳桿菌和副干酪乳桿菌活菌總數(shù)達到5×109cfu/g。
(4)發(fā)酵巨菌草生物基在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應用效果
將上述所得的發(fā)酵巨菌草生物基按10kg/畝·米水深的用量投入蝦養(yǎng)殖塘中，每個月使用一次，養(yǎng)殖池塘水深1m，面積10畝，在投入巨菌草前測得水樣ph7.5，氨氮初始濃度為0.42mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.75mg/l，第90天取水樣分析，氨氮濃度為0.1mg/l，亞硝酸鹽濃度為0.2mg/l，氨氮降解率為76.19％，亞硝酸鹽降解率為73.33％。