本申請為分案申請，原申請的申請日為2011年6月16日，申請?zhí)枮?01180039874.2(pct/us2011/040674)，發(fā)明名稱為“減少炎性反應的具有減少的脂磷壁酸的重組乳桿菌”。發(fā)明領域本發(fā)明涉及用于減少炎癥的方法和組合物。對作為文本文件通過efs-web提交的序列表的引用序列表的正式副本作為文本文件通過efs-web與說明書一起提交，其遵從美國信息交換標準碼(ascii)，文件名稱為406734seqlist.txt，創(chuàng)建日期為2011年6月16日，大小為15.7kb。通過efs-web提交的序列表為說明書的一部分，因此通過引用以其整體結合到本文中。發(fā)明背景腸道免疫穩(wěn)態(tài)的維持涉及細菌微生物區(qū)系、腸上皮與宿主先天免疫細胞之間的平衡相互作用。這些免疫相互作用的失調(diào)可導致免疫功能障礙并引起明顯的炎癥，這是人炎性腸病(ibd)，包括潰瘍性結腸炎(uc)和克羅恩病通常所具有的。盡管還未完全理解ibd的細胞和分子機制，但數(shù)據(jù)表明炎性細胞因子(例如il-12)誘導的慢性腸炎癥起關鍵作用。這些細胞因子啟動對強烈牽涉疾病進展的致病性cd4+t細胞的分化。相應地，研究顯示對這些細胞的調(diào)節(jié)減輕實驗性結腸炎。此外，如il-12、活化樹突狀細胞(dc)利用il-12p40亞基分泌的il-23也牽涉多種自身免疫疾病(包括ibd)的發(fā)展。il-23的炎性性質(zhì)已被歸因于對th17的誘導。此外，該細胞因子還激活dc中炎性細胞因子例如tnfα和il-6的產(chǎn)生。合起來，研究顯示阻斷il-12p40亞基信號轉(zhuǎn)導顯著減少炎癥，并表明il-12和il-23二者參與導致ibd的炎性級聯(lián)。與此二者細胞因子相反，il-10對炎性信號發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，從而調(diào)節(jié)炎性細胞因子引發(fā)的免疫反應。益生菌(probiotic)微生物可與宿主免疫細胞相互作用，并且特定益生菌乳桿菌種類可刺激dc產(chǎn)生炎性細胞因子(即il-12)和調(diào)節(jié)性il-10。乳桿菌是人胃腸道中的正常棲居者(inhabitant)，且為小腸中天然小型生物群的主要組分。認為這些細菌是有益的共生物，并且一些種類和菌株由于人類消費的歷史悠久而被普遍認為是安全的。本領域需要進一步的方法和組合物以改進炎性胃腸病癥例如ibd的治療。發(fā)明簡述提供用于減少受試者炎癥的方法和組合物。所述組合物包含經(jīng)遺傳修飾以減少細胞表面上脂磷壁酸(lipoteichoicacid)展示的重組細菌。方法包括給予受試者經(jīng)修飾以減少細胞表面上脂磷壁酸展示的重組細菌。給予所述重組細菌促進所需的治療反應。所述重組細菌可以以單劑量或系列劑量給予。方法在治療或預防多種炎性病癥包括，例如，治療或預防炎性腸病、結腸炎或克羅恩病中得到應用。附圖簡述圖1(a和b)顯示lta生物合成相關通路和基因。c-d顯示使用剪接重疊延伸(soeing)pcr擴增和連接的靶orf內(nèi)部區(qū)域側翼的兩個非鄰接片段(horton,rm(1995)molbiotechnol.apr;3(2):93-9)。將所得片段克隆到pori28并轉(zhuǎn)化到包含溫度敏感型輔助質(zhì)粒ptrk669的嗜酸乳桿菌(l.acidophilus)nck1392中。利用pcr，使用靶區(qū)域側翼的引物，針對缺失突變對erm敏感型細胞進行篩選，并通過對包含缺失的區(qū)域進行測序來確認。圖2(a)顯示用nck56(也稱為嗜酸乳桿菌ncfm)或nck2025處理的dc的表型。將骨髓來源的dc與nck56或nck2025共培養(yǎng)24小時。細胞用相應的抗體染色，固定，隨后用facscalibur分析。b部分顯示單獨培養(yǎng)或與nck56或nck20251:1培養(yǎng)1和6小時的dc。提取rna、反轉(zhuǎn)錄并使用針對tlr1和tlr2的引物進行實時pcr。所顯示數(shù)據(jù)表示單獨的dc或這些細胞與nck56或nck2025的共培養(yǎng)物(1小時)。c部分顯示細胞因子分析。通過elisa測定nck56或nck2025處理以及未處理dc的上清液中釋放的細胞因子。d部分顯示t細胞增殖。連續(xù)四天用nck56或nck2025口服治療多組c57bl/6小鼠(5/組)。取得腸系膜ln-t細胞，并與nck56或nck2025處理的以及未處理的dc共培養(yǎng)4天以使用[3h]胸苷摻入測定t細胞增殖。在一些實驗中，為恢復抑制的t細胞增殖，將抗il-10抗體加入來源于與nck2025共培養(yǎng)的dc的上清液中。來源于各組小鼠的腸系膜ln-t細胞與用嗜酸乳桿菌菌株處理或未處理的dc共培養(yǎng)以測定細胞因子。圖3顯示nck2025對dss誘導的結腸炎的改善。a部分顯示連續(xù)4天經(jīng)口接種nck56或nck2025(5x108cfu/100μl/小鼠)或pbs的c57bl/6小鼠(n=10)。將這些組的小鼠暴露于3%dss(溶解在飲用水中)中5天，接著7天白水，并評估結腸炎隨時間的進展，包括h&e染色、體重減輕、腹瀉和潛血檢測陽性(hemoccultpositivity)。b-e部分顯示結腸h&n染色。b顯示未處理的小鼠；c部分dss處理的小鼠；d顯示nck56-dss處理的小鼠；以及e顯示nck2025-dss處理的小鼠。f表示結腸炎評分。fob代表糞便潛血檢測血液陽性(fecalhemoccultbloodpositivity)，dai代表疾病活性指數(shù)。數(shù)據(jù)表示至少三個獨立實驗。g部分顯示結腸細胞因子分析。nck56或nck2025或dss處理的小鼠(5/組)的結腸用冷pbs清洗，切成碎片，37℃培養(yǎng)18h。使用elisa測定細胞因子。圖4顯示nck2025對已建立的結腸炎的減輕。a-d部分顯示三組c57bl/6小鼠(10/組)，其首先接受五天周期的3%dss(溶解在無菌水中)以引發(fā)結腸炎，其中的兩組隨后連續(xù)四天用nck56或nck2025口服治療。監(jiān)測疾病進展，直至實驗方案的第13天(此時小鼠被處死)，評估結腸。b-d部分顯示結腸h&n染色。b部分顯示dss處理的小鼠；c部分顯示dss-nck56處理的小鼠；d部分顯示dss-nck2025處理的小鼠。e部分表示結腸炎評分。fob代表糞便潛血檢測血液陽性，dai代表疾病活性指數(shù)。數(shù)據(jù)表示至少三個獨立實驗。f部分顯示結腸細胞因子分析。洗滌各組小鼠的結腸，切成碎片，37℃培養(yǎng)18h。通過elisa測定細胞因子。圖5顯示nck2025對treg細胞的誘導。a-b部分顯示連續(xù)4天經(jīng)口接種nck56或nck2025(5x108cfu/100μl/小鼠)或pbs的c57bl/6小鼠(5/組)。在第五天，將小鼠處死，清洗分離的結腸。自每組小鼠制備結腸單細胞懸浮液，并通過percol梯度富集。淋巴細胞用相應的或同種型匹配抗體染色，并通過facscalibur分析。重復實驗至少7次。圖6顯示il-10-/-小鼠中結腸炎的誘導。a-b：c57bl/6il-10-/-小鼠組(10/組)常規(guī)喂養(yǎng)1周。小鼠連續(xù)四天接種nck56或nck2025，然后喂食低劑量吡羅昔康(piroxicam)1周，隨后喂食高劑量吡羅昔康1周以加速并誘導結腸炎的發(fā)病。測定體重減輕，兩周后處死小鼠，制備結腸橫斷面瑞士卷(coloncross-sectionalswissroll)和組織切片用于h&e染色。c顯示吡羅昔康單獨處理的小鼠；d顯示nck56-吡羅昔康處理的小鼠；以及e顯示nck2025-吡羅昔康處理的小鼠。這些評分在0-4的范圍內(nèi)無分別地測定。圖7顯示在小鼠中，在dss誘導的結腸炎中用nck56或nck202治療或不治療時的基因調(diào)節(jié)。a-b部分顯示dss誘導結腸炎前給予nck56、nck2025或未處理達四天的小鼠(5/組)。分離近端或遠端結腸區(qū)域并提取rna。cdna微陣列分析顯示小鼠結腸中免疫調(diào)節(jié)/刺激、信號轉(zhuǎn)導、增殖、凋亡、血管發(fā)生和粘附相關通路的差異性基因表達模式。值表示與對照小鼠相比暴露于實驗條件的基因表達的倍數(shù)增加(>1.0)或表達的倍數(shù)減少(<1.0)。圖8提供seqidnos:1-16的序列。發(fā)明詳述現(xiàn)在將在下文中參照附圖對本發(fā)明進行更全面地描述，其中顯示本發(fā)明的一些但并非全部實施方案。事實上，這些發(fā)明可以以多種不同形式實施，并且不應解釋為限于本文所示實施方案；更確切地，提供這些實施方案使得本公開內(nèi)容將滿足適用的法律要求。在全文中相似的數(shù)字指相似的元素。受益于前述說明和相關附圖所呈現(xiàn)的教導，這些發(fā)明所屬領域的技術人員將想到本文所示發(fā)明的多種修飾和其它實施方案。因此，應理解的是，本發(fā)明并非限于所公開的特定實施方案，且修飾和其它實施方案意欲包括在所附權利要求書的范圍內(nèi)。盡管本文采用了特定術語，但其僅以一般性和描述性意義使用，而不用于限制目的。概述提供用于減少受試者炎癥的方法和組合物，包括用于治療或預防炎性病癥的方法和組合物。使用經(jīng)修飾以減少細菌細胞表面上lta展示的重組細菌，這些方法和組合物可用于減少胃腸道炎癥。胃腸道明顯炎癥是人ibd(包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病)的代表性特征。通過減少細胞表面上的lta展示，本發(fā)明重組細菌比相應的野生型細菌細胞顯著減少凈的炎性反應。因此，提供多種重組細菌及其使用方法，其在有需要的受試者中通過刺激抗炎細胞因子的產(chǎn)生和限制促炎細胞因子的產(chǎn)生而減少炎性反應。lta展示減少的重組細菌細胞提供減少細胞表面上lta展示的方法和組合物。如本文所使用的，細胞表面上lta展示的減少包括與適當?shù)膶φ障啾?，細胞表面上展示的lta水平的任何統(tǒng)計學上顯著的減少。這樣的減少可包括，例如，細胞表面上展示的lta的量至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的減少。測定細胞表面上lta量的方法包括，例如，丁醇和疏水相互作用色譜(moraths,geyera,&hartungt(2001)jexpmed193(3):393-397)或酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)(tadler等(2005)jclinlabanal.1989;3(1):21)。如本文所使用的，術語“表面”、“細胞表面”或“細菌表面”指包括質(zhì)膜和在質(zhì)膜外的細菌細胞的區(qū)域。革蘭氏陽性細菌在質(zhì)膜外包含一層其中散布磷壁酸的肽聚糖。革蘭氏陰性細菌還包含覆蓋肽聚糖層的外膜。因此，本發(fā)明表面上lta的展示可在革蘭氏陽性細菌質(zhì)膜或肽聚糖層中或上，或在革蘭氏陰性細菌的質(zhì)膜、肽聚糖層或外膜中或上。提供經(jīng)遺傳修飾以減少細胞表面上lta展示的重組細菌細胞。如本文所使用的，術語“重組細菌”或“重組細菌細胞”指其中對于目的基因已產(chǎn)生至少一種遺傳改變的細菌或多個(plurality)或細菌細胞，或源自于如此改變的細胞并且包括遺傳改變的細胞。因此，如本文所使用的，術語“遺傳修飾的”或“遺傳修飾”指對于目的基因或核酸序列已產(chǎn)生的遺傳改變，例如缺失、添加或取代。在一些實施方案中，所述遺傳改變?yōu)槿斯ぶ亟M技術所導致的改變。在一些實施方案中遺傳改變包括向細菌細胞基因組內(nèi)引入異源多核苷酸。如本文所使用的，關于序列“異源的”為來源于外來物種的序列，或者，若源自同一物種，則自其天然形式在組成和/或基因組位點方面基本上被修飾。例如，可操作地連接到異源多核苷酸的啟動子來自與衍生該多核苷酸的物種不同的物種，或者，若來自相同/類似物種，則其一或二者自其原始形式和/或基因組位點基本上被修飾，或所述啟動子不是可操作地連接的多核苷酸的天然啟動子。本文所述方法和組合物中可使用任何目的細菌。在具體實施方案中，所述細菌包括益生菌細菌。如本文使用的術語“益生菌”指給予足夠量時賦予宿主健康益處的活微生物(fao2001：參見網(wǎng)址isapp.net/docs/probioticdefinition.pdf)或至少一種有助于受試者腸道健康和平衡的生物。在具體實施方案中，其也被稱為“友好的”、“有益的”或“好的”細菌，當受試者攝入時其幫助維持健康腸道并幫助部分或完全減輕病和/或疾病的一種或多種癥狀。如本文所使用的，“益生菌性質(zhì)”包括增強的腸功能和穩(wěn)定性、改善的針對傳染和非傳染性疾病的防護、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、減輕的乳糖不耐性、改善的消化和營養(yǎng)物吸收、減少的血液膽固醇、減少的變態(tài)反應風險和減少的尿道感染風險。在一些實施方案中，益生菌性質(zhì)包括接受益生菌細菌的受試者中抗炎細性胞因子產(chǎn)生的增加、接受益生菌細菌的受試者中促炎細胞因子產(chǎn)生的減少或接受益生菌細菌的受試者中抗炎與促炎細胞因子產(chǎn)生的比率增加。在一些實施方案中，已經(jīng)對本文所述細菌進行修飾以增強一種或多于一種益生菌性質(zhì)。例如，在一些實施方案中，提供已被修飾以增加胃腸上皮粘附并已被進一步修飾以減少細胞表面上lta展示的細菌。在其它實施方案中，提供已被修飾以增加酸或膽汁抗性并已被進一步修飾以減少細胞表面上lta展示的細菌。在其它實施方案中，所述細菌為乳酸細菌。如本文所使用的，“乳酸細菌”是指選自以下屬的細菌：氣球菌屬(aerococcu)、肉桿菌屬(carnobacterium)、腸球菌屬(enterococcus)、乳球菌屬(lactococcus)、乳桿菌屬、明串珠菌屬(leuconostoc)、酒球菌屬(oenococcus)、片球菌屬(pediococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、蜜蜂球菌屬(melissococcus)、差異球菌屬(alloiococcu)、狡詐球菌屬(dolosigranulum)、乳球形菌屬(lactosphaera)、四聯(lián)球菌屬(tetragenococcus)、漫游球菌屬(vagococcus)和魏斯氏菌屬(weissella)(holzapfel等(2001)am.j.clin.nutr.73:365s-373s;sneath,ed.(1986)bergey’smanualofsystematicbacteriology第2卷,lippincott,williams和wilkins,hagerstown,md)。在又其它實施方案中，使用乳桿菌?！叭闂U菌”意指來自乳桿菌屬的任何細菌，包括但不限于干酪乳桿菌(l.casei)、類干酪乳桿菌(l.paracasei)、路氏乳桿菌(l.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(l.rhamnosus)、約氏乳桿菌(l.johnsonni)、加氏乳桿菌(l.gasseri)、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌(l.plantarum)、發(fā)酵乳桿菌(l.fermentum)、唾液乳桿菌(l.salivarius)、保加利亞乳桿菌(l.bulgaricus)以及wood等概述的許多其它種類(holzapfel和wood,eds.(1995)thegeneraoflacticacidbacteria(乳酸細菌屬),第2卷.,springer,newyork)。在一個具體實施方案中，所述細菌為嗜酸乳桿菌ncfm。lta展示減少的細菌的產(chǎn)生、所述細菌起子培養(yǎng)物的制備以及使底物特別是食物底物例如牛奶發(fā)酵的方法可根據(jù)已知技術實施，所述技術包括但不限于m?yr?-m?kinen和bigret(1993)lacticacidbacteria.salminen和vonwright編輯.marceldekker,inc.newyork.65–96.;sandine(1996)dairystarterculturescogan和accolas編輯.vch出版社,newyork.191–206;gilliland(1985)bacterialstarterculturesforfood.crcpress,bocaraton,florida中所描述的技術。本文所述細菌細胞可在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如sambrook等(1989)molecularcloning,alaboratorymanual(分子克隆實驗室手冊)(第2版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork)中所一般性描述的。在一些實施方案中，本文所述細菌菌株為生物學上純的細菌培養(yǎng)物，所述細菌包含至少一種如本文所述導致細胞表面上lta展示減少的遺傳改變。在進一步的實施方案中，所述細菌包含一個或數(shù)個核苷酸添加、缺失和/或取代。這些菌株可包括但不限于：嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、約氏乳桿菌或植物乳桿菌?！吧飳W上純的”是指90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%不含其它細菌細胞。在其它實施方案中，本文所述細菌菌株與其它細菌菌株組合存在，以產(chǎn)生混合培養(yǎng)物?！皩φ铡被颉皩φ占毎被颉皩φ占毦睘闇y量重組細菌細胞表型變化提供參考點。對照細菌可包括，例如：(a)野生型細菌，即，具有與起始材料(其用于產(chǎn)生主題細菌的遺傳改變)相同的基因型；或(b)具有與起始材料相同的基因型但已用空構建體(nullconstruct)(即，用對目的性狀無已知作用的構建體，例如包含標記基因的構建體)轉(zhuǎn)化的細菌。lta相關多肽和多核苷酸已經(jīng)改變細胞表面上lta展示減少的重組細菌使得至少一種lta相關多核苷酸或多肽的活性水平已被調(diào)節(jié)(即升高或降低)。如本文所使用的，術語“l(fā)ta”指脂磷壁酸，一種糖脂錨定在膜中和聚(甘油磷酸酯)(gro-p)鏈延伸至壁中的大型兩親性分子。在一些實施方案中，術語“l(fā)ta”或“脂磷壁酸”包括壁磷壁酸(wta)，一種與細胞壁肽聚糖層共價連接的磷壁酸。lta的生物合成從碳水化合物單元通過糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移以形成錨定在細胞內(nèi)部膜上的糖脂開始。糖脂通過膜蛋白轉(zhuǎn)運出細胞并錨定在細胞外面的細胞膜上。最終，磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶將甘油磷酸酯(gro-p)單元轉(zhuǎn)運至錨定的糖脂以形成伸長的lta(圖1)。因此，本發(fā)明lta相關多核苷酸和多肽應理解為包括細胞表面上lta產(chǎn)生、組成、轉(zhuǎn)運、裝配以及展示有關的多核苷酸和多肽。在一些實施方案中，細菌表面上lta的展示減少以調(diào)節(jié)給予細菌的受試者的炎性反應。這些lta相關序列的片段和變體也可用于實施本文所述方法。如本文所使用的，術語“基因”和“重組基因”指包含開放閱讀框的核酸分子，特別是編碼lta產(chǎn)生、裝配或展示有關蛋白的那些。在一個實施方案中，lta相關多核苷酸和多肽包含seqidnos：1和2，或其活性片段或變體。在進一步的實施方案中，lta相關多核苷酸和多肽包含seqidnos：3-16或其活性片段或變體。lta相關多核苷酸包含編碼lta相關蛋白的編碼序列，以及調(diào)節(jié)序列例如啟動子兩者。lta相關多核苷酸可進一步包含正確翻譯lta相關mrna所必需的位點，例如核糖體結合位點。分離的lta、細胞壁、細胞膜、細胞表面相關多肽和蛋白、或分泌的所述多肽和蛋白及其變體和片段為包括在內(nèi)的。用于本發(fā)明目的，術語“蛋白”和“多肽”可互換使用。如本文所使用的，術語“表達”指源自本發(fā)明核酸片段的有義(mrna)或反義rna的翻譯。表達可還指mrna翻譯為多肽。減少lta展示提供調(diào)節(jié)靶l(wèi)ta相關多核苷酸表達水平(濃度和/或活性)的方法和組合物。如本文所使用的，“靶序列”包括期需調(diào)節(jié)表達水平的任何序列。靶序列包括編碼和不編碼多肽的序列。功能性lta相關多核苷酸或多肽理解為編碼負責細菌表面上lta產(chǎn)生、裝配、轉(zhuǎn)運或展示的蛋白、序列或rna。因此，表達降低的lta相關多核苷酸或多肽將產(chǎn)生與其野生型相應物相比lta表面展示減少的細菌。在一些實施方案中，lta表面展示減少的細菌可減少或預防患有ibd例如結腸炎的受試者的炎性反應?！皽p少”或“降低”多核苷酸或其編碼的多肽的表達水平意欲指靶序列的多核苷酸或多肽水平在統(tǒng)計學上低于適當對照中相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在特定實施方案中，根據(jù)目前公開的主題降低靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平導致適當對照中相同靶序列的多核苷酸水平或其編碼的多肽水平至少95%的降低、至少90%的降低、至少80%的降低、至少70%的降低、至少60%的降低、至少50%的降低、至少40%的降低、至少30%的降低、至少20%的降低、至少10%的降低、至少5%的降低。在其它實施方案中，降低靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平導致與適當對照相比，多核苷酸水平或其編碼的多肽水平約3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%-45%、40%-55%、50%-65%、60%-75%、70%-90%、70%-80%、70%-85%、80%-95%、90%-100%的降低。用于測定rna轉(zhuǎn)錄物水平、所編碼多肽水平或多核苷酸或多肽活性的方法在本文別處討論。在一些實施方案中，提高目的多核苷酸或多肽水平可減少細胞表面上lta的展示?！霸黾印被颉疤岣摺倍嗪塑账峄蚱渚幋a的多肽水平意指靶序列的多核苷酸或多肽水平在統(tǒng)計學上高于適當對照中相同靶序列的多核苷酸水平或多肽水平。在特定實施方案中，根據(jù)目前公開的主題提高靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平導致適當對照中相同靶序列的多核苷酸水平或其編碼的多肽水平至少95%的提高、至少90%的提高、至少80%的提高、至少70%的提高、至少60%的提高、至少50%的提高、至少40%的提高、至少30%的提高、至少20%的提高、至少10%的提高、至少5%的提高。在其它實施方案中，提高靶序列的多核苷酸水平和/或多肽水平導致與適當對照相比，多核苷酸水平或其編碼的多肽水平約3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%-45%、40%-55%、50%-65%、60%-75%、70%-90%、70%-80%、70%-85%、80%-95%、90%-100%的提高。用于測定rna轉(zhuǎn)錄物水平、所編碼多肽的水平或多核苷酸或多肽活性的方法在本文別處討論。表面lta展示減少的重組生物可使用多種技術構建。在本發(fā)明中，可降低編碼lta裝配途徑中一個的至少一種酶例如磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶或糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸或多肽的表達，如本文所述。在一個實施方案中，降低lta相關多肽(包括磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶)的水平。在某些實施方案中，降低seqidno:2所示磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶或其活性片段或變體的表達。磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶是參與將gro-p單元轉(zhuǎn)移至糖脂從而延伸lta鏈的多肽。已經(jīng)知道多種磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶多肽和編碼所述多肽的基因。如本文所使用的，磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶包括lta合酶(ltas)、甘油磷酸轉(zhuǎn)移酶(glycerolphosphotransferase)、甘油磷酸轉(zhuǎn)移酶(glycerophosphotransferase)和任何其它催化gro-p單元轉(zhuǎn)移以形成lta聚甘油磷酸酯主鏈的多肽。磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶為堿性磷酸酶超家族(mdob[cog1368]磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶)的成員。參見，例如，ncbi登錄號nz_acgx01000068.1和nc_010609.1。這些參考的每一個通過引用結合到本文中。在另一個實施方案中，lta相關多肽可包括糖基轉(zhuǎn)移酶。在該實施方案中，使用本文別處描述的任何降低多核苷酸或多肽水平的方法降低糖基轉(zhuǎn)移酶水平。在一個實施方案中，降低seqidno:4或6所示糖基轉(zhuǎn)移酶或其活性片段或變體的表達。糖基轉(zhuǎn)移酶為參與lta的糖脂或脂錨合成的多肽。已經(jīng)知道糖基轉(zhuǎn)移酶多肽和編碼所述多肽的基因。如本文所使用的，術語糖基轉(zhuǎn)移酶指催化lta的糖脂或脂錨合成的任何多肽，包括例如ygpp、ugt、bgsa、iaga、lafa或lafb。糖基轉(zhuǎn)移酶為糖基轉(zhuǎn)移酶_gtb_型超家族[cl10013]的成員。已知多種糖基轉(zhuǎn)移酶。參見，例如ncbi登錄號nc_010609.1和ef138835.1。這些參考的每一個通過引用結合到本文中。對磷壁酸的d-ala取代的質(zhì)量和水平可減少細胞表面上lta的展示。d-丙氨酰lta的合成需要dlt操縱子編碼的四個蛋白，dlta、dltb、dltc或dltd。因此，在一些實施方案中，lta相關多核苷酸或多肽可包括dlt操縱子中所示多核苷酸或多肽，包括seqidnos:9-16。因此，在另一個實施方案中，使用本文別處所述任何降低lta相關多核苷酸或多肽水平的方法降低dlta、dltb、dltc或dltd水平。已知dlt操縱子的多種成員。參見，例如ncbi登錄號aaf09201(dlta)、ncbi登錄號aab17658.1(dltb)、ncbi登錄號car86674.1(dltc)和ncbi登錄號caq65981.1(dltd)。這些參考的每一個通過引用結合到本文中。lta的結構可使用已知技術通過nmr和ms測量。參見，例如，moraths,geyera,&hartungt(2001)jexpmed193(3):393-397。lta相關多核苷酸或多肽表達的降低可通過本領域熟知的多種技術實現(xiàn)。例如，可通過突變降低基因表達。所述突變可為插入、缺失、取代或其組合，只要該突變導致功能性lta相關蛋白表達降低或?qū)е耹ta相關多核苷酸表達降低使得細胞表面上lta展示減少。lta展示減少的細菌可用于減少受試者炎性反應，從而治療或預防炎性腸病，例如結腸炎?？墒褂弥亟Mdna技術向染色體的特定位點引入突變。這樣的突變可為插入、缺失、一個核苷酸被另一個核苷酸置換或其組合，只要突變基因?qū)е鹿δ苄詌ta相關蛋白表達降低或?qū)е耹ta相關基因表達降低使得細胞表面上lta展示減少。這樣的突變可通過缺失若干堿基對獲得。在一個實施方案中，單個堿基對的缺失可致使lta相關蛋白無功能，從而減少細菌表面上lta的展示，這是因為由于該突變，其它堿基對不再處于正確的閱讀框中。在其它實施方案中，移去多個堿基對例如100個堿基對。在又其它的實施方案中，缺失整個lta相關基因的長度。在開放閱讀框中引入終止密碼子的突變或?qū)е麻_放閱讀框移碼的突變可用于降低lta相關基因的表達。用于降低lta相關基因表達以減少lta展示的其它技術為本領域所熟知。例如，技術可包括通過定向誘變修飾基因序列、限制酶消化后重新連接、基于pcr的誘變技術、等位交換、等位置換、rna干擾或翻譯后修飾。標準重組dna技術例如將lta相關基因克隆入質(zhì)粒、用限制酶消化基因、隨后用內(nèi)切核酸酶處理、重新連接以及同源重組為本領域所熟知，并在maniatis/sambrook(sambrook,j.等molecularcloning:alaboratorymanual(分子克?。簩嶒炇沂謨?.isbn0-87969-309-6)中描述。定向誘變可使用clontech出售的transformer試劑盒通過體外定向誘變方式獲得。pcr技術在(dieffenbach&dreksler;pcrprimers,alaboratorymanual(pcr引物，實驗室手冊).isbn0-87969-447-3和isbn0-87969-447-5)中詳細描述。認為編碼區(qū)中的突變以及正確轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的序列(包括調(diào)節(jié)序列例如啟動子)中的突變落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在某些實施方案中，通過定向誘變修飾重組細菌以在表面上具有減少的lta展示。在其它實施方案中，lta展示減少的細菌自細菌種群中分離。將理解的是，本文所用術語分離的指從其天然環(huán)境中分離出的細菌。這可例如從混合細菌種群或環(huán)境樣品中純化。分離的細菌基本上不含其它細菌種類和該細菌天然環(huán)境組分。基本不含其它細菌種類和天然環(huán)境組分的細菌包括污染細菌種類或天然環(huán)境組分少于約30%、20%、10%、5%或1%的細菌制備物。測定法檢測所公開多肽和/或核酸分子表達的測定法可包括lta的檢測和/或定量。用于檢測lta的方法在本文別處描述。細菌細胞表面上lta展示的減少可導致暴露在細菌中的宿主細胞的抗炎性反應增加或促炎性反應減少。測量抗炎性或促炎性反應的測定法，例如，還可用于評估本發(fā)明lta相關多肽的表達。測量炎性反應的方法亦在本文別處描述。片段和變體根據(jù)上下文，“片段”指多肽或蛋白氨基酸序列的一部分，或編碼多肽或蛋白氨基酸序列的一部分的多核苷酸。片段可保留原始蛋白的活性，因此，這樣的“活性”片段包括，例如，lta相關蛋白的片段，例如保留磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶活性的seqidno:2的片段。lta相關核苷酸序列的片段，例如編碼活性磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的seqidno:1的片段，可編碼具有生物學活性的蛋白片段。此外，lta相關蛋白片段包括seqidnos:2、4、6、8、10、12、14和16的片段。生物學活性核苷酸片段可如下制備：分離lta相關多核苷酸或多肽的部分，表達lta相關蛋白的編碼部分并評估lta相關蛋白的編碼部分的活性。在其它實施方案中，lta相關蛋白核苷酸序列的片段不需編碼生物學活性多肽，而是可包含表達時抑制靶l(wèi)ta相關多肽表達的多核苷酸(即有義、反義、mirna或sirna抑制)。lta相關多核苷酸的片段包括seqidnos:1、3、5、7、9、11、13和15的片段。lta相關核酸分子的片段包含至少約15、20、50、75、100、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000個核苷酸或多達本文所公開全長lta相關核苷酸序列中存在的核苷酸總數(shù)的核苷酸。氨基酸序列的片段包括包含與lta相關蛋白的氨基酸序列足夠相同或衍生自lta相關蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的肽，或部分長度的蛋白并且顯示至少一種lta相關蛋白活性(即調(diào)節(jié)細胞表面上展示的lta水平)，但其包含比本文所公開全長lta相關蛋白少的氨基酸。lta相關蛋白的生物學活性部分可為這樣的多肽，其為例如10、25、50、100、150、200個連續(xù)氨基酸長度或多達本發(fā)明全長lta相關蛋白(即seqidno:2、4、6、8、10、12、14或16)中存在的氨基酸總數(shù)。這些生物學活性部分可通過重組技術制備并針對天然lta相關蛋白的一種或多種功能活性，例如磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶活性進行評估。如本文所使用的，片段包含seqidnos:2、4、6、8、10、12、14或16的至少5個連續(xù)氨基酸。然而，本發(fā)明包括其它片段，例如蛋白中多于6、7、8或9個氨基酸的片段。在一些實施方案中提供已被修飾以降低本文別處所提供核苷酸和氨基酸序列的變體表達的重組細菌。變體意指足夠相同的序列。因此，本發(fā)明包括細菌，其經(jīng)修飾以降低與編碼seqidnos:2、4、6、8、10、12、14或16中l(wèi)ta相關蛋白的核苷酸序列足夠相同的核酸分子的表達或降低包含seqidnos:1、3、5、7、9、11、13或15核苷酸序列或其互補序列(complement)的核酸分子的表達。變體多核苷酸進一步包括包含一個或數(shù)個添加、缺失或取代的序列。變體還包括本發(fā)明核苷酸序列編碼的變體多肽。此外，本發(fā)明多肽具有與seqidnos:2、4、6、8、10、12、14或16中所示氨基酸序列足夠相同的氨基酸序列。“足夠相同的”意指一種氨基酸序列或核苷酸序列與另一氨基酸序列或核苷酸序列性比，包含足夠或最小數(shù)目的相當或相同氨基酸殘基或核苷酸，因此提供共同的結構域和/或表明共同的功能活性。保守變體包括由于遺傳密碼簡并性而不同的那些核苷酸序列。一般而言，分別與seqidnos:2、4、6、8、10、12、14或16的任一氨基酸序列或seqidnos:1、3、5、7、9、11、13或15的任一核苷酸序列具有至少約45%、55%、或65%同一性、優(yōu)選至少約70%或75%同一性、更優(yōu)選至少約80%、85%或90%、最優(yōu)選至少約91%、92%、93%、94%、95%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%序列同一性的氨基酸序列或核苷酸序列，在本文中被定義為足夠相同的。本發(fā)明所包括的變體蛋白具有生物學活性，即其保留所需的天然蛋白lta相關生物學活性，例如seqidno:2的磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶活性。參見，例如，varcamonti等(2003)appl.environ.microbiol.69:1287–1289。蛋白的生物學活性變體可與該蛋白具有少至1-15個氨基酸殘基、少至1-10例如6-10、少至5、少至4、3、2或甚至1個氨基酸殘基的差異。lta相關多肽可通過多種方式改變，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于誘變和多核苷酸改變的方法為本領域所熟知。參見，例如，kunkel(1985)proc.natl.acad.sci.usa82:488-492;kunkel等(1987)methodsinenzymol.154:367-382;u.s.專利號4,873,192;walker和gaastra,eds.(1983)techniquesinmolecularbiology(分子生物學技術)(macmillan出版公司,newyork)及其中引用的參考文獻。關于不影響目的蛋白生物學活性的氨基酸取代的指導可參見dayhoff等(1978)atlasofproteinsequenceandstructure(natl.biomed.res.found.,washington,d.c.)的模型，其通過引用結合到本文?？蛇M行保守取代，例如一個氨基酸用另一個具有相似性質(zhì)的氨基酸進行交換。本領域技術人員將理解的是，本文所公開lta相關多肽的活性可通過常規(guī)篩查測定法，例如本文別處所描述的測定法評估。如本文所使用的，“天然序列”多肽包括與來源于自然的相應多肽具有相同氨基酸序列的多肽。這些天然序列多肽可從自然分離或可通過重組和/或合成方法產(chǎn)生。術語“天然序列”特別地包括多肽的天然存在的截短、可溶或分泌形式、天然存在的變體形式以及天然存在的等位變體。如本文所使用的，兩個多核苷酸或多肽序列背景下的“序列同一性”或“同一性”為當在特定比較窗口內(nèi)比對最大對應性時，涉及兩個序列中相同的殘基。當序列同一性百分數(shù)關于蛋白而使用時，公認不相同的殘基位點往往因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被具有相似化學性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基取代，并因此不改變該分子的功能性質(zhì)。當序列差異在于保守取代時，序列同一性百分數(shù)可向上調(diào)整以校正取代的保守性質(zhì)。因這些保守取代而不同的序列被認為具有“序列相似性”或“相似性”。進行該調(diào)整的方法為本領域技術人員所熟知。典型地，其涉及給作為部分而非完全錯配的保守取代評分，從而增加序列同一性百分數(shù)。因此，例如，當相同氨基酸給予分數(shù)1，非保守取代給予分數(shù)0時，保守取代給予0-1之間的分數(shù)。計算保守取代的評分，例如在程序pc/gene(intelligenetics,mountainview,california)中執(zhí)行。如本文所使用的，“序列同一性百分數(shù)”意指通過在比較窗口內(nèi)比較兩個最佳比對序列所確定的值，其中為了兩個序列的最佳比對，比較窗口中的多核苷酸序列部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)。所述百分數(shù)如下計算：確定兩序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位點數(shù)目以得到匹配位點數(shù)目，將匹配位點數(shù)目除以比較窗口中的總位點數(shù)并將該結果乘以100以得到序列同一性百分數(shù)。除非另外說明，本文所提供序列同一性/相似性值指使用gap版本10獲得的值，其使用下列參數(shù)：使用gap權重50和長度權重3的核苷酸序列%同一性和%相似性以及nwsgapdna.cmp評分矩陣，使用gap權重8和長度權重2的氨基酸序列%同一性和%相似性以及blosum62評分矩陣；或其任何等價程序?！暗葍r程序”意指對于任何兩個目的序列，與gap版本10產(chǎn)生的相應比對相比時，產(chǎn)生具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配的比對以及相同的序列同一性百分數(shù)的任何序列比較程序。治療和預防方法提供用于減少受試者炎癥的方法，包括給予本文別處所述重組細菌。在一些實施方案中，給予lta展示減少的重組細菌可改善受試者的ibd例如結腸炎癥狀。在其它實施方案中，給予lta展示減少的重組細菌可預防受試者ibd例如結腸炎發(fā)病。在一些實施方案中，lta相關蛋白(包括，例如，磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶)表達降低(包括，例如，seqidno:1或其活性片段或變體表達降低)的重組細菌在細胞表面上具有減少的lta展示，并且可改善已建立結腸炎的癥狀和預防結腸炎發(fā)病。參見下文實施例1。在一些實施方案中，提供用于在受試者中局部治療和/或預防胃腸道炎癥、治療和/或預防胃腸道炎性病癥以及局部治療腸疼痛的方法?！爸委煛痹诒疚闹卸x為治愈、愈合、緩和、減輕、改變、醫(yī)治、改良、改善或影響患有胃腸病癥的受試者的癥狀。待治療受試者可患有胃腸病癥或處于出現(xiàn)胃腸病癥的風險中，包括例如，患有炎性腸病或處于出現(xiàn)炎性腸病的風險中。給予重組細菌可用于預防或治療目的?！邦A防”意指重組細菌預防性地提供，即細菌在任何癥狀之前提供。預防性給予重組細菌用于預防或減弱任何后續(xù)的癥狀。當治療性地提供時，細菌在癥狀出現(xiàn)時(或其后不久)提供。物質(zhì)的治療性給予用于減弱任何實際癥狀。“受試者”意指動物。在具體實施方案中，受試者為哺乳動物，例如靈長類或人。在其它實施方案中，受試者包括馴養(yǎng)動物例如貓科動物或犬科動物，或農(nóng)用動物例如反芻動物、馬、豬、家禽或綿羊。在具體實施方案中，用本發(fā)明藥物制劑進行治療的受試者為人。在一些實施方案中，進行治療的人可為新生兒、嬰兒、幼兒、青春期前的少年、青少年或成年人。本發(fā)明的受試者可能患有胃腸病癥的癥狀或可能有胃腸病癥的風險(例如已進行抗生素治療的受試者)。胃腸病癥本發(fā)明方法和組合物涉及炎性胃腸病癥的治療。如本文所使用的，術語“炎性胃腸病癥”或“胃腸病癥”或“胃腸道炎性病癥”指免疫系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)細胞介導的胃腸道或腸疾病。炎性胃腸病癥包括，例如，炎性腸病(ibd)例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎、淋巴細胞結腸炎、顯微鏡下結腸炎、膠原性結腸炎、自身免疫性腸病、變應性胃腸疾病和嗜酸性胃腸疾病，以及腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛或便秘。在某些實施方案中，本發(fā)明方法涉及肥胖癥或肥胖癥癥狀包括ibd、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛或便秘的治療或預防。參見，例如，kadookay等(2010)eurjclinnutr.64(6):636-43，其通過引用結合到本文中。在一些實施方案中，炎癥的減少可包括刺激腸健全；降低腸通透性；改善粘蛋白合成、分泌和/或質(zhì)量；改善腸上皮的成熟和分化；改善營養(yǎng)吸收；增加轉(zhuǎn)移抗微生物活性的可溶性因子的產(chǎn)生；刺激、改善或支持感染抗性；支持針對病毒或細菌感染的細胞或體液應答；增加細胞毒性(抗病毒和抗腫瘤兩者)；支持全身和/或粘膜接種應答；提高或支持細胞和/或體液免疫；提高或支持天然免疫(包括嗜中性粒細胞、吞噬細胞、巨噬細胞和天然殺傷細胞活性)；提高或支持適應性t細胞和b細胞免疫；刺激輔助t細胞1(th1)細胞因子模式(提高il-1、il-2、ifn-γ、il-12、tnf-α；人白細胞抗原-dr(hla-dr)表達)；抑制炎癥或產(chǎn)生全身和粘膜炎癥介質(zhì)(包括細胞因子和/或趨化因子)；通過降低總ige和/或變應原特異性ige而降低敏化；降低變應性細胞因子的產(chǎn)生；降低th2支持性免疫球蛋白概況及其組合。本文所用術語“抗炎細胞因子”指在具有該細胞因子受體的細胞中引發(fā)抗炎反應的天然存在的或重組的蛋白、其類似物或其片段。本發(fā)明抗炎細胞因子可為控制促炎細胞因子應答的免疫調(diào)節(jié)分子。本發(fā)明抗炎細胞因子包括白介素(il)-1受體拮抗物、il-4、il-10、il-11和il-13、il-16、ifn-α、tgf-β、g-csf。本文所用術語“促炎細胞因子”是指有利于炎癥的免疫調(diào)節(jié)細胞因子。本發(fā)明的促炎細胞因子包括il1-α、il1-β、tnf-α、il-2、il-3、il-6、il-7、il-9、il-12、il-17、il-18、tnf-α、lt、lif、制瘤素或ifn-α、ifn-β、ifn-γ。在一些實施方案中，給予重組細菌導致抗炎細胞因子產(chǎn)生的增加。如本文所使用的，抗炎細胞因子產(chǎn)生的增加或提高包括與適當?shù)膶φ障啾瓤寡准毎蜃铀降娜魏谓y(tǒng)計學上顯著的增加。所述增加可包括，例如，抗炎細胞因子水平至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%或更大的增加。所述增加還可包括，例如，抗炎細胞因子水平至少約3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%-45%、40%-55%、50%-65%、60%-75%、70%-85%、80%-95%、90%-105%、100%-115%、105%-120%、115%-130%、125%-150%、140%-160%、155%-500%或更大的增加。測定抗炎細胞因子水平的方法是已知的。參見，例如，lengs.,等(2008)jgerontolabiolscimedsci63(8):879-884。測定抗炎細胞因子產(chǎn)生的方法包括多重微珠測定法(multiplexbeadassay)、elispot和流式細胞術。參見，例如，maecker等(2005)bmcimmunology6:13。方法和組合物還包括降低促炎細胞因子產(chǎn)生的方法和組合物，其可減少或防止炎性反應。如本文所使用的，促炎細胞因子產(chǎn)生水平的降低包括與適當對照相比受試者中促炎細胞因子產(chǎn)生水平的任何統(tǒng)計學上顯著的降低。所述降低可包括，例如，促炎細胞因子水平至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的降低。測定細胞因子水平的方法是已知的，包括，例如lengs.,等(2008)jgerontolabiolscimedsci63(8):879-884。測定促炎細胞因子產(chǎn)生的方法包括多重微珠測定法、elispot和流式細胞術。參見，例如，maecker等(2005)bmcimmunology6:13。炎性細胞因子的產(chǎn)生還可通過測定抗炎細胞因子產(chǎn)生與促炎細胞因子產(chǎn)生的比率測量。在特定方面，與適當對照相比抗炎細胞因子產(chǎn)生與促炎細胞因子產(chǎn)生的比率增加約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、300、600、900、1000倍或更多。在其它方面，與適當對照相比抗炎細胞因子產(chǎn)生與促炎細胞因子產(chǎn)生的比率增加約1-5倍、約5-10倍、約10-20倍、約20-30倍、約30-40倍、約40倍-60倍、約60倍-80倍、約80倍-約100倍、約100-200倍、約200倍-300倍、約300-400倍、約400-約500倍、約500-約500倍、約500倍-約700倍、約700倍-800倍、約800倍-約1000倍或更多。測定抗炎細胞因子產(chǎn)生與促炎細胞因子產(chǎn)生的比率的方法可參見例如，lengs.,等(2008)jgerontolabiolscimedsci63(8):879-884。測定細胞因子產(chǎn)生的方法包括多重微珠測定法、elispot和流式細胞術。參見，例如，maecker等(2005)bmcimmunology6:13。炎性病癥在一些實施方案中，通過使用本文別處所述組合物和方法減少炎癥，可治療或預防免疫和炎性病癥。例如，可通過本文所述方法和組合物治療或預防的病癥包括，但不限于：關節(jié)炎(類風濕性關節(jié)炎、青少年型類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、銀屑病性關節(jié)炎)、銀屑病、皮炎包括特應性皮炎、慢性自身免疫性蕁麻疹、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮壞死松解癥、系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥、呼吸窘迫綜合征、成人呼吸窘迫綜合征(ards)、腦膜炎、過敏性鼻炎、腦炎、葡萄膜炎、結腸炎、腎小球腎炎、過敏性病況、濕疹、哮喘、t細胞浸潤和慢性炎癥反應相關病況、動脈粥樣硬化、自身免疫心肌炎、白細胞粘附缺陷、全身性紅斑狼瘡(sle)、狼瘡(包括腎炎、非腎臟的、盤狀、脫發(fā))、青少年糖尿病、多發(fā)性硬化癥、過敏性腦脊髓炎、細胞因子和t淋巴細胞介導的急性和遲發(fā)型過敏癥相關免疫反應、結核病、結節(jié)病、肉芽腫病包括韋格納氏肉芽腫病(wegener'sgranulomatosis)、粒細胞缺乏癥、血管炎(包括anca)、再生障礙性貧血、coombs陽性貧血、diamondblackfan貧血、免疫溶血性貧血包括自身免疫溶血性貧血(aiha)、惡性貧血、純紅細胞再生障礙(prca)、因子viii缺乏、血友病a、自身免疫性中性粒細胞減少癥、全血細胞減少癥、白血球減少癥、白細胞滲出相關疾病、cns炎性病癥、多發(fā)性器官損傷綜合征、重癥肌無力、抗原-抗體復合物介導的疾病、抗腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體綜合征、變應性視神經(jīng)炎、bechet疾病、castleman氏綜合征、古德帕斯丘綜合征、蘭伯特-伊頓肌無力綜合征、reynaud氏綜合征、sjorgen氏綜合征、史-約綜合征(stevens-johnsonsyndrome)、實體器官移植排斥(包括高群體反應性抗體滴度的預處理、組織中的iga沉積等)、移植物抗宿主疾病(gvhd)、大皰性類天皰瘡、天皰瘡(均包括尋常天皰瘡和落葉狀天皰瘡)、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、萊特爾氏病(reiter'sdisease)、僵人綜合征、巨細胞動脈炎、免疫復合物性腎炎、iga腎病、igm多神經(jīng)病或igm介導的神經(jīng)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)、血栓性血小板減少性紫癜(ttp)、自身免疫性血小板減少癥、睪丸和卵巢自身免疫性疾病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎、原發(fā)性甲狀腺功能減退癥、自身免疫性內(nèi)分泌性疾病包括自身免疫性甲狀腺炎、慢性甲狀腺炎(橋本氏甲狀腺炎(hashimoto'sthyroiditis))、亞急性甲狀腺炎、特發(fā)性甲狀腺功能減退癥、阿狄森氏病(addison'sdisease)、格雷夫氏病(grave'sdisease)、自身免疫性多腺體綜合征(或多腺體內(nèi)分泌病綜合征)、i型糖尿病又稱胰島素依賴型糖尿病(iddm)和席漢氏綜合癥(sheehan'ssyndrome)、自身免疫性肝炎、淋巴間質(zhì)性肺炎(hiv)、閉塞性細支氣管炎(非移植)與nsip、格林-巴利綜合癥(guillain-barre'syndrome)、大血管血管炎(包括風濕性多肌痛和巨細胞(高安氏)動脈炎)、中血管血管炎(包括川崎病和結節(jié)性多動脈炎)、強直性脊柱炎、貝格爾氏病(berger'sdisease)(iga腎病)、急進性腎小球腎炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)、冷球蛋白血癥、als或冠狀動脈疾病。在具體實施方案中，通過減少受試者的炎癥，治療或預防心臟病癥。如本文所使用的心臟病癥包括但不限于：心力衰竭(包括但不限于心臟肥大、左心衰竭和右心衰竭)、缺血性心臟病(包括但不限于心絞痛、心肌梗死、慢性缺血性心臟病和心臟性猝死)、高血壓性心臟病(包括但不限于全身性(左側)高血壓性心臟病和肺部(右側)高血壓性心臟病)、瓣膜性心臟病(包括但不限于鈣化引起的瓣膜變性，例如鈣化性主動脈瓣狹窄、先天性二葉主動脈瓣鈣化、二尖瓣環(huán)鈣化、二尖瓣粘液瘤樣變性(二尖瓣脫垂)、風濕熱、風濕性心臟病、感染性心內(nèi)膜炎、和非感染的贅生物例如非細菌性血栓性心內(nèi)膜炎和全身性紅斑狼瘡心內(nèi)膜炎(libman-sacks疾病)、類癌性心臟病和人工瓣膜并發(fā)癥)、心肌病(包括但不限于擴張型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病和心肌炎)、心包疾病(包括但不限于心包積液、心包積血、心包炎包括急性心包炎和愈合性心包炎(healedpericarditis)、類風濕性心臟病)、贅生物性心臟病(neoplasticheartdisease)(包括但不限于原發(fā)性心臟腫瘤，例如粘液瘤、脂肪瘤、乳頭狀纖維彈性組織瘤、橫紋肌瘤、肉瘤，和非心臟贅生物的心臟效應)、先天性心臟病(包括但不限于左向右分流-晚發(fā)紺，例如房間隔缺損、室間隔缺損、動脈導管未閉、和房室間隔缺損；右向左分流-早發(fā)紺，例如法洛四聯(lián)癥、大動脈易位、動脈干、三尖瓣閉鎖、和完全性肺靜脈異常連接；阻塞性先天異常，例如主動脈縮窄、肺動脈狹窄和閉鎖、主動脈狹窄和閉鎖)以及心臟移植相關病癥。藥物組合物在一些實施方案中，將lta展示減少的細菌菌株以營養(yǎng)藥物組合物(nutraceuticalcomposition)例如營養(yǎng)補劑和/或食品添加劑的形式給予受試者。在具體的實施方案中，藥物組合物包含已經(jīng)修飾以降低編碼磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸或多肽(例如seqidno:1和2中所示多核苷酸和多肽)表達的重組細菌。在其它實施方案中，將提取物以藥物組合物的形式給予受試者。如本文其它部分所述，給予可包括單劑量或多劑量給予。藥物組合物可以是液體制劑或固體制劑。當藥物組合物是固體制劑時，其可配制成片劑、口含片(suckingtablet)、咀嚼片、口香糖、膠囊劑、小藥囊劑、散劑、顆粒劑、包衣顆粒、包衣片、腸包衣片、腸包衣膠囊、口溶條(meltingstrip)或膜。如果藥物組合物是液體制劑，則其可配制成口服溶液劑、混懸劑、乳劑或糖漿劑。所述組合物還可包含獨立選自(但不限于)以下的載體材料：乳酸發(fā)酵食品、發(fā)酵乳制品、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)。本文所用術語“藥物組合物”可配制成食物組合物、膳食補充劑、功能食品、醫(yī)藥用食品或營養(yǎng)制品，只要達到所需作用，即治療或預防胃腸道炎性病癥。所述食物組合物可選自飲料、酸奶、果汁、冰淇淋、面包、餅干、薄脆餅干、谷類食物、健康條(healthbar)、涂味品(spreads)和營養(yǎng)制品。食物組合物還可包含載體材料，其中所述載體材料選自乳酸發(fā)酵食品、發(fā)酵乳制品、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白質(zhì)。按照本發(fā)明使用的或按照本發(fā)明產(chǎn)生的本發(fā)明的藥物組合物還可包含眾所周知的其它物質(zhì)，例如惰性溶媒或藥學上可接受的輔助劑、載體、防腐劑等。本公開內(nèi)容還包括重組細菌彼此的組合，和/或與一種或多種可用于治療胃腸道炎性病癥的其它藥劑的組合。例如，本發(fā)明細菌可與有效劑量的治療胃腸道炎性病癥的常規(guī)抗炎劑例如潑尼松(prednisone)、美沙拉秦(mesalamine)、硫唑嘌呤、tnf抑制劑、氨甲喋呤或6-巰嘌呤組合給予。術語“組合給予”指活性劑的同時給予和序貫給予兩者。組合療法當然并不限于本文提供的藥劑，而是包括用于治療炎性病癥的任何組合物。治療有效量“治療有效劑量”、“治療有效量”或“有效量”意指給予受試者時減少炎性反應或防止炎性反應增加的lta展示減少的重組細菌的量。“陽性治療反應”指，例如，改善炎性胃腸病癥的至少一種癥狀的病況。有效量的治療劑根據(jù)預定目的確定。術語“單位劑量“是指適用于受試者的物理獨立單位，各單位含有經(jīng)計算產(chǎn)生所需的與其給予(即合適的途徑和治療方案)相關的反應的治療組合物的預定量。按照治療次數(shù)和單位劑量兩者的待給予的量，取決于待治療的受試者、受試者的狀態(tài)和所需保護。治療組合物的確切量還取決于從業(yè)人員的判斷，并且為每個個體所特有。一般而言，重組細菌的劑量可隨例如患者的年齡、體重、身高、性別、一般醫(yī)學狀況和既往病史等因素而變化。在具體的實施方案中，可合乎需要的是，給予細菌的范圍為約104-約1012cfu、105-1011cfu、106-1010cfu、108-1010cfu或108-1012cfu。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述方法包括給予多劑量的細菌。所述方法可包括給予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多治療有效劑量的包含本文所述細菌的組合物。在一些實施方案中，在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天或超過30天的時程內(nèi)給予劑量。多劑量組合物的給予頻率和持續(xù)時間是這樣的，使得降低或預防炎性反應，從而治療或預防胃腸病癥。此外，用治療有效量的本發(fā)明的重組細菌治療受試者可包括單一治療或可包括系列治療。還應理解的是，可在具體治療進程中增加或減少用于治療的細菌的有效劑量。劑量的改變可起因于本領域已知的和本文描述的用于檢測炎癥的診斷測定結果，并且從該結果來看是顯然的。保藏物申請人于2011年1月10日在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection,atcc)，馬納薩斯，va20110usa對嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilus:nck2025進行了保藏，atcc保藏號為pta-11587。自本申請?zhí)峤蝗掌谥埃?011年1月10日保藏在atcc的細菌培養(yǎng)物取自由北卡羅來納州立大學，100schaubhall，校園郵箱(campusbox)7624，羅利(raleigh)，北卡羅來納州，27695維持的保藏物。在本申請未決期間，向?qū)＠虡司旨霸摼质跈喽ǖ娜藛T提出請求時，可獲得該保藏物。在本申請任何權利要求的許可時，申請人將依照37c.f.r.§1.808使公眾可獲得該保藏物。該嗜酸乳桿菌lactobacillusacidophilus:nck2025保藏物將在作為公共保藏機構的atcc保藏機構維持達30年的時間，或在最新要求后5年，或?qū)＠蓪嵤┢谙?哪個期限較長就維持該較長的期限)，且如果保藏物在該期限內(nèi)變得非存活的，則將更換。另外，申請人已符合或?qū)⒎?7c.f.r.§§1.801-1.809的全部要求，包括在保藏時提供樣品存活性的說明。申請人無權免除有關生物材料轉(zhuǎn)移或其商業(yè)運輸時法律所強加的任何限制。根據(jù)上文提供的描述，提供下列實施方案：已編號的實施方案：1.重組或分離的細菌，其已經(jīng)被遺傳修飾以減少所述細菌表面上脂磷壁酸(lta)的展示。2.實施方案1的重組或分離的細菌，其中所述重組或分離的細菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶表達。3.實施方案1或2的重組或分離的細菌，其中所述重組或分離的細菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低包含與seqidno:1所示核酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表達。4.實施方案1或2的重組或分離的細菌，其中所述重組或分離的細菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低包含seqidno:1所示核苷酸序列的多核苷酸表達。5.前述實施方案中任一個的重組或分離的細菌，其中所述重組或分離的細菌為益生菌細菌。6.實施方案5的重組或分離的細菌，其中所述益生菌細菌為乳酸細菌。7.實施方案6的重組或分離的細菌，其中所述乳酸細菌為乳桿菌。8.實施方案7的重組細菌，其中所述乳桿菌為嗜酸乳桿菌。9.實施方案8的重組或分離的細菌，其中所述遺傳修飾對嗜酸乳桿菌ncfm實施。10.實施方案8的重組或分離的細菌，其中所述嗜酸乳桿菌為以atcc登記號pta-11587保藏的嗜酸乳桿菌nck2025。11.制備重組或分離的細菌的方法，所述方法包括遺傳修飾細菌以減少所述細菌表面上脂磷壁酸(lta)展示。12.實施方案11的方法，其中所述重組或分離的細菌已經(jīng)被修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達。13.實施方案11或12的方法，其中所述重組或分離的細菌已經(jīng)被遺傳修飾以降低包含與seqidno:1所示核苷酸序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表達。14.實施方案11-13中任一個的方法，其中所述重組細菌為益生菌細菌。15.實施方案14的方法，其中所述益生菌細菌為乳酸細菌。16.實施方案15的方法，其中所述乳酸細菌為乳桿菌。17.實施方案16的方法，其中所述乳桿菌為嗜酸乳桿菌。18.實施方案17的方法，其中所述遺傳修飾對嗜酸乳桿菌ncfm實施。19.實施方案17的方法，其中所述嗜酸乳桿菌為以atcc登記號pta-11587保藏的嗜酸乳桿菌nck2025。20.實施方案17-19中任一個的方法，其中所述嗜酸乳桿菌已經(jīng)被修飾以降低包含seqidno:1所示核苷酸序列的多核苷酸表達。21.減少受試者炎癥的方法，包括給予所述受試者治療有效量的實施方案1-10中任一個的重組或分離的細菌。22.治療或預防受試者胃腸道炎性病癥的方法，包括給予受試者治療有效量的實施方案1-10中任一個的重組或分離的細菌。23.實施方案21或22中任一個的方法，其中所述受試者為動物。24.實施方案23的方法，其中所述受試者為哺乳動物。25.實施方案24的方法，其中所述受試者為人。26.實施方案23的方法，其中所述受試者為馴養(yǎng)動物。27.實施方案23的方法，其中所述受試者為農(nóng)用動物。28.實施方案21-27中任一個的方法，其中所述受試者患有胃腸病癥。29.實施方案28的方法，其中所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。30.實施方案21-29中任一個的方法，其中所述細菌增加所述受試者中一種或多種抗炎細胞因子的產(chǎn)生。31.實施方案30的方法，其中所述抗炎細胞因子為il-10。32.實施方案21-31中任一個的方法，其中所述細菌降低所述受試者中一種或多種促炎細胞因子的產(chǎn)生。33.實施方案32的方法，其中所述促炎細胞因子選自il-12、il-6、ifnγ、tnfα及其任何組合。34.實施方案21-33中任一個的方法，其中所述細菌的治療有效量為約108-1012cfu/天。35.包含實施方案1-10中任一個的重組或分離的細菌的藥物組合物。36.實施方案1-10中任一個的重組或分離的細菌，其用作藥物。37.實施方案1-10中任一個的重組或分離的細菌，其用于治療或預防受試者例如實施方案23-27中任一個的受試者的胃腸道炎性病癥。38.實施方案36或37的重組或分離的細菌，其中所述細菌導致所述受試者中抗炎細胞因子產(chǎn)生的增加。39.實施方案38的重組或分離的細菌，其中所述抗炎細胞因子為il-10。40.實施方案36-39中任一個的重組或分離的細菌，其中所述細菌降低所述受試者中一種或多種促炎細胞因子的產(chǎn)生。41.實施方案40的重組或分離的細菌，其中所述促炎細胞因子選自il-12、il-6、ifnγ、tnfα及其任何組合。42.實施方案36-41中任一個的重組或分離的細菌，其中將所述細菌配制為以治療有效量給予受試者，其中所述細菌的治療有效量為約108-1012cfu/天。43.實施方案36-42中任一個的重組或分離的細菌，其中所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。44.實施方案1-10中任一個的細菌在制造藥物中的用途。45.44中的細菌在制造用于治療或預防受試者例如實施方案23-27中任一個的受試者的胃腸道病癥的藥物中的用途。46.實施方案44或45中的細菌在制造用于治療炎性病癥的藥物中的用途。47.實施方案46的細菌的用途，其中所述病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。48.實施方案1-10中任一個的細菌作為藥物的用途。49.實施方案48中細菌的用途，其中所述藥物用于治療或預防受試者例如實施方案23-27中任一個的受試者的胃腸道病癥。50.實施方案48或49中的細菌的用途，其中所述病癥為炎性病癥。51.實施方案50的細菌的用途，其中所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。未編號的實施方案根據(jù)第一個方面，提供重組或分離的細菌，其經(jīng)遺傳修飾以減少所述細菌表面上脂磷壁酸(lta)的展示。在一個實施方案中，重組或分離的細菌已被遺傳修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達。在具體實施方案中，重組或分離的細菌已被遺傳修飾以使磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達與未修飾的對照相比降低約3%-15%、10%-25%、20%-35%、30%-45%、40%-55%、50%-65%、60%-75%、70%-90%、70%-80%、70%-85%、80%-95%、90%-100%。在進一步的實施方案中，重組或分離的細菌以被遺傳修飾以降低包含與seqidno:1、3、5、7、9、11、13或15中任一所示核酸序列或其片段或變體具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表達。在進一步的實施方案中，重組或分離的細菌已被遺傳修飾以降低包含seqidno:1、3、5、7、9、11、13或15的核苷酸序列或其片段或變體的多核苷酸表達。根據(jù)第二個方面，提供制備重組或分離的細菌的方法，所述方法包括遺傳修飾細菌以減少該細菌表面上脂磷壁酸的展示。在具體實施方案中，通過定向誘變修飾細菌。在進一步的實施方案中，所述重組或分離的細菌已被修飾以降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達。將理解的是，降低磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶的表達可由dna、rna或翻譯后水平的破壞導致，獲得這種表達降低的合適方法在本領域是已知的，并在本文中進一步詳細討論。在另一個實施方案中，所述重組或分離的細菌已被遺傳修飾以降低包含與seqidno:1、3、5、7、9、11、13或15中任一個所示核酸序列或其片段或變體具有至少70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸表達。在進一步的實施方案中，嗜酸乳桿菌已被修飾以降低包含seqidno:1、3、5、7、9、11、13或15所示核苷酸序列或其片段或變體的多核苷酸表達。在進一步的實施方案中，所述重組或分離的細菌為益生菌細菌。特別地，乳酸細菌。更特別地，乳桿菌特別是嗜酸乳桿菌。甚至更特別地，遺傳修飾對嗜酸乳桿菌ncfm實施。在具體實施方案中，重組或分離的細菌為以atcc登記號pta-11587保藏的嗜酸乳桿菌nck2025。第三方面，提供減少受試者炎癥的方法，包括給予所述受試者治療有效量的本文別處所述重組或分離的細菌。在一個實施方案中，炎癥的減少治療或預防心臟疾病例如冠狀動脈疾病或心力衰竭。第四方面，提供治療或預防胃腸道炎性病癥的方法，包括給予受試者治療有效量的本文別處所述重組或分離的細菌。在一個實施方案中，受試者為動物，更特別地哺乳動物。在另一個實施方案中受試者為人。在進一步的實施方案中受試者為馴養(yǎng)動物。在又進一步的實施方案中，受試者為農(nóng)用動物。在進一步的實施方案中，受試者患有胃腸病癥。在具體實施方案中，所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。將理解的是，細菌可增加受試者中一種或多種抗炎細胞因子的產(chǎn)生。在具體實施方案中，抗炎細胞因子為il-10。在另一個實施方案中，細菌降低受試者中一種或多種促炎細胞因子的產(chǎn)生。在進一步的實施方案中，促炎細胞因子選自：il-12、il-6、ifnγ、tnfα或其任何組合。在進一步的實施方案中，細菌以治療有效量給予，其中所述細菌的治療有效量為約108-1012cfu/天。根據(jù)第五個方面，提供包含本文所述重組或分離的細菌的藥物組合物。根據(jù)第六個方面，提供用作藥物的本文所述重組或分離的細菌。根據(jù)第七個方面，提供用于治療或預防受試者胃腸道病癥的本文所述重組或分離的細菌。特別地，所述病癥為炎性病癥。更特別地，所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。在另一個實施方案中，用于本文所述方法的重組或分離的細菌增加受試者抗炎細胞因子的產(chǎn)生。在一個實施方案中，抗炎細胞因子為il-10。在另一個實施方案中，用于本文所述方法的重組或分離的細菌降低受試者一種或多種促炎細胞因子的產(chǎn)生。在進一步的實施方案中，促炎細胞因子選自：il-12、il-6、ifnγ、tnfα或其任何組合。將理解的是，細菌以治療有效量提供，其中所述細菌的治療有效量為約108-1012cfu/天。根據(jù)第八個方面，提供本文別處所述細菌在制造藥物中的用途。在具體實施方案中，所述藥物用于治療或預防受試者胃腸道病癥。在進一步的實施方案中，所述病癥為炎性病癥。在進一步的實施方案中，所述胃腸病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。根據(jù)第九個方面，提供本文所述細菌作為藥物的用途。在具體實施方案中，所述藥物用于治療或預防受試者的胃腸道病癥。在進一步的實施方案中，所述病癥為炎性病癥。在進一步的實施方案中，所述病癥選自炎性腸病、克羅恩病、腸易激綜合征、潰瘍性結腸炎、肥胖癥、腹瀉、胃氣脹、腸胃氣脹、腹部絞痛、腹痛、便秘及其任何組合。將顯而易見的是，關于本文所述任何方面的受試者可為任何合適的受試者，例如關于上述第四方面所描述的受試者。進一步的方面如上所述。對于本領域技術人員將顯而易見的是，關于一個特定方面所描述的任何特征同樣適用于所有其它方面，除非另外特別說明或明顯不相容。下列實施例以說明的方式而非限制的方式提供。實驗實施例1減少嗜酸乳桿菌的lta展示。在嗜酸乳桿菌ncfm(nck56)中，鑒定基因lba0444-lba0447并注釋其在lta生物合成中的推定作用(圖1b)?；騦ba0444和lba0448兩側為推定的rho非依賴性終止子(kingsfordc,ayanbulek,&salzbergs(2007)genomebiology8(2):r22)，提示此兩基因為共轉(zhuǎn)錄的并起操縱子作用。雖然lba0444-lba0447基因在lta生物合成中具有推定的作用，但lba0448為在該級聯(lián)中似乎不發(fā)揮作用的假定蛋白。乳桿菌物種可有效激活dc中的多種信號，其繼而誘發(fā)t細胞免疫反應(mohamadzadehm,等(2005)procnatlacadsciusa102(8):2880-2885;konstantinovsr,等(2008)procnatlacadsciusa105(49):19474-19479)。為了進一步研究修飾dc功能涉及的分子機制，我們特別刪除了嗜酸乳桿菌nck56的磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶基因(lba0447)。該基因組區(qū)域的pcr分析顯示該缺失突變體nck2025失去2kbp(圖1c-d)。該區(qū)域內(nèi)的測序確定了lba0447的消除。親本nck56和突變體nck2025的細胞壁提取物的色譜分析證明磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶基因已缺失的突變體中不存在lta。處理的dc。dc與nck56或lta-陰性突變體(nck2025)的共培養(yǎng)顯示nck2025下調(diào)dc表面上的mhcii、cd40、cd80和cd86(圖2a)。此外，用nck56處理dc誘導tlr1和2的轉(zhuǎn)錄，而在nck2025處理的dc中此兩種模式識別受體(prr)未活化(圖2b)。兩個菌株均誘導dc中il-10的產(chǎn)生；然而，該細胞因子的產(chǎn)生在與nck2025共培養(yǎng)的dc中顯著增加(圖2)。伴隨地，il-12和tnfα在nck2025處理的dc中顯著減少(圖2)。通過共培養(yǎng)腸系膜ln來源的t細胞與用nck56或nck2025處理的骨髓來源的dc來測定t細胞增殖。相對于nck56，與t細胞共培養(yǎng)的nck2025處理的dc中t細胞增殖顯著消除(圖2)。有趣的是，向nck2025處理的dc上清液中加入抗il-10抗體部分地恢復了t細胞的增殖，提示il-10可為dc:t細胞共培養(yǎng)物中調(diào)節(jié)t細胞增殖的關鍵因子。對收集的dc:t細胞共培養(yǎng)物上清液的分析顯示t細胞中il-10被高度誘導，而ifnγ、il-2和tnfα自nck2025處理的小鼠的t細胞中最小程度地釋放(圖2)。對dss誘導的結腸炎的改善。為確定nck2025在體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)，在3%dss暴露前(預防的)或后(治療)用nck56或nck2025連續(xù)處理四天的小鼠中分析dss誘導的結腸炎。數(shù)據(jù)顯示相對于基線(圖3b)dss在未處理的c57bl/6小鼠(圖3a、c)中誘導臨床和組織學結腸炎。臨床上，小鼠在第9天后開始減輕體重，且到第13天為約10%的總體重損失并在約10-11天發(fā)生嚴重的血性腹瀉(圖3a)。相比之下，經(jīng)口接種nck2025的小鼠顯著防止體重損失、減少腹瀉和潛血檢測陽性(圖3a)?？傮w而言，從第2天起“疾病活性指數(shù)”(dai)一直顯著降低。此外，用nck2025預處理小鼠降低組織學結腸炎評分多達90%(21.5±1.4至2.3±0.5)(圖3b-f)。相應地，圖3e表示具有限制在粘膜的有限炎癥的完整、未成為潰瘍的上皮。為明確論述lta缺失在nck2025對結腸炎的預防中的作用，第三組小鼠用nck56處理。野生型嗜酸乳桿菌nck56不預防結腸炎發(fā)病(圖3a和3d)，并且小鼠出現(xiàn)與未處理小鼠相似的臨床和組織學結腸炎。為闡明結腸組織表達的細胞因子，從各組小鼠中提取結腸并培養(yǎng)過夜。結腸細胞因子分析顯示來源于nck56和dss處理小鼠的結腸中il-6、il-12、tnfα和ifnγ水平較高(圖3g)。相比之下，來源于nck2025處理小鼠的結腸培養(yǎng)物中il-10產(chǎn)生顯著上升。經(jīng)nck2025處理的小鼠結腸中il-12、il-6、ifnγ和tnfα顯著減少(圖3g)。此外，在dss誘導的結腸炎中，對接種nck56與nck2025的小鼠遠端和近端區(qū)域基因的研究顯示免疫刺激的(即cd40、ccl11)、信號轉(zhuǎn)導(即stat1、stat4)和增殖/凋亡/血管發(fā)生/蛋白水解酶(即timp1、fasl、icam1)基因的上調(diào)，提示nck56而非nck2025處理的小鼠中有活性的炎性反應(圖7a和7b)。有趣的是，多種調(diào)節(jié)的、信號轉(zhuǎn)導和抗炎基因[即血小板活化因子乙酰水解酶(pla2g7)、血清應答因子(srf)、tgfβ、(p21-活化激酶pak1、raf1、基質(zhì)金屬蛋白酶(timp1)的組織抑制劑、tyk2]在nkc2025而非nck56或dss單獨處理的小鼠結腸遠端(非近端)區(qū)域被高度調(diào)節(jié)(圖7a)。這暗示這些基因在dss誘導的結腸炎更嚴重的遠端結腸變得顯著活化以發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。對dss誘導的結腸炎的治療作用。為了論述已建立結腸炎的小鼠中nck2025暴露的作用，用nck56或nck2025處理前先將小鼠暴露在3%dss中。一旦疾病癥狀發(fā)生，小鼠接受nck56或nck2025連續(xù)四天(圖4a)。數(shù)據(jù)顯示nck56和nck2025二者均減弱已建立的結腸炎，但減弱程度明顯不同。用nck2025處理小鼠導致體重穩(wěn)定化以及腹瀉和失血的快速消退，而nck56處理的小鼠持續(xù)失去體重，但速率較慢，并且腹瀉和失血的消退明顯較慢(圖4a)。組織學分析顯示第13天dss處理的小鼠中持續(xù)的活性結腸炎和潰瘍形成，且結腸炎評分為16.8±2.2(圖4b、e)。nck2025處理的小鼠具有明顯改善的結腸炎評分(8.4±2.2,p=0.01)，表明加速的愈合，包括稀少的潰瘍形成、再生的隱窩結構和炎癥主要限制在粘膜(圖4d、e)。再次，nck56處理輕度改善組織學結腸炎評分(14.7±2.0,p=ns)，伴隨表皮恢復，但有限的隱窩再生以及粘膜和粘膜下層的持續(xù)性活性炎癥(圖4c,e)。有趣的是，nck2025處理的小鼠的細胞因子分析顯示il-10的上調(diào)和這些小鼠結腸中il-12、tnfα、il-6和ifnγ的最小程度釋放(圖4f)。相比之下，nck56或dss單獨處理的小鼠結腸中il-12、tnfα、ifnγ和il-6被高度誘導，并且在這些組的小鼠中il-10最小程度釋放(圖4f)。對結腸cd4+foxp3+t細胞的誘導。cd4+treg細胞的作用近來已經(jīng)在抑制對自身和共生小型生物群的免疫反應失調(diào)方面特別關注(fontenotjd,gavinma,&rudenskyay(2003)natimmunol4(4):330-336)。因此，對nck2025(其在經(jīng)處理小鼠的dc和結腸微環(huán)境中誘導il-10)進行研究以確定與nck56相比其是否增加結腸cd4+foxp3+treg細胞。實際上，圖5a&b顯示與nck56相比經(jīng)nck2025處理小鼠的結腸中treg細胞被顯著誘導，提示這些細胞的抑制劑作用可影響dss誘導的粘膜過度炎癥。的調(diào)節(jié)作用。體外研究的數(shù)據(jù)以及體內(nèi)細胞因子分析提示nck2025改善結腸炎的作用依賴于粘膜il-10的誘導(kuhnr,lohlerj,rennickd,rajewskyk,&mullerw(1993)cell75(2):263-274)。為證實這些觀測結果，如上在il-10-/-小鼠中實施“預防性”和治療性研究。il-10-/-小鼠在暴露于共生細菌時出現(xiàn)自發(fā)的th1介導的結腸炎，具有與人克羅恩病類似的深的、透壁的潰瘍損傷(bergdj,等(1996)jclininvest98(4):1010-1020)。在結腸炎發(fā)病前，小鼠連續(xù)四天接種nck56或nck2025(或不處理作為對照組)。如上所述結腸炎的發(fā)病通過吡羅昔康處理誘導。臨床上，在28天內(nèi)監(jiān)測體重減輕，處死后分離結腸以評估組織結腸炎的程度。在誘導的結腸炎的起初兩周期間，未觀察到nck56或nck2025對預期的體重減輕的防護(圖6a)?？偲饋碚f，全部三組出現(xiàn)相似的組織學結腸炎和結腸炎評分(圖6b-e)，提示nck2025的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)需要內(nèi)源性il-10。討論控制腸免疫耐受的免疫機制損壞導致慢性ibd(macdonaldtt&monteleoneg(2005)science307(5717):1920-1925;macdonaldtt&gordonjn(2005)gastroenterolclinnortham34(3):401-412,vii-viii)。cd患者固有層中ifnγ+t細胞數(shù)目的增加有力地提示ibd發(fā)病機制中th1極化的參與(fussij,等(1996)jimmunol157(3):1261-1270;25-27;neurathmf,duchmannr,&meyerzumbuschenfeldekh(1996)dtschmedwochenschr121(22):735-741(inger);neurathmf,等(1996)jexpmed183(6):2605-2616)導致失控的腸炎癥和組織破壞(powrief(1995)immunity3(2):171-174)。當被高度活化dc釋放的炎性細胞因子(即il-12)外周激活時，cd8+(cheroutreh(2006)gastroenterology131(2):667-670;vezysv&lefrancoisl(2002)jimmunol169(12):6677-668)和cd4+t細胞(elsonco,等(2005)immunolrev206:260-276;wirtzs&neurathmf(2000)intjcolorectaldis15(3):144-160)均觸發(fā)腸炎癥。因此，有效的免疫療法需要深入理解引起免疫耐受(通常由調(diào)節(jié)信號維持)損壞的免疫信號轉(zhuǎn)導機制(wirtzs,等(1999)jimmunol162(4):1884-1888)。近來，對嗜酸乳桿菌基因組的測序和注解允許對該細菌細胞表面的可影響粘膜細胞和分子事件的組分進行基因操作，最終導致治療應用(konstantinovsr,等(2008)procnatlacadsciusa105(49):19474-19479;altermanne,等(2005)procnatlacadsciusa102(11):3906-3912)。嗜酸乳桿菌的細胞壁和細胞表面蛋白包含維持細胞形狀和激活免疫細胞(包括dc)的關鍵組分(konstantinovsr,等(2008)procnatlacadsciusa105(49):19474-19479)。為了研究細菌與先天細胞(即dc)之間的復雜通訊(crosstalk)及其與結腸炎的關聯(lián)，刪除嗜酸乳桿菌中編碼磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶(其合成lta的甘油鏈)的基因。數(shù)據(jù)顯示嗜酸乳桿菌lta陰性突變體，nck2025，在小鼠dc中誘導調(diào)節(jié)信號(即il-10)和較少的協(xié)同刺激分子(cd40,cd86)，有效將這些細胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎{(diào)節(jié)性dc(belkaidy&oldenhoveg(2008)immunity29(3):362-371)。這些調(diào)節(jié)性dc隨后與cd4+t細胞的相互作用明顯改變t細胞活化。此外，nck2025處理改善dss誘導的結腸炎，提示用該細菌菌株預處理動物誘導如結腸組織學所證實的抵抗dss攻擊的調(diào)節(jié)免疫、體重減輕、減少的腹瀉和潛血檢測陽性。調(diào)節(jié)粘膜內(nèi)明顯炎性反應的一個機制為il-10(krausta,等(2005)jclininvest115(8):2234-2243;krausta&mayerl(2005)curropingastroenterol21(6):692-696)。我們的數(shù)據(jù)清楚地顯示該細胞因子不僅由dc，而且還由經(jīng)nck2025處理小鼠的結腸組織高度分泌，此現(xiàn)象在治療dss結腸炎的預防性和治療性策略中均可見到。先前已經(jīng)表明il-10通過其發(fā)揮抗炎作用的能力調(diào)節(jié)先天和獲得性免疫反應兩者(moorekw,dewaalmalefytr,coffmanrl,&o'garraa(2001)annurevimmunol19:683-765;trinchierig(2007)jexpmed204(2):239-243)。該細胞因子通過下調(diào)mhcii、協(xié)同刺激分子和dc中il-12的產(chǎn)生(其全部強烈參與t細胞分化和活化)功能上抑制t細胞(moorekw,dewaalmalefytr,coffmanrl,&o'garraa(2001)annurevimmunol19:683-765;dewaalmalefytr,abramsj,bennettb,figdorcg,&devriesje(1991)jexpmed174(5):1209-1220)。此外，il-10還通過其啟動淋巴細胞中多重信號級聯(lián)(包括jak1,tyk2和stat3通路)的活化的il-10受體(finbloomds&winestockkd(1995)jimmunol155(3):1079-1090)調(diào)節(jié)cd8+細胞毒性t淋巴細胞(ctl)、b細胞和th1極化(moorekw,dewaalmalefytr,coffmanrl,&o'garraa(2001)annurevimmunol19:683-765)。這些觀測結果證明粘膜耐受性的調(diào)節(jié)和維持由強烈修飾致病cd4+t免疫反應的il-10嚴格控制，與本文給出的結果一致。此外，近來使用發(fā)生嚴重結腸炎的il-10缺陷小鼠證明了il-10在對良性抗原的反應中的關鍵作用(kuhnr,lohlerj,rennickd,rajewskyk,&mullerw(1993)cell75(2):263-274)。如上所見，nck2025的免疫調(diào)節(jié)作用不足以完全逆轉(zhuǎn)il-10-/-中已建立的結腸炎，然而，當以預防/治療性方式給予時其確實消除了結腸炎的誘導，突出了il-10在調(diào)節(jié)炎癥發(fā)病中的關鍵作用。重要地，不斷增加的證據(jù)支持以下觀念：il-10分泌型treg細胞控制dc炎性性質(zhì)(lundjm,hsingl,phamtt,&rudenskyay(2008)science320(5880):1220-1224)，其繼而調(diào)節(jié)有效的t細胞免疫的誘導，以控制繼發(fā)的組織損傷(matareseg,derosav,&lacavaa(2008)trendsimmunol29(1):12-17)。在此方面，我們證明嗜酸乳桿菌lta陰性突變體處理增加小鼠結腸中cd4+foxp3+treg細胞的數(shù)量。這些觀測結果有力支持treg細胞在炎性病癥中的關鍵作用，如先前在人和嚙齒動物模型(其中foxp3基因突變導致失控的增殖以及th1和th2細胞因子信號的顯著增加)中所證實的(fontenotjd,gavinma,&rudenskyay(2003)natimmunol4(4):330-336)?？烧{(diào)節(jié)il-10及其隨后對先天和t細胞的作用的其它機制仍有待確定。涉及嗜酸乳桿菌中l(wèi)ta合成的整個基因的完全缺失產(chǎn)生衍生細菌，其顯著影響腸道微環(huán)境、誘導調(diào)節(jié)信號(即il-10、treg細胞)并能在誘導的炎性免疫反應期間修復細胞共存。嗜酸乳桿菌呈現(xiàn)獨特的徹底改變dc功能的s層蛋白展示(konstantinovsr,等(2008)procnatlacadsciusa105(49):19474-19479,mohamadzadehm,duongt,sandwicksj,hoovert,&klaenhammertr(2009)procnatlacadsciusa106(11):4331-4336)。嗜酸乳桿菌的s層由三個s層a、b和x基因組成(gohyj,等(2009)applenvironmicrobiol75(10):3093-3105,gohyj&klaenhammertr(2009)frontbiosci14:1362-1386)，其中“自組裝”的s層蛋白a或b為覆蓋該細菌表面的主要蛋白。當免疫反應通過給予益生菌微生物調(diào)節(jié)(即活性ibd)或保持不受干擾(即腸道感染)時，非永久寄居腸中的外來細菌的遺傳修飾可提供更多治療選擇。其將有助于開發(fā)可優(yōu)化口腔免疫反應調(diào)節(jié)的治療媒介物。因此，建立這樣一種針對自身免疫疾病的益生菌干預必須從多個免疫角度精心協(xié)調(diào)以取得較好的臨床結果。首先，炎癥的主導調(diào)控不應保持不變，這是因為炎癥是常規(guī)免疫的一部分(nathanc(2002)nature420(6917):846-852)。寄居腸道的細菌可損害維持腸道調(diào)節(jié)/協(xié)同刺激免疫平衡所需的免疫反應。例如，感染期間，免疫過程允許識別病原體，并激活促進從感染中恢復的先天和獲得性免疫反應。因此，協(xié)調(diào)一系列事件的炎癥必須進行適當分期和調(diào)節(jié)以實現(xiàn)微生物消除，但仍防止由于多種免疫級聯(lián)和病原體存在所致的不必要的組織損傷。這樣的炎性過程可通過可引起炎性反應的擴大、抑制或調(diào)節(jié)的反饋回路和特定檢查點控制。所述正和負反饋回路依賴于介導炎性反應的多種分子，最終在其控制中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。重要地，調(diào)動信號向細菌清除的活性免疫需要調(diào)節(jié)信號(即il-10)(其部分地由炎性信號誘導)控制的最佳細胞協(xié)同控制。第二，為了達到瞬時調(diào)節(jié)性免疫，必須謹慎選擇和使用工具，包括細菌種類。在此方面，廣泛使用的減少炎癥的益生菌微生物，嗜酸乳桿菌ncfm的lta缺失衍生物的遺傳構建在我們的方法中可作為工具。由于該細菌不含有新的基因或dna序列，且不在腸道永久寄居，其可用作經(jīng)口接種時誘導調(diào)節(jié)性免疫反應的理想媒介物。這暗示一旦下調(diào)炎癥的目標實現(xiàn)，可停止任何益生菌補充劑以重新建立“正常的”腸道免疫。最后，這些研究確定了在疾病例如感染中不忽略有效免疫活化所需的協(xié)同刺激信號的情況下，嗜酸乳桿菌lta缺失如何啟動先天細胞的調(diào)節(jié)機制?？傮w而言，當深入了解細胞相互作用并確定最終導致自身免疫、炎癥或抗炎反應的關鍵分子時，靶向的預防性或治療性策略將是有效的。方法試劑。吡羅昔康和舒林酸獲自sigma(st.louis,mo)。葡聚糖硫酸鈉(dss)獲自mpbiochemicals(solon,oh)。ns-398獲自cayman化學公司(annarbor,mi)。cd4、cd25、foxp3、cd3、cd11c、cd11b、cd40、cd80、cd86、il-10和小鼠gm-csf的單克隆抗體購自invitrogen(carlsbad,california)和ebioscience(sandiego,ca)。細菌菌株。嗜酸乳桿菌nck56和nck2025以1%接種并在deman,rogosa和sharpe肉湯(mrs,difco)中37℃繁殖15h。隨后，將1ml的各培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至50ml新mrs中，37℃孵育18小時。嗜酸乳桿菌菌株的集落形成單位(cfu)數(shù)目通過在600nm處測量光密度確定(greenejd&klaenhammertr(1994)applenvironmicrobiol60(12):4487-4494)。離心收集細胞，用無菌pbs洗兩次，以5x108cfu/ml包含20%甘油的pbs重懸，隨后-80儲存直至用于體外刺激未成熟dc(1:1)。對于經(jīng)口接種小鼠，生長48小時的細菌用無菌pbs洗兩次，以5x109/mlpbs重懸，并用于小鼠經(jīng)口接種(5x108cfu/100μlpbs/小鼠)。小鼠。6-8周齡c57bl/6和il-10-/-(c57bl/6背景)小鼠購自jackson實驗室(barharbor,me)，和germantown,ny。小鼠在西北大學動物護理所微隔離籠中在無特定病原、無螺桿菌條件下飼養(yǎng)。我們未觀察到il-10-/-小鼠結腸中的任何自發(fā)炎癥征兆。實驗根據(jù)實驗動物護理和使用指南中的nih指導方針(nih-72-23)在可信任機構進行，并且動物實驗方案經(jīng)地方倫理委員會批準。靶向磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶。使用標準整合和切除方法、工具和菌株構建磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶(lba0447)缺失的嗜酸乳桿菌nck56的突變體菌株(pfeilerea&klaenhammertr(2009)applenvironmicrobiol75(18):6013-6016,russellwm&klaenhammertr(2001)applenvironmicrobiol67(9):4361-4364)。構建pori28缺失載體，其包含兩個靶向片段，在lba0447兩側的del1_sphi和del2_bglii。雙交換整合和切除事件后，nck2025恢復為基因組中l(wèi)ba0447含有1,984bp的缺失。nck2025中l(wèi)ba0447區(qū)域內(nèi)的pcr擴增和dna測序證實了~2kbp的丟失，并顯示缺失周圍的基因無另外的突變。生化分析。嗜酸乳桿菌nck56(5x108/cfu/10ml)和nck2025(5x108/cfu/10ml)從冷凍的原種(-80℃)在不含erm的deman、rogosa和sharpe肉湯(mrs,difco,lawrence,ks)中37℃繁殖。隨后，如前所述分析nck56和nck2025中的lta表達(moraths,geyera,&hartungt(2001)jexpmed193(3):393-397)。簡單來說，將兩菌株nck56和nck2025的冷凍提取物溶解在ph4.7的檸檬酸鹽緩沖液(0.5m)，隨后聚合(syndication)15分鐘。將細菌裂解液(30ml)與等體積正丁醇混合，室溫攪拌20分鐘。隨后，離心(17,200xg)40分鐘，收集水相，然后加入新鮮檸檬酸鹽緩沖液進行第二次萃取。進行兩次再萃取，將三次的水相合并并凍干。用色譜起始緩沖液(35ml，15%正丙醇/0.1m醋酸銨，ph4.7)重懸樣品后，將所有樣品離心(26,900xg，1h)并過濾(0.2μm)。將來自兩種細菌菌株的凍干物質(zhì)溶解在0.7%三氟乙酸中，hplc分析0.45mg各菌株提取物。色譜通過連續(xù)監(jiān)測260nm的吸光度獲得。細胞培養(yǎng)。從周圍組織中除去小鼠股骨并機械純化，骨髓用冷pbs沖洗。細胞用tris緩沖的氯化銨處理以溶解紅細胞。隨后，通過抗cd19、cd3、mhcii和gr-1的特異性抗體陽性(positively)除去b細胞、t細胞、ia+細胞和gr-1+粒細胞(pharmingen,sandiego,ca)。剩余的細胞為i-a–，并在加上10%胎牛血清(fbs)的rpmi1640完全培養(yǎng)基(只含gm-gsf(25ng/ml))的6孔板中培養(yǎng)6天。每隔一天用含gm-csf的新鮮培養(yǎng)基飼養(yǎng)培養(yǎng)物。第六天收集細胞用于不同實驗。為研究t細胞活化和增殖，連續(xù)四天給予c57bl/6小鼠nck56或nck2025(以5x108cfu/100μl/小鼠)。一周后，處死小鼠以分離各組小鼠的腸系膜ln。通過負磁珠損耗(negativemagneticbeaddepletion)富集腸系膜t細胞。為了測定t細胞活化和增殖，將梯度劑量的nck56或nck2025處理和未處理的dc(104/96孔板孔)與分離的腸系膜lncd4+t細胞(105/孔)在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。然后，96孔板各孔收集25μl并冷凍用于細胞因子分析。然后在最后16h內(nèi)每孔用0.5μci[3h]胸苷給予細胞脈沖(newenglandnuclear)(pulendranb,等(2004)eurjimmunol34(1):66-73)。在一些實施方案中，在dc:t細胞共培養(yǎng)物中分別使用抗il-10抗體(終濃度100ng/ml)。誘導的結腸炎。對于接種/預防研究，給幾組c57bl/6小鼠(10小鼠/組)連續(xù)四天經(jīng)口接種nck56或nck2025(5x108cfu/100μlpbs/小鼠)。這些組的小鼠和對照小鼠接受6天一周期的飲用水中的3%dss，隨后接受1天的常規(guī)飲用水，然后在第8天處死。未接種組中第一個dss周期后觀察到急性結腸炎。研究期間監(jiān)測疾病進展，包括體重減輕、腹瀉和糞便潛血檢測血液陽性(fob)。其后，處死小鼠，將結腸橫斷面瑞士卷固定在10%甲醛中，并嵌入石蠟。組織切片(4μm)用蘇木精和伊紅(h&e)染色，如前所述無分別地(blindly)評分(cooperhs,等(1993)labinvest69(2):238-249,murthysn,等(1993)digdissci38(9):1722-1734)?；?-28范圍的分級考慮炎性浸潤的程度、糜爛的存在情況、潰瘍形成或壞死，以及損傷的深度和表面延伸。對于治療研究，3組c57bl/6小鼠(10/組)首先接受5天周期的3%dss以引發(fā)結腸炎，其中2組隨后連續(xù)四天通過口腔管飼法用nck56或nck2025(5x108cfu/100μlpbs/小鼠)治療。監(jiān)測疾病進展直至實驗方案的第13天，此時小鼠被處死，并如上評估結腸。結腸組織培養(yǎng)。結腸組織培養(yǎng)如前文所述進行(sellonrk,等(1998)infectimmun66(11):5224-5231)。簡單來說，3%dss施用前或后用嗜酸乳桿菌菌株處理的各小鼠組的結腸組織用冷pbs徹底清洗。將組織切成1cm小塊并在包含慶大霉素(50μg/ml)的完全rpmi1640中280rpm振搖30分鐘。結腸組織在添加5%胎牛血清(fcs)、50μg/ml慶大霉素和1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素b的rpmi1640培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18小時。然后收集上清液，-80℃保存直至用于細胞因子分析。-/-結腸炎。幾組c57bl/6il-10-/-(10/組)從不含病原體的房間轉(zhuǎn)移至常規(guī)房間，并允許適應1周。隨后小鼠連續(xù)四天接種nck56或nck2025(5x108cfu/100μlpbs/小鼠)，然后喂食低劑量吡羅昔康1周，隨后喂食高劑量吡羅昔康1周，以加速和同步化結腸炎的發(fā)病，如前所述(bergdj,等(2002)gastroenterology123(5):1527-1542)。2周的標準食物后(第28天)，處死小鼠，將結腸橫斷面瑞士卷固定在10%甲醛中，并嵌入石蠟。組織切片(4μm)用h&e染色，在0-4的范圍內(nèi)無分別評分，如前所述(bergdj,等(2002)gastroenterology123(5):1527-1542)。流式細胞術。嗜酸乳桿菌處理和未處理的dc(5x105)用表面標記單克隆抗體在4℃孵育30分鐘，用加0.1%fcs的pbs充分洗滌，用0.1%多聚甲醛固定，通過facscalibur四激光細胞計量術使用標準cellquest獲取分析軟件(bectondickinson)進行分析。每個條件至少獲得104個門控事件。在一些實驗中，為了取得結腸淋巴細胞，幾組小鼠(5小鼠/組)連續(xù)4天接種nck56或nck2025(5x108cfu/100μl無菌pbs/小鼠)。將小鼠處死，清洗結腸，如前所述從固有層分離單細胞(haddadw,等(2003)jexpmed198(3):369-377)。淋巴細胞使用percol富集，并用抗cd4fitc,cd25apc抗體和7aad染色。隨后，將染色的細胞固定、透化、用抗foxp3pe或同種型抗體染色，并通過facscalibur分析。實時pcr。使用rneasymini試劑盒(qiagen,md)從骨髓dc分離總rna。使用大容量cdna反轉(zhuǎn)錄試劑盒從5ugrna合成cdna，通過實時半定量pcr使用abi7500實時pcr系統(tǒng)和powersybergreen2xpcrmaster混合物(appliedbiosystems,fostercity,ca)測定tlr1和tlr2基因的表達。對于跨越內(nèi)含子結點的區(qū)域選擇tlr1的引物(正向-；反向-)和tlr2的引物(正向-；反向-)以排除基因組dna的擴增。使用ddct方法用gapdh作為內(nèi)源對照(正向-；反向-)，結果反映相對于對照樣品的倍數(shù)增加。低密度cdna微陣列。dss單獨、nck56-dss或nck2025-dss處理的各組小鼠(5x/組)的結腸遠端和近端區(qū)域用pbs沖洗，并立即浸入rnalater(qiagen,md)中穩(wěn)定rna。用rneasymini試劑盒(qiagen,md)提取rna，使用agilentnanochip生物分析(agilent,santaclara,ca)評估其質(zhì)量。所有使用的樣品具有大于7的rna完整數(shù)(rin)。如制造商(eppendorfdualchipmicroarray,germany)所述實施反轉(zhuǎn)錄和微陣列的雜交。簡單來說，如下將6ugrna進行反轉(zhuǎn)錄：通過將樣品首先用oligo(dt)12-18引物(invitrogen)在70℃孵育10分鐘然后加入rt混合物(superscriptiii)、dntp(invitrogen)、生物素標記的atp和ctp并在42℃孵育90分鐘接著70℃15分鐘。加入rnaseh，樣品在37℃孵育20分鐘，接著95℃3分鐘以終止反應。將所得cdna加入雜交室，在eppendorfthermomixer中在60℃混合以1400rpm孵育過夜。清洗載玻片，如制造商(eppendorf,germany)所述使用silverquant檢測系統(tǒng)通過檢測生物素摻入測定rna水平。通過比較樣品與來自相同結腸區(qū)域的對照使用silverquant分析軟件(eppendorf,germany)進行分析。說明書中提到的所有出版物和專利申請表明本發(fā)明所屬領域技術人員的水平。所有出版物和專利申請通過引用通過引用結合到本文中，并且在某種程度上如同各個出版物或?qū)＠暾埫鞔_且單獨地指出通過引用結合。雖然已通過說明和用于清楚理解目的的實施例的方式描述了前述發(fā)明的一些細節(jié)，但將顯而易見的是，某些變更和修飾可在所附權利要求書的范圍內(nèi)實施。cpch1263835p序列表<110>klaenhammer,toddr.pfeiler,erikamohamadzadeh,mansour<120>減少炎性反應的組合物和方法<130>035051/427765<150>61/356,165<151>2010-06-18<150>61/433,598<151>2011-01-18<150>pct/us2011/040674<151>2011-06-16<160>22<170>用于windowsversion4.0的fastseq<210>1<211>2058<212>dna<213>嗜酸乳桿菌<220><221>misc_feature<222>(1)...(2058)<223>lba0447磷酸甘油轉(zhuǎn)移酶genbank登錄號aav42337<220><221>cds<222>(1)...(2058)<400>1atggaacgtaccaaatctttttttaaatggttgacgcaaactaagctg48metgluargthrlysserphephelystrpleuthrglnthrlysleu151015ggattttttacaatagttttagtattgttttggctaaaaacatattat96glyphephethrilevalleuvalleuphetrpleulysthrtyrtyr202530atttatttaactaagttcaacttgggtgcagttggtcctatgcagcaa144iletyrleuthrlyspheasnleuglyalavalglyprometglngln354045tttttgcttttaattaaccctattccatcagggatgctgctactaggt192pheleuleuleuileasnproileproserglymetleuleuleugly505560attggcctattttttaagggacgaaaatcttattggattattctgata240ileglyleuphephelysglyarglyssertyrtrpileileleuile65707580atcgattttttattaacgctgtggcttttttctaatattttatattat288ileasppheleuleuthrleutrpleupheserasnileleutyrtyr859095cgagaattttctaatttcttgtctttttcaattattaagacatcagga336argglupheserasnpheleuserpheserileilelysthrsergly100105110tcgacatccgataatctgggaaaaagtattgcaggaataactttagca384serthrseraspasnleuglylysserilealaglyilethrleuala115120125agtgattttttagcatttttggatattgcagttattattgcgttatta432serasppheleualapheleuaspilealavalileilealaleuleu130135140gctactaaagttattaaaatggatgtgcgtccattaaagttaaaagtg480alathrlysvalilelysmetaspvalargproleulysleulysval145150155160agtcttttaattgaatttttggcacttagtttaatgggacttaattta528serleuleuileglupheleualaleuserleumetglyleuasnleu165170175ttgatggcccaaaaagatagatcaggtcttttaactagaacctttgat576leumetalaglnlysaspargserglyleuleuthrargthrpheasp180185190aataactatattgttaaatatctaggaattaatgaatacgctatttat624asnasntyrilevallystyrleuglyileasnglutyralailetyr195200205gatggatataaaacagcccaaacaagcgcccaaatggctaaggcaaac672aspglytyrlysthralaglnthrseralaglnmetalalysalaasn210215220gtatctgatttaaaatctgtacgtaattatttaaatgcaaacaaggta720valseraspleulysservalargasntyrleuasnalaasnlysval225230235240aaacctaatccagaatatacgggtgtagcaaaaggaaaaaacgtttta768lysproasnproglutyrthrglyvalalalysglylysasnvalleu245250255gttattcaccttgaaagttttcaacaatttttaattggctataaatgg816valilehisleugluserpheglnglnpheleuileglytyrlystrp260265270aagggtaaagaagtaacacctaatttaaataaaatatatcatcaaaaa864lysglylysgluvalthrproasnleuasnlysiletyrhisglnlys275280285gatacgattagctttgataatttctttaaccaggtaggacaaggtaaa912aspthrileserpheaspasnphepheasnglnvalglyglnglylys290295300acttcagatgctgaaatgatgttagaaaattcattatatggtttgcag960thrseraspalaglumetme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