本發(fā)明屬于藥物載體領(lǐng)域，尤其是一種氧化還原和ph雙重響應(yīng)的無(wú)規(guī)-接枝型藥物載體及方法。

背景技術(shù)：

納米藥物載體一般是指粒徑大小在10-1000nm的粒子，一般由天然或合成高分子組成。聚合物膠束作為藥物載體具有重要的應(yīng)用價(jià)值，可有效的提高藥物在腫瘤治療中的選擇性和生物利用度。生物可降解藥物載體系統(tǒng)由于具有可降解性、無(wú)細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)的到了研究者的極大關(guān)注。

但是現(xiàn)階段，設(shè)計(jì)和制備具有高穩(wěn)定性、可官能化和敏感性的生物可降解材料用于構(gòu)建具有特殊響應(yīng)性的智能型納米藥物載體以提高腫瘤的治療效果依然面臨巨大挑戰(zhàn)。

為此，有必要設(shè)計(jì)一種高穩(wěn)定性的、能夠利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)特殊的微環(huán)境作為刺激手段,實(shí)現(xiàn)高效入胞的同時(shí),快速將藥物釋放到胞內(nèi),提高療效的藥物載體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是提供一種高穩(wěn)定性，同時(shí)兼具氧化還原和ph雙重響應(yīng)的藥物載體。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種氧化還原和ph雙重響應(yīng)的無(wú)規(guī)-接枝型藥物載體，所述藥物載體為聚乳酸-聚蘋(píng)果酸共聚物接枝雙硫化聚乙二醇和1-(3-氨基丙基)咪唑的產(chǎn)物，其分子式分別如下所示：

其中，m＝60-110，a＝1-3，n＝22-220，b＝4-19。

本方案的另一目的在于提供一種前述的氧化還原和ph雙重響應(yīng)的無(wú)規(guī)-接枝型藥物載體的制備方法，該方法包括以下步驟：

步驟a：共聚物的制備步驟，所述共聚物制備步驟包括通過(guò)l-丙交酯與蘋(píng)果酸內(nèi)酯共聚形成聚乳酸-co-聚蘋(píng)果酸共聚物，其中所述l丙交酯與所述蘋(píng)果酸內(nèi)酯的加入摩爾量為5-12：1。

步驟b：接枝peg制備步驟，所述接枝peg制備步驟系通過(guò)mpeg與檸康酸酐反應(yīng)后得mpeg-ca，所述mpeg-ca再與帶雙硫鍵的胺反應(yīng)，獲得氧化還原改性的peg，其中mpeg與檸康酸酐的投料質(zhì)量比為1:0.1-1；所述mpeg-ca與所述胺的投料質(zhì)量比為1:0.2-0.7。

步驟c：藥物載體制備步驟，所述藥物載體制備步驟系將步驟a制備的聚乳酸-co-聚蘋(píng)果酸共聚物、步驟b制備的氧化還原改性的peg以及1-(3-氨基丙基)咪唑進(jìn)行反應(yīng)獲得所述藥物載體，其中所述聚乳酸-co-聚蘋(píng)果酸共聚物、所述氧化還原改性的peg、所述1-(3-氨基丙基)咪唑的摩爾投料比為1：1-3:4-19。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，步驟a中所述蘋(píng)果酸內(nèi)酯由溴琥珀酸為原料制成。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述蘋(píng)果酸內(nèi)酯的制備包括以下步驟，

步驟z1:所述溴琥珀酸與三氟乙酸酐室溫反應(yīng)，反應(yīng)溫度為15-40℃，反應(yīng)時(shí)間為3-6h；

步驟z2：步驟z1反應(yīng)產(chǎn)物與芐醇反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40-50℃，反應(yīng)時(shí)間為10-15h；

步驟z3：步驟z2反應(yīng)產(chǎn)物中加入二氯甲烷后進(jìn)行回流反應(yīng)，反應(yīng)溫度30-50℃，反應(yīng)時(shí)間3-5h的。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟a包括以下分步驟，

步驟a1：通過(guò)蘋(píng)果酸內(nèi)酯和l-丙交酯合成聚乳酸-co-聚蘋(píng)果酸共聚物，其中使用辛酸亞錫作為催化劑；

步驟a2：使用pd/c催化體系對(duì)步驟a1獲得的聚乳酸-co-聚蘋(píng)果酸共聚物進(jìn)行保護(hù)基脫除。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟a1中反應(yīng)溫度為110-140℃，反應(yīng)時(shí)間為22-27h。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟a1中反應(yīng)在真空環(huán)境下進(jìn)行。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，所述步驟a2中反應(yīng)溫度為25-40℃，反應(yīng)時(shí)間為9-12h。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，步驟b包括以下分步驟：

步驟b1：以二氯甲烷為溶液，加入mpeg、吡啶和檸康酸酐，室溫反應(yīng)30-50h后處理得mpeg-ca；

步驟b2：將所述mpeg-ca與胱胺加入反應(yīng)器，再加入dcc和dmap混合溶液體系后反應(yīng)40-50h，其中溶劑為二氯甲烷；

步驟b3：步驟b2產(chǎn)物過(guò)濾沉淀后得到氧化還原改性的peg。

本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)在于，步驟c包括以下分步驟，

步驟c1：將步驟a制備的聚乳酸-co-聚蘋(píng)果酸共聚物、步驟b制備的氧化還原改性的peg放入dmap/dcc體系中反應(yīng)20-30h，反應(yīng)溫度為20-30℃，以thf和二氯甲烷混合液作為溶劑；

步驟c2：補(bǔ)充dmap/dcc并將1-(3-氨基丙基)咪唑加入步驟c1產(chǎn)物中反應(yīng)40-55h，反應(yīng)溫度20-30℃；

步驟c3：對(duì)步驟c2反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)濾、沉淀、干燥處理得所述藥物載體。

本發(fā)明的有益效果是：本方案提供的藥物載體結(jié)構(gòu)新穎、設(shè)計(jì)獨(dú)特、具有顯著的特異性效果，同時(shí)兼具氧化還原和ph雙重敏感特性?？梢葬槍?duì)腫瘤細(xì)胞特異性環(huán)境誘導(dǎo)藥物載體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而快速將藥物釋放，提高治療效果。

將本方案的藥物載體制備成膠束可對(duì)藥物進(jìn)行高效包載，載藥膠束能快速的被細(xì)胞吞噬，且細(xì)胞對(duì)兼具氧化還原及ph雙重響應(yīng)的載藥膠束的攝取量明顯要高于對(duì)無(wú)敏感性載藥膠束，同時(shí)隨培養(yǎng)時(shí)間的增加細(xì)胞攝取量增加。體外細(xì)胞毒性結(jié)果表明空白膠束對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒性，細(xì)胞的相對(duì)存活率高于90％；兼具氧化還原及ph雙重響應(yīng)的載藥膠束相比于無(wú)敏感載藥膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)得到了顯著的抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與無(wú)敏感性載藥膠束相比，兼具氧化還原及ph雙重響應(yīng)的載藥膠束體現(xiàn)出更好的體內(nèi)抗腫瘤效果，能有效抑制腫瘤及腫瘤部位新生血管生長(zhǎng)、細(xì)胞的增殖及降低藥物的毒副作用。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本申請(qǐng)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本申請(qǐng)中記載的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1：實(shí)施例1中蘋(píng)果酸內(nèi)酯的合成路線圖。

圖2：實(shí)施例1中聚左旋乳酸-co-聚蘋(píng)果酸內(nèi)酯的合成。

圖3：實(shí)施例1中乳酸-co-聚蘋(píng)果酸內(nèi)酯保護(hù)基脫除。

圖4：實(shí)施例1中mpeg2000-ca的合成。

圖5：實(shí)施例1中mpeg2000-ss-nh2的合成。

圖6：實(shí)施例1中plm-g-peg的合成。圖7：實(shí)施例1中空白膠束的酸堿滴定曲線。

圖8：實(shí)施例1中(a)plla-co-(pma-g-mpeg-g-api),(b)plla-co-(pma-g-ss-mpeg-g-api膠束在不同濃度gsh溶液中的粒徑變化

圖9：實(shí)施例1中體外藥物釋放曲線圖。

圖10：實(shí)施例1中空白膠束與3t3(a),4t1(b)共培養(yǎng)48h的毒性評(píng)價(jià)。

圖11：實(shí)施例1中dox/plla-co-(pma-g-mpeg-g-api)(a),dox/plla-co-(pma-g-ss-mpeg-g-api)(b),鹽酸阿霉素(c)與4t1(ⅰ),hela(ⅱ)細(xì)胞共培養(yǎng)1h與4h后的激光共聚焦顯微鏡照片(1代表明場(chǎng)下細(xì)胞形態(tài)，2代表細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒猓?代表前兩張圖片的疊加，藥物濃度均為10μg/ml，標(biāo)尺25μm)。

圖12：實(shí)施例1中載藥膠束和鹽酸阿霉素與4t1細(xì)胞共培養(yǎng)的流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果，(a)為載藥膠束和鹽酸阿霉素與4t1共培養(yǎng)0.5h,(b)為載藥粒子和鹽酸阿霉素與4t1共培養(yǎng)2h,(c)為dox/a與4t1共培養(yǎng)0.5h、1h、2h，(d)為dox/b與4t1共培養(yǎng)0.5h、1h、2h,n＝3.(a：dox/plla-co-(pma-g-mpeg-g-api),b：dox/plla-co-(pma-g-ss-mpeg-g-api)，藥物濃度均為10μg/ml)。

圖13：載藥膠束與鹽酸阿霉素balb/c小鼠體內(nèi)抗腫瘤效果及全身毒性評(píng)價(jià)，注射劑量均為5mg/kg，給藥期間小鼠(a)體重變化(w/w0)。

圖14：載藥膠束與鹽酸阿霉素balb/c小鼠體內(nèi)抗腫瘤效果及全身毒性評(píng)價(jià)，注射劑量均為5mg/kg，腫瘤體積增長(zhǎng)率(v/v0)。

圖15：載藥膠束與鹽酸阿霉素balb/c小鼠體內(nèi)抗腫瘤效果及全身毒性評(píng)價(jià)，注射劑量均為5mg/kg，不同治療組24天后腫瘤質(zhì)量。

圖16：載藥膠束與鹽酸阿霉素balb/c小鼠體內(nèi)抗腫瘤效果及全身毒性評(píng)價(jià)，注射劑量均為5mg/kg，不同治療組24天后腫瘤圖(n＝5)

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種兼具氧化還原和ph雙重響應(yīng)的無(wú)規(guī)-接枝型藥物載體及其制備方法。以下結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

首先詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例的合成方法。

蘋(píng)果酸內(nèi)酯(mabz)的合成

具體的合成路線如圖1所示，首先準(zhǔn)確稱取溴琥珀酸19.86g(0.10mol)加入到150ml支口瓶中室溫下抽真空6h，在氮?dú)夥諊录尤?5ml干燥的四氫呋喃并攪拌溶解，在0℃條件下用注射器緩慢滴入三氟乙酸酐22ml(0.15mol)，室溫反應(yīng)4h，濃縮得到棕色液體。繼續(xù)加入芐醇12.00g(0.11mol)，置于45℃油浴中反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入150ml乙醚溶解產(chǎn)物，接著用去離子水等體積萃取兩次，收集有機(jī)相，并加入一定量的無(wú)水硫酸鎂與活性炭進(jìn)行干燥脫色。砂芯漏斗過(guò)濾并將濾液旋蒸濃縮，干燥得到淡黃色油狀液體。

將上述產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到500ml兩口瓶中并加入40ml去離子水，在劇烈攪拌的條件下用2mol/lnaoh調(diào)節(jié)其ph值至7.4，接著向體系中加入150ml二氯甲烷，于45℃油浴中回流反應(yīng)4h，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中體系的ph值保持在7.2-7.4。反應(yīng)結(jié)束后用二氯甲烷萃取水相三次，收集有機(jī)相并進(jìn)行濃縮，再用去離子水與飽和氯化鈉水溶液洗滌至中性，收集有機(jī)相并用無(wú)水硫酸鎂進(jìn)行干燥、砂芯漏斗過(guò)濾、旋蒸濃縮、干燥得到淡黃色油狀液體，硅膠層析柱進(jìn)行純化，流動(dòng)相為石油醚/二氯甲烷(v/v＝1:4)，得到蘋(píng)果酸內(nèi)酯單體。

蘋(píng)果酸內(nèi)酯(mabz)與l-丙交酯(l-la)共聚物的合成

如圖2所示，分別準(zhǔn)確稱取芐醇0.0291g(0.27mmol)、蘋(píng)果酸內(nèi)酯1.1500g(5.58mmol)與l-丙交酯2.1356g(14.82mmol)加入到10ml安瓿瓶中，加入底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1‰的辛酸亞錫甲苯溶液，抽真空2h，在高真空的條件下用丁烷氣體噴燈進(jìn)行燒結(jié)封端，130℃油浴攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，二氯甲烷溶解，乙醚沉淀，過(guò)濾得到白色固體，真空干燥48h至恒重。

聚左旋乳酸-co-聚蘋(píng)果酸內(nèi)酯保護(hù)基團(tuán)的脫除

如圖3所示，準(zhǔn)確稱取共聚物2.32g加入到50ml高壓反應(yīng)釜中，用30ml四氫呋喃將產(chǎn)物全部溶解，接著加入pd/c0.45g，擰緊反應(yīng)釜螺母，充放氫氣三次，最終擰緊閥門使反應(yīng)釜內(nèi)壓強(qiáng)保持恒定，將反應(yīng)釜置于30℃油浴中反應(yīng)10h后，四氫呋喃稀釋至100ml，硅藻土過(guò)濾，收集濾液，旋蒸濃縮，乙醚沉淀，過(guò)濾得到白色固體，真空干燥箱中室溫干燥48h至恒重。

聚乙二醇(mpeg2000)端基羧基化反應(yīng)

如圖4所示，準(zhǔn)確稱取mpeg20001.0000g(0.50mmol)加入到50ml支口瓶中，在油浴105℃中真空除水3h，等體系冷卻到室溫后充入氮?dú)獗Ｗo(hù)，接著用注射器加入0.2900g(2.59mmol)檸康酸酐(ca)以及20ml二氯甲烷溶液使底物完全溶解，冰浴條件下緩慢滴入0.8ml吡啶，待使體系自然升到室溫并繼續(xù)反應(yīng)40h后，旋蒸濃縮，乙醚沉淀，過(guò)濾得到白色固體，于真空干燥箱中室溫干燥48h至恒重。

聚乙二醇接枝胱胺

如圖5所示，準(zhǔn)確稱取mpeg2000-ca0.8g與胱胺0.31g加入到50ml支口瓶中，加入8ml二氯甲烷與8mldmf使底物全部溶解，接著分別稱取1.65gdcc與0.0010gdmap溶解于12ml二氯甲烷中，在冰浴的條件下緩慢將dcc與dmap的混合溶液滴加到體系中，滴加完畢后待體系逐步升到室溫后繼續(xù)反應(yīng)48h后，旋蒸濃縮并加入15ml二氯甲烷置于-20℃冰箱中靜置3h，中性濾紙過(guò)濾后，旋蒸濃縮，乙醚沉淀，過(guò)濾得到白色固體，于真空干燥箱中室溫干燥48h至恒重。

plla-co-pma接枝功能化改性聚乙二醇(mpeg2000-ca-ss-nh2)與1-(3-氨基丙基)咪唑(plm-g-ss-peg)的合成

如圖6所示，準(zhǔn)確稱取plla-co-pma0.5400g、mpeg2000-ca-ss-nh20.2400g加入到100ml支口瓶中，抽真空充氮?dú)馊?，在氮?dú)夥諊录尤?0ml四氫呋喃以及5ml二氯甲烷使底物完全溶解；接著稱取dcc2.9000g、dmap0.0020g溶解于10mlthf中，在冰浴的條件下緩慢滴加到反應(yīng)體系中，滴加完畢后使其逐漸升到室溫繼續(xù)反應(yīng)24h；接著準(zhǔn)確稱取1-(3-氨基丙基)咪唑0.0754g，用5ml四氫呋喃溶解稀釋后注入反應(yīng)體系中，同時(shí)稱取dcc2.0000g、dmap0.0020g并用10mlthf將其溶解，同樣在冰浴的條件下用注射器將其緩慢滴加到反應(yīng)體系中，滴加完畢后使其逐漸升到室溫繼續(xù)反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸濃縮除去溶劑并加入15ml二氯甲烷溶解，置于-20℃冰箱中靜置3h，取出后迅速使用砂芯漏斗進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液，旋蒸濃縮，乙醚沉淀，過(guò)濾得到產(chǎn)物，置于真空干燥箱中室溫干燥48h至恒重。

通過(guò)上述6步反應(yīng)獲得本具體實(shí)施例的藥物載體材料。

為了對(duì)本藥物載體材料的性質(zhì)和優(yōu)點(diǎn)做出進(jìn)一步說(shuō)明，接下來(lái)介紹本方案的模擬實(shí)驗(yàn)。

首先將本方案的藥物載體材料制備成為載藥膠束。本實(shí)驗(yàn)中我們采用溶劑揮發(fā)法制備聚合物空白膠束，用透析法制備聚合物載藥膠束。聚合物空白膠束的制備方法如下：稱取5mg聚合物溶于200μl色譜純四氫呋喃中，在高速磁力攪拌下將其緩慢滴加到10ml蒸餾水中，待四氫呋喃揮發(fā)完畢即得到空白膠束。聚合物載藥膠束的制備方法如下：稱取5mg聚合物與1.25mg疏水阿霉素分別溶于200μl和300μl色譜純二甲基亞砜中，接著將兩者混合并在高速磁力攪拌下將其緩慢滴加到10ml蒸餾水中攪拌過(guò)夜，然后將其轉(zhuǎn)移到截透析袋，每隔4h換一次水，當(dāng)透析袋中的二甲基亞砜被完全除去后將其轉(zhuǎn)移到15ml的離心管中離心除去未被載入的疏水阿霉素，離心條件為3000rpm，5min，取上層液體備用。

圖7是實(shí)施例1中空白膠束的酸堿滴定曲線。結(jié)果證明聚合物膠束具有一定的緩沖能力，這有利于其在低ph條件下吸收質(zhì)子使膠束結(jié)構(gòu)變得松散，促進(jìn)膠束內(nèi)部藥物的釋放。接枝了咪唑基團(tuán)后的聚合物空白膠束滴定曲線如圖所示，其中空白對(duì)照組在滴入0.01mnaoh溶液后ph值迅速上升并很快達(dá)到目標(biāo)值；而接枝了咪唑基團(tuán)的聚合物空白膠束由于咪唑基團(tuán)具有很好的緩沖能力而緩慢上升，其在ph5.94至ph7.69出現(xiàn)了緩沖平臺(tái)，表明合成的材料具有良好的ph緩沖能力。

當(dāng)含有還原敏感鍵的聚合物膠束在到達(dá)高濃度還原環(huán)境后，其包含的雙硫鍵將發(fā)生斷裂，引起膠束結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而促進(jìn)藥物快速釋放。圖8為膠束在不同gsh濃度下的粒徑變化圖。圖8(a)為無(wú)還原敏感聚合物膠束的粒徑變化，在有還原劑及無(wú)還原劑存在條件下，聚合物膠束的粒徑均沒(méi)有很大的變化，說(shuō)明高濃度還原環(huán)境對(duì)無(wú)敏感聚合物膠束沒(méi)有影響。圖8(b)為帶有還原敏感鍵的聚合物膠束粒徑變化，當(dāng)不加入還原劑時(shí)，聚合物膠束的粒徑在4個(gè)小時(shí)后幾乎無(wú)變化，對(duì)于加入低濃度gsh(0.5mm)的聚合物膠束，粒徑稍有增加，因?yàn)轶w系中存在的gsh使膠束中的雙硫鍵部分?jǐn)嗔眩沽皆龃?，而?dāng)gsh濃度為10mm時(shí)，膠束的粒徑增加明顯，這主要是由于體系中大量雙硫鍵被破壞，使得膠束的親疏水發(fā)生變化，從而導(dǎo)致膠束聚集，粒徑增大。

為研究載藥膠束的藥物釋放行為，我們選擇在pbs7.4、abs5.0的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并加入gsh用于模擬腫瘤微環(huán)境下的藥物釋放。圖9為plla-co-(pma-g-mpeg-g-api)(a材料)plla-co-(pma-g-ss-mpeg-g-api)(b材料)聚合物載藥膠束在不同條件下的藥物釋放曲線。從圖中我們可以看出，在釋放初期，兩種載藥膠束都存在著快速釋放的現(xiàn)象，隨著釋放時(shí)間的增加，釋放速率趨于平緩，在相同條件下，兩種載藥膠束的釋放速度相當(dāng)。在ph7.4的弱堿性介質(zhì)中，兩者的總釋放量都不高，釋放48h后累積釋放量分別為58％與63.7％；當(dāng)ph值降低后，兩者的釋放速率與釋放量明顯增加，在48h的累積釋放量分別為75％與79.5％，這是由于在酸性條件下，咪唑基團(tuán)接收質(zhì)子而產(chǎn)生了膨脹，使整個(gè)膠束結(jié)構(gòu)變得松散，從而有利于阿霉素從內(nèi)部遷移出來(lái)。而當(dāng)加入還原型gsh后，plla-co-(pma-g-ss-mpeg-g-api)載藥膠束的釋放速率與釋放量達(dá)到最大，48h的累積釋放量達(dá)到91.5％，72h更是高達(dá)96％，這是因?yàn)樵诩尤脒€原劑后plla-co-(pma-g-ss-mpeg-g-api)載藥膠束的親疏水段發(fā)生了斷裂，導(dǎo)致阿霉素釋放速率的增加。

對(duì)于納米藥物輸送系統(tǒng)而言，細(xì)胞毒性是評(píng)價(jià)其生物相容性的重要指標(biāo)，只有具備低毒性或無(wú)毒性的藥物載體才有望進(jìn)一步使用。本研究采用cck8法評(píng)價(jià)空白膠束對(duì)3t3及4t1細(xì)胞的細(xì)胞毒性。如圖10所示，空白膠束在50-200g/ml濃度范圍對(duì)3t3及4t1細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性，即使培養(yǎng)48h，細(xì)胞的存活率高于90％，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，可以評(píng)定膠束無(wú)細(xì)胞毒性，具有良好的細(xì)胞相容性。

圖11為載藥膠束與4t1、hela細(xì)胞共培養(yǎng)1h與4h激光共聚焦圖。對(duì)于兩種細(xì)胞，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為1h時(shí)，由于鹽酸阿霉素主要通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，在1h時(shí)已經(jīng)到達(dá)了細(xì)胞核，而兩種載藥膠束的細(xì)胞內(nèi)熒光都比較微弱，且大部分均在細(xì)胞質(zhì)中，其中兼具氧化還原和ph雙重響應(yīng)的膠束熒光強(qiáng)度略強(qiáng)于無(wú)敏感載藥膠束。當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間(4h)，鹽酸阿霉素及載藥膠束在細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但兼具氧化還原和ph雙重響應(yīng)的膠束的熒光強(qiáng)度依然強(qiáng)于無(wú)敏感組，且載藥膠束組的熒光主要位于細(xì)胞質(zhì)中，僅有少量進(jìn)入到細(xì)胞核中。說(shuō)明在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，膠束粒子進(jìn)入細(xì)胞后，由于高濃度的還原環(huán)境，膠束中雙硫鍵斷裂，阿霉素的釋放速度快于無(wú)敏感載藥膠束。

另外，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)定量表征細(xì)胞對(duì)載藥膠束的攝取情況。圖12為與4t1共培養(yǎng)后的結(jié)果圖，其中a為對(duì)比材料，b材料為具有還原敏感性能的材料。從a、b圖中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)0.5h時(shí)，a、b材料用具體的名字之間的差異較小，具有還原敏感性的b材料稍強(qiáng)于對(duì)比材料a，由于鹽酸阿霉素主要通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，因此其熒光強(qiáng)度比膠束組高，這與激光共聚焦的結(jié)果相吻合。在培養(yǎng)2h后，細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度顯著增加，a與b之間的差別也顯現(xiàn)出來(lái)，b與鹽酸阿霉素之間的強(qiáng)度比較接近，這是由于載藥膠束進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，由于雙硫鍵的斷裂，使得藥物從膠束核內(nèi)迅速釋放出來(lái)，增加了胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

從c、d圖中可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的繼續(xù)增加，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，主要?dú)w因于進(jìn)入細(xì)胞中載藥膠束越來(lái)越多，且藥物在細(xì)胞中的釋放量增加引起的。相比于a材料，由于b擁有更快的釋放速度，因此相對(duì)于0.5h與h，在培養(yǎng)2h后b材料的熒光強(qiáng)度增加明顯。

在保證安全性的條件下，我們采用對(duì)載藥膠束對(duì)荷瘤小鼠的皮下瘤進(jìn)行了抗腫瘤效果的評(píng)價(jià)。

本實(shí)驗(yàn)所選用的為spf級(jí)雄性balb/c小鼠，5-6周齡，體重20±1g，購(gòu)買于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。用于建立腫瘤模型的細(xì)胞為小鼠乳腺癌細(xì)胞(4t1)。

動(dòng)物腫瘤模型的建立

將小鼠后腿前上方的皮毛剔除便于建立腫瘤模型以及腫瘤體積的測(cè)量。培養(yǎng)4t1細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好并增殖達(dá)到70％時(shí)用胰酶將細(xì)胞消化收集，將收集起來(lái)的細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中并以1000rpm的速度離心5分鐘，吸去上層清液并加入一定體積的pbs7.4緩沖溶液輕輕吹散細(xì)胞進(jìn)行洗滌，按上述方法再次離心并洗滌，吸出洗滌液并加入適量pbs7.4緩沖溶液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，最終將其配置成濃度為每50μl有5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。將其分裝到0.2ml的離心管中，每個(gè)離心管中細(xì)胞懸液的體積為50μl。

用胰島素注射器將細(xì)胞懸液注射到小鼠后腿前上方皮下，每個(gè)小鼠接種50μl，在注射與拔出胰島素針頭前，對(duì)注射部位使用75％乙醇溶液消毒。注射完畢后每天觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。

體內(nèi)抗腫瘤效果評(píng)價(jià)

使用游標(biāo)卡尺對(duì)小鼠的腫瘤大小進(jìn)行測(cè)量并計(jì)算腫瘤體積，其計(jì)算公式為v＝ab2/2(a為測(cè)量的長(zhǎng)徑，b為測(cè)量的短徑)。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到到50-100mm3，開(kāi)始進(jìn)行藥物注射。在注射之前，我們將腫瘤生長(zhǎng)良好并符合實(shí)驗(yàn)條件的小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組并標(biāo)記，對(duì)它們的腫瘤體積與體重進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)量并記錄，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，我們選擇同一時(shí)間段進(jìn)行測(cè)量實(shí)驗(yàn)，且腫瘤體積的測(cè)量人員為同一人。本研究采用的是小鼠尾靜脈注射，具體方法如下：取一定量的載藥膠束凍干粉，按每只老鼠每次注射200μl，根據(jù)其載藥量以及小鼠的體重用生理鹽水將其配置成一定濃度的溶液，使用胰島素注射器吸取200μl的載藥膠束通過(guò)尾靜脈進(jìn)行注射，在注射與拔出胰島素針頭前，對(duì)注射部位使用75％乙醇溶液消毒。鹽酸阿霉素對(duì)照組直接注射200μl一定濃度的鹽酸阿霉素溶液，空白對(duì)照組注射200μl生理鹽水。每只小鼠的給藥量為5mg/kg，共給藥四次，每次間隔2天。待給藥組與對(duì)照組間的腫瘤體積存在明顯差異時(shí)結(jié)束觀察。將小鼠取血后斷頸處死并解剖取出臟器與腫瘤組織。

圖13-16為balb/c小鼠在進(jìn)行藥物治療后的腫瘤體積及全身毒性評(píng)價(jià)圖。從圖13中可以看出，注射生理鹽水與載藥膠束組小鼠體重穩(wěn)步增加，最后的增長(zhǎng)率分別為15.4％、13.1％與11.2％，而注射鹽酸阿霉素組的小鼠體重在注射后體重明顯下降，最大為3.8％，這是由于鹽酸阿霉素的全身毒性較強(qiáng)，而將阿霉素通過(guò)載體進(jìn)行包載后后可大大降低藥物的全身毒性。

圖14為給藥后小鼠腫瘤體積增長(zhǎng)率曲線。從圖中可以看出，相比生理鹽水空白組，給藥組在給藥前期腫瘤生長(zhǎng)較慢，其抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果與鹽酸阿霉素相當(dāng)。隨著給藥次數(shù)的增加，載藥納米粒子具有較好的腫瘤抑制效果，但與鹽酸阿霉素相比其抑瘤效果還不佳。這可能是由于鹽酸阿霉素組小鼠其體內(nèi)的生理器官受到破壞，且在宏觀上表現(xiàn)為體重的下降，進(jìn)而引起小鼠的精神萎靡，以至于腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)受到影響從而體現(xiàn)出了假陽(yáng)性的效果，這種效果是以巨大的毒性犧牲小鼠自身健康來(lái)獲得的。而相比于非敏感性載藥膠束而言，氧化還原敏感載藥膠束體現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果，主要是由于載藥膠束更易進(jìn)入到腫瘤組織，且藥物可通過(guò)腫瘤細(xì)胞中高gsh引入載藥膠束結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)而快速的釋放出來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖15、16為實(shí)驗(yàn)24天后小鼠腫瘤重量及解剖圖，其趨勢(shì)與圖14一致，說(shuō)明我們?cè)O(shè)計(jì)的氧化還原敏感載藥膠束達(dá)到了預(yù)期的目的，具有很好的抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果。

本方案提供的藥物載體結(jié)構(gòu)新穎、設(shè)計(jì)獨(dú)特、具有顯著的特異性效果，同時(shí)兼具氧化還原和ph雙重響應(yīng)特性。可以針對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性環(huán)境發(fā)生膠束的開(kāi)閉，從而有效的將藥物釋放到細(xì)胞中，提高治療效果的同時(shí)降低藥物的毒副作用。

將本方案的藥物載體制備成膠束后發(fā)現(xiàn)載藥膠束能快速的被細(xì)胞吞噬，且細(xì)胞對(duì)兼具氧化還原和ph雙重響應(yīng)的載藥膠束的攝取量明顯要高于對(duì)無(wú)敏感性載藥膠束，且隨培養(yǎng)時(shí)間的增加細(xì)胞攝取量增加。體外細(xì)胞毒性結(jié)果表明空白膠束對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒性，細(xì)胞的相對(duì)存活率高于90％；兼具氧化還原和ph雙重響應(yīng)的載藥膠束相比于無(wú)敏感載藥膠束對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能顯著的抑制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與無(wú)敏感性載藥膠束相比，兼具氧化還原和ph雙重響應(yīng)的載藥膠束具有更好的體內(nèi)抗腫瘤效果，能有效抑制腫瘤及腫瘤部位新生血管生長(zhǎng)、細(xì)胞的增殖及降低藥物的毒副作用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。