本發(fā)明涉及一種在離子液體介質(zhì)中進(jìn)行的微波輔助的脂肪酶催化合成曲酸月桂酸單酯的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
曲酸(kojicacid)是由曲霉屬中某些菌株利用葡萄糖、果糖、山梨糖和糖醉等原料，好氧發(fā)酵產(chǎn)生的一種弱酸化合物。曲酸具有抑菌能力、抗氧化性、與金屬離子鰲合等性質(zhì)，并具有抑制酪氨酸酶減少黑色素生成的作用，因此在食品中可作為防腐劑、保鮮劑、護(hù)色劑?？砂踩珣?yīng)用于食品、護(hù)膚品及醫(yī)療行業(yè)。目前對于曲酸的開發(fā)研究，大多數(shù)集中在尋找能夠保留甚至提高曲酸抑制酪氨酸酶活力的性能，又可以克服曲酸易變性的缺點(diǎn)的曲酸衍生物。因而，曲酸衍生物的制備成為近年來的研究應(yīng)用上的焦點(diǎn)和相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)的新動(dòng)向。
ariff等人(jbiomedbiotechnol.2012；2012:952452.)通過研究曲酸酯對細(xì)胞及mushroom酪氨酸酶的抑制活性，結(jié)果表明，曲酸酯是安全無毒的除色劑，能有效抑制b16f1黑色素瘤細(xì)胞的酪氨酸酶活性。人們嘗試通過其與脂肪酸的酯化反應(yīng)，以期提高曲酸的脂溶性，尤其是通過利用生物轉(zhuǎn)化法獲得更為安全可靠的曲酸脂肪酸酯衍生物(jamoilchem-soc.1998,75:1507–1511；enzymeandmicrobtechnol.2014,55:128–132；enzymeandmicrobtechnol.2005,37:739–744.)，進(jìn)一步擴(kuò)大其在疏水性食品中的應(yīng)用范圍。
我們的前期研究結(jié)果表明，曲酸月桂酸單酯(kojicmonolaurate，kml)具有良好的抑菌能力、抗氧化性能，有望被開發(fā)成為防腐劑、保鮮劑、護(hù)色劑，應(yīng)用于果蔬及甲殼類水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域。合成kml的方法主要有化學(xué)合成與生物催化法。化學(xué)合成法使用大量有機(jī)溶劑和價(jià)格昂貴的金屬催化劑，通過復(fù)雜的保護(hù)與去保護(hù)步驟，提高產(chǎn)物的單酯選擇性。分離純化復(fù)雜、投資成本大、易污染環(huán)境等缺點(diǎn)。而生物催化法具有條件溫和、能耗低、無有害副產(chǎn)物、分離純化操作簡便等特點(diǎn)。此外生物催化劑可以重復(fù)利用，降低了成本。
酶促法制備kml，主要利用脂肪酶作為催化劑，使曲酸與月桂酸發(fā)生直接酯化反應(yīng)。但從國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)脂肪酶在有機(jī)溶劑(叔戊醇、叔丁醇等)介質(zhì)中催化酯化反應(yīng)仍存在反應(yīng)活性低、時(shí)間過長、產(chǎn)率低、酶用量大等問題?；谝陨涎芯楷F(xiàn)狀，如何縮短反應(yīng)時(shí)間、提高轉(zhuǎn)化率，同時(shí)減少脂肪酶及揮發(fā)性有機(jī)溶劑的使用成為制備kml亟待解決的問題。
自1986年gedye等利用微波輻射有效地加速有機(jī)反應(yīng)以來，人們對微波的研究越來越深入。目前微波加速有機(jī)反應(yīng)主要用微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)來解釋。微波的熱效應(yīng)表現(xiàn)在其高效加熱特性使反應(yīng)速率加快。微波的非熱效應(yīng)表現(xiàn)在微波輻射還起到催化劑的作用，改變了反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，降低了反應(yīng)活化能，提高反應(yīng)速率。1990年以來，微波被應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域特別是在非水相酶催化方面。微波輻射對生物催化反應(yīng)的影響主要表現(xiàn)在：適宜強(qiáng)度的微波輻射能使酶分子的活性部位更加“裸露”，便于更好地與底物結(jié)合，結(jié)果表現(xiàn)出酶活升高。微波輻射能增加反應(yīng)體系及底物分子的能量，加強(qiáng)底物分子的有效碰撞，從而實(shí)現(xiàn)加快反應(yīng)速率的目的。
離子液體因具備對環(huán)境友好的特性而被稱為“綠色”溶劑，己經(jīng)在有機(jī)合成與生物化學(xué)、電化學(xué)、分離過程、催化等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。離子液體具有優(yōu)異的化學(xué)和熱力學(xué)穩(wěn)定性，有很好的底物溶解性，較寬的溫度適用范圍，且?guī)缀鯚o蒸汽壓，是綠色的反應(yīng)介質(zhì)。同時(shí)，其自身結(jié)構(gòu)的“可調(diào)節(jié)性”，使得離子液體可對微波能量有著較好的吸收效果。并且已經(jīng)有研究表明，與有機(jī)溶劑相比，脂肪酶在一些離子液體中較有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出更高的催化活性和反應(yīng)立體及區(qū)域選擇性。
本發(fā)明是利用脂肪酶在離子液體中催化合成曲酸月桂酸單酯。該方法以固定化狀脂肪酶為生物催化劑，離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)，曲酸與月桂酸為底物，在微波反應(yīng)裝置中利用微波加熱促進(jìn)脂肪酶催化合成食品添加劑曲酸月桂酸單酯。提高了脂肪酶的催化活性及選擇性，縮短了反應(yīng)時(shí)間，避免環(huán)境污染，為生物法制備kml提供了又一成功范例
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目在于提供一種脂肪酶在離子液體中催化合成kml的方法，縮短反應(yīng)時(shí)間、減小環(huán)境污染，提高產(chǎn)物得率。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種微波輔助的離子液體中酶促合成kml的方法，包括以下步驟：
將曲酸、月桂酸、分子篩、脂肪酶與離子液體加入生物反應(yīng)器中，將反應(yīng)器移入微波反應(yīng)裝置中，啟用微波輻射進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)體系進(jìn)行離心分離，并用乙酸乙酯洗滌固體相兩次，收集有機(jī)相，減壓除溶劑得白色固體粗產(chǎn)物；再經(jīng)過色譜分離，收集樣品組分，合并有機(jī)相，干燥，減壓除溶劑，得白色產(chǎn)物。
本發(fā)明是在微波加熱條件下，利用脂肪酶在離子液體中催化合成kml，不僅提高的脂肪酶的催化反應(yīng)活性及選擇性，反應(yīng)條件溫和、工藝條件簡單，縮短反應(yīng)時(shí)間，更減小了環(huán)境污染。
其中，上述脂肪酶為疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶、褶皺假絲酵母脂肪酶、南極假絲酵母脂肪酶、豬胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋蔥假單胞菌脂肪酶、洋蔥布克氏菌脂肪酶；或上述一種或多種的脂肪酶。
其中，上述固定化脂肪酶的用量為2.0-3.0％(w/v)。
其中，上述離子液體為三辛烷基甲基季銨鹽、氯化-1-烯丙基-3-甲基咪唑鹽、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸正離子、1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物、1-羥乙基-3-甲基咪唑四氯硼酸鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽、1-羥乙基-3-甲基咪唑硝酸鹽；或上述一種或多種的混合離子液體。
其中，上述曲酸的用量為5-8g/l,且與月桂酸的摩爾比為1:1-1:8。
其中，上述酶促反應(yīng)溫度為50-70℃。
其中，上述催化反應(yīng)時(shí)間為0-3h。
其中，上述分子篩為3a，且分子篩的用量為10-12％(w/v)。。
對反應(yīng)進(jìn)行微波加熱的輻射功率為30～200w，優(yōu)選30～80w，輻射頻率2000mhz。
本發(fā)明中，最佳的反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度62℃，輻射功率60w，輻射頻率為2000mhz，反應(yīng)時(shí)間為1h。
本發(fā)明還提供了一種曲酸月桂酸單酯在制備食品添加劑中的應(yīng)用，所述的食品添加劑用于抑菌或者抗氧化。
作為優(yōu)選，所述的曲酸月桂酸單酯用于抑制金黃色葡萄球菌。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明采用微波輔助下在綠色離子液體介質(zhì)中脂肪酶催化合成kml，不僅操作簡便，反應(yīng)迅速，而且提高了脂肪酶的選擇性，提高產(chǎn)物得率。同時(shí)采用了綠色離子液體作為反應(yīng)介質(zhì)，即提高了對微波的吸收效果，促進(jìn)微波效應(yīng)，又減少環(huán)境污染，符合綠色化學(xué)的要求。
附圖說明
圖1為實(shí)施例4中曲酸月桂酸酯對金黃色葡萄球菌的生長曲線的影響圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于此。
氣相色譜(gc)分析條件：不同時(shí)間從反應(yīng)器中取出適量樣品用色譜純甲醇稀釋并置于樣品瓶中。立刻加樣入gc色譜儀(agilent6890n)中，以防止樣品的分解。色譜柱：ht-5fusedsilicacapillarycolumn(0.15μm,0.53mm,0.30m),檢測器：fid，進(jìn)樣口及檢測器溫度340℃和350℃，柱溫采用程序升溫：70℃到340℃，升溫速率20℃/min。載氣為n2，流速：1.0ml/min，進(jìn)樣量：2μl。kml得率(摩爾轉(zhuǎn)化率)＝曲酸月桂酸單酯摩爾數(shù)/初始曲酸摩爾數(shù)×100％。
樣品處理?xiàng)l件：反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系進(jìn)行離心分離，并用乙酸乙酯洗滌固體相兩次，收集有機(jī)相，減壓除溶劑得白色固體粗產(chǎn)物；再經(jīng)過色譜分離，收集樣品組分，合并有機(jī)相，干燥，減壓除溶劑，得白色產(chǎn)物。
實(shí)施例1
本實(shí)施例探究有機(jī)溶劑中常規(guī)加熱和微波加熱的脂肪酶催化反應(yīng)的差異。
用常規(guī)加熱的脂肪酶催化反應(yīng)：
在生物反應(yīng)器中加入20mm曲酸、100mm月桂酸、300mg3a分子篩和60mg脂肪酶novozym435(candidaantarcticalipaseimmobilizedonmacroporouspolyacrylicresin)，3ml叔丁醇，水浴恒溫62℃，反應(yīng)10h后的kml產(chǎn)率為20.3％。
微波加熱的脂肪酶催化反應(yīng)：
在微波反應(yīng)器中加入0.2mm曲酸、1.0mm月桂酸、24mg/ml3a分子篩和1.2mg/ml脂肪酶novozym435，3ml叔丁醇，將微波反應(yīng)器移入微波反應(yīng)裝置中，啟用微波輻射，設(shè)定反應(yīng)溫度62℃，輻射功率30w，輻射頻率為2000mhz，反應(yīng)1h后的kml產(chǎn)率為22.3％。
實(shí)施例2
與實(shí)施例1對比，本實(shí)施例探究了微波加熱脂肪酶催化反應(yīng)在離子液體中的反應(yīng)情況。
在微波反應(yīng)器中加入20mm曲酸、100mm月桂酸、300mg3a分子篩和160mg脂肪酶novozym435與3ml離子液體[peg350im]pf6，將微波反應(yīng)器移入微波反應(yīng)裝置，啟用微波輻射，設(shè)定反應(yīng)溫度62℃，輻射功率30w，輻射頻率為2000mhz，反應(yīng)1h后的kml產(chǎn)率為35.1％。
實(shí)施例3
與實(shí)施例2相較，本實(shí)施例探究在離子液體中用不同功率微波加熱脂肪酶催化反應(yīng)的差異。
在離子液體中用60w功率微波加熱脂肪酶催化反應(yīng)：在微波反應(yīng)器中加入20mm曲酸、100mm月桂酸、300mg3a分子篩和160mg脂肪酶novozym435與3ml離子液體[peg350im]pf6，將微波反應(yīng)器移入微波反應(yīng)裝置，設(shè)定反應(yīng)溫度62℃，輻射功率60w，輻射頻率為2000mhz，反應(yīng)為1h的kml產(chǎn)率為37.3％。
實(shí)施例4
本實(shí)施例探究了曲酸月桂酸酯對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。選取金黃色葡萄球菌作為代表菌屬，研究抑制劑對它們生長曲線的影響。固定菌液的初始濃度，將1mic，2mic，4mic,6mic的濃度的曲酸月桂酸酯加入含菌液體培養(yǎng)基中。然后定期取樣用無菌水稀釋至適當(dāng)濃度，涂布，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)?？倳r(shí)間取微生物的一個(gè)生長周期24h。從圖1看出，濃度為2mic時(shí)，2h內(nèi)可以將109cfu/ml的金黃色葡萄球菌抑制到小于104cfu/ml左右，并能持續(xù)作用到4h。濃度大于4mic時(shí)，在4h內(nèi)對金黃色葡萄球菌直接殺死。
實(shí)施例5
本實(shí)施例探究了曲酸月桂酸酯的體外模擬脂質(zhì)過氧化的抑制作用。于比色管中加入3.0mlhci溶液(1.2mol/l)，3.0mltba溶液和0.2ml油酸，60℃水浴共熱1h，水冷至室溫，吸出油酸，用10.0ml正丁醇萃取，靜置5min，測量上層溶液熒光強(qiáng)度i1。加入不同濃度的曲酸月桂酸酯0.5ml，于ex＝543nm處測量其熒光強(qiáng)度is，未加清除劑的空白體系熒光強(qiáng)度為io，實(shí)驗(yàn)選擇激發(fā)波長為543nm，光譜帶寬為10nm.按以下公式計(jì)算抑制率i：
i＝[(i1-is)/(i1-io)]×100％
表1抗氧化劑抑制脂質(zhì)過氧化能力
丙二醛可用來反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化狀態(tài)及機(jī)體受損傷的程度。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，曲酸不具有抑制脂質(zhì)過氧化能力，而曲酸月桂酸酯具有較強(qiáng)的脂質(zhì)過氧化抑制能力，且隨著濃度的增大，抑制作用不斷增強(qiáng)。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。