本發(fā)明涉及藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物及其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物病害一直是農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的重要制約因素之一。據(jù)估計(jì)，全球主要農(nóng)作物的平均損失約占總產(chǎn)量的10％～15％，每年直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)千億美元。其中，植物病原細(xì)菌和真菌是嚴(yán)重威脅我國(guó)的糧食及農(nóng)作物的生產(chǎn)最重要的因素，為了控制細(xì)菌性病害和真菌性病害，迫切需要制備高效的抗病原細(xì)菌和真菌的活性小分子。但目前使用的商品化抗菌藥物的活性不夠高效，篩選和尋找高效殺菌的活性化合物，是當(dāng)前新農(nóng)藥創(chuàng)制研發(fā)的重要環(huán)節(jié)。

而基于吡啶鹽的化合物因具有廣泛的生物活性(如抗革蘭氏陽性(或陰性)菌等)成為研究學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。同時(shí)，吡唑類化合物和含1,3,4-噁(噻)二唑基的硫醚類化合物在農(nóng)藥方面表現(xiàn)出廣譜的生物活性，商品化的藥劑有農(nóng)用殺菌劑唑菌胺酯(pyraclostrobin)、殺蟲劑氟蟲腈(fipronil)、除草劑唑草胺(cafenstrole)、除草劑嘧硫草醚(pyrithiobac-sodium)等。

為了尋找高效殺菌的活性化合物，本發(fā)明以吡唑聯(lián)噁(噻)二唑氧醚、硫醚類化合物為基礎(chǔ)，將能夠提高目標(biāo)化合物生物活性的吡啶鹽基團(tuán)引入到此體系中，合成一系列含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁二唑類化合物，測(cè)試其生物活性，為新農(nóng)藥的研發(fā)和創(chuàng)制提供重要的科學(xué)基礎(chǔ)。

含吡唑基團(tuán)、噁二唑基團(tuán)以及吡啶鹽結(jié)構(gòu)的活性小分子的生物活性研究進(jìn)展如下：

2016年hafez等[hafez,h.n.；el-gazzar,a.r.；al-hussain,s.a.,novelpyrazolederivativeswithoxa/thiadiazolyl,pyrazolylmoietiesandpyrazolo[4,3-d]-pyrimidinederivativesaspotentialantimicrobialandanticanceragents.bioorg.med.chem.lett.,2016,26,2428-2433]合成了一系列含噁唑(噻唑或嘧啶)結(jié)構(gòu)的吡唑類衍生物，大部分的化合物都具有較好的抗菌活性。其中3b,7b,9,10b,15,19a對(duì)gram-(-)大腸桿菌(escherichiacoli)、綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)和gram-(+)乳酸鏈球菌(streptococcuslactis)、金色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，以及兩種真菌白色念珠菌(candidaalbicans)、黃曲霉菌(aspergillusflavus)具有較高的活性，優(yōu)于其對(duì)照藥劑氨噻肟唑頭孢菌素。尤其是化合物3b對(duì)乳酸鏈球菌(streptococcuslactis)、金色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的最小抑制濃度分別為5和10μg/ml，明顯出高于對(duì)照藥(cefatoxime，mic＝12,15μg/ml)。

2016年，desai等[desai,n.c.；kotadiya,g.m.；trivedi,a.r.；khedkar,v.m.；jha,p.c.,synthesis,biologicalvaluation,andqsarstudiesofnovelpyrazolebearingpyridyloxadiazoleanaloguesaspotentialantimicrobialagents.med.chem.res.,2016,25712-727.]合成了一系列的含吡啶基噁二唑聯(lián)吡唑類似物。其中化合物5e、5f、5j、5k和5l對(duì)細(xì)菌gram-(+)釀膿葡萄球菌(staphylococcuspyogenes)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和gram-(-)大腸桿菌(escherichiacoli.)、綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)以及真菌白色念珠菌(candidaalbicans)、黑曲霉菌(aspergillusniger)和棒曲霉菌(aspergillusclavatus)展現(xiàn)了較好的抑制活性，且比對(duì)照藥劑細(xì)胞毒性低，具有成為潛在的抗微生物劑的前景。其中，5l(取代基甲氧基處于對(duì)位)對(duì)細(xì)菌金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)和真菌黑曲霉菌(aspergillusniger)展現(xiàn)出了最高的抑制活性mic＝12.5μg/ml構(gòu)效關(guān)系：當(dāng)苯環(huán)上取代基為供電子基團(tuán)時(shí)，活性明顯優(yōu)于苯環(huán)上取代基為吸電子基的化合物，供電子基對(duì)活性具有積極的作用。

2016年shetty等[shetty,p.；praveen,b.m.；raghavendra,m.；manjunath,k.；cheruku,s.,synthesisandantimicrobialevaluationofnovel4-amino-6-(1,3,4-oxadiazolo/1,3,4-thiadiazolo)-pyrimidinederivatives.moleculardiversity2016,20,391-398]報(bào)道了一系列4-氨基-6-(1,3,4-噁二唑/1,2,4-三氮唑)嘧啶類衍生物，生物活性測(cè)試結(jié)果表明，化合物表現(xiàn)出一定的抗革蘭氏陽性(或陰性)菌及真菌的活性，如抗gram-(+)：枯草桿菌(bacillussubtilis)，腸球菌(enterococcusfaecalis)和金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)；抗gram-(-)：大腸桿菌(escherichiacoli)克雷伯氏菌(klebsiellapneumonie)和綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)，真菌黃曲霉菌(aspergillusflavus)、煙曲霉菌(aspergillusfumigatus)、馬爾尼菲青霉(penicilliummarneffei)和須毛癬菌(trichophytonmentagrophytes)。其中化合物7f對(duì)四種細(xì)菌以及四種真菌的最小抑制濃度(minimalinhibitionconcentration,mic)都為6.25μg/ml。

2015年，chen等[desai,n.c.；bhatt,n.；dodiya,a.；karkar,t.；patel,b.；bhatt,m.,synthesis,characterizationandantimicrobialscreeningofthiazolebased1,3,4-oxadiazolesheterocycles.res.chem.intermediat.,2015,42,3039-3053.]合成了一系列含噻唑聯(lián)噁二唑基苯甲酰胺類化合物，生物活性測(cè)試表明，化合物5e、5k和5a、5b分別對(duì)四種細(xì)菌(mic＝12.5-25μg/ml)gram(+)金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和釀膿葡萄球菌(streptococcuspyogenes),gram(-)大腸桿菌(escherichiacoli)和綠膿桿菌(pseudomonasaeruginosa)，以及三種真菌(mic＝12.5-500μg/ml)白色念珠菌(candidaalbicans)、黑曲霉菌(aspergillusniger)和棒曲霉菌(aspergillusclavatus)具有良好的的抑制活性。構(gòu)效關(guān)系：含供電子基團(tuán)5e(甲氧基)和5k(甲基)化合物對(duì)細(xì)菌活性的提高有促進(jìn)作用；含吸電子基團(tuán)5a(鄰氟)和5b(對(duì)氟)化合物對(duì)真菌活性的提高有促進(jìn)作用。

2015年，mhaske等[mhaske,p.c.；shelke,s.h.；gadge,k.；shinde,a.,synthesisandantifungalscreeningof2-(2-aryl-4-methyl-thiazol-5-yl)-5-((2-aryl/benzylthiazol-4-yl)methyl)-1,3,4-oxadiazolederivatives.j.heterocyclic.chem.,2016,53,129-134.]報(bào)道了一系列含噻唑環(huán)的1,3,4-噁二唑衍生物，并對(duì)四種真菌白色念珠菌(candidaalbicans)、熱帶念珠菌(candidatropicalis)、黑曲霉菌(aspergillusniger)、黃曲霉菌(aspergillusflavus)進(jìn)行抑菌活性測(cè)試。抑菌活性測(cè)試表明，該系列化合物對(duì)四種真菌表現(xiàn)出了較好的抑制活性(mic＝1.56-50μg/ml)，其中化合物5e對(duì)黑曲霉菌(aspergillusniger)表現(xiàn)出了與對(duì)照藥劑相當(dāng)?shù)囊种苹钚?mic＝1.56μg/ml)。

2013年kahriman等[kahriman,n.；yayli,b.；aktas,a.；iskefiyeli,z.；beris,f.s.；yayli,n.synthesis,antibacterialandantioxidantactivitiesofnew1-alkyl-4-(1-alkyl-4-oxo-1,4-dihydroquinolin-2-yl)pyridiniumbromides.eur.j.med.chem.,2013,69,348-355]報(bào)道了一系列含有不同取代烷基吡啶鹽的1,4-二氫喹啉衍生物(3a-3k)，生物活性測(cè)試結(jié)果表明，化合物表現(xiàn)出一定的抗革蘭氏陽性(或陰性)菌的活性，如抗gram-(+)：枯草桿菌(bacillussubtilis)，腸球菌(enterococcusfaecalis)和金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)；抗gram-(-)：克雷伯氏菌(klebsiellapneumonie)，假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)和變形桿菌(proteusvulgaris)。當(dāng)目標(biāo)化合物的烷烴鏈長(zhǎng)度增加時(shí)，其抑菌活性反而降低，其中化合物3b對(duì)gram-(+)金黃色葡萄球菌和gram-(-)假單胞菌的最小抑制濃度(minimalinhibitionconcentration,mic)都為7.8μg/ml。

2015年，marek等[marek,j.；malinak,d.；dolezal,r.；soukup,o.；pasdiorova,m.；dolezal,m.；kuca,k.,synthesisanddisinfectioneffectofthepyridine-4-aldoximebasedsalts.molecules.2015,20,3681-3696.]合成了一系列不同碳鏈長(zhǎng)度的4-醛肟基吡啶鹽類衍生物，初步的生物活性測(cè)試表明對(duì)8種細(xì)菌和8種真菌具有一定的抑制活性。其中，發(fā)現(xiàn)c14和c16對(duì)酵母型真菌具有較好的抑制活性，而c16對(duì)絲狀真菌完全沒有活性。另外，c14和c16分別對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌具有相當(dāng)高的抑制活性。

2013年，garcia等[garcia,m.t.；ribosa,i.；perez,l.；manresa,a.；comelles,f.,aggregationbehaviorandantimicrobialactivityofester-functionalizedimidazolium-andpyridinium-basedionicliquidsinaqueoussolution.langmuir.2013,29,2536-2545.]報(bào)道了一系列含有不同取代烷基吡啶鹽的離子液體衍生物，分別對(duì)3種革蘭氏陰性菌、3種革蘭氏陽性菌和1種真菌進(jìn)行了抑菌活性測(cè)試。通過生物活性測(cè)試表明，當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度大于8個(gè)碳鏈長(zhǎng)度時(shí)，化合物表現(xiàn)出了抗微生物活性。c10-c12隨著碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)，抑菌活性逐漸提高。當(dāng)碳鏈長(zhǎng)度為12時(shí)，化合物展現(xiàn)出了最佳的抗微生物活性，優(yōu)于其他化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是：提供一種含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物及其制備方法及應(yīng)用，它對(duì)致病病原細(xì)菌和真菌具有良好的抑制效果，且其合成方法非常經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物，該化合物具有如通式(ⅰ)所示的結(jié)構(gòu)：

式中，r1為甲基、乙基、丙基、異丙基或不同取代苯基，其中，不同取代的苯基上的取代基為一個(gè)以上，取代基為氫、c1-4烷基、三氟甲基、羥基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或鹵素原子；吡啶鹽陽離子上為不同取代基，r2為氫、c1-4烷基、三氟甲基、羥基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或鹵素原子；r3為吡唑基上的取代基，為氫、鹵素原子、c1-4烷基或三氟甲基；m及x為氧原子或硫原子；n為自然數(shù)，n不能為0。

含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物的制備方法，其合成路線如下；

式中，r1為甲基、乙基、丙基、異丙基或不同取代苯基，其中，不同取代的苯基上的取代基為一個(gè)以上，取代基為氫、c1-4烷基、三氟甲基、羥基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或鹵素原子；吡啶鹽陽離子上為不同取代基，r2為氫、c1-4烷基、三氟甲基、羥基、c1-3烷氧基、三氟甲氧基、丙烯基、丙烯酰胺基、氨基、c1-3烷氨基、硝基或鹵素原子；r3為吡唑基上的取代基，為氫、鹵素原子、c1-4烷基或三氟甲基；m及x為氧原子或硫原子；n為自然數(shù)，n不能為0。

含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物在制備抗病原細(xì)菌和真菌的藥物的應(yīng)用。

通過采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明以吡唑聯(lián)噁(噻)二唑氧醚、硫醚類化合物為基礎(chǔ)，將能夠提高目標(biāo)化合物生物活性的吡啶鹽基引入到此體系中，合成一系列含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑氧醚、硫醚類兩親性分子，且發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)致病病原細(xì)菌和真菌具有良好的抑制作用，針對(duì)病原細(xì)菌[如水稻白葉枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae,xoo)、煙草青枯病菌(ralstoniasolanacearum,r.solanacearum)、柑橘潰瘍病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri,xac)等]和病原真菌[如小麥赤霉病菌(g.zeae)、馬鈴薯晚疫病菌(p.infestans)、水稻紋枯病菌(t.cucumeris)、黃瓜灰霉病菌(b.cinerea)、辣椒枯萎病原菌(f.oxysporum)、蘋果腐爛病原菌(c.mandshurica)等]均具有良好的抑制效果，為新農(nóng)藥的研發(fā)和創(chuàng)制提供重要的科學(xué)基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例1：目標(biāo)化合物10-(2-硫醚-5-(1苯基-2-三氟甲基)吡唑基)-1,3,4-噁二唑-癸基-1-溴化吡啶鹽的制備

將0.5g2-(10-溴癸基)硫醚基-5-(1苯基-2-三氟甲基)吡唑基-1,3,4-噁二唑溶于5ml吡啶，50℃反應(yīng)6h，脫溶，柱層析法純化得黃色液體0.53g，收率92.0％。

硫醚和氧醚類目標(biāo)化合物的合成參照實(shí)施例1。

合成的部分含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物的結(jié)構(gòu)及核磁共振氫譜、碳譜和氟譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表1所示，物化性質(zhì)如表2所示。

表1部分化合物的核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)

表2部分目標(biāo)化合物的理化性質(zhì)

藥理實(shí)施例1：ec50(medianeffectiveconcentration)是評(píng)價(jià)植物病原菌對(duì)化合物敏感性的重要指標(biāo)，同時(shí)也是對(duì)目標(biāo)化合物作用機(jī)制研究時(shí)，化合物濃度設(shè)置的重要參數(shù)。在濃度梯度實(shí)驗(yàn)中，采用二倍稀釋法設(shè)定合適的5個(gè)濃度，最后將藥劑對(duì)植物病原菌的抑制率、藥劑濃度換算成對(duì)數(shù)值，通過spss軟件回歸分析得到毒力曲線，計(jì)算出ec50。

采用濁度法測(cè)試目標(biāo)化合物對(duì)植物病原菌的有效中濃度ec50，試驗(yàn)對(duì)象為水稻白葉枯病菌(xoo)、煙草青枯病菌(r.solanacearum)和柑橘潰瘍病菌(xac)。dmso溶解在培養(yǎng)基中作為空白對(duì)照。將水稻白葉枯病菌(水稻白葉枯病原菌在m210固體培養(yǎng)基)放到nb培養(yǎng)基中，在28℃、180rpm恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用；煙草青枯病原菌在na固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，放置在30℃恒溫培養(yǎng)箱中，直到長(zhǎng)出單菌落，挑取單菌落，將煙草青枯病菌放到nb液體培養(yǎng)基，在30℃、180rpm恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用；將柑橘潰瘍病菌(在m210固體培養(yǎng)基上)放到nb培養(yǎng)基中，在28℃、180rpm恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。將藥劑(化合物)配置成不同濃度(例：80,40,20,10,5μg/ml)的含毒nb液體培養(yǎng)基5ml加入到試管中，分別加入40μl含有植病細(xì)菌的nb液體培養(yǎng)基，在28-30℃、180rpm恒溫?fù)u床中振蕩，其水稻白葉枯病原菌培養(yǎng)36h，煙草青枯病菌培養(yǎng)48h，柑橘潰瘍病菌培養(yǎng)48h。將各個(gè)濃度的菌液在分光光度計(jì)上測(cè)定od595值，并且另外測(cè)定對(duì)應(yīng)濃度的含毒無菌nb液體培養(yǎng)基的od595值。

校正od值＝含菌培養(yǎng)基od值－無菌培養(yǎng)基od值

抑制率％＝[(校正后對(duì)照培養(yǎng)基菌液od值－校正含毒培養(yǎng)基od值)/

校正后對(duì)照培養(yǎng)基菌液od值]×100

本發(fā)明實(shí)施例輔以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但實(shí)施例的內(nèi)容并不局限于此，部分目標(biāo)化合物實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物對(duì)植物病原細(xì)菌的抑制活性

“nt”表示未測(cè)試

從表3中可以看出，在離體試驗(yàn)中，目標(biāo)化合物對(duì)植物致病病原菌(如水稻白葉枯病菌、煙草青枯菌和柑橘潰瘍病菌)表現(xiàn)出了良好的抑制活性?；衔?-11、13和14對(duì)水稻白葉枯病菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae,xoo)表現(xiàn)出了極好的抑制活性，其ec50為0.5-29.9μg/ml；化合物3-14對(duì)煙草青枯病菌(ralstoniasolanacearum,r.solanacearum)表現(xiàn)出了良好的抑制活性，其ec50為1.0-46.3μg/ml；化合物1-14對(duì)柑橘潰瘍病菌(xanthomonasaxonopodispv.citri,xac)表現(xiàn)出了極好的抑制活性，其ec50為0.6-54.9μg/ml；可用于制備抗植物致病病原細(xì)菌農(nóng)藥。

藥理實(shí)施例2：含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物的抗致病病原真菌應(yīng)用，用于抗黃瓜灰霉病菌(b.cinerea)、辣椒枯萎病原菌(f.oxysporum)、蘋果腐爛病原菌(c.mandshurica)、小麥赤霉病菌(f.graminearum)、馬鈴薯晚疫病菌(p.infestans)和水稻紋枯病菌(t.cucumeris)試驗(yàn)方法。

在50μg/ml的濃度下，以惡霉靈為對(duì)照藥劑，選用6種致病病原真菌為供試對(duì)象，采用生長(zhǎng)速率法對(duì)部分化合物進(jìn)行了生物活性測(cè)試，其結(jié)果見表4-5。

表4含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物對(duì)植物病原真菌的抑制活性

表5含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物對(duì)植物病原真菌的抑制活性

表6含吡啶鹽的吡唑聯(lián)噁(噻)二唑類化合物對(duì)植物病原真菌的抑制活性

從表4-6可以看出，測(cè)試結(jié)果表明，該系列化合物有一定的抗真菌活性，其中化合物4、5、6、9、14在濃度為50μg/ml下，對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率分別為83.7％、84.3％、86.1％、83.0％和80.5％，其ec50分別為21.9，16.6，24.0，15.0和10.2μg/ml；化合物1-14對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑制率在79.5-99.0％之間，化合物1-11，13和14對(duì)黃瓜灰霉病菌的ec50在2.7-34.8μg/ml之間?？梢姳景l(fā)明的化合物完全可用于制備抗植物致病病原真菌農(nóng)藥。