本發(fā)明涉基因工程及發(fā)酵工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

間苯三酚又名1,3,5-三羥基苯、均苯三酚，是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，是合成黃酮、異黃酮類藥物的中間體，間苯三酚本身可作為一種優(yōu)良的平滑肌解痙藥物，廣泛應(yīng)用于臨床。間苯三酚還能抑制過(guò)氧化物酶活性，具有抗炎抗氧化作用，它可催化h2o2分解為分子氧和水，是一種重要的抗氧化酶。此外，間苯三酚還是一種性能優(yōu)越的抗養(yǎng)護(hù)劑、穩(wěn)定劑、燃料偶合劑、輪胎增粘劑等，具有廣闊的市場(chǎng)需求。目前，間苯三酚的工業(yè)化生產(chǎn)方法主要為化學(xué)合成法，包括三硝基甲苯(tnt)法、異丙基苯法、氯代苯法和苯胺法?；瘜W(xué)合成法存在多種弊端，如原料來(lái)源困難、副產(chǎn)物較多、分離提純困難、環(huán)境污染嚴(yán)重等。以微生物發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚，可以克服化學(xué)法的多種弊端，并且生物法合成間苯三酚周期短，安全環(huán)保。

異源表達(dá)熒光假單胞菌聚酮合成酶基因phld可以合成間苯三酚(jihaneachkar,moxian,huiminzhao,j.w.frost.biosynthesisofphloroglucinol[j].journaloftheamericanchemicalsociety,2005,127(15):5332-5333.；wenjuanzha,sherylb.rubin-pitel,huiminzhao.characterizationofthesubstratespecificityofphld,atypeiiipolyketidesynthasefrompseudomonasfluorescens[j].journalofbiologicalchemistry,2006,281(42):32036-32047.)。在此基礎(chǔ)上表達(dá)多重抗性激活因子mara，增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)間苯三酚的耐受性，表達(dá)大腸桿菌自身的乙酰coa羧化酶基因(accase)，細(xì)胞內(nèi)丙二酸單酰coa的水平為原始菌株的3.6倍(yujincao,xinglinjiang,rubingzhang,moxian.improvedphloroglucinolproductionbymetabolicallyengineeredescherichiacoli[j].applmicrobiolbiotechnol,2011,91:1545–1552.)。然而，上述間苯三酚合成工程菌的產(chǎn)量還比較低，離實(shí)際應(yīng)用的要求尚有一定差距，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。原因之一在于:間苯三酚作為一種酚類物質(zhì)，本身就是一種優(yōu)良的殺菌劑，對(duì)大腸桿菌的正常生長(zhǎng)具有嚴(yán)重的抑制作用,由于間苯三酚抑制了大腸桿菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致其合成產(chǎn)量無(wú)法提升。因此,我們需要進(jìn)一步對(duì)工程菌株進(jìn)行基因改造，以期提高間苯三酚的合成能力。groesl是大腸桿菌內(nèi)重要的熱激分子伴侶蛋白，該調(diào)節(jié)因子對(duì)間苯三酚發(fā)酵生產(chǎn)的影響暫無(wú)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決目標(biāo)產(chǎn)物間苯三酚本身作為一種酚類物質(zhì)具有殺菌作用,抑制大腸桿菌正常生長(zhǎng)從而降低其自身產(chǎn)量的問題，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種高間苯三酚合成能力的基因工程菌及其構(gòu)建方法，該方法是為了增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)間苯三酚的耐受性，降低間苯三酚對(duì)大腸桿菌正常生長(zhǎng)的抑制作用，進(jìn)而提高大腸桿菌合成間苯三酚產(chǎn)量。具體步驟為：

1)制備含有分子伴侶蛋白groesl基因的重組質(zhì)粒；

2)制備含有聚酮合成酶基因phld、多重抗性激活因子mara、乙酰coa羧化酶基因accase的重組質(zhì)粒；

3)將步驟1)和步驟2)所得重組質(zhì)粒導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌株。

步驟1)所述分子伴侶蛋白groesl基因來(lái)源于細(xì)菌，為groes蛋白和groel蛋白的基因或者與groes蛋白和groel蛋白的基因同源性超過(guò)70％的基因。

或者，步驟1)所述分子伴侶蛋白groesl基因并非來(lái)源于細(xì)菌，為與groes蛋白和groel蛋白的基因沒有明顯同源性，但與groes蛋白和groel蛋白的基因具有相同或相似功能的基因。

步驟2)所述聚酮合成酶基因phld，來(lái)源于熒光假單胞菌；所述多重抗性激活因子mara，來(lái)源于大腸桿菌；所述乙酰coa羧化酶基因accase，來(lái)源于大腸桿菌。

步驟2)所述聚酮合成酶基因phld，genebankid為11830552；所述多重抗性激活因子mara，genebankid為6060688；所述乙酰coa羧化酶基因accase，其中，亞基acca的genebankid為6062185，亞基accb的genebankid為6058890，亞基accc的genebankid為6058863，亞基accd的genebankid為6059083。

步驟3)所述感受態(tài)菌株，是大腸桿菌e.colibl21(de3)的感受態(tài)菌株。

優(yōu)選的，本發(fā)明提供的高間苯三酚合成能力的基因工程菌的構(gòu)建方法具體為：

1)將分子伴侶蛋白groesl基因連接到載體pet28a(+)上，獲得重組質(zhì)粒pet-groesl；

所述分子伴侶蛋白groesl的基因?yàn)間roes和groel，來(lái)源于大腸桿菌，groesgenebankid：948655，groelgenebankid：948665。

2)將聚酮合成酶基因phld、多重抗性激活因子mara和乙酰coa羧化酶基因accase連接到載體pacyc上，獲得重組質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc；

所述聚酮合成酶基因phld，來(lái)源于熒光假單胞菌，genebankid：11830552；所述多重抗性激活因子mara，來(lái)源于大腸桿菌，genebankid：6060688；所述乙酰coa羧化酶基因accase，來(lái)源于大腸桿菌，其中，亞基acca的genebankid：6062185，亞基accb的genebankid：6058890，亞基accc的genebankid：6058863，亞基accd的genebankid：6059083；

3)再將步驟1)和步驟2)所得的重組質(zhì)粒pet-groesl和pacyc-phld/mara/accadbc導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞e.colibl21(de3)中獲得重組菌株。

本發(fā)明的另一個(gè)目的為，提供一種高間苯三酚合成能力的基因工程菌，該基因工程菌包含含有分子伴侶蛋白groesl基因的重組質(zhì)粒和含有聚酮合成酶基因phld、多重抗性激活因子mara、乙酰coa羧化酶基因accase的重組質(zhì)粒。

另外，本發(fā)明還提供利用上述基因工程菌生產(chǎn)間苯三酚的方法，具體步驟如下：

1)基因工程菌種子液按照接種量為培養(yǎng)基體積的1％-5％接種于培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30-37℃，攪拌速度為300-800rpm，ph6.0-8.0，溶氧18％以上的條件下培養(yǎng)至od600為8-12，然后加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度0.1-1mmol/l，以40-80％的葡萄糖為底物繼續(xù)分批補(bǔ)料發(fā)酵12-24h后結(jié)束培養(yǎng)；

2)將步驟1)得到的培養(yǎng)液進(jìn)行離心取上清，上清采用等體積的乙酸乙酯萃取1-3次；

3)合并2)中所述萃取產(chǎn)物，減壓蒸餾濃縮，所得固體粉末即為間苯三酚。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

groesl是大腸桿菌內(nèi)重要的熱激分子伴侶蛋白，該調(diào)節(jié)因子對(duì)間苯三酚發(fā)酵生產(chǎn)的影響暫無(wú)報(bào)道。本發(fā)明在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)了熱激分子伴侶蛋白groesl基因，所得基因工程菌間苯三酚合成能力大大提高，分批補(bǔ)料發(fā)酵時(shí)每升發(fā)酵液間苯三酚產(chǎn)量可達(dá)到4.97-5.91g，較僅包含質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc的菌株提高到1.5倍，該方法為間苯三酚生物合成的工業(yè)化應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

定義和縮寫

在本文中使用下列的縮寫或簡(jiǎn)稱：

間苯三酚(phloroglucinol)：pg

異丙基硫代半乳糖苷：iptg

分子伴侶蛋白基因：groesl

聚酮合成酶基因：phld

多重抗性激活因子：mara

乙酰coa羧化酶基因：accase

大腸埃希氏桿菌(escherichiacoli)：e.coli

“基因型”指某一生物個(gè)體全部基因組合的總稱，是該生物的細(xì)胞內(nèi)所包含的、特有的那組基因。

“過(guò)量表達(dá)”或“過(guò)表達(dá)”指細(xì)胞內(nèi)特定基因受到各種信號(hào)調(diào)控后，在生物體中超過(guò)原有水平表達(dá)，可以通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源表達(dá)或引入外源基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1pet-groesl重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2pet-t7-groesl重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3pacyc-phld/mara/accadbc重組質(zhì)粒示意圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)例來(lái)詳細(xì)闡明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。

下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法若無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)技術(shù)。

下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等若無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

所用限制性內(nèi)切酶及t4dna連接酶均購(gòu)自mbifermentas公司，質(zhì)粒提取及膠回收所用試劑盒購(gòu)自美國(guó)omega公司，操作步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行；所有培養(yǎng)基如無(wú)特別說(shuō)明均用去離子水配制。

培養(yǎng)基配方：

1)種子液培養(yǎng)基

lb培養(yǎng)基：酵母粉5g/l，nacl10g/l，蛋白胨10g/l，接種時(shí)補(bǔ)加卡那霉素50μg/ml，氯霉素50μg/ml。

m9培養(yǎng)基：nh4cl1.0g/l，na2hpo4·12h2o15.2g/l，kh2po43.0g/l，nacl0.5g/l，葡萄糖20g/l，mgso4·7h2o0.4g/l，1000×微量元素((nh4)6mo7o24·4h2o3.7g/l；znso4·7h2o2.9g/l；h3bo324.7g/l；cuso4·5h2o2.5g/l；mncl2·4h2o15.8g/l)，接種時(shí)補(bǔ)加卡那霉素50μg/ml，氯霉素50μg/ml。

2)發(fā)酵培養(yǎng)基

k2hpo4·3h2o9.8g/l，citricacid·h2o2.1g/l，檸檬酸鐵銨0.3g/l，(nh4)2so43.0g/l，葡萄糖20g/l，mgso4·7h2o0.4g/l，1000×微量元素((nh4)6mo7o24·4h2o3.7g/l；znso4·7h2o2.9g/l；h3bo324.7g/l；cuso4·5h2o2.5g/l；mncl2·4h2o15.8g/l)，卡那霉素50μg/ml，氯霉素50μg/ml。

其中：k2hpo4·3h2o9.8g/l，citricacid·h2o2.1g/l，檸檬酸鐵銨0.3g/l，(nh4)2so43.0g/l混合后調(diào)至ph7.0，121℃，20min高壓蒸氣滅菌。葡萄糖儲(chǔ)液為500g/l，115℃，20min單獨(dú)滅菌，mgso4·7h2o儲(chǔ)液為200g/l，121℃，20min單獨(dú)滅菌，1000×微量元素采用0.22μm濾菌膜過(guò)濾除菌，轉(zhuǎn)接種子液時(shí)分別補(bǔ)加上述單獨(dú)除菌的葡萄糖、mgso4·7h2o、1000×微量元素儲(chǔ)液及抗生素。

實(shí)施例1

構(gòu)建分子伴侶蛋白(groesl)的表達(dá)載體，具體過(guò)程如下：

以寡核苷酸5’-gaagatctgggttgatgtccgattgcgcccaaa-3’和5’-ggaattcttacatcatgccgcccatgccacccat-3’為引物，以大腸桿菌k-12[escherichiacolik-12]基因組dna為模版，采用大腸桿菌groesl基因自身的操縱調(diào)控原件，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法擴(kuò)增出groesl基因，并在5’端和3’端分別引入bglii和ecori位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到pet28a(+)(novagen)載體上，得到重組質(zhì)粒pet-groesl。

構(gòu)建聚烯酮酐合成酶(phld)、多重抗性因子(mara)和乙酰輔酶a羧化酶(accase)共表達(dá)的載體，具體過(guò)程如下：

以寡核苷酸5’-ataagaatgcggccgctcgatctcgatcccgcgaaat-3’和5’-atcgcttaagctagctgttgtaatgatttaatggatg-3’為引物，以原有質(zhì)粒pet-phld/mara為模版，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法擴(kuò)增出聚烯酮酐合成酶基因(phld)和多重抗性基因基因(mara)，并在5’端和3’端分別引入noti和aflii位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到原有質(zhì)粒pacyc-accadbc上，得到重組質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc。

pcr反應(yīng)體系：

pcr擴(kuò)增程序：

酶切體系：

酶切程序：37℃，60min。

按照takara感受態(tài)制備試劑盒的操作步驟制備e.colibl21(de3)的感受態(tài)細(xì)胞，將兩種重組質(zhì)粒pet-groesl和pacyc-phld/mara/accadbc通過(guò)熱激法共同轉(zhuǎn)化至上述制備的感受態(tài)細(xì)胞；將質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入上述制備的感受態(tài)細(xì)胞，形成對(duì)照菌株。

實(shí)施例2

構(gòu)建分子伴侶蛋白(groesl)的表達(dá)載體，具體過(guò)程如下：

以寡核苷酸5’-catgccatgggcaatattcgtccattgcatgatcgcgt-3’和5’-ggaattcttacatcatgccgcccatgccacccat-3’為引物，以大腸桿菌k-12[escherichiacolik-12]基因組dna為模版，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法擴(kuò)增出groesl基因，并在5’端和3’端分別引入bglii和ecori位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到pet28a(+)(novagen)載體上，得到重組質(zhì)粒pet-t7-groesl。

構(gòu)建聚烯酮酐合成酶(phld)、多重抗性因子(mara)和乙酰輔酶a羧化酶(accase)共表達(dá)的載體，具體過(guò)程如下：

以寡核苷酸5’-ataagaatgcggccgctcgatctcgatcccgcgaaat-3’和5’-atcgcttaagctagctgttgtaatgatttaatggatg-3’為引物，以原有質(zhì)粒pet-phld/mara為模版，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)方法擴(kuò)增出聚烯酮酐合成酶基因(phld)和多重抗性基因基因(mara)，并在5’端和3’端分別引入noti和aflii位點(diǎn)，然后用上述酶切位點(diǎn)將此基因克隆到原有質(zhì)粒pacyc-accadbc上，得到重組質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc。pcr和酶切的體系與程序同實(shí)施例1。

按照takara感受態(tài)制備試劑盒的操作步驟制備e.colibl21(de3)的感受態(tài)細(xì)胞，將兩種重組質(zhì)粒pet-t7-groesl和pacyc-phld/mara/accadbc通過(guò)熱激法共同轉(zhuǎn)化至上述制備的感受態(tài)細(xì)胞；將質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入上述制備的感受態(tài)細(xì)胞，形成對(duì)照菌株。

實(shí)施例3

用構(gòu)建好的工程大腸桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚，其步驟如下：

1、搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1)一級(jí)種子液的培養(yǎng)：在lb種子液培養(yǎng)基中接種固體lb平板上的實(shí)施例1制備得到的重組菌株單菌落，并加入終濃度為50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素，37℃生長(zhǎng)8-12h；在lb種子液培養(yǎng)基中接種固體lb平板上的實(shí)施例1制備得到對(duì)照菌株單菌落，加入終濃度34μg/ml氯霉素，37℃生長(zhǎng)8-12h。

2)將步驟1)得到的一級(jí)種子液分別按1％(wt)接種量轉(zhuǎn)接至250ml發(fā)酵搖瓶中，含50ml發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接種子液時(shí)各補(bǔ)加200g/l的mgso4.7h2o100μl、500g/l葡萄糖2ml、1000×微量元素50μl、終濃度50μg/ml卡那霉素(對(duì)照菌株不加卡那霉素)、終濃度50μg/ml氯霉素，每種菌株設(shè)定3個(gè)平行對(duì)照，37℃、180rpm培養(yǎng)。

3)細(xì)胞od600達(dá)到0.6-1.0間加入終濃度100μmol/l的iptg誘導(dǎo)。

4)iptg誘導(dǎo)后，37℃、180rpm繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集菌液，離心取上清，測(cè)定間苯三酚含量。

2、分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1)一級(jí)種子液的培養(yǎng)：重復(fù)上述步驟1、1)。

2)二級(jí)種子液的培養(yǎng)，將步驟1)得到的一級(jí)種子液分別按3％(wt)接種量轉(zhuǎn)接至250ml三角瓶中，含50mlm9培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接種子液時(shí)各補(bǔ)加200g/lmgso4.7h2o100μl、500g/l葡萄糖2ml、1000×微量元素50μl、終濃度50μg/ml卡那霉素、終濃度50μg/ml氯霉素，37℃、180rpm培養(yǎng)8-12h。

3)將步驟2)得到的二級(jí)種子液分別按1％(wt)接種量轉(zhuǎn)接至5l發(fā)酵罐中，含2l發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)溫度37℃、攪拌速度300-800rpm、ph6.5-7.5和溶氧18％以上的條件下培養(yǎng)至od600約為12，加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度100μmol/l，50％-80％葡萄糖儲(chǔ)液繼續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵24小時(shí)，離心取上清，測(cè)定間苯三酚含量。

3、間苯三酚的含量檢測(cè)

間苯三酚(pg)濃度測(cè)定：肉桂醛顯色法。

采用反weisner檢測(cè)法(wenjuanzha,sherylb.rubin-pitel,huiminzhao.exploitinggeneticdiversitybydirectedevolution:molecularbreedingoftypeiiipolyketidesynthasesimprovesproductivity[j].molecularbiosystems,2008,4(3):246-248.)測(cè)定發(fā)酵液中間苯三酚的含量，其原理是根據(jù)間苯三酚與肉桂醛的顯色反應(yīng)，具體步驟如下：

1)配制10mg/l的肉桂醛顯色液(肉桂醛直接溶解于體積比1:3的濃鹽酸/乙醇溶液中)。

2)向1.5ml離心管中加入1ml肉桂醛顯色液，再加入5μl發(fā)酵液上清，顛倒混勻，室溫放置15min。

3)用10mm光徑比色杯讀取od446值，od446值在2h內(nèi)穩(wěn)定；

4)繪制間苯三酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算間苯三酚含量。

根據(jù)本實(shí)施例操作步驟，搖瓶水平，含有單質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc的對(duì)照菌株pg產(chǎn)量為0.70g/l，含有兩種重組質(zhì)粒pet-groesl和pacyc-phld/mara/accadbc的菌株產(chǎn)量為1.12g/l；在分批補(bǔ)料發(fā)酵罐水平，單質(zhì)粒對(duì)照菌株的pg產(chǎn)量為3.90g/l，雙質(zhì)粒菌株的產(chǎn)量為5.91g/l。在發(fā)酵罐的相同發(fā)酵條件下，含有兩種重組質(zhì)粒pet-groesl和pacyc-phld/mara/accadbc的菌株比單質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc的對(duì)照菌株間苯三酚濃度提高了約51％。

實(shí)施例4

用構(gòu)建好的工程大腸桿菌菌株發(fā)酵生產(chǎn)間苯三酚，其步驟如下：

1、搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1)一級(jí)種子液的培養(yǎng)：在lb種子液培養(yǎng)基中接種固體lb平板上的實(shí)施例2制備得到的重組單菌落，并加入終濃度50μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素，37℃生長(zhǎng)8-12h；在lb種子液培養(yǎng)基中接種固體lb平板上的實(shí)施例2制備的對(duì)照菌株單菌落，加入終濃度34μg/ml氯霉素，37℃生長(zhǎng)8-12h。

2)將步驟1)得到的一級(jí)種子液按1％(wt)接種量轉(zhuǎn)接至250ml發(fā)酵搖瓶中，含50ml發(fā)酵培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接種子液時(shí)各補(bǔ)加200g/lmgso4.7h2o100μl、500g/l葡萄糖2ml、1000×微量元素50μl、終濃度50μg/ml卡那霉素(對(duì)照菌株不加卡那霉素)、終濃度50μg/ml氯霉素，每種菌株設(shè)定3個(gè)平行對(duì)照，37℃、180rpm培養(yǎng)。

3)細(xì)胞od600達(dá)到0.6-1.0間加入終濃度100μmol/l的iptg誘導(dǎo)。

4)iptg誘導(dǎo)后，37℃、180rpm繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集菌液，離心取上清，測(cè)定間苯三酚含量。

2、分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

1)一級(jí)種子液的培養(yǎng)：重復(fù)上述步驟1、1)。

2)二級(jí)種子液的培養(yǎng)：將步驟1)得到的一級(jí)種子液按3％(wt)接種量轉(zhuǎn)接至250ml三角瓶中，含50mlm9培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接種子液時(shí)各補(bǔ)加200g/lmgso4.7h2o100μl、500g/l葡萄糖2ml、1000×微量元素50μl、終濃度50μg/ml的卡那霉素、終濃度50μg/ml的氯霉素，37℃、180rpm培養(yǎng)8-12h。

3)將步驟2)得到的二級(jí)種子液按1％(wt)接種量轉(zhuǎn)接至5l發(fā)酵罐中，含2l發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)溫度37℃、攪拌速度300-800rpm、ph6.5-7.5和溶氧18％以上的條件下培養(yǎng)至od600約為12，加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度100μmol/l，50％-80％葡萄糖儲(chǔ)液繼續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵24小時(shí)，離心取上清，測(cè)定間苯三酚含量。

3、間苯三酚的含量檢測(cè)

間苯三酚的含量測(cè)定同實(shí)施例3.3

根據(jù)本實(shí)施例操作步驟，搖瓶水平，含有單質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc的對(duì)照菌株pg產(chǎn)量為0.70g/l，含有兩種重組質(zhì)粒pet-t7-groesl和pacyc-phld/mara/accadbc的菌株產(chǎn)量為0.93g/l；在分批補(bǔ)料發(fā)酵罐水平，單質(zhì)粒對(duì)照菌株的pg產(chǎn)量為3.90g/l，雙質(zhì)粒菌株的產(chǎn)量為4.97g/l。在發(fā)酵罐的相同發(fā)酵條件下，含有兩種重組質(zhì)粒pet-t7-groesl和pacyc-phld/mara/accadbc的菌株比單質(zhì)粒pacyc-phld/mara/accadbc的對(duì)照菌株間苯三酚濃度可提高了約27％。

本實(shí)施例所列數(shù)據(jù)為多次重復(fù)試驗(yàn)的平均數(shù)值。

雖然本發(fā)明已經(jīng)公開了示例性示范方案，但是本領(lǐng)域人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。