本申請是申請日為2011年3月24日、申請?zhí)枮?01180015330.2的中國發(fā)明申請“特異性結(jié)合免疫球蛋白的蛋白質(zhì)以及免疫球蛋白結(jié)合性親和配體”的分案申請。

本發(fā)明涉及與抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，以及以該蛋白質(zhì)作為免疫球蛋白結(jié)合性親和配體的親和分離基質(zhì)，以及使用所述基質(zhì)對抗體進行分離純化或吸附去除的方法。

背景技術(shù)：

抗體具有與被稱為抗原的物質(zhì)進行特異性結(jié)合的功能，以及協(xié)同其他的生物分子或細胞，將具有抗原的因子脫毒、去除的功能。所謂“抗體”這個名稱，是強調(diào)這種與抗原結(jié)合的功能的名稱，這類物質(zhì)也被稱為“免疫球蛋白(ig)”。

近年來，伴隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程和細胞工程的發(fā)展，被稱為抗體藥物的利用抗體所具有的功能的藥物開發(fā)盛行。由于與傳統(tǒng)藥物相比，抗體藥物更加特異性地作用于靶分子，因此預(yù)期其可以使副作用減輕并且獲得高療效，實際上有助于改善各種疾病。

另一方面，因為抗體藥物是向生物體內(nèi)大量施用的，因此與其他的重組蛋白質(zhì)藥品相比的情況下，抗體藥物的純度對品質(zhì)產(chǎn)生更大的影響。由此，為了制造高純度的抗體，親和層析等方法被普遍使用，親和層析利用特異性結(jié)合抗體的分子作為配體的吸附材料。

作為抗體藥物得到開發(fā)的基本上是單克隆抗體，使用重組的細胞培養(yǎng)技術(shù)等進行大量生產(chǎn)。“單克隆抗體”是指從來源于單一抗體生產(chǎn)細胞的克隆所獲得的抗體。現(xiàn)在上市的抗體藥物，基本上在分子結(jié)構(gòu)上都是免疫球蛋白g(igg)亞類。作為與igg抗體具有親和性的免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)，普遍已知的是蛋白質(zhì)a。蛋白質(zhì)a是由革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)生產(chǎn)的細胞壁蛋白質(zhì)的1種，由信號序列s、5個免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(e結(jié)構(gòu)域、d結(jié)構(gòu)域、a結(jié)構(gòu)域、b結(jié)構(gòu)域、c結(jié)構(gòu)域)以及細胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域即xm結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(非專利文獻1)。在抗體藥物制造步驟的早期純化步驟(捕獲步驟)中，將蛋白質(zhì)a作為配體固定在水不溶性擔(dān)載體上的親和層析用柱(下文稱為蛋白質(zhì)a柱)被普遍使用(非專利文獻1、非專利文獻2、非專利文獻3)。

為了改善蛋白質(zhì)a柱的性能，進行了種種技術(shù)開發(fā)。從配體方面出發(fā)的技術(shù)研發(fā)也在進行中。最初使用野生型蛋白質(zhì)a作為配體，但以加入蛋白質(zhì)工程修飾的重組蛋白質(zhì)a作為配體而對于柱子性能進行改善的技術(shù)也日益增多。

作為典型的重組蛋白質(zhì)a，可列舉沒有免疫球蛋白結(jié)合活性的、去除了xm區(qū)域的重組蛋白質(zhì)a(rproteinasepharose(注冊商標(biāo))，gehealthcarejapan公司生產(chǎn))。以去除了xm區(qū)域的重組蛋白質(zhì)a作為配體的柱子，具有抑制傳統(tǒng)制品中的蛋白質(zhì)的非特異性吸附的優(yōu)點，現(xiàn)在在產(chǎn)業(yè)上普遍使用。

此外，還有以向蛋白質(zhì)a中導(dǎo)入1個cys突變的重組蛋白質(zhì)a(專利文獻1)，或者導(dǎo)入多個lys突變的重組蛋白質(zhì)a(專利文獻2)作為配體使用的發(fā)明。這些技術(shù)表現(xiàn)出固定在水不溶性擔(dān)載體上的效果，具有降低抗體與柱子的結(jié)合容量和減少固定化配體泄露的優(yōu)點。

作為進行了修飾的重組蛋白質(zhì)a，普遍已知利用在b結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)入突變的修飾結(jié)構(gòu)域(被稱為z結(jié)構(gòu)域)作為配體的技術(shù)(非專利文獻1、非專利文獻4、專利文獻3)。z結(jié)構(gòu)域相對于b結(jié)構(gòu)域，是導(dǎo)入了將第29位的gly取代為ala的突變的修飾結(jié)構(gòu)域。并且，在z結(jié)構(gòu)域中，可以同時導(dǎo)入val取代b結(jié)構(gòu)域的第1位的ala的取代突變，這是以方便基因工程制造復(fù)數(shù)個結(jié)構(gòu)域連接而成的編碼基因為目的的突變，對結(jié)構(gòu)域的功能幾乎沒有影響(例如，在專利文獻4中，實施例使用了ala取代了z結(jié)構(gòu)域的第1位的val的變體)。

已知z結(jié)構(gòu)域比b結(jié)構(gòu)域的耐堿性更高，具有使用殺菌、洗滌效果好的堿溶液洗滌后可對柱子重復(fù)利用的優(yōu)點。以z結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)，發(fā)明了用其他氨基酸取代asn，產(chǎn)生更高的耐堿性的配體(專利文獻5、專利文獻6)，也開始用于產(chǎn)業(yè)。

由此可見，對于蛋白質(zhì)a的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域)，導(dǎo)入將第29位的gly取代為ala的突變的有效性是普遍已知的。實際上，自1987年公開該“g29a”的突變以來，在后研發(fā)的涉及修飾蛋白質(zhì)a的現(xiàn)有技術(shù)中，也導(dǎo)入了該“g29a”的突變(專利文獻2、專利文獻4、專利文獻6)。

作為z結(jié)構(gòu)域的另一個特征，可列舉與免疫球蛋白的fab區(qū)域結(jié)合力變?nèi)?非專利文獻5)。由于該特征，在用酸來解離結(jié)合的抗體的步驟中，具有易于解離抗體的優(yōu)點(非專利文獻1、專利文獻7)。抗體易于解離，是可以用更少體積的洗脫液回收含有更高濃度抗體的洗脫液。近年來，在抗體藥物制造中，每一批次的細胞培養(yǎng)液量超過10,000升，近幾年抗體表達水平提高到了10g/l(非專利文獻6)。下游的純化步驟必須達到與該處理規(guī)模擴大對應(yīng)，對以少量洗脫液回收含有更高濃度抗體的洗脫液的技術(shù)改進具有極大期望。

除z結(jié)構(gòu)域以外，作為修飾蛋白質(zhì)a·配體，以蛋白質(zhì)a的c結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)的研究不斷深入(專利文獻4)。這類配體的特征是產(chǎn)生了野生型c結(jié)構(gòu)域本來具有的高耐堿性，代替基于b結(jié)構(gòu)域制造而成的z結(jié)構(gòu)域，作為新的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)域受到關(guān)注。但是，對于c結(jié)構(gòu)域的檢驗結(jié)果證實，在使用酸將與c結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體進行解離的步驟中，存在抗體難以解離的缺點。在非專利文獻2和專利文獻4中，c結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出與免疫球蛋白的fab區(qū)域的強結(jié)合力，推測該特征是難以用酸解離抗體的原因。為了改善這一缺點，使用導(dǎo)入了第29位的gly被ala取代的突變的c結(jié)構(gòu)域，在檢驗抗體酸解離特性時，相比野生型c結(jié)構(gòu)域，可見抗體有變得易于解離的傾向，但仍不充分。

由此可見，現(xiàn)在公知的使抗體變得易于從蛋白質(zhì)a的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域上解離的突變只有“g29a”。如前所述，“g29a”除了易于解離抗體這一點以外還有優(yōu)點，預(yù)期通過第29位以外的突變技術(shù)來改善。但是，尚未報道除第29位以外的突變，能夠使抗體更易于解離。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1：美國專利第6399750號公報

專利文獻2：日本特開2007-252368號公報

專利文獻3：美國專利第5143844號公報

專利文獻4：日本特開2006-304633號公報

專利文獻5：歐州專利第1123389號公報

專利文獻6：國際公開第03/080655號公報

專利文獻7：美國公開第2006/0194950號公報

非專利文獻

非專利文獻1：hobers.等人，“j.chromatogr.b”2007年，第848卷，第40～47頁

非專利文獻2：lowd.等人，“l(fā).chromatogr.b”2007年，第848卷，第48～63頁

非專利文獻3：roquea.c.a.等人“j.chromatogr.a”2007年，第1160卷，第44～55頁

非專利文獻4：nilssonb.等人“proteinengineering”1987年，第1卷，第107～113頁

非專利文獻5：janssonb.等人“femsimmunologyandmedicalmedicalmicrobiology”1998年，第20卷，第69～78頁

非專利文獻6：稻川淳一等人“分離技術(shù)(分離技術(shù))”2008年，第38卷，第201～207頁

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明要解決的問題是：通過向第29位以外的氨基酸導(dǎo)入突變，產(chǎn)生了具有比現(xiàn)有的修飾型蛋白質(zhì)a配體具有更好的抗體酸解離特性的新型修飾蛋白質(zhì)a配體。

解決問題的方法

本發(fā)明人對在第29位以外的位置具有氨基酸取代突變的大量重組蛋白質(zhì)a變體進行了分子設(shè)計，使用蛋白質(zhì)工程的方法和基因工程的方法，通過轉(zhuǎn)化細胞獲得了所述突變體，通過比較檢驗所述突變體的活性，完成了本發(fā)明。

換言之，本發(fā)明涉及對免疫球蛋白具有親和性的蛋白質(zhì)，其中：

該蛋白質(zhì)是具有下述氨基酸序列：在來源于選自序列號1～5所記載的蛋白質(zhì)a的e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域中的至少一個結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中，將至少1個氨基酸取代突變導(dǎo)入至a、b和c結(jié)構(gòu)域的第31～37位的氨基酸殘基、e結(jié)構(gòu)域的第29～35位的氨基酸殘基、或d結(jié)構(gòu)域的第34～40位的氨基酸殘基中而得到的氨基酸序列，并且，與導(dǎo)入突變前的蛋白質(zhì)相比，該蛋白質(zhì)與免疫球蛋白的fab區(qū)域的親和性降低。

優(yōu)選導(dǎo)入突變前的來源于結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是：

序列號1～5所記載的蛋白質(zhì)a的e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，或

序列號6～10所記載的來源于蛋白質(zhì)a的e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。

優(yōu)選導(dǎo)入突變前的來源于結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是：

序列號5所記載的蛋白質(zhì)a的c結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，

或序列號10所記載的來源于蛋白質(zhì)a的c結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。

優(yōu)選在導(dǎo)入突變前的氨基酸殘基中，

各結(jié)構(gòu)域中的對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第33位的氨基酸殘基是ser，

各結(jié)構(gòu)域中的對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第35位的氨基酸殘基是lys，

各結(jié)構(gòu)域中的對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第36位的氨基酸殘基是asp，或

各結(jié)構(gòu)域中的對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第37位的氨基酸殘基是asp。

優(yōu)選所導(dǎo)入的氨基酸取代突變是：

將對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第33位的ser取代為glu、leu或thr的突變，

將對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第35位的lys取代為arg的突變，

將對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第36位的asp取代為arg或ile的突變，或

將對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第37位的asp取代為glu的突變。

優(yōu)選所導(dǎo)入的氨基酸取代突變是將對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第33位的ser取代為glu的突變。

此外，本發(fā)明涉及將2個以上的上述蛋白質(zhì)相互連接而得到的由多個結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選相互連接的蛋白質(zhì)是不同種類的蛋白質(zhì)，相互連接的蛋白質(zhì)的個數(shù)為2～5個。

此外，本發(fā)明涉及編碼前述蛋白質(zhì)的dna。

優(yōu)選在上述dna中，構(gòu)成相互連接的結(jié)構(gòu)域的堿基序列的序列同一性在90％以下。

此外，本發(fā)明涉及包含上述dna的載體。

此外，本發(fā)明涉及用上述載體對宿主進行轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體。

在上述轉(zhuǎn)化體中，宿主優(yōu)選是革蘭氏陽性菌。

優(yōu)選革蘭氏陽性菌是短芽孢桿菌屬(brevibacillus)細菌，優(yōu)選短芽孢桿菌屬細菌是橋石短芽孢桿菌(brevibacilluschoshinensis)。

此外，本發(fā)明涉及采用上述轉(zhuǎn)化體，或者采用使用了上述dna的無細胞蛋白質(zhì)合成體系制造制造上述蛋白質(zhì)的方法。

在上述制造方法中，優(yōu)選將蛋白質(zhì)積蓄在轉(zhuǎn)化體的細胞內(nèi)和/或周質(zhì)區(qū)域中，和/或?qū)⒌鞍踪|(zhì)分泌到轉(zhuǎn)化體的細胞外。

此外，本發(fā)明涉及親和分離基質(zhì)，其是以上述蛋白質(zhì)作為親和配體固定于由水不溶性基體材料構(gòu)成的擔(dān)載體而得到。

優(yōu)選水不溶性基體材料包括合成高分子或多糖類，優(yōu)選多糖類是纖維素。

上述親和分離基質(zhì)，優(yōu)選與含有免疫球蛋白的fc區(qū)域的蛋白質(zhì)結(jié)合，更優(yōu)選與免疫球蛋白g或免疫球蛋白g的衍生物結(jié)合。

此外，本發(fā)明涉及上述親和分離基質(zhì)的用途，其用于分離含有免疫球蛋白的fc區(qū)域的蛋白質(zhì)。分離含有免疫球蛋白的fc區(qū)域的蛋白質(zhì)，優(yōu)選其目的在于分離回收只含有免疫球蛋白的fab區(qū)域的蛋白質(zhì)。

發(fā)明的效果

本發(fā)明的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出優(yōu)異的抗體酸解離特性。通過使用將所述蛋白質(zhì)固定在載體上的親和分離基質(zhì)，可以改善抗體的分離純化。本發(fā)明的蛋白質(zhì)由于在所有結(jié)構(gòu)域中都保守的氨基酸位置上導(dǎo)入了突變，因此不論在使用e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域中的任何結(jié)構(gòu)域的情況下，本發(fā)明的蛋白質(zhì)以及親和分離基質(zhì)都具有上述共同的效果。

附圖說明

圖1是葡萄球菌屬(staphylococcus)的蛋白質(zhì)a的e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域的序列比對表。

圖2是本發(fā)明的實施例10和比較例3中涉及的biacore測定中的，與各種gst融合c結(jié)構(gòu)域突變體的單克隆igg-fab(vh3型)的結(jié)合傳感圖。

圖3是本發(fā)明的實施例12中涉及的，關(guān)于相對于親和分離基質(zhì)(4)抗體的5％dbc的圖。

圖4是本發(fā)明的實施例13和比較例1中涉及的，顯示了使用親和分離基質(zhì)(1)的抗體純化層析的洗脫峰譜的圖。

圖5是本發(fā)明的實施例13和比較例2中涉及的，顯示了使用親和分離基質(zhì)(2)的抗體純化層析的洗脫峰譜的圖。

圖6是本發(fā)明的實施例13和比較例1中涉及的，顯示了使用親和分離基質(zhì)(3)的抗體純化層析的洗脫峰譜的圖。

圖7是本發(fā)明的實施例13涉及的，顯示了使用親和分離基質(zhì)(4)的抗體純化層析的洗脫峰譜的圖。

具體實施方式

本發(fā)明的蛋白質(zhì)，是對免疫球蛋白具有親和性的蛋白質(zhì)，其中，該蛋白質(zhì)是具有如下氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且，與具有導(dǎo)入突變前的氨基酸序列的蛋白質(zhì)相比，該蛋白質(zhì)與免疫球蛋白的fab區(qū)域的親和性降低；所述氨基酸序列是在來源于選自序列號1～5所記載的蛋白質(zhì)a的e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域中的至少一個結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中，

將至少1個氨基酸取代突變導(dǎo)入至a、b和c結(jié)構(gòu)域的第31～37位的氨基酸殘基、e結(jié)構(gòu)域的第29～35位的氨基酸殘基、或d結(jié)構(gòu)域的第34～40位的氨基酸殘基中而得到的氨基酸序列。

蛋白質(zhì)a是由5個免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)相互連接而構(gòu)成的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)a的e、d、a、b或c結(jié)構(gòu)域是能夠與免疫球蛋白的互補決定區(qū)(cdr)之外的區(qū)域結(jié)合的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，任一個結(jié)構(gòu)域都具有分別與免疫球蛋白的各個區(qū)域結(jié)合的活性，所述各個區(qū)域是免疫球蛋白的fc區(qū)域、fab區(qū)域以及fab中特別是fv區(qū)域。此外，本發(fā)明中對蛋白質(zhì)a的來源也沒有特殊的限定，優(yōu)選是來自葡萄球菌屬(staphylococcus)的蛋白質(zhì)a。

被稱為“蛋白質(zhì)”的術(shù)語包含了具有多肽結(jié)構(gòu)的所有分子，片段化的或者通過肽鍵連接的多肽鏈也都包含在被稱為“蛋白質(zhì)”的術(shù)語中。此外，所謂“結(jié)構(gòu)域”是蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)單位，由數(shù)十至數(shù)百個氨基酸殘基序列構(gòu)成，足以顯現(xiàn)出某種物理化學(xué)或生物化學(xué)上的功能的蛋白質(zhì)單位。

來源于結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列是指導(dǎo)入突變前的氨基酸序列，不僅限于蛋白質(zhì)a的e、d、a、b及c結(jié)構(gòu)域中任何的野生型氨基酸序列，即使有通過氨基酸的取代、插入、缺失或化學(xué)修飾而部分被改變的氨基酸序列，只要其是具有與fc區(qū)域的結(jié)合力的蛋白質(zhì)，就包含在所述來源于結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中。來源于結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，例如可列舉構(gòu)成序列號1～5中記載的葡萄球菌屬蛋白質(zhì)a的e、d、a、b或c結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，以及構(gòu)成序列號6～10記載的蛋白質(zhì)a的e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。此外，由序列號6～10記載的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)是如下蛋白質(zhì)：該蛋白質(zhì)是由相對于蛋白質(zhì)a的e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域(序列號1～5)、向?qū)?yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第29位導(dǎo)入了將gly取代為ala的突變的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)。此外，由于在b結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)入了被稱為a1v和g29a的突變的z結(jié)構(gòu)域也具有與fc區(qū)域的結(jié)合力，因此也是來源于結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。優(yōu)選例如導(dǎo)入突變前的氨基酸序列是化學(xué)穩(wěn)定性高的結(jié)構(gòu)域或其突變體。

導(dǎo)入氨基酸取代突變的蛋白質(zhì)是與蛋白質(zhì)a的e、d、a、b及c結(jié)構(gòu)域中的任一個的野生型氨基酸具有優(yōu)選85％以上，更優(yōu)選90％以上的氨基酸序列同一性，并具有與fc區(qū)域的結(jié)合力的蛋白質(zhì)。

在所有結(jié)構(gòu)域中都保守的氨基酸殘基是指在比較e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列時，存在于相同位置上的相同的氨基酸殘基。如圖1的序列比對表所示，a、b和c結(jié)構(gòu)域的第26～39位，e結(jié)構(gòu)域的第24～37位，d結(jié)構(gòu)域的第29～42位的氨基酸殘基是在所有結(jié)構(gòu)域中都是保守的。在所有結(jié)構(gòu)域中保守的具體氨基酸殘基是指，例如可列舉a、b和c結(jié)構(gòu)域的第31～37位的氨基酸，e結(jié)構(gòu)域的第29～35位的氨基酸，以及d結(jié)構(gòu)域的第34～40位的氨基酸。優(yōu)選是對于于c結(jié)構(gòu)域的第33位的ser，對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第35位的lys，對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第36位的asp，和對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第37位的asp。特別優(yōu)選對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第33位的ser，但不限于此。此外，“對應(yīng)”是指如圖1所示，將蛋白質(zhì)a的e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域比對時，位于縱列上相同的位置上。

一般而言，氨基酸序列高度保守的區(qū)域大部分是對蛋白質(zhì)功能重要的區(qū)域，一旦在這樣的區(qū)域中導(dǎo)入突變，在很多情況下蛋白質(zhì)的功能會喪失。但是，盡管上述區(qū)域中的氨基酸序列是高度保守的，但導(dǎo)入突變對與免疫球蛋白fc區(qū)域的結(jié)合力沒有太多影響，同時可以極大的降低與免疫球蛋白fab區(qū)域的結(jié)合力。

此外，公知的事實是，在導(dǎo)入突變前的氨基酸序列是化學(xué)穩(wěn)定性高的結(jié)構(gòu)域或其突變體的情況下，由于構(gòu)成結(jié)構(gòu)域的氨基酸是較少的60個氨基酸左右，一旦導(dǎo)入新的突變，很多時候會降低化學(xué)穩(wěn)定性。例如，對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第30位的phe被ala取代的突變體對堿的化學(xué)穩(wěn)定性大幅降低(linhultm等人，proteins:structure,function,andbioinformatics,2004年，第55卷，第407～416頁)。但是，本發(fā)明中的氨基酸突變可以在保持原有的化學(xué)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，發(fā)揮出上述效果。

氨基酸的取代突變是指消除原來的氨基酸，并在相同的位置補充其他的不同種類的氨基酸的突變。所補充的其他氨基酸不受特別的限制，例如可列舉天然的構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸、不構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸、非天然氨基酸。其中，從基因工程生產(chǎn)的觀點看，可以良好地適用天然氨基酸。天然氨基酸可列舉例如ala、phe、val、trp、leu、pro、ile、met、gly、asn、ser、gln、thr、tyr、cys、lys、his、asp、glu和arg，特別優(yōu)選是glu或arg。氨基酸取代突變的個數(shù)沒有特殊的限定，只要包含突變的蛋白質(zhì)對免疫球蛋白fab區(qū)域的親和力降低，但保持與免疫球蛋白整體的親和力即可，基于保持突變導(dǎo)入前的蛋白質(zhì)立體構(gòu)造的觀點來看，優(yōu)選4個以下，更優(yōu)選2個以下。

此外，對于氨基酸取代突變的表述，取代位置的編號之前記載了野生型或非突變型的氨基酸，而在取代位置的編號之后，記載了突變的氨基酸。例如，將29位的gly取代為ala的突變記載為g29a。

在將氨基酸取代突變導(dǎo)入到在上述所有結(jié)構(gòu)域都保守的氨基酸部位中的情況下，作為導(dǎo)入實例可列舉例如與c結(jié)構(gòu)域的第33位相對應(yīng)的ser被glu、leu或thr取代突變，對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第35位的lys被arg取代的突變，對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第36位的asp被arg或ile取代的突變，和對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第37位的asp被glu取代的突變。特別優(yōu)選的是對應(yīng)于c結(jié)構(gòu)域的第33位的ser被glu取代的突變，但不限于此。

導(dǎo)入氨基酸取代突變所獲得的蛋白質(zhì)，是與蛋白質(zhì)a的e、d、a、b和c結(jié)構(gòu)域中的任一個的野生型氨基酸具有優(yōu)選85％以上，更優(yōu)選90％以上的序列同一性，并具有與fc區(qū)域的結(jié)合力的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是只由導(dǎo)入了氨基酸取代突變的單個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)，也可以是由2個以上的上述蛋白質(zhì)連接而成的由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)。

在由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)的情況下，所連接的蛋白質(zhì)可以是來源于同一種結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(同源二聚體、同源三聚體等同源多聚體)，也可以是來源于種類不同的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(異源二聚體、異源三聚體等異源多聚體)。連接的蛋白質(zhì)數(shù)量優(yōu)選是2個以上，進一步優(yōu)選是2～10個，更優(yōu)選是2～5個。

在由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)中，使單體蛋白質(zhì)之間、單個結(jié)構(gòu)域之間連接的方法，可列舉不通過作為接頭的氨基酸殘基連接的方法，或者以一個或多個氨基酸殘基連接的方法，但不限于此。對連接的氨基酸殘基個數(shù)沒有特別的限制。對連接模式和連接個數(shù)沒有特別的限制，只要沒有使單體蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定即可。

此外，上述蛋白質(zhì)或者由上述多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)作為1個組成成分，與功能不同的其他蛋白質(zhì)融合而成的融合蛋白，也包含在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中。作為融合蛋白的實例，可列舉與卵清蛋白、gst(谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶)或mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)融合的蛋白質(zhì)，但不限于此。通過作為與gst、mbp的融合蛋白表達，可以方便的純化蛋白質(zhì)。此外，融合dna適體等核酸、抗生物素等藥物、peg(聚乙二醇)等大分子的情況，只要實現(xiàn)與本發(fā)明相同的效果，就包含在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中。

本發(fā)明還涉及編碼上述蛋白質(zhì)的dna。只要由所述dna構(gòu)成的堿基序列翻譯的氨基酸序列構(gòu)成本發(fā)明的蛋白質(zhì)即可。此類堿基序列可利用普遍使用的公知方法獲得，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(下文簡稱為pcr)法。此外，還可以由公知的化學(xué)合成法合成，或者由dna文庫獲得。所述堿基序列的密碼子可進行簡并密碼子替換，只要在翻譯時編碼相同的氨基酸即可，而不必需與原來的堿基序列相同。

本發(fā)明的dna，相對于編碼野生型或突變型蛋白質(zhì)a的結(jié)構(gòu)域的以往已知的dna，是通過導(dǎo)入位點特異性突變而獲得的。位點特異性的突變導(dǎo)入可以如下所述使用重組dna技術(shù)、pcr方法等進行。

通過重組dna技術(shù)導(dǎo)入突變，例如可以進行盒式突變法，既在編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的基因中，在希望導(dǎo)入突變的目的位點兩側(cè)存在合適的限制性酶識別序列的情況下，用上述限制性酶切開這些限制性酶識別序列部分，去除包含希望導(dǎo)入突變的位置的區(qū)域后，插入通過化學(xué)合成等僅在目的位置導(dǎo)入了突變的dna片段。

此外，通過pcr導(dǎo)入位置特異性突變可如下進行，例如通過以編碼蛋白質(zhì)的雙鏈質(zhì)粒為模板，使用與+或-鏈互補的、含有突變的2種合成寡核苷酸引物進行pcr的雙引物法。

此外，將編碼本發(fā)明的單體蛋白質(zhì)(1個結(jié)構(gòu)域)的dna按期望數(shù)量串聯(lián)連接，來制造編碼由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)的dna。例如，編碼由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)的dna的連接方法可以是在dna序列中導(dǎo)入合適的限制性酶切位點，用dna連接酶將限制性酶片段化了的雙鏈dna連接而成。限制性酶切位點可以是一種，也可以導(dǎo)入多種不同種類的限制性酶切位點?；蛘撸梢栽诰幋a蛋白質(zhì)a的dna(例如，國際公開第wo06/004067號公報)中應(yīng)用上述突變導(dǎo)入法來制造編碼由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)的dna。在本文中，在編碼由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)的dna中，在編碼各個單體蛋白質(zhì)的堿基序列相同的情況下，由于存在引起宿主的同源重組的可能性，因此編碼連接而成的單體蛋白質(zhì)的dna的堿基序列間的序列同一性優(yōu)選90％以下，更優(yōu)選85％以下。

本發(fā)明的載體包含編碼上述蛋白質(zhì)或由多個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的蛋白質(zhì)的堿基序列，以及與所述堿基序列可操作連接的、可在宿主中發(fā)揮功能的啟動子。一般而言，編碼上述蛋白質(zhì)的dna可以通過與載體連接或插入而獲得。

用于插入基因的載體只要是可以在宿主中自主復(fù)制的即可，沒有特別的限定，質(zhì)粒dna或噬菌體dna都可作為載體使用。就用于插入基因的載體而言，例如，在使用大腸桿菌作為宿主的情況下，可列舉pqe系列載體(qiagen公司生產(chǎn))、pet系列載體(merck公司生產(chǎn))和pgex系列載體(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))等載體。在使用短芽孢桿菌屬細菌作為宿主的情況下，可以使用例如作為枯草芽孢桿菌載體而公知的pub110或phy500(日本特開平2-31682號公報)、pny700(日本特開平4-278091號公報)、pnu211r2l5(日本特開平7-170984號公報)、pht210(日本特開平6-133782號公報)，或者，大腸桿菌和短芽孢桿菌屬細菌的穿梭載體即pncmo2(日本特開2002-238569號公報)等。

可以通過用載體轉(zhuǎn)化宿主，獲得轉(zhuǎn)化體。對于宿主，并沒有特別的限制，在可廉價的大量生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)選可恰當(dāng)?shù)氖褂么竽c桿菌、枯草芽孢桿菌、短芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬(streptomyces)、棒桿菌屬(corynebacterium)等細菌(真細菌)。更優(yōu)選的可以是枯草芽孢桿菌、短芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬(streptomyces)、棒桿菌屬(corynebacterium)等革蘭氏陽性菌。進一步優(yōu)選的可以是公知的大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)a的適用例(國際公開第wo06/004067號公報)的短芽孢桿菌屬細菌。

短芽孢桿菌屬細菌雖無限定，但可示例土壤短芽孢桿菌(brevibacillusagri)、波茨坦短芽孢桿菌(b.borstelensis)、短短芽孢桿菌(b.brevis)、中孢短芽孢桿菌(b.centrosporus)、橋石短芽孢桿菌(b.choshinensis)、美麗短芽孢桿菌(b.formosus)、污染短芽孢桿菌(b.invocatus)、側(cè)孢短芽孢桿菌(b.laterosporus)、b.limnophilus、類短短芽孢桿菌(b.parabrevis)、羅伊氏短芽孢桿菌(b.reuszeri)、嗜熱紅短芽孢桿菌(b.thermoruber)。優(yōu)選的可示例短短芽孢桿菌47株(jcm6285)、短短芽孢桿菌47k株(fermbp-2308)、短短芽孢桿菌47-5q株(jcm8970)、橋石短芽孢桿菌hpd31株(fermbp-1087)或橋石短芽孢桿菌hpd31-ok株(fermbp-4573)。以提高產(chǎn)量為目的，可以使用上述短芽孢桿菌屬細菌的蛋白酶缺陷株、高表達株或芽孢形成能力缺失株等突變株(或誘導(dǎo)株)。具體可列舉來源于橋石短芽孢桿菌hpd31的蛋白酶突變株即橋石短芽孢桿菌hpd31-ok(日本特開平6-296485號公報)，或沒有芽孢形成能力的橋石短芽孢桿菌hpd31-sp3(國際公開第wo05/045005號公報)。

向宿主細胞導(dǎo)入載體的方法可列舉例如使用鈣離子的方法、電穿孔法、原生質(zhì)體法、醋酸鋰法、農(nóng)桿菌感染法、基因槍法，或聚乙二醇法等，但不限于此。此外，在宿主中表達所獲得的基因的功能的方法，可列舉在染色體中重組本發(fā)明獲得的基因的方法等。

可通過上述轉(zhuǎn)化體或使用了dna的無細胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)來制造蛋白質(zhì)。

在使用轉(zhuǎn)化體制造蛋白質(zhì)的情況下，可以通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞，使本發(fā)明的蛋白質(zhì)生產(chǎn)積蓄在培養(yǎng)菌體內(nèi)(包含菌體的細胞周質(zhì)區(qū)域內(nèi))或培養(yǎng)液中(細胞外)來制造，并從所述培養(yǎng)物中收集所需的蛋白質(zhì)。

在使用轉(zhuǎn)化細胞制造蛋白質(zhì)的情況下，蛋白質(zhì)可以積蓄在轉(zhuǎn)化體的細胞內(nèi)和/或細胞周質(zhì)區(qū)域內(nèi)。在此情況下，如果積蓄在細胞內(nèi)，則具有可以防止表達的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，也不與培養(yǎng)基組分發(fā)生副反應(yīng)的優(yōu)點，積蓄在周質(zhì)區(qū)域內(nèi)時，優(yōu)點是可以抑制細胞內(nèi)蛋白酶引起的分解。另一方面，在制造蛋白質(zhì)的情況下，蛋白質(zhì)可以分泌到轉(zhuǎn)化體的細胞外。在此情況下，就不需要菌體破碎、提取工藝，優(yōu)點是降低了生產(chǎn)成本。

在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細胞的方法，通過用于宿主培養(yǎng)的常用方法進行。用于培養(yǎng)所獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基并無特殊限制，只要能夠高效、高產(chǎn)量的生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)即可。具體而言，可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、聚胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸等作為碳源或氮源。此外，必要時相應(yīng)添加鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽、鋅鹽、鐵鹽等無機鹽類。在使用營養(yǎng)缺陷型的宿主細胞的情況下，可添加生長繁殖必需的營養(yǎng)物。此外，必要時也可以添加青霉素、紅霉素、氯霉素、新霉素等抗生素。

進一步的，為了抑制位于菌體內(nèi)外的來源于宿主的蛋白酶導(dǎo)致該目標(biāo)蛋白質(zhì)的分解和小分子化，可以添加適當(dāng)濃度的各種公知的蛋白酶抑制劑，即，苯甲基磺酰氟(pmsf)、苯甲脒、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟(aebsf)、抗蛋白酶(antipain)、糜蛋白酶抑素、亮抑蛋白酶肽、胃酶抑素a、膦酰二肽(phosphoramidon)、抑肽酶(aprotinin)、乙二胺四乙酸(edta)，和/或其他市售的蛋白酶抑制劑。

進一步的，為了正確的折疊本發(fā)明的蛋白質(zhì)，可以利用例如groel/es、hsp70/dnak、hsp90、hsp104/clpb等分子伴侶。在此情況下，分子伴侶可以通過例如共表達或融合蛋白化等方法與本發(fā)明的蛋白質(zhì)共存。在以蛋白質(zhì)的正確折疊為目的的情況下，雖然也存在向培養(yǎng)基中添加促進正確折疊的添加劑，或者在低溫下培養(yǎng)等方法，但不限于此。

培養(yǎng)以大腸桿菌為宿主獲得的轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)基沒有特殊的限定，例如，可列舉lb培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl)或2xyt培養(yǎng)基(1.6％胰蛋白胨，1.0％酵母提取物，0.5％nacl)等。

培養(yǎng)以短芽孢桿菌屬細菌作為宿主獲得的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基沒有特殊的限定，例如，可列舉tm培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.5％肉提取物，0.2％酵母提取物，1％葡萄糖，ph7.0)或2sl培養(yǎng)基(4％蛋白胨，0.5％酵母提取物，2％葡萄糖，ph7.2)等。

此外，通過在15～42℃，優(yōu)選20～37℃的培養(yǎng)溫度下，在通氣攪拌的條件下好氧培養(yǎng)數(shù)小時至數(shù)天，使本發(fā)明的蛋白質(zhì)積蓄在培養(yǎng)細胞內(nèi)(包含菌體的細胞周質(zhì)區(qū)域內(nèi))或培養(yǎng)液(細胞外)中并回收。根據(jù)具體情況，也可以切斷通氣進行厭氧培養(yǎng)。

在分泌生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的情況下，可以在培養(yǎng)結(jié)束后，通過離心分離、過濾等普通的分離方法，將培養(yǎng)細胞和含有分泌生產(chǎn)的蛋白質(zhì)的上清液分離，回收所生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)。

此外。在積蓄在培養(yǎng)細胞內(nèi)(包含周質(zhì)空間區(qū)域內(nèi))的情況下，可以通過例如從培養(yǎng)液離心分離、過濾等方法收集菌體，然后，通過超聲破碎、法式壓濾法等將所述菌體破碎和/或通過添加表面活性劑等使其溶解，回收細胞內(nèi)積蓄生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。

在通過無細胞蛋白質(zhì)合成體系制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)的情況下，所述無細胞蛋白質(zhì)合成體系并無特殊限制，例如，可以使用原核細胞來源的、植物細胞來源的、高等動物細胞來源的合成體系等。

可以通過親和層析、陽離子或陰離子交換層析、凝膠過濾層析等單獨或恰當(dāng)?shù)慕M合，進行本發(fā)明的蛋白質(zhì)的提純。

確認所獲得的純化物質(zhì)是否是目標(biāo)蛋白質(zhì)，一般可以進行的方法是例如sds聚丙烯酰胺凝膠電泳、n末端氨基酸序列分析、western印跡等。

通過將上述方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)作為親和配體固定在由水不溶性基體材料組成的擔(dān)載體上，可以制造親和分離基質(zhì)。在此，“親和配體”是指以抗原和抗體的結(jié)合為代表，基于特異性的分子間親和力，從某些分子的集合中選擇性地捕獲(結(jié)合)目標(biāo)分子的物質(zhì)(官能團)的術(shù)語，在本發(fā)明中，指特異性結(jié)合免疫球蛋白的蛋白質(zhì)。在本說明書中，在只記載“配體”的情況下，與“親和配體”是同義的。

在本發(fā)明中使用的由水不溶性基體材料組成的擔(dān)載體可以列舉玻璃珠、硅膠等無機擔(dān)載體，交聯(lián)聚乙烯醇、交聯(lián)聚丙烯酸酯、交聯(lián)聚丙烯酰胺、交聯(lián)聚乙烯等合成高分子，或包括結(jié)晶纖維素、交聯(lián)纖維素、交聯(lián)瓊脂糖、交聯(lián)右旋糖酐等多糖的有機擔(dān)載體，此外，由這些組合獲得的有機-有機、有機-無機等復(fù)合載體等。

作為市售商品，可以列舉作為多孔纖維素凝膠的gcl2000、烯丙基右旋糖酐和亞甲基雙丙烯酰胺共價結(jié)合交聯(lián)的sephacryls-1000、作為甲基丙烯酸酯類的擔(dān)載體的toyopearl、作為瓊脂糖類交聯(lián)擔(dān)載體的sepharosecl4b和作為纖維素類交聯(lián)擔(dān)載體的cellufine等。但是，本發(fā)明中的水不溶性擔(dān)載體不限于這些示例的擔(dān)載體。

此外，本發(fā)明中使用的水不溶性擔(dān)載體，從所述親和分離基質(zhì)的使用目的和方法來看，希望是表面積大的，優(yōu)選是具有大量合適大小的細孔的多孔物質(zhì)。擔(dān)載體的形狀可以選擇任意的形狀，珠狀、獨石狀、纖維狀、膜狀(包括中空纖維)等都是可以的。

關(guān)于配體的固定化方法，可以是例如利用配體中存在的氨基、羧基或硫醇基，通過傳統(tǒng)的偶聯(lián)方法與擔(dān)載體結(jié)合。偶聯(lián)方法可列舉使擔(dān)載體與溴化氰、表氯醇、二環(huán)氧甘油醚、對甲苯磺酰氯、三氟代乙烷磺酰氯、肼和高碘酸鈉等反應(yīng)而活化擔(dān)載體(或者在擔(dān)載體表面導(dǎo)入反應(yīng)官能團)，與作為配體的進行固定化的化合物進行偶聯(lián)反應(yīng)的固定化方法，此外，可列舉添加在擔(dān)載體和配體這樣的固定化化合物中存在的類似碳化二亞胺這類的縮合試劑，或者類似戊二醛這類的在分子中具有多個官能團的試劑，通過縮合、交聯(lián)來固定化的方法。

此外，可以在配體和擔(dān)載體之間導(dǎo)入由多個原子構(gòu)成的間隔分子，也可以將配體直接固定在擔(dān)載體上。然而，為了進行固定化，可以對本發(fā)明的蛋白質(zhì)進行化學(xué)修飾，也可以加入對固定化有利的氨基酸殘基。對固定化有利的氨基酸可列舉側(cè)鏈具有對固定化的化學(xué)反應(yīng)有利的官能團的氨基酸，例如可列舉側(cè)鏈含有氨基的lys、側(cè)鏈含有硫醇基的cys。本發(fā)明的實質(zhì)是，只要將在本發(fā)明中賦予蛋白質(zhì)的效果，也同樣賦予給將該蛋白質(zhì)作為配體而固定化的基質(zhì)即可，不論為固定化而進行何種修飾、變化，也都包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

由于親和分離基質(zhì)是通過固定本發(fā)明的蛋白質(zhì)而獲得的，因此基于本發(fā)明蛋白質(zhì)本身的活性，可以結(jié)合包含免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)。由此可見，利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)和親和分離基質(zhì)，可以通過親和柱層析純化方法分離純化包含免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)?！鞍庖咔虻鞍譮c區(qū)域的蛋白質(zhì)”是指包含結(jié)合蛋白質(zhì)a的fc區(qū)域一側(cè)部分的蛋白質(zhì)。但是，只要能夠結(jié)合蛋白質(zhì)a即可，不必是包含完整fc區(qū)域的蛋白質(zhì)。

作為包含免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)，可列舉免疫球蛋白g或免疫球蛋白g衍生物，但不限于此。作為包含免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)的具體實例，可列舉屬于vh3亞家族的igg，特別是屬于vh3亞家族的人igg(單克隆抗體)。優(yōu)選的，本發(fā)明的蛋白質(zhì)和親和分離基質(zhì)與屬于vh3亞家族的igg的fab區(qū)域的親和力與導(dǎo)入突變前的蛋白質(zhì)的親和力相比降低，同時，優(yōu)選是與亞型1、2和4的igg的fc區(qū)域具有親和力的。人的vh生殖細胞基因約一半屬于vh3亞家族，實際上，由屬于vh3亞家族的igg抗體構(gòu)成的藥物正在銷售、開發(fā)中。進一步的，在抗體純化中，雖然屬于vh3亞家族的免疫球蛋白fab片段殘留了對于與作為親和分離基質(zhì)使用的配體的結(jié)合力，但卻對抗體的酸解離特性產(chǎn)生不良影響，上述內(nèi)容由于參考文獻等已成為公知信息(ghoses.等，biotechnologyandbioengineering,2005年，第92卷，第6期)。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)和親和分離基質(zhì)優(yōu)選與屬于vh3亞家族的人igg的fab區(qū)域的結(jié)合力降低。

上述“免疫球蛋白g衍生物”是指能夠結(jié)合蛋白質(zhì)a的修飾型人工蛋白質(zhì)的總稱，例如將人免疫球蛋白g的一部分結(jié)構(gòu)域替換為其他物種的免疫球蛋白g的結(jié)構(gòu)域而融合成的嵌合型免疫球蛋白g，或?qū)⑷嗣庖咔虻鞍譯的cdr(互補決定區(qū))部分替換為其他物種的抗體的cdr部分而融合成的人源化免疫球蛋白，向fc區(qū)域的糖鏈中增加分子修飾的免疫球蛋白g，人免疫球蛋白g的fv區(qū)域與fc區(qū)域融合成的人工免疫球蛋白g等。

此外，結(jié)合區(qū)域廣義上定義為fab區(qū)域(特別是fv區(qū)域)和fc區(qū)域，由于抗體的立體結(jié)構(gòu)是已知的，因此在本發(fā)明的蛋白質(zhì)以及作為親和分離基質(zhì)結(jié)合對象的蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)工程學(xué)上保持與蛋白質(zhì)a的結(jié)合區(qū)域的立體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，也可以對fab區(qū)域或fc區(qū)域?qū)嵤┻M一步修飾(片段化等)。

使用填充了本發(fā)明的親和分離基質(zhì)的親和柱純化包含免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)的方法，可以依照親和柱層析提純法，使用已經(jīng)作為市售品存在的蛋白質(zhì)a柱來實現(xiàn)(非專利文獻3)。換言之，將包含含有免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)的緩沖液調(diào)整為中性后，使所述溶液通過填充了本發(fā)明的親和分離基質(zhì)的親和柱，吸附含有免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)。然后，使適量的純凈緩沖液通過親和柱，將柱內(nèi)部洗凈。此時，所期望的含有免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)被吸附到柱內(nèi)的本發(fā)明的親和分離基質(zhì)上。然后，使調(diào)整到合適的ph的酸性緩沖液(也有含有促進從所述基質(zhì)解離的物質(zhì)的情況)流經(jīng)柱子，通過洗提所期望的含有免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)，實現(xiàn)高純度的提純。

通過使緩沖液流經(jīng)本發(fā)明的親和分離基質(zhì)對其進行清洗，本發(fā)明的親和分離基質(zhì)可以循環(huán)利用，所述緩沖液是不完全損壞配體化合物或擔(dān)載體基體材料的功能的、適當(dāng)?shù)膹娝嵝曰驈妷A性的純凈緩沖液(也有含合適的變性劑或有機溶劑的溶液的情況)。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)以及使用了所述蛋白質(zhì)的親和分離基質(zhì)產(chǎn)生的效果是與免疫球蛋白具有親和力，而與免疫球蛋白的fab區(qū)域的親和力下降。一般而言，蛋白質(zhì)a的各個結(jié)構(gòu)域與fc區(qū)域的結(jié)合比與fab(fv)區(qū)域的結(jié)合更強(非專利文獻3)。但是，蛋白質(zhì)a和各個結(jié)構(gòu)域的“對免疫球蛋白的親和力”實質(zhì)上是指對fc區(qū)域的親和性的表述，僅與fab區(qū)域的結(jié)合力發(fā)生變化，與免疫球蛋白的親和性的強度也沒有很大的變化。本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有蛋白質(zhì)a的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與fab區(qū)域的次級親和性低，產(chǎn)生如下效果，即可以排除與免疫球蛋白的相互作用中的次級結(jié)合的影響。另一方面，由于保持了與fc區(qū)域的親和性，因而保持了與免疫球蛋白整體的親和性。當(dāng)通過下文所述的biacore系統(tǒng)測定與人免疫球蛋白g制品的親和性時，本發(fā)明的蛋白質(zhì)所具有的與免疫球蛋白的親和性其親和常數(shù)(ka)優(yōu)選在10⁶(m^-1)以上，更優(yōu)選在10⁷(m^-1)以上。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)和親和分離基質(zhì)與包含免疫球蛋白fc區(qū)域的蛋白質(zhì)的親和性可以通過例如使用表面等離子體共振原理的biacore系統(tǒng)(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))等生物傳感器來測定，但不限于這類測定方法。

作為測定條件，可以檢測出蛋白質(zhì)a與免疫球蛋白的fc區(qū)域結(jié)合時的結(jié)合信號就行，可以在20～40℃(恒定溫度)的溫度，ph6～8的中性條件下測定來進行簡單的評價。

結(jié)合對象的免疫球蛋白只要可以檢出與fab區(qū)域的結(jié)合即可，沒有特殊的限定，但是由于一旦使用含fc區(qū)域的免疫球蛋白分子也就檢測出與fc區(qū)域的結(jié)合，故優(yōu)選使用將fab區(qū)域片段化從而去除fc區(qū)域所獲得的免疫球蛋白分子(fab片段、fv片段)。進一步的，優(yōu)選通過屬于vh3亞家族的免疫球蛋白的fab片段，該片端已經(jīng)確認蛋白質(zhì)a與fab區(qū)域的結(jié)合。

通過在相同的測定條件下，獲得與相同的免疫球蛋白分子的結(jié)合反應(yīng)曲線，根據(jù)分析時所獲得的結(jié)合參數(shù)，比較導(dǎo)入突變前的蛋白質(zhì)和導(dǎo)入突變后的蛋白質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便的驗證親和性的差異。此時，比較親和性不同的兩條序列在突變位置以外的序列必須是相同的，例如，在評價突變d36r的效果的情況時，如導(dǎo)入突變前的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是b結(jié)構(gòu)域，而導(dǎo)入突變后的蛋白質(zhì)的氨基酸序列是c結(jié)構(gòu)域中導(dǎo)入了突變d36r的序列，則所述比較是不恰當(dāng)?shù)摹?/p>

作為結(jié)合參數(shù)可使用例如親和指數(shù)(ka)或解離指數(shù)(kd)(永田等著“生體物質(zhì)相互作用のリアルタイム解析実験法”，springer-verlag東京，1998年，第41頁)。本發(fā)明的各個結(jié)構(gòu)域突變體與fab的親和常數(shù)可以如下獲得，例如利用biacore系統(tǒng)，在傳感芯片中固定屬于vh3亞家族的免疫球蛋白的fab片段，在溫度25℃，ph7.4的條件下向流路中添加各結(jié)構(gòu)域突變體的實驗體系。對于具有導(dǎo)入了本發(fā)明所涉及突變的序列的蛋白質(zhì)而言，可以優(yōu)選使用與具有導(dǎo)入該突變前的序列的蛋白質(zhì)相比，可以恰當(dāng)?shù)氖褂盟龅鞍踪|(zhì)的親和常數(shù)(ka)降低至1/2以下的蛋白質(zhì)，更優(yōu)選降低1/5以下，進一步優(yōu)選降低至1/10以下的蛋白質(zhì)。并且，在某些文獻中，將親和常數(shù)記載為結(jié)合常數(shù)，兩者的定義基本上是相同的。

第29位的gly替換為ala的c結(jié)構(gòu)域突變體對fab的ka通常在1×10⁴～1×10⁵(m^-1)之間，可以在本發(fā)明中優(yōu)選使用導(dǎo)入了將第29位的gly替換為ala的突變和本發(fā)明涉及的突變的c結(jié)構(gòu)域突變體，其是ka降低至低于1×10⁴(m^-1)的變體，更優(yōu)選適用ka降低至0.5×10⁴(m^-1)以下的該突變體。并且，在上述ka測定中，可以使用通過木瓜蛋白酶解將免疫球蛋白g片段化為fab片段和fc片段而獲得的fab，或者可以使用通過基因工程方法獲得的、只表達免疫球蛋白g的fab區(qū)域的生產(chǎn)系統(tǒng)制造的fab。

由于本發(fā)明的親和分離基質(zhì)具有與免疫球蛋白的fab區(qū)域的結(jié)合力降低的性質(zhì)，在用酸性溶液洗提抗體的步驟中，其解離抗體的特性是優(yōu)異的。具體而言，可以通過更偏中性的酸性洗提條件進行洗提，而獲得抑制酸性條件對抗體的破壞的效果。具體而言，普通的酸性洗提條件是ph2.0～3.5左右，相對于此更偏中性的酸性洗提條件是ph3.0～5.0左右的條件，此條件下的洗提對抗體的破壞小(ghoses.等，biotechnologyandbioengineering，2005，第92卷，第6期)。優(yōu)異的抗體酸解離特性，是指在更偏中性的酸性洗提條件下解離、在酸性條件下洗提抗體時的洗提峰形更加尖銳這樣的特性。層析的洗提峰形變得更尖銳，則可以用更小體積的洗提液回收含有更高濃度的抗體的洗提液。

此外，通過使用本發(fā)明的親和分離基質(zhì)，可以從包括含有fc區(qū)域的分子與只含有fab區(qū)域的分子的混合物中，作為直接通過的級分，方便的分離回收fab區(qū)域。

實施例

以下基于實施例，對本發(fā)明進行更詳細地說明，但是本發(fā)明不限于這些實施例。

對于實施例中獲得的各種蛋白質(zhì)，以“表示結(jié)構(gòu)域的字母-導(dǎo)入的突變(野生型時注為“野生型(wild)”)”的形式表述。例如，蛋白質(zhì)a的野生型c結(jié)構(gòu)域以“c-野生型”的形式表述，導(dǎo)入g29a突變的c結(jié)構(gòu)域突變體以“c-g29a”的形式表述。對于同時導(dǎo)入2種突變的突變體的表述，用斜杠來表述。例如，導(dǎo)入g29a突變和s33e突變的c結(jié)構(gòu)域突變體以“c-g29a/s33e”的形式表述。此外，對于由多個單結(jié)構(gòu)域連接而成的蛋白質(zhì)，加入“.”號，在連接數(shù)后添加“d”來組合表述。例如，由5個導(dǎo)入g29a突變和s33e突變的c結(jié)構(gòu)域突變體連接而成的蛋白質(zhì)以“c-g29a/s33e.5d”的形式表述。

[實施例1]制造編碼c-g29a.5d的dna

由5個c-g29v連接而成的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(c-g29a.5d，序列號11)進行逆翻譯，設(shè)計出編碼該蛋白質(zhì)的堿基序列。所述蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率與橋石短芽孢桿菌hpd31菌株中大量表達的細胞表面蛋白hwp(ebisus.著，“j.bacteriol.”1990年，第172期，1312～1320頁)的密碼子使用頻率接近，并且，考慮到使5個結(jié)構(gòu)域之間的堿基序列的序列同一性變低而分配密碼子。此外，在編碼5連接型結(jié)構(gòu)域的序列的5’端制作psti，和在3’端制作xbai的限制性酶識別位點。dna片段的制造是委托takarabio公司完成的。制造的dna片段的序列記載在序列號12中。

用psti和xbai(均為takarabio公司生產(chǎn))消化所制造的編碼c-g29v.5d的dna片段，用瓊脂糖凝膠電泳分離、純化。另一方面，pnk3262是短芽孢桿菌屬細菌用的質(zhì)粒載體，用psti和xbai消化后，純化回收再通過堿性磷酸酶(takarabio公司生產(chǎn))處理進行脫磷酸化處理。將兩者混合后，用ligationhigh(toyobo公司生產(chǎn))連接，構(gòu)建c-g29v.5d表達質(zhì)粒載體pnk3262-c-g29v.5d。使用由上述操作獲得的質(zhì)粒載體進行橋石短芽孢桿菌fy-1菌株的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化是通過已知的方法由電轉(zhuǎn)法來實施的(“biosci.biotech.biochem.j”，1997年，第61期，202～203頁)。此外，橋石短芽孢桿菌fy-1菌株是對橋石短芽孢桿菌hpd31-ok菌株(日本特開平6-296485號公報)進行突變處理獲得的phe、tyr缺陷性菌株。

由所制造的質(zhì)粒pnk3262-c-g29v.5d來制造dna片使其包含各結(jié)構(gòu)域的val-29的、分成5段的編碼c-g29v.5d的基因。從n端開始，各結(jié)構(gòu)域按順序賦予1～5的編號。分別用psti和nari消化結(jié)構(gòu)域1，用nari和hindiii消化結(jié)構(gòu)域2，用hindiii和mlui消化結(jié)構(gòu)域3，用mlui和bglii消化結(jié)構(gòu)域4，用bglii和xbai消化結(jié)構(gòu)域5(nari由東洋紡織株式會社生產(chǎn)，其他酶由takarabio公司生產(chǎn))，用瓊脂糖凝膠電泳分離、純化，獲得各dna片段。

使用與用于編碼各個結(jié)構(gòu)域的dna片段所使用的相同的2種限制性酶消化2種兩種克隆載體psl301(invitrogen公司生產(chǎn))和puc19(takarabio公司生產(chǎn))，與上述dna片段混合后，用ligationhigh連接，構(gòu)建具有切割成5份的dna片段的質(zhì)粒。在各個質(zhì)粒中，與結(jié)構(gòu)域所附編號對應(yīng)的，各個質(zhì)粒分別表述為puc19-v29-d1、puc19-v29-d2、psl301-v29-d3、psl301-v29-d4、psl301-v29-d5。序列號13～17中顯示了各個c-g29v.5d編碼區(qū)的dna片段的序列(包含限制性內(nèi)切酶識別部位)。

以puc19-v29-d1、puc19-v29-d2、psl301-v29-d3、psl301-v29-d4、psl301-v29-d5為模板，使用序列號18-27的寡核苷酸引物實施quickchange法，制造含有各結(jié)構(gòu)域的val-29被ala替換了的c-g29a的dna片段的質(zhì)粒puc19-a29-d1、puc19-a29-d2、、psl301-a29-d3、psl301-a29-d4、psl301-a29-d5，用ligationhigh依次連接5個片段，構(gòu)建具有編碼c-g29a.5d(序列號28)的dna片段(序列號29)的表達質(zhì)粒pnk3262-c-g29a.5d，實施fy-1重組菌的轉(zhuǎn)化。quickchange法是使用dna聚合酶pfuturbo和甲基化dna(模板dna)切割酶dpni(均為stratagene公司生產(chǎn))，依照stratagene公司的規(guī)程實施的。例如，對于包含序列號13的dna片段的質(zhì)粒puc19-v29-d1，使用序列號18和序列號19這兩條合成dna引物，實施quickchange法，制造包含結(jié)構(gòu)域1的val-29被ala替換的dna片段的質(zhì)粒puc19-a29-d1。

[實施例2]制造編碼c-g29a/s33e.5d、c-g29a/d36r.5d和c-g29a/k35r/d37e.5d的dna

以實施例1制造的含有編碼c-g29a的dna片段的5種質(zhì)粒，即puc19-a29-d1、puc19-v29-d2、psl301-v29-d3、psl301-v29-d4、psl301-v29-d5為模板，使用序列號30～59的寡核苷酸引物，按實施例1相同的方式，采取利用quickchange法的方法，制造含有c-g29a/s33e、c-g29a/d36r和c-g29a/k35r/d37e的dna片段的質(zhì)粒。

之后，用實施例1中記載的方法將各種dna片段進行連接，分別制造包含編碼c-g29a/s33e.5d(序列號60)的dna片段(序列號61)的表達質(zhì)粒pnk3262-c-g29a/s33e.5d，包含編碼c-g29a/d36r.5d(序列號62)的dna片段(序列號63)的表達質(zhì)粒pnk3262-c-g29a/d36r.5d，和包含編碼c-g29a/k35r/d37e.5d(序列號64)的dna片段(序列號65)的表達質(zhì)粒pnk3262-c-g29a/k35r/d37e.5d，實施fy-1重組菌的轉(zhuǎn)化。此外，在連接編碼c-g29a的dna片段時利用限制性酶hindiii，由于hindiii的識別序列與突變導(dǎo)入位點接近，因此，在制造了將編碼未導(dǎo)入突變的結(jié)構(gòu)域2的dna片段和編碼導(dǎo)入了突變的結(jié)構(gòu)域3的dna片段在hindiii位點連接而成的質(zhì)粒之后，在編碼結(jié)構(gòu)域2的區(qū)域中導(dǎo)入相應(yīng)的突變。此外，以pnk3262-c-g29a/s33e.5d為模板質(zhì)粒，使用序列號66～67的寡核苷酸引物，pcr擴增編碼c-g29a/s33e.4d(序列號68)的dna片段(序列號69)。用psti和xbai消化該dna片段，插入到用相同的酶消化的載體pnk3262中，制造表達質(zhì)粒pnk3262-c-g29a/s33e.4d，實施fy-1重組菌的轉(zhuǎn)化。

[實施例3]dna序列確認

使用dna測序儀3130x1geneticanalyzer(appliedbiosystem公司生產(chǎn))，確認實施例1～2所獲得的各種表達質(zhì)粒的dna堿基序列。使用bigdyeterminatorv.1.1循環(huán)測序試劑盒(appliedbiosystem公司生產(chǎn))，根據(jù)附帶的規(guī)程，進行各個質(zhì)粒dna的測序pcr反應(yīng)，純化所述測序產(chǎn)物，進行序列分析。略去測序中使用的寡核苷酸引物的序列。

[實施例4]表達重組菌中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達

將實施例1～2所獲得的各種橋石短芽孢桿菌fy-1重組菌，在含有60μg/ml新霉素的5ml3yc培養(yǎng)基(聚胨(polypeptone)3％，酵母提取物0.2％，葡萄糖3％，硫酸鎂0.01％、硫酸鐵0.001％、氯化錳0.001％、氯化鋅0.0001％)中，30℃下振蕩培養(yǎng)3天。

離心處理培養(yǎng)物，分離菌體，從所獲得的培養(yǎng)上清液中，利用spfastflow柱(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))進行陽離子交換層析，純化目標(biāo)蛋白質(zhì)(初步純化)。具體而言，將添加醋酸鈉使其終濃度為50mm，再將用鹽酸調(diào)節(jié)至ph4.0的培養(yǎng)上清液加入到用陽離子交換緩沖液a(50mm醋酸-醋酸鈉，ph4.0)平衡過的spfastflow柱中，用陽離子交換緩沖液a洗凈后，利用陽離子交換緩沖液a和陽離子交換緩沖液b(50mm醋酸-醋酸鈉，1mnacl，ph4.0)的鹽濃度梯度，分離中途洗提出的目標(biāo)蛋白質(zhì)。

然后，在使用deaefastflow柱(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))的陰離子交換層析中，純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。具體而言，在超純水中透析所分離的目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液，將其添加到用陰離子交換緩沖液a(50mmtris-hcl，ph8.0)平衡過的deaefastflow柱中，用陰離子交換緩沖液a洗凈后，利用陰離子交換緩沖液a和陰離子交換緩沖液b(50mm醋酸-醋酸鈉，0.3mnacl，ph8.0)的鹽濃度梯度，分離中途洗提出的目標(biāo)蛋白質(zhì)。再次在超純水中透析所分離的目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液，以只含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的水溶液作為最終純化的樣品。

此外，上述通過使用柱子的層析進行的蛋白質(zhì)的純化，是利用aktaprimeplus系統(tǒng)(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))來實施的。

[實施例5]

使用biacore3000(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))對實施例4中獲得的各種蛋白質(zhì)與免疫球蛋白的親和性進行解析來解析所獲得的蛋白質(zhì)與人免疫球蛋白g(人igg)的親和性，biacore3000利用了表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance)。在本實施例中，利用從人血漿中分級的人免疫球蛋白g制品(下文稱為人igg)。將人igg固定在傳感芯片上，使各種蛋白質(zhì)流至芯片上，檢測兩者的相互作用。用氨基偶聯(lián)法將人igg固定在傳感芯片cm5上，所述氨基偶聯(lián)法使用n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)或n-乙基-n’-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺氯化物(edc)進行，使用乙醇胺進行封閉(傳感芯片和固定化試劑都是gehealthcarejapan公司生產(chǎn)的)。將gammagard(baxter公司生產(chǎn))按1.0mg/ml溶解在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(20mmnah2po4-na2hpo4，150mmnacl，ph7.4)中，調(diào)制人igg溶液。用固定化用緩沖液(10mm醋酸-醋酸鈉，ph4.5)將人igg溶液稀釋100倍，依照biacore3000附帶的規(guī)程，將人igg固定在傳感芯片上。此外，對于芯片上其他的流動池，在用edc/nhs活化后，進行乙醇胺固定的處理，準(zhǔn)備好作為陰性對照的參照池。使用上樣緩沖液(20mmnah2po4-na2hpo4，150mmnacl，0.005％p-20，ph7.4)，在10～1000nm的范圍內(nèi)恰當(dāng)配制(將各種蛋白質(zhì)分別配制3種不同的蛋白質(zhì)濃度的溶液)各種蛋白質(zhì)，將各種蛋白質(zhì)溶液以20μl/min的流速利用30秒添加至傳感芯片中。測定溫度為25℃，依次觀測添加時(結(jié)合相，30秒)和添加結(jié)束后(解離相，60秒)的結(jié)合反應(yīng)曲線。在各種觀測結(jié)束后，添加50mmnaoh(15秒)，使傳感芯片再生(目的是去除傳感芯片上殘留的添加蛋白質(zhì)，確認固定化的人igg的結(jié)合活性幾乎完全恢復(fù))。針對所獲得的結(jié)合反應(yīng)曲線(減去參照池的結(jié)合反應(yīng)曲線的結(jié)合反應(yīng)曲線)，使用系統(tǒng)附帶的biaevaluation軟件，通過1:1結(jié)合模型進行適合度解析，計算出結(jié)合速率常數(shù)(kon)、解離速率常數(shù)(koff)、親和常數(shù)(ka＝kon/koff)和解離常數(shù)(kd＝koff/kon)。

根據(jù)表1所示，各種蛋白質(zhì)與人igg的結(jié)合參數(shù)和c-g29a.5d(比較例1)是相同程度的。具體而言，對于任一種蛋白質(zhì)，與人igg的親和常數(shù)(ka)落入5.0×10⁷m^-1～5.0×10⁸m^-1的范圍。

表1

[實施例6]制造來源于人源化單克隆抗體的fab片段

對于本發(fā)明中的“與fab區(qū)域的親和性”，使用不含免疫球蛋白的fc區(qū)域的fab片段進行研究。

以人源化單克隆igg制品為原料，通過木瓜蛋白酶片段化為fab片段和fc片段，僅分離純化制造fab片段。

將人源化單克隆igg制品赫賽汀(herceptin，中外制藥公司生產(chǎn))溶解在木瓜蛋白酶消化緩沖液(0.1macoh-acona，2mmedta，1mm半胱氨酸，ph5.5)中，加入來自papayalatex的papainagarose即固定了木瓜蛋白酶的瓊脂糖(sigma公司生產(chǎn))，一邊用旋轉(zhuǎn)器(rotator)混合，一邊在37℃溫育約8小時。從固定了木瓜蛋白酶的瓊脂糖分離的反應(yīng)溶液(fab片段和fc片段混合存在)中，通過使用resources柱(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))的離子交換層析，分離純化fab片段(下文記載為單克隆igg-fab)。具體而言，反應(yīng)溶液用離子交換緩沖液a(50mmch3cooh-ch3coona，ph4.5)稀釋至ph4.5，將所述反應(yīng)溶液添加到用離子交換緩沖液a平衡的resources柱中，用離子交換緩沖液a洗滌后，使用離子交換緩沖液a和離子交換緩沖液b(50mmch3cooh-ch3coona，1mnacl，ph4.5)的鹽濃度梯度(在用10倍柱體積的緩沖液流過柱的時侯，將緩沖液b的濃度從0％直線升高至50％)，在中途分離提取洗脫的單克隆igg-fab。

用superdex7510/300gl柱(在平衡和分離中使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液)凝膠過濾層析來純化分離提取的單克隆igg-fab溶液，獲得單克隆igg-fab溶液。

此外，與實施例4相同，通過使用aktaprimeplus系統(tǒng)的層析來進行蛋白質(zhì)的純化。

[實施例7]解析所獲得的各種蛋白質(zhì)與單克隆igg-fab的親和性

對于解析實施例4所獲得的各種蛋白質(zhì)與igg-fab的親和性，按實施例5相同的方式，也使用biacore3000來實施。

將實施例6中獲得的單克隆igg-fab固定在傳感芯片cm5上，檢測實施例4所獲得的各種蛋白質(zhì)在芯片上流動時的相互作用。參照池是固定化的人血清白蛋白(sigma-aldrich公司生產(chǎn))。單克隆igg-fab和人血清白蛋白的固定方法與實施例5相同。

使用上樣緩沖液(20mmnah2po4-na2hpo4，150mmnacl，0.005％p-20，ph7.4)，將測定的各種蛋白質(zhì)分別配制成4μm、8μm、16μm、32μm的不同蛋白質(zhì)濃度的溶液(某些情況下未配制32μm)，將各種蛋白質(zhì)溶液以20μl/min的流速利用30秒添加至傳感芯片中。在25℃的測定溫度下，依次觀測添加時(結(jié)合相，30秒)和添加結(jié)束后(解離相，60秒)的結(jié)合反應(yīng)曲線。在各種觀測結(jié)束后，添加10mmnaoh(30秒)，使傳感芯片再生。解析方法與實施例6相同。但是，作為解析時的結(jié)合參數(shù)的1種，將rmax作為常數(shù)進行擬合。rmax值是所有的固定化的分子都與添加的分子結(jié)合時的信號量，在固定了相同分子(單克隆igg-fab)的本實驗系統(tǒng)中，該值不可能有大的變化。然而，在結(jié)合信號非常微弱的情況下，為了避免rmax值成為極小值而導(dǎo)致錯誤的擬合，將rmax值作為常數(shù)進行擬合。如表2所示，各種蛋白質(zhì)與單克隆igg-fab的結(jié)合參數(shù)與c-g29a.5d(比較例1)相比顯著降低。具體而言，對于任一種蛋白質(zhì)而言，與單克隆igg-fab的親和常數(shù)(ka)，與c-g29a.5d相比，顯示出低于其1/10的數(shù)值。

表2

[實施例8]制造表達單個結(jié)構(gòu)域的各種變體的轉(zhuǎn)化細胞

除實施例7中評價的突變以外，出于有效的評價本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的其他突變的目的，在單個結(jié)構(gòu)域水平上制造各種變體。

作為導(dǎo)入突變的蛋白質(zhì)序列，選擇來源于蛋白質(zhì)a的c結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(序列號10，c-g29a.1d)。以包含序列號70所示的編碼c-g29a.1d的dna序列的gst融合蛋白表達載體pgex-6p-1(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))作為導(dǎo)入突變的模板質(zhì)粒。模板質(zhì)粒的制造方法已記載在公開的專利文獻(國際公開第2010/110288號公報)中。

以上述2種質(zhì)粒作為模板，使用序列號71～80的寡核苷酸引物，利用quickchange法，獲得編碼序列號81～85所示各種c結(jié)構(gòu)域突變體(c-g29a/s33l.1d、c-g29a/s33t.1d、c-g29a/d36i.1d、c-g29a/d36r.1d、c-g29a/d37e.1d)的各種表達質(zhì)粒。例如，以包含序列號70的dna序列的表達質(zhì)粒(pgex-6p-c-g29a.1d)為模板，使用序列號71～72的寡核苷酸引物，利用quickchange法，獲得序列號81所示的c結(jié)構(gòu)域突變體(c-g29a/s33l.1d)。對于所獲得的表達質(zhì)粒，按實施例3相同的方法，確認dna序列。此外，使用所獲得的各種表達質(zhì)粒，按實施例1相同的方法，實施對大腸桿菌hb101株(takara公司生產(chǎn))的轉(zhuǎn)化。

[實施例9]單結(jié)構(gòu)域型的各種突變體的表達、純化

由實施例8獲得的各種轉(zhuǎn)化細胞以gst融合蛋白的形式表達各種突變體。將這些轉(zhuǎn)化細胞在含有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。將這些培養(yǎng)液接種在2×yt培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)中，37℃下培養(yǎng)約1小時。添加iptg(異丙基-1-硫代-β-d-吡喃半乳糖苷)使其終濃度為0.1mm，進一步在37℃培養(yǎng)18小時。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集細菌，重新懸浮于含edta(0.5mm)的pbs緩沖液中。超聲破碎細胞，離心分離，將上清液級分(無細胞提取液)和不溶性級分分級。使用與gst具有親和性的gstrapff柱(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))的親和層析，從包含gst融合蛋白的各種無細胞提取液中純化gst融合蛋白(初步純化)。將各種無細胞提取液添加到gstrapff柱中，用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(20mmnah2po4-na2hpo4，150mmnacl，ph7.4)洗滌柱，然后用洗提緩沖液(50mmtris-hcl，20mm谷胱甘肽，ph8.0)洗提目標(biāo)gst融合蛋白。將洗提的級分通過超濾替換為標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的溶液，作為最終純化的樣品。

[實施例10]解析單結(jié)構(gòu)域型的各種突變體與單克隆igg-fab的親和性

對于解析實施例9所獲得的各種單結(jié)構(gòu)域型突變體，按實施例7記載的相同的方法，使用biacore測定其與單克隆igg-fab的親和性，解析導(dǎo)入各種突變對igg-fab結(jié)合力的改變。但是，只測定蛋白質(zhì)濃度為4μm(在280nm下相同吸光度表示的濃度)的各種單結(jié)構(gòu)域型突變體的傳感圖。

圖2顯示了所獲得的igg-fab結(jié)合傳感圖。與c-g29a.1d(比較例3)相比，各種蛋白質(zhì)對單克隆igg-fab的結(jié)合響應(yīng)顯著降低，減少至不能檢出的程度?？梢源_定通過本發(fā)明獲得的突變降低了fab的結(jié)合力。此外，由于降低至不能檢出結(jié)合的程度，因此不進行親和常數(shù)的計算。

[實施例11]c-g29a/s33e.5d的耐堿性評估

關(guān)于實施例4獲得的c-g29a/s33e.5d的耐堿性，在堿性條件下進行一段時間的溫育處理后，比較相對于人igg的結(jié)合量降低的程度(相對于人igg的殘留的結(jié)合活性)來進行評估。

針對c-g29a/s33e.5d，使用biacore3000測定在堿處理前后與人igg的結(jié)合量。關(guān)于堿處理，在26.2μm的各種蛋白質(zhì)(10μl)中加入一定量的0.625mnaoh，使最終濃度為0.5m，在30℃溫育8小時。之后，在各種處理溶液中加入0.5mhcl(預(yù)先確定ph恢復(fù)中性的一定體積)進行中和，用上樣緩沖液(20mmnah2po4-na2hpo4，150mmnacl，0.005％p-20，ph7.4)稀釋2倍，制造成堿處理后的c-g29a/s33e.5d溶液。

堿處理前的c-g29a/s33e.5d溶液，是將堿處理時添加的naoh溶液、以及中和處理時添加的hcl溶液預(yù)先混合得到的溶液添加到26.2μm的c-g29a/s33e.5d(10μl)中使得蛋白質(zhì)濃度、溶液組成都是相同的而制造的。關(guān)于傳感芯片的制造(人igg的固定化等)、測定時的上樣緩沖液、測定溫度、芯片的再生處理都與實施例7相同。將堿處理之前和處理之后的c-g29a/s33e.5d溶液，以20μl/min的流速利用150秒添加至傳感芯片中。依次觀測添加時(結(jié)合相，150秒)和添加結(jié)束時(解離相，210秒)的結(jié)合反應(yīng)曲線。

解析方法與實施例5相同，在此對所獲得的結(jié)合參數(shù)的解釋進行補充。此次的解析方法中，雖然堿處理前后的蛋白質(zhì)濃度相同，但與人igg具有結(jié)合活性的蛋白質(zhì)濃度發(fā)生了變化。然而，由于濃度作為變量難以擬合，將處理前后的濃度作為定值進行擬合。此時，與igg具有結(jié)合活性的蛋白質(zhì)濃度的變化反映在表示最大結(jié)合容量的rmax上，計算并比較c-g29a/s33e.5d的堿處理前的rmax和堿處理后的rmax的相對值(殘留的igg結(jié)合活性[％])，評估耐堿性。

對于堿處理后殘留的igg結(jié)合活性，c-g29a.5d(比較例1)是85.4％，相對的c-g29a/s33e.5d是85.5％。確認到本發(fā)明的突變可以在不損害c-g29a的優(yōu)異耐堿性的基礎(chǔ)上發(fā)揮其效果。

[實施例12]制造固定了所獲得的各種蛋白質(zhì)(配體)的親和分離基質(zhì)

親和分離基質(zhì)(1)：甲基丙烯酸酯類聚合物基底

作為水不溶性基體材料，使用市售的活化型親和層析填充劑“toyopearlaf-formyl-650m”(tosoh公司生產(chǎn))。該填充劑以甲基丙烯酸酯類的聚合物為基底，導(dǎo)入了固定蛋白質(zhì)類配體用的甲酰基。制造固定了以實施例4中獲得的c-g29a/s33e.5d的最終純化樣品作為配體的親和分離基質(zhì)(1)。

具體而言，將5ml填充劑在玻璃過濾器上用檸檬酸緩沖液(0.25m二水合檸檬酸三鈉，ph9.0，用naoh調(diào)節(jié))替換后，使離心管內(nèi)總量為7.5ml。向其中加入0.64ml含有c-g29a/s33e.5d的溶液(64.6mg/ml)，用mixrotor(ミックスローター)(azone生產(chǎn)的mixrotormr-31-336-05)在6℃振蕩4小時。之后，用2.4m檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)至ph3，在6℃繼續(xù)振蕩4小時。之后，加入2.8ml濃度為5.5重量％的二甲胺硼烷水溶液(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))，25℃下振蕩18小時。將該擔(dān)載體在玻璃過濾器上，使用ro水洗滌至洗滌濾液的電導(dǎo)率降至5μs/cm以下，制造成親和分離基質(zhì)。

親和分離基質(zhì)(2)：交聯(lián)瓊脂糖基底

作為水不溶性基體材料，使用1ml的市售的活化型已填充(prepack)柱(hitrapnhsactivatedhp)(gehealthcare公司生產(chǎn))。該柱子以交聯(lián)瓊脂糖為基底，導(dǎo)入了固定蛋白質(zhì)類配體用的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)基?；咀裱唐肥謨裕圃旃潭艘詫嵤├?中獲得的c-g29a/s33e.4d的最終純化樣品作為配體的親和分離基質(zhì)(2)。

具體而言，用偶聯(lián)緩沖液(0.2m碳酸鈉，0.5mnacl，ph8.3)將最終純化樣品制造成1ml終濃度稀釋為約6mg/ml的溶液。將冰浴冷卻的1mmhcl，按1ml/min的流速流過2ml，重復(fù)操作3次，去除柱內(nèi)的異丙醇。之后立刻以相同的流速添加之前制造的樣品稀釋溶液，塞住柱子上下端，在25℃靜置30分鐘，將獲得的蛋白質(zhì)固定在柱子里。之后打開塞子，以相同的流速流過3ml偶聯(lián)緩沖液，回收未反應(yīng)的蛋白質(zhì)。之后，流過2ml封閉緩沖液(0.5m乙醇胺，0.5mnacl，ph8.3)，重復(fù)實施3次，流過2ml洗滌緩沖液(0.1m醋酸，0.5mnacl，ph4.0)，重復(fù)實施3次，最后流過2ml標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(20mmnah2po4-na2hpo4，150mmnacl，ph7.4)，完成親和分離柱的制造。

親和分離基質(zhì)(3)：纖維素基底

作為水不溶性基體材料，使用市售的凝膠過濾用填充劑“cellufine(セルロファイン)gcl-2000-m”(chisso公司生產(chǎn))。該填充劑以交聯(lián)的多孔纖維素為基底。制造固定了以實施例4中獲得的c-g29a/s33e.5d的最終純化樣品作為配體的親和分離基質(zhì)(3)。

具體而言，將12ml填充劑在玻璃過濾器(top公司生產(chǎn)17g-2)上用檸檬酸緩沖液(0.01m二水合檸檬酸三鈉-一水合檸檬酸，ph3)替換后，使離心管內(nèi)液量為18ml。向其中加入6ml由0.08g高碘酸鈉(和光純藥工業(yè)公司生產(chǎn))溶解在ro水中的水溶液，用mixrotor(azone生產(chǎn)的mixrotormr-31-336-05)在6℃振蕩約30分鐘。在玻璃過濾器上，使用足量的ro水洗滌，獲得含有甲?；膿?dān)載體。

將5ml該含有甲?；膿?dān)載體在玻璃過濾器上用檸檬酸緩沖液(0.25m二水合檸檬酸三鈉，ph8.0，用naoh調(diào)節(jié))替換后，使離心管內(nèi)總量為8.5ml。向其中加入0.64ml含有c-g29a/s33e.5d的溶液(64.6mg/ml)，用0.4mnaoh調(diào)節(jié)至ph12以后，用mixrotor在6℃振蕩4小時。之后，用2.4m檸檬酸水溶液(一水合檸檬酸)調(diào)節(jié)至ph3，在6℃繼續(xù)振蕩4小時。之后，加入2.8ml濃度為5.5重量％的二甲胺硼烷水溶液，25℃下振蕩18小時。將該擔(dān)載體在玻璃過濾器上，使用ro水洗滌至洗滌濾液的電導(dǎo)率降至5μs/cm以下，獲得親和分離基質(zhì)。

親和分離基質(zhì)(4)：纖維素基底-2

作為水不溶性基體材料，使用結(jié)晶型高度交聯(lián)纖維素(chisso公司生產(chǎn)，通過美國公開0062118號(日本特開2009-242770)獲得的凝膠)。制造固定了以實施例4中獲得的c-g29a/s33e.5d的最終純化樣品作為配體的親和分離基質(zhì)(4)。

具體而言，將12ml凝膠在玻璃過濾器上用檸檬酸緩沖液(0.01m二水合檸檬酸三鈉-一水合檸檬酸，ph3)替換后，使離心管內(nèi)液量為18ml。向其中加入6ml由0.08g高碘酸鈉溶解在ro水中的水溶液，用mixrotor在6℃振蕩約30分鐘。

將5ml該含有甲?；膿?dān)載體在玻璃過濾器上用檸檬酸緩沖液(0.25m二水合檸檬酸三鈉，ph8.0，用naoh調(diào)節(jié))替換后，使離心管內(nèi)總量為8.5ml。向其中加入0.96ml實施例4獲得的含有c-g29a/s33e.5d的溶液(64.6mg/ml)，用0.4mnaoh調(diào)節(jié)至ph12以后，用mixrotor在6℃振蕩4小時。

之后，用2.4m檸檬酸水溶液(一水合檸檬酸)調(diào)節(jié)至ph5，在6℃繼續(xù)振蕩4小時。之后，加入0.46ml濃度為5.5重量％的二甲胺硼烷水溶液，25℃下振蕩18小時。反應(yīng)后，測量反應(yīng)溶液在275nm附近最大吸收的吸光度值，其結(jié)果是c-g29a/s33e.5d的導(dǎo)入量為11mg/ml-凝膠，配體在擔(dān)載體上的固定化收率為90％。

將該載體在玻璃過濾器上，使用ro水洗滌至洗滌濾液的電導(dǎo)率降至5μs/cm以下，進一步用0.1m檸檬酸水溶液(一水合檸檬酸)、氫氧化鈉-硫酸鈉混合水溶液(0.05mnaoh，0.5m硫酸鈉)、檸檬酸緩沖液(0.5m二水合檸檬酸三鈉-一水合檸檬酸，ph6)依次洗滌。最終，使用ro水洗滌至洗滌濾液的電導(dǎo)率降至5μs/cm以下，獲得親和分離基質(zhì)。

此外，對于該親和分離基質(zhì)(4)，施用國際公開號2010/064437中記載的測定，測量對抗體的吸附容量和配體泄漏量。在接觸時間1.8分鐘、3分鐘時的5％dbc分別是33、41mg/ml，相對于洗脫的igg，配體泄漏量是30ppm。此外，在相同條件下測量的市售高交聯(lián)瓊脂糖載體“mabselect”(gehealthcarebioscience公司生產(chǎn))的5％dbc分別是28、37mg/ml。圖3中圖示了比較5％dbc的圖。此外，對于配體泄漏量，存在研究了市售的親和分離基質(zhì)的公知文獻(hagnr.等人，j.chromatogr.a.，2006年，1102卷，224～231頁)。由此可見，已知本實施例獲得的親和分離基質(zhì)(4)在對抗體藥物純化工藝中表示重要性能的參數(shù)方面達到了充分有效的水平。

[實施例13]評價各種親和分離基質(zhì)的抗體酸洗脫特性

將實施例12中制造的親和分離基質(zhì)(1)～(4)，分別填充到emptycolumntricorn^tm5/50柱(gehealthcare公司生產(chǎn))中，連接層析系統(tǒng)aktaprimeplus(gehealthcarejapan公司生產(chǎn))，通過抗體純化層析評價抗體酸洗脫特性。但是，親和分離基質(zhì)(2)由于是預(yù)填充柱，可以直接連接。在所有情況下，使柱子體積為約1ml。用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(20mmnah2po4-na2hpo4，150mmnacl，ph7.4)平衡上述親和分離柱后，按2ml/min的流速，添加500μl屬于vh3亞家族的人源化單克隆igg制品赫賽汀在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中制造成的1mg/ml的溶液。然后，用相同的流速流過5ml標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，然后，用相同的流速流過5ml洗提緩沖液(35mm醋酸-醋酸鈉，ph3.5)，監(jiān)控280nm的吸光度值，確定所獲得的igg洗脫峰的層析譜。進一步連續(xù)的，用相同的流速流過5ml標(biāo)準(zhǔn)緩沖液，然后，用相同的流速流過3ml強洗脫液(0.5m醋酸，0.1mna2so4，ph2.5)，監(jiān)控280nm的吸光度值，確定強行分離的柱內(nèi)殘留igg的峰。此外，對于親和分離基質(zhì)(2)，強洗脫液的組成是20mm醋酸鈉-醋酸，1mnacl(ph3.2)。

對于親和分離基質(zhì)(1)～(3)，使用調(diào)節(jié)至ph3.75的洗脫緩沖液，通過相同的抗體純化層析評價抗體酸洗脫特性。

親和分離基質(zhì)(1)的抗體酸洗脫特性

在圖4中顯示了使用固定了c-g29a/s33e.5d和c-g29a.5d(比較例1)的各種親和分離基質(zhì)(1)的抗體純化層析的洗脫峰譜的重疊圖。上圖是洗脫ph3.5時，下圖是洗脫ph3.75時的洗脫峰譜。如圖4所示，可以確定，固定了c-g29a/s33e.5d的基質(zhì)的洗脫峰譜與c-g29a.5d的情況相比明顯更尖銳。通過洗脫ph3.75時的洗脫峰譜，可以確定導(dǎo)入突變前的c-g29a.5d所吸附的igg難以回收，而導(dǎo)入突變后的c-g29a/s33e.5d上吸附的igg可以全部回收?？烧J為這是一個顯示出通過本發(fā)明可以顯著提高在更偏中性的酸性溶液中的抗體回收率的例子。

親和分離基質(zhì)(2)的抗體酸洗脫特性

在圖5中顯示了使用固定了c-g29a/s33e.4d和c-g29a.4d(比較例2)的各種親和分離基質(zhì)(2)的抗體純化層析的洗脫峰譜的重疊圖。與親和分離基質(zhì)(1)的情況相同，可以確定固定了c-g29a/s33e.4d的基質(zhì)的洗脫峰譜與c-g29a.4d的情況相比明顯更尖銳。通過這一數(shù)據(jù)，顯示本發(fā)明的蛋白質(zhì)不依賴于作為基體材料的水不溶性基體材料的種類、基體材料上的配體固定方法和作為配體的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域個數(shù)的效果的實現(xiàn)。

親和分離基質(zhì)(3)的抗體酸洗脫特性

在圖6中顯示了使用固定了c-g29a/s33e.5d和c-g29a.5d(比較例1)的各種親和分離基質(zhì)(3)的抗體純化層析的洗脫峰譜的重疊圖?？梢源_定固定了c-g29a/s33e.5d的基質(zhì)的洗脫峰譜與c-g29a.5d的情況相比明顯更尖銳。通過這一數(shù)據(jù)，顯示本發(fā)明的蛋白質(zhì)通過與作為基體材料時具有優(yōu)異的抗體洗脫特性(洗脫快)的基體材料組合，可以進一步發(fā)揮優(yōu)異的效果。

親和分離基質(zhì)(4)的抗體酸洗脫特性

在圖7中顯示了使用固定了c-g29a/s33e.5d的親和分離基質(zhì)(4),的抗體純化層析的洗脫峰譜(洗脫ph3.5)。在產(chǎn)業(yè)上，對表現(xiàn)出高抗體結(jié)合容量的基質(zhì)的需求高，增加配體的固定量對提高抗體結(jié)合容量是有效的。通過這一數(shù)據(jù)，確定了本發(fā)明即使在蛋白質(zhì)固定量高的情況下，也可以正常實現(xiàn)本發(fā)明的效果。

比較例1：制造、使用c-g29a.5d

用與實施例3～5記載的相同的方法，使用實施例1中獲得的重組菌，制造c-g29a.5d(序列號28)。對于與人igg及單克隆igg-fab的親和性的解析方法，用與實施例5及實施例7記載的相同的方法，解析結(jié)果合并顯示在表1～2中。

此外，對于耐堿性，用實施例11記載的方法解析評價。此外，在實施例12的親和分離基質(zhì)(1)、(3)的制造中也使用c-g29a.5d，按與實施例13相同的方法評價抗體酸洗脫特性，其結(jié)果合并顯示在圖4和圖6中。此外，在親和分離基質(zhì)(1)、(3)的制造中，所用溶液的蛋白質(zhì)濃度是58.2mg/ml，使用的量是0.79ml。

比較例2：制造、使用c-g29a.4d

用與實施例2相同的方法，使用實施例1中獲得的表達質(zhì)粒pnk3262-c-g29a.5d作為模板，和序列號66～67的寡核苷酸引物，獲得c-g29a.4d的表達質(zhì)粒及其轉(zhuǎn)化細胞。用與實施例3～5記載的相同的方法，制造c-g29a.4d。此外，在實施例12的親和分離基質(zhì)(2)的制造中也使用c-g29a.4d，按與實施例13相同的方法評價抗體酸洗脫特性，其結(jié)果合并顯示在圖5中。

比較例3：制造c-g29a.1d

用包含實施例8所使用的模板質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細胞(hb101)，用與實施例9相同的方法，制造c-g29a.1d，用與實施例10相同的方法，解析與單克隆igg-fab的親和性。解析結(jié)果合并顯示在圖2中。

序列表

<110>株式會社鐘化(kanekacorporation)

<120>特異性結(jié)合免疫球蛋白的蛋白質(zhì)以及免疫球蛋白結(jié)合性親和配體

<130>b100013wo01

<140>pct/jp2011/057156

<141>2011-03-24

<150>jp2010-068870

<151>2010-03-24

<160>85

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>56

<212>prt

<213>金黃色葡萄球菌

<400>1

alaglnhisaspglualaglnglnasnalaphetyrglnvalleuasn

151015

metproasnleuasnalaaspglnargasnglypheileglnserleu

202530

lysaspaspproserglnseralaasnvalleuglyglualaglnlys

354045

leuasnaspserglnalaprolys

5055

<210>2

<211>61

<212>prt

<213>金黃色葡萄球菌

<400>2

alaaspalaglnglnasnlyspheasnlysaspglnglnseralaphe

151015

tyrgluileleuasnmetproasnleuasnglugluglnargasngly

202530

pheileglnserleulysaspaspproserglnserthrasnvalleu

354045

glyglualalyslysleuasngluserglnalaprolys

505560

<210>3

<211>58

<212>prt

<213>金黃色葡萄球菌

<400>3

alaaspasnasnpheasnlysgluglnglnasnalaphetyrgluile

151015

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