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      一種DF?1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑及其制備方法、使用方法與流程

      文檔序號:11380166閱讀:1916來源:國知局

      本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑及其制備方法、使用方法。



      背景技術(shù):

      df-1細(xì)胞來源于ell雞胚胎,是一種可傳代的雞成纖維細(xì)胞系,該細(xì)胞無禽白血病病毒,肉瘤病毒內(nèi)源性基因,同時在形態(tài)上呈纖維狀。df-1細(xì)胞系還是一種穩(wěn)定的、無腫瘤基因、自發(fā)無限增殖的細(xì)胞系。目前已被廣泛用于動物病毒研究、疫苗研制、癌癥研究等諸多領(lǐng)域,是生命科學(xué)領(lǐng)域重要的病毒轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)生物材料。

      在傳統(tǒng)的df-1細(xì)胞培養(yǎng)中,胎牛血清(fetalbovineserum,fbs)一直被作為細(xì)胞培養(yǎng)基添加劑,但其在使用中存在諸多缺點(diǎn):具有批間差異、成分不明確、有抑制生長的成分、不利于疫苗和單克隆抗體等目的產(chǎn)品的分離純化、容易被病毒和支原體感染;價格昂貴,需要大量驗(yàn)證工作、使用不方便、貨源緊張,來源不穩(wěn)定等問題,還有隨著來自動物保護(hù)組織的壓力,因此,胎牛血清將逐步被無血清培養(yǎng)基取代,無血清培養(yǎng)基是加入成分明確的血清替代成分,既能滿足細(xì)胞的培養(yǎng)要求,又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素,因而無血清培養(yǎng)基得到了越來越普遍的應(yīng)用。

      無血清培養(yǎng)基是以合成培養(yǎng)基為基礎(chǔ)加入不同劑量的生長因子、結(jié)合蛋白、激素、低分子量營養(yǎng)物質(zhì)(維生素、微量元素、脂類等),起到替代動物血清支持細(xì)胞正常生長代謝的作用。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題,本發(fā)明目的在于設(shè)計提供一種df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑及其制備方法、使用方法的技術(shù)方案。

      所述的一種df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,其特征在于每1000mlpbs溶液中含有以下組分:紅芪多糖10-30mg、柚皮素5-15mg、黃芪皂苷5-15mg、菟絲子提取物10-20mg、腐胺1-10mg和谷胱甘肽5-20mg。

      所述的一種df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,其特征在于每1000mlpbs溶液中含有以下組分:紅芪多糖15-25mg、柚皮素8-12mg、黃芪皂苷8-12mg、菟絲子提取物12-18mg、腐胺2-8mg和谷胱甘肽12-18mg。

      所述的一種df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑的制備方法,其特征在于包括以下步驟:將所述重量份的組分混合后,加入到盛有pbs溶液中,邊加邊攪拌,直至完全溶解,補(bǔ)pbs溶液至1000ml,即得。

      所述的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑的使用方法,其特征在于按照藥物混合液:dmem/f12重量比=1:1~1:2將兩者充分混合后使用。

      本發(fā)明中中紅芪多糖購買于:西安天瑞生物技術(shù)有限公司;柚皮素購買于:武漢易泰科技有限公司;黃芪皂苷購買于:海佰世凱化學(xué)科技有限公司;菟絲子提取物購買于:西安原生植物工程技術(shù)有限公司;腐胺購買于:sigma;谷胱甘肽mg購買于:sigma。

      本發(fā)明具有以下有益效果:

      1、本發(fā)明所制備的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,可替代血清,大幅度降低生產(chǎn)成本,保證了疫苗的質(zhì)量和安全性。

      2、本發(fā)明所制備的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,可以大大提高細(xì)胞的生長速度。

      3、本發(fā)明所制備的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,可以促進(jìn)雞傳染性法氏囊病毒對df-1細(xì)胞的感染敏感性,提高其病毒含量,從而提高雞傳染性法氏囊活疫苗的免疫原性。

      具體實(shí)施方式

      為了使本發(fā)明更加容易理解,下面結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍,下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法,通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

      實(shí)施例1:培養(yǎng)液添加劑的制備

      紅芪多糖:10mg(購買于:西安天瑞生物技術(shù)有限公司)

      柚皮素:5mg(購買于:武漢易泰科技有限公司)

      黃芪皂苷:5mg(購買于:海佰世凱化學(xué)科技有限公司)

      菟絲子提取物:10mg(購買于:西安原生植物工程技術(shù)有限公司)

      腐胺:1mg(購買于:sigma)

      谷胱甘肽:5mg(購買于:sigma)

      將以上各種成分混合后,加入到盛有一定量的pbs溶液中,邊加邊攪拌,直至完全溶解,補(bǔ)pbs溶液至1000ml,按照藥物混合液:dmem/f12=1:1制備一種df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,兩者充分混合,并經(jīng)過0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過濾除菌,之后進(jìn)行分裝備用。

      實(shí)施例2:培養(yǎng)液添加劑的制備

      紅芪多糖:12mg(購買于:西安天瑞生物技術(shù)有限公司)

      柚皮素:8mg(購買于:武漢易泰科技有限公司)

      黃芪皂苷:6mg(購買于:海佰世凱化學(xué)科技有限公司)

      菟絲子提取物:12mg(購買于:西安原生植物工程技術(shù)有限公司)

      腐胺:5mg(購買于:sigma)

      谷胱甘肽:8mg(購買于:sigma)

      將以上各種成分混合后,加入到盛有一定量的pbs溶液中,邊加邊攪拌,直至完全溶解,補(bǔ)pbs溶液至1000ml,按照藥物混合液:dmem/f12=1:1.5制備一種df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,兩者充分混合,并經(jīng)過0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過濾除菌,之后進(jìn)行分裝備用。

      實(shí)施例3:培養(yǎng)液添加劑的制備

      紅芪多糖:30mg(購買于:西安天瑞生物技術(shù)有限公司)

      柚皮素:15mg(購買于:武漢易泰科技有限公司)

      黃芪皂苷:15mg(購買于:海佰世凱化學(xué)科技有限公司)

      菟絲子提取物:20mg(購買于:西安原生植物工程技術(shù)有限公司)

      腐胺:10mg(購買于:sigma)

      谷胱甘肽:20mg(購買于:sigma)

      將以上各種成分混合后,加入到盛有一定量的pbs溶液中,邊加邊攪拌,直至完全溶解,補(bǔ)pbs溶液至1000ml,按照藥物混合液:dmem/f12=1:2制備一種df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,兩者充分混合,并經(jīng)過0.22um細(xì)菌濾器進(jìn)行過濾除菌,之后進(jìn)行分裝備用。

      試驗(yàn)例1本發(fā)明培養(yǎng)液添加劑的應(yīng)用

      1材料

      1.1df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑

      按本發(fā)明實(shí)施例1-3制得

      1.2dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清購于gibco公司,

      硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(tg)、胰酪蛋白胨培養(yǎng)基(tsb)購于北京中海生物科技有限公司

      1.3df-1細(xì)胞購于atcc,由浙江美保龍生物技術(shù)有限公司保存

      1.4雞傳染性法氏囊病毒(d78株/b87株),購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所

      1.5試驗(yàn)雞14日齡spf雞60只,購于青島易邦生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動物中心

      2方法

      2.1培養(yǎng)基檢驗(yàn)

      2.1.1無菌檢驗(yàn)

      將實(shí)施例1-3制備的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,各取3個不同批次進(jìn)行無菌檢驗(yàn),每個批次分別取1ml接種于2支50mltg大管中,1支置于35-37℃培養(yǎng),1支置于23-25℃培養(yǎng),3d后各吸取培養(yǎng)物分別接種于10個tg小管,再分別置于35-37℃和23-25℃培養(yǎng),另外每個批次分別取0.2ml接種于tsb小管內(nèi),置于23-25℃培養(yǎng),同時做陰性對照,均培養(yǎng)7日,觀察結(jié)果。

      2.1.2內(nèi)毒素測定

      將實(shí)施例1-3制備的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,各取3個不同批次進(jìn)行內(nèi)毒素檢驗(yàn),每個批次分別取1.7ml用鱟試劑盒分別進(jìn)行檢測,用酶標(biāo)儀選擇波長405nm測其od值,同時做陰性對照。

      2.2細(xì)胞生長速度測定

      由實(shí)施例1-3使用的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,以及含8%、10%胎牛血清的dmem/f12完全培養(yǎng)液分別將已消化好的df-1細(xì)胞,稀釋成3*104個/ml的細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板,每孔培養(yǎng)液體積為2ml,每種培養(yǎng)基接種1塊24孔培養(yǎng)板,置于37℃,5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后,用0.25%(w/v)的胰蛋白酶溶液消化用不同培養(yǎng)液培養(yǎng)的df-1細(xì)胞細(xì)胞各4個培養(yǎng)孔,用cedexas-20細(xì)胞密度和活力自動分析儀計數(shù)細(xì)胞密度和活力。

      2.3病毒培養(yǎng)

      用dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基將雞傳染性法氏囊病毒(d78株/b87株)稀釋成1500tcid50/ml,分別接種于由2.2培養(yǎng)的5種細(xì)胞中,分別置于37℃、5%co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90h之后進(jìn)行收毒。

      2.4tcid50測定

      分別將由實(shí)施例1-3制備的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑培養(yǎng)的細(xì)胞、含8%、10%fbs的dmem/f12培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞,均稀釋成105~106個/ml,按0.2ml/孔轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板中,置于37℃,5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d,棄掉培養(yǎng)液上清,將2.3收獲的雞傳染性法氏囊病毒(d78株/b87株)分別用dmem/f12基礎(chǔ)培養(yǎng)基作連續(xù)的10倍稀釋,按0.2ml/孔接種,置于37℃,5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d,每天觀察細(xì)胞病變并記錄,按reed-muench法計算tcid50。

      2.5免疫原性測定

      將2.3收獲的五種病毒液經(jīng)檢驗(yàn)合格,加入佐劑后制作成疫苗成品測定疫苗的免疫原性。將60只14日齡的spf雞共分為6組,每組10只,第ⅰ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例1制備的培養(yǎng)液添加劑,用于培養(yǎng)df-1細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒,經(jīng)加工處理后制成的疫苗,按照0.2ml/只,進(jìn)行胸肌注射免疫;第ⅱ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例2制備的培養(yǎng)液添加劑,用于培養(yǎng)df-1細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒,經(jīng)加工處理后制成的疫苗,按照0.2ml/只,進(jìn)行胸肌注射免疫;第ⅲ組采用經(jīng)本發(fā)明實(shí)施例3制備的培養(yǎng)液添加劑,用于培養(yǎng)df-1細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒,經(jīng)加工處理后制成的疫苗,按照0.2ml/只,進(jìn)行胸肌注射免疫;第ⅳ組采用含10%fbs培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)df-1細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒,經(jīng)加工處理后制成的疫苗,按照0.2ml/只,進(jìn)行胸肌注射免疫;第ⅴ組采用含8%fbs培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)df-1細(xì)胞繁殖雞傳染性法氏囊病毒,經(jīng)加工處理后制成的疫苗,按照0.2ml/只,進(jìn)行胸肌注射免疫。第ⅳ組,疫苗對照組,不進(jìn)行免疫。各組均在免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、45d、49d分別翅靜脈采血并分離血清,用elisa方法進(jìn)行測定ibdv的抗體水平。

      3結(jié)果

      3.1檢驗(yàn)結(jié)果

      表1無菌檢驗(yàn)結(jié)果

      表2內(nèi)毒素檢驗(yàn)結(jié)果(405nm)

      由表1、表2可以看出,由實(shí)施例1、2、3制備的不同批次的培養(yǎng)基添加劑均既無菌生長又不含內(nèi)毒素,該方法制備的培養(yǎng)基添加劑安全可靠。

      3.2細(xì)胞密度及活力測定結(jié)果

      表3細(xì)胞密度測定結(jié)果

      由表3可以看出,由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)的df-1細(xì)胞密度明顯大于含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的df-1細(xì)胞。

      表4細(xì)胞活率測定結(jié)果

      由表4可以看出,在相同的培養(yǎng)時間內(nèi),由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)的df-1細(xì)胞存活率明顯大于由含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的df-1細(xì)胞。

      3.3tcid50測定結(jié)果

      表5tcid50測定結(jié)果

      由表5可以看出,由實(shí)施例1、2、3制備的培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)的df-1細(xì)胞比由含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的df-1細(xì)胞更有利于ibdv的繁殖,敏感性更強(qiáng)。

      3.4免疫原性測定結(jié)果

      表6ibdv的抗體水平測定結(jié)果

      由表6可以看出,ⅰ、ⅱ、ⅲ組的抗體水平明顯高于ⅳ、ⅴ組,由實(shí)施例1、2、3制備的添加劑培養(yǎng)的ibdv的免疫原性高于含fbs培養(yǎng)基培養(yǎng)的ibdv。

      4結(jié)論

      綜上所述,本發(fā)明所使用的df-1細(xì)胞培養(yǎng)液添加劑,在可以大大提高細(xì)胞的生長速度的前提下,一方面能增強(qiáng)雞傳染性法氏囊病毒對df-1細(xì)胞的敏感性,提高病毒的tcid50含量;另一方面,還可以增強(qiáng)雞傳染性法氏囊病毒活疫苗的免疫原性。

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