本申請是申請?zhí)枮?01110127667.4，發(fā)明名稱為培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法的中國發(fā)明專利申請(申請日為2011年5月17日)的分案申請。

本發(fā)明涉及培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法，特別是用于上皮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒及細(xì)胞培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

人體重要器官如肺、腎、肝、胰腺和皮膚都由器官特異性分化的上皮細(xì)胞為其組成成分。這些特異性分化的上皮細(xì)胞與不同器官的特異性功能直接相關(guān)，如肺的氣體交換功能、腎的過濾功能、肝的解毒及中和功能、胰腺細(xì)胞產(chǎn)生胰島素、皮膚具有保護(hù)機(jī)體免受外界環(huán)境的傷害。而這些重要器官一旦發(fā)生病變或退化就會威脅人類的健康，因?yàn)檫@些重要器官是很難被替換的，不同器官的特異性細(xì)胞也不能相互取代其它器官的細(xì)胞。

特異性分化的細(xì)胞，如腎上皮細(xì)胞、胰腺的胰島素產(chǎn)生細(xì)胞、真皮的毛囊和腺體細(xì)胞都是很難再生的，更不要說在體外進(jìn)行培養(yǎng)增殖了。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(包括各種轉(zhuǎn)基因和克隆動(dòng)物)是用于疾病發(fā)病機(jī)理研究和新藥研發(fā)的必要工具。但是，對于分離自人和哺乳動(dòng)物的原代上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)仍然是很困難的。應(yīng)用目前的無血清培養(yǎng)基，有的只能進(jìn)行短期的原代培養(yǎng)(存活數(shù)天，如肺和胰腺等上皮細(xì)胞)，有的只能進(jìn)行有限的傳代培養(yǎng)(1-3代，如氣管/支氣管及前列腺等上皮細(xì)胞)，有的甚至根本不能體外培養(yǎng)(如肝和結(jié)腸等上皮細(xì)胞)，只有來自于人體皮膚的角化上皮細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)10代左右。而且從每個(gè)動(dòng)物或活體組織樣品中獲得的上皮細(xì)胞產(chǎn)量仍然很低，包括細(xì)胞的數(shù)量、直接分離或短期培養(yǎng)的細(xì)胞純度都是很低的，這些原代和傳代上皮細(xì)胞的增殖速度也極為有限。

為了在體外進(jìn)行上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，目前國外嘗試通過遺傳操作，如轉(zhuǎn)入病毒(sv40t或hpv16e6e7)或細(xì)胞癌基因，可以延長體外細(xì)胞存活的代數(shù)。然而遺傳操作的最大缺點(diǎn)是會改變這些細(xì)胞的遺傳背景和表型，以致讓這些正常上皮細(xì)胞丟失其正常生理功能,如p53和prb信號通路常常被抑制。而且，這些經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞是不可能重新再移植進(jìn)機(jī)體的。但是由于目前缺乏有效的體外培養(yǎng)上皮細(xì)胞的技術(shù)，上述這些細(xì)胞在當(dāng)今世界的醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究中仍然備受青睞。在非癌癥研究領(lǐng)域，它們就代表著最初來源的“功能”性的組織或器官。在癌癥研究領(lǐng)域，它們還常常被用來作為“正常細(xì)胞”對照。而且它們的市場價(jià)格還非常昂貴。

抗腫瘤藥物研究的第一步就是藥物對癌細(xì)胞的特異性毒性實(shí)驗(yàn)，目前所用的癌細(xì)胞株(如hela和a539等)多在體外傳代數(shù)年甚至數(shù)十年，它們在很大程度上已不能反應(yīng)同類型人體惡性腫瘤的特性，一些實(shí)驗(yàn)室還存在大量癌細(xì)胞株的交叉污染。而且對于不同的個(gè)體，即使同一類型的腫瘤也可能由不同的原因或機(jī)制所導(dǎo)致，因此對于每一種腫瘤，都需要有能代表其特定發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞株來進(jìn)行新藥研發(fā)。更為突出的例子，如前列腺癌的研究領(lǐng)域根本沒有人類原發(fā)前列腺癌的細(xì)胞系，僅有的細(xì)胞系(lncap,pc-3,du-145)都是來自轉(zhuǎn)移后的腫瘤組織。盡管如此，全世界90％以上的腫瘤研究和幾乎所有抗癌新藥的研究還在繼續(xù)使用著可能根本沒有代表性的癌細(xì)胞株。因此，目前癌癥研究和新藥研發(fā)要解決的關(guān)鍵問題是，如何能獲得反應(yīng)各種類型人體腫瘤特性、同種腫瘤代表不同個(gè)體特性或不同發(fā)病機(jī)制的癌細(xì)胞。當(dāng)然，歸根結(jié)底的真正難題是缺乏有效的上皮細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)技術(shù)。另外，抗腫瘤藥物存在的很多毒副作用，很大程度上是因?yàn)樾滤幯芯咳狈φ５募?xì)胞對照。若能得到來自于同一個(gè)體同一組織的癌細(xì)胞和正常細(xì)胞(美國asterand公司用上述hpve6e7轉(zhuǎn)化得到的所謂的“正常”和癌的前列腺細(xì)胞，價(jià)格雖然高達(dá)1,2000美金/對，但還是十分搶手)，新藥研發(fā)的第一步將會回歸科學(xué)，抗癌新藥研究的歷史必將重寫。

再生醫(yī)學(xué)是現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的一種嶄新的治療模式，即以再生、再造、代替和新生為基本治療原理的現(xiàn)代干細(xì)胞移植治療術(shù)，利用干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞)具有向各種細(xì)胞分化轉(zhuǎn)變能力，治療臨床上眾多的、目前尚無治療辦法的變性、壞死性和損傷性疾病，具有顯著和獨(dú)特的醫(yī)療效果。然而目前面臨的困境是，雖然胚胎干細(xì)胞具有分化能力，再生性和可塑性強(qiáng)，但可能致瘤和面臨倫理爭議，如何誘導(dǎo)其定向分化和增加移植的成活率仍然是未解的難題；而成體干細(xì)胞來源稀少，難以識別、分離及純化，因此阻礙了其臨床應(yīng)用；目前新興的研究熱點(diǎn)——誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，由于其涉及遺傳操作導(dǎo)致細(xì)胞遺傳背景的改變，且導(dǎo)入的外源基因和病毒基因有致癌或致畸的潛能而不能用于臨床治療。

個(gè)體化醫(yī)學(xué)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)今后的發(fā)展方向。根據(jù)臨床病人的疾病發(fā)生/發(fā)展有關(guān)的遺傳背景及相關(guān)因素,在最短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地對疾病進(jìn)行診斷、監(jiān)測，制定真正的個(gè)體化治療方案是解決問題的關(guān)鍵。例如，世界衛(wèi)生組織調(diào)查發(fā)現(xiàn)藥物安全性問題是住院病人致死最重要的原因之一。藥物反應(yīng)個(gè)體差異所致不良反應(yīng)已成為危害人類健康的重要公共衛(wèi)生問題。而遺傳因素是造成藥物反應(yīng)個(gè)體差異的主要原因。在美國，已經(jīng)有70余種藥物經(jīng)fda批準(zhǔn)貼上了遺傳標(biāo)簽,用于指示不同基因型的臨床患者在應(yīng)用藥物時(shí)對療效和毒性的預(yù)測作用，而遺傳背景清晰的新藥研發(fā)必將成為未來發(fā)展的趨勢。如何利用極其微量的活檢組織(如針吸細(xì)胞等)對惡性腫瘤等疾病進(jìn)行早期快速診斷、體外藥敏實(shí)驗(yàn)、療效監(jiān)測是對腫瘤患者個(gè)體化治療的關(guān)鍵。所有這些都將依賴于快速、有效的原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)才能真正實(shí)現(xiàn)。

生物銀行(時(shí)代周刊稱之為改變世界的十大觀念之一)正在全世界范圍興起。美國國立衛(wèi)生研究院的研究人員正努力創(chuàng)建全美首個(gè)保存人類生物組織樣本、腫瘤細(xì)胞、dna，以及血液的全國性生物銀行。英、加、挪威和瑞典已設(shè)立了這類全國性的機(jī)構(gòu)。搜集和儲藏足夠多的，從癌癥、大腦紊亂到新陳代謝疾病的生物組織樣本，為建立個(gè)體化醫(yī)學(xué)和新藥研發(fā)奠定基礎(chǔ)，讓篩選和治療患者更有針對性。但是目前生物銀行所儲存的只是包括冰凍組織、固定的組織、dna、rna、蛋白質(zhì)、血液、血漿、血清和尿液等，這些極其寶貴的資源用之即去，無法再生。有效的原代和傳代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)必將為生物銀行注入真正的“活”力。這種具有“再生”能力的生物銀行的出現(xiàn)將對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究、個(gè)體化診斷和治療、新藥研發(fā)具有里程碑意義。

綜上所述，目前急需解決的問題是，如何快速、有效地進(jìn)行組織器官來源的原代上皮細(xì)胞的增殖以及這些上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，并且能有效地延長上皮細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)，同時(shí)又不能改變細(xì)胞的遺傳背景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人針對上述問題進(jìn)行了深入研究，提出了新的培養(yǎng)基和試劑盒，通過使用該培養(yǎng)基或試劑盒體外增殖原代上皮細(xì)胞和傳代培養(yǎng)上皮細(xì)胞，能夠在不改變細(xì)胞遺傳背景的情況下，有效地延長上皮細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)。

即，本發(fā)明提供下述培養(yǎng)基(也稱作本發(fā)明的培養(yǎng)基)：

1.一種培養(yǎng)基，其包含

血清，

鈣成分，和

rock抑制劑。

2.根據(jù)項(xiàng)1所述的培養(yǎng)基，其中，所述血清的含量是1.0～35v/v％。

3.根據(jù)項(xiàng)1所述的培養(yǎng)基，其中，所述rock抑制劑是選自法舒地爾、h-1152、y-27632、ha1100、ha1077和gsk429286中的一種或兩種以上。

4.根據(jù)項(xiàng)1所述的培養(yǎng)基，其用于培養(yǎng)上皮細(xì)胞。

5.根據(jù)項(xiàng)4所述的培養(yǎng)基，其中，所述上皮細(xì)胞是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。

6.根據(jù)項(xiàng)4所述的培養(yǎng)基，其中，所述上皮細(xì)胞是原代細(xì)胞。

7.根據(jù)項(xiàng)4所述的培養(yǎng)基，其中，所述上皮細(xì)胞是傳代細(xì)胞。

8.根據(jù)項(xiàng)4所述的培養(yǎng)基，其中，所述上皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。

9.根據(jù)項(xiàng)5所述的培養(yǎng)基，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞或過渡類型上皮細(xì)胞。

10.根據(jù)項(xiàng)5所述的培養(yǎng)基，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島β細(xì)胞,腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。

11.根據(jù)項(xiàng)1所述的培養(yǎng)基，其中，所述鈣成分的含量以鈣離子計(jì)為0.1μm～30mm。

12.根據(jù)項(xiàng)1所述的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基還包含飼養(yǎng)細(xì)胞。

13.根據(jù)項(xiàng)1所述的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基中包含條件培養(yǎng)基。

此外，本發(fā)明還提供下述試劑盒(也稱作本發(fā)明的試劑盒)：

14.一種試劑盒，其包含培養(yǎng)基、血清和rock抑制劑。

15.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，該試劑盒用于培養(yǎng)上皮細(xì)胞。

16.根據(jù)項(xiàng)15所述的試劑盒，其中，所述上皮細(xì)胞是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。

17.根據(jù)項(xiàng)15所述的試劑盒，其中，所述上皮細(xì)胞是原代細(xì)胞。

18.根據(jù)項(xiàng)15所述的試劑盒，其中，所述上皮細(xì)胞是傳代細(xì)胞。

19.根據(jù)項(xiàng)15所述的試劑盒，其中，所述上皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。

20.根據(jù)項(xiàng)16所述的試劑盒，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞或過渡類型上皮細(xì)胞。

21.根據(jù)項(xiàng)16所述的試劑盒，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島β細(xì)胞,腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。

22.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其還包含鈣成分。

23.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其還包含飼養(yǎng)細(xì)胞。

24.根據(jù)項(xiàng)23所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是低溫凍存的。

25.根據(jù)項(xiàng)23所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是低溫儲存的。

26.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其中，其還包含用于在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)單獨(dú)盛放所述飼養(yǎng)細(xì)胞的容器，該容器具有可通透性膜結(jié)構(gòu)。

27.根據(jù)項(xiàng)23所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是小鼠或人的成纖維細(xì)胞。

28.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其中，所述培養(yǎng)基包含條件培養(yǎng)基。

29.根據(jù)項(xiàng)14所述的試劑盒，其中，所述rock抑制劑是選自法舒地爾、h-1152、y-27632、ha1100、ha1077和gsk429286中的一種或兩種以上。

30.一種試劑盒，其包含項(xiàng)1～13中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基和飼養(yǎng)細(xì)胞。

31.根據(jù)項(xiàng)30所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是低溫凍存的。

32.根據(jù)項(xiàng)30所述的試劑盒，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是低溫儲存的。

33.根據(jù)項(xiàng)30所述的試劑盒，其中，其還包含用于在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)單獨(dú)盛放所述飼養(yǎng)細(xì)胞的容器，該容器具有可通透性膜結(jié)構(gòu)。

此外，本發(fā)明還提供下述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法(也稱作本發(fā)明的培養(yǎng)方法)：

34.一種培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，該方法包括

步驟a：使用項(xiàng)1～13中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)。

35.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是原代細(xì)胞。

36.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是傳代細(xì)胞。

37.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。

38.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。

39.根據(jù)項(xiàng)38所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞或過渡類型上皮細(xì)胞。

40.根據(jù)項(xiàng)38所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島β細(xì)胞,腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。

41.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，該培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法是上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法。

42.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，該培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法是原代上皮細(xì)胞增殖培養(yǎng)方法。

43.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞置于同一培養(yǎng)器皿中。

44.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，將飼養(yǎng)細(xì)胞單獨(dú)置于具有可通透性膜結(jié)構(gòu)的容器中。

45.根據(jù)項(xiàng)34所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述飼養(yǎng)細(xì)胞是小鼠或人的成纖維細(xì)胞。

46.一種培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，該方法包括

步驟b：使用項(xiàng)12或13所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)上皮細(xì)胞。

47.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是原代細(xì)胞。

48.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是傳代細(xì)胞。

49.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。

50.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。

51.根據(jù)項(xiàng)50所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是鱗狀上皮細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞、腺體上皮細(xì)胞或過渡類型上皮細(xì)胞。

52.根據(jù)項(xiàng)50所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，所述非角質(zhì)上皮細(xì)胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島β細(xì)胞,腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。

53.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，該培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法是上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法。

54.根據(jù)項(xiàng)46所述的培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法，其中，該培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法是原代上皮細(xì)胞增殖培養(yǎng)方法。

通過使用本發(fā)明的培養(yǎng)基或試劑盒培養(yǎng)上皮細(xì)胞，能夠在不改變細(xì)胞遺傳背景的情況下，有效增殖培養(yǎng)原代上皮細(xì)胞，并有效地延長上皮細(xì)胞的培養(yǎng)代數(shù)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明培養(yǎng)方法示意圖，其中，方案①、②、③是本發(fā)明的培養(yǎng)基與飼養(yǎng)細(xì)胞組合的三種培養(yǎng)系統(tǒng)。

圖2是采用本發(fā)明的條件培養(yǎng)基進(jìn)行上皮細(xì)胞培養(yǎng)的工作流程圖。

圖3是采用本發(fā)明的飼養(yǎng)細(xì)胞間接(transwell)共培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行上皮細(xì)胞培養(yǎng)的工作流程圖。

圖4是采用本發(fā)明的飼養(yǎng)細(xì)胞與上皮細(xì)胞直接共培養(yǎng)系統(tǒng)的工作流程圖。

圖5是正常人的支氣管原代上皮細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基(左)和含血清培養(yǎng)基(右)中培養(yǎng)的生長狀態(tài)比較。圖中顯示，支氣管上皮細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)基中不能增殖。按實(shí)施例5的方法分離制備原代支氣管上皮細(xì)胞，最后將獲得的細(xì)胞沉淀重新懸浮于完全的dmem培養(yǎng)基[成分為dmem,加入10％胎牛血清(fbs),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)]中，或者是無血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基sfm(gibco#10744-019)(見實(shí)施例10)。一周后，在常規(guī)倒置顯微鏡下觀察并照相。雖然培養(yǎng)效果不佳，但無血清培養(yǎng)基仍然廣泛用于常規(guī)的上皮細(xì)胞原代與傳代培養(yǎng)。

圖6是培養(yǎng)的正常人支氣管原代上皮細(xì)胞生長狀態(tài)比較。圖中顯示，對于支氣管上皮細(xì)胞，采用本發(fā)明的三種培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞的生長增殖明顯優(yōu)于使用常規(guī)的無血清培養(yǎng)基。按實(shí)施例5的方法分離制備原代支氣管上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重新懸浮于實(shí)施例8的條件培養(yǎng)基中(方法見圖2)，或者重懸細(xì)胞于本發(fā)明的hl培養(yǎng)基(見實(shí)施例2，hl培養(yǎng)基6)中，按圖3的方法和實(shí)施例9所說明的飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)，或按圖4和實(shí)施例6進(jìn)行原代培養(yǎng)。一周后，在常規(guī)倒置顯微鏡下觀察并照相。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按照實(shí)施例1進(jìn)行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的hl培養(yǎng)基按實(shí)施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按實(shí)施例3和4獲得。

圖7是正常人支氣管上皮細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)的比較。橫坐標(biāo)表示培養(yǎng)天數(shù)，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞增殖的倍數(shù)。圖中顯示，對于支氣管上皮細(xì)胞，采用本發(fā)明的三種培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞可以在體外傳代至少10代左右，明顯優(yōu)于采用無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)。按實(shí)施例5的方法分離制備原代支氣管上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重新懸浮于實(shí)施例8的條件培養(yǎng)基中(方法見圖2)，或者重懸細(xì)胞于本發(fā)明的hl培養(yǎng)基(見實(shí)施例2，hl培養(yǎng)基6)中，按圖3的方法和實(shí)施例9所說明的飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)，或按圖4和實(shí)施例6和7的說明進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按照實(shí)施例1進(jìn)行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的hl培養(yǎng)基按實(shí)施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按實(shí)施例3和4獲得。

圖8總結(jié)了本發(fā)明方法已經(jīng)成功培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的種系和類型。這些細(xì)胞分別來自于人、小鼠和大鼠。這些細(xì)胞的組織類型有，但不限定于：口腔、氣管、支氣管、肺上皮、胃、結(jié)腸、前列腺、乳腺、肝、胰腺、膀胱、卵巢和扁桃腺。具體實(shí)施步驟按實(shí)施例5的方法分離制備原代上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重新懸浮于實(shí)施例8的條件培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(方法見圖2)，或者重懸細(xì)胞于本發(fā)明的hl培養(yǎng)基(見實(shí)施例2，其中hl培養(yǎng)基1用于乳腺、前列腺、胃、膀胱來源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；hl培養(yǎng)基2用于肝來源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；hl培養(yǎng)基3用于結(jié)腸、扁桃腺、乳腺、胃來源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；hl培養(yǎng)基4用于卵巢、扁桃腺來源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；hl培養(yǎng)基5用于胰腺、扁桃腺來源的上皮細(xì)胞培養(yǎng)；hl培養(yǎng)基6用于口腔、氣管、支氣管、肺來源的上皮細(xì)胞培養(yǎng))，按圖3和實(shí)施例9所說明的飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)，或按圖4和實(shí)施例6和7的說明進(jìn)行培養(yǎng)傳代。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按照實(shí)施例1進(jìn)行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的hl培養(yǎng)基按實(shí)施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按實(shí)施例3和4獲得。

圖9所示為來源于人、大鼠和小鼠上皮細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)例。左圖是來源于人的前列腺上皮細(xì)胞，按實(shí)施例5的方法分離制備原代上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重懸于實(shí)施例8的hl條件培養(yǎng)基(即由hl培養(yǎng)基1與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)，按圖示2方法得到)中培養(yǎng)。中圖和右圖分別是來源于大鼠的乳腺上皮細(xì)胞和小鼠的肺上皮細(xì)胞，按實(shí)施例5的方法分離制備原代上皮細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞沉淀重懸于實(shí)施例2中的hl培養(yǎng)基1或hl培養(yǎng)基6，按圖4和實(shí)施例6和7的方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按照實(shí)施例1進(jìn)行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的hl培養(yǎng)基按實(shí)施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養(yǎng)細(xì)胞按實(shí)施例3和4制備。

圖10比較不同胎牛血清濃度對上皮細(xì)胞生長的影響。按實(shí)施例2配制hl培養(yǎng)基，加入胎牛血清使其終濃度分別為1％，2％，5％，10％。15％，20％。將5000個(gè)第二代的正常人支氣管上皮細(xì)胞(來自圖7研究中，實(shí)施例9的方法)分別懸浮于3毫升上述的含不同胎牛血清濃度的hl培養(yǎng)基中，然后置于6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，再將500000個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞(按實(shí)施例3制備)置于transwell筐(corning公司產(chǎn)品)中，按照圖3的方法，在5％co2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天。棄去transwell筐以及其中盛裝的飼養(yǎng)細(xì)胞，棄去培養(yǎng)板中剩余的培養(yǎng)基，以無鈣鎂的磷酸緩沖液洗一次，加入1ml0.05％edta/胰酶消化液，37℃孵育約2－3分鐘，待細(xì)胞完全脫壁后，加入2ml含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，充分混勻細(xì)胞，取出50ul細(xì)胞懸液混合于50ul的4％的臺盼藍(lán)(trypanblue)中染色，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

圖11本發(fā)明的培養(yǎng)基所添加的rock抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖12顯示rock抑制劑的濃度對上皮細(xì)胞生長的影響。按實(shí)施例2配制hl培養(yǎng)基6，加入不同的rock抑制劑使其終濃度分別為1um，5um，10um，20um，50um。將5000個(gè)第二代的正常支氣管上皮細(xì)胞(從圖7研究中，實(shí)施例9的方法)分別懸浮于3毫升上述的含不同濃度rock抑制劑的hl培養(yǎng)基6中，然后置于6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中，再將500000個(gè)飼養(yǎng)細(xì)胞(按實(shí)施例3制備)置于transwell筐(corning公司產(chǎn)品)中，按照圖3的方法，在5％co2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天。棄去transwell筐以及其中盛裝的飼養(yǎng)細(xì)胞，棄去培養(yǎng)孔中剩余的培養(yǎng)基，以無鈣鎂的磷酸緩沖液洗一次，加入1ml0.05％edta/胰酶消化液，37℃孵育約2－3分鐘，待細(xì)胞完全脫壁后，加入2ml含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，充分混勻細(xì)胞，取出50ul細(xì)胞懸液混合于50ul的4％的臺盼藍(lán)(trypanblue)中染色，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

發(fā)明的具體實(shí)施方式

本發(fā)明的培養(yǎng)基

本發(fā)明的第一方面涉及一種培養(yǎng)基(也稱作本發(fā)明的培養(yǎng)基，即hl培養(yǎng)基)，其包含血清、鈣成分和rock抑制劑。

本說明書中，培養(yǎng)基是指用于培養(yǎng)生物材料的基質(zhì)。對于生物材料沒有特殊限制，可以是病毒、細(xì)胞(例如微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞)、組織(例如動(dòng)物組織、植物組織)等。本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選是用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，即細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基更優(yōu)選是用于上皮細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。本說明書中的上皮細(xì)胞可以為例如非角質(zhì)上皮細(xì)胞，例如來源于腺體，包括乳腺、前列腺、肝和腸道上皮的非角質(zhì)上皮細(xì)胞。非角質(zhì)上皮細(xì)胞分化為具有吸收或分泌功能的活性細(xì)胞，非角質(zhì)上皮細(xì)胞并不是高度角質(zhì)化結(jié)構(gòu)的鱗狀上皮細(xì)胞?？捎帽景l(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的非角質(zhì)上皮細(xì)胞可以來源于任何種類的組織器官?？梢耘囵B(yǎng)的非角質(zhì)上皮細(xì)胞包括但不限定為如下類型：口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的、胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細(xì)胞的、膽管上皮的、膽囊的、胰腺(包括胰島β細(xì)胞)、腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是固體粉末狀培養(yǎng)基，也可以是液體培養(yǎng)基，優(yōu)選是液體培養(yǎng)基。當(dāng)本發(fā)明的培養(yǎng)基是固體粉末狀培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選在使用時(shí)將其調(diào)制成液體培養(yǎng)基來進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在調(diào)制過程中可以添加血清、鈣成分和rock抑制劑等各種成分，使其滿足本發(fā)明的要件。

本說明書中，當(dāng)對象為細(xì)胞時(shí)，“培養(yǎng)”或“細(xì)胞培養(yǎng)”是指在體外進(jìn)行人工維系，使細(xì)胞得以增殖。細(xì)胞培養(yǎng)通常在無菌條件下進(jìn)行，可以是培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞或組織。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中應(yīng)該含有血清。作為血清，可以使用細(xì)胞培養(yǎng)中常用的血清，例如小牛血清或胎牛血清，優(yōu)選胎牛血清。作為血清，還包括各種血清替代物，血清替代物包括但不限定于商品化購買的產(chǎn)品(例如invitrogen公司的knockout^tm血清替代物,pallcorporation公司的ultroser^tm)，還包括牛奶及牛奶成分(例如過濾的脫脂牛奶干粉)。對于培養(yǎng)基中的血清的量沒有特殊限制，可以與常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)中添加至培養(yǎng)基中的血清的量相同，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。優(yōu)選地，以體積比計(jì)(v/v％)，培養(yǎng)基中血清含量的下限可以是1.0％、更優(yōu)選2.0％、更優(yōu)選3.0％、更優(yōu)選4.0％、更優(yōu)選4.5％、更優(yōu)選5.0％；培養(yǎng)基中血清含量的上限可以是35％、更優(yōu)選30％、更優(yōu)選25％、更優(yōu)選20％、更優(yōu)選17％、更優(yōu)選15％、更優(yōu)選13％、更優(yōu)選11％、更優(yōu)選10％。

本說明書中，rock是指rho激酶1(rock1)和/或rho激酶2(rock2)。抑制rock是指降低rock1或rock2中的至少一種酶的活性、表達(dá)或功能。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，rock活性、表達(dá)或功能可以被完全抑制即達(dá)到無活性、無表達(dá)或無功能，也可以是活性、表達(dá)或功能水平降低。本說明書中，rock抑制劑是指：具有抑制rock的作用的物質(zhì)。對于rock抑制劑，沒有特殊限制，可以使用本領(lǐng)域公知的rock抑制劑，例如法舒地爾(fasudil),h-1152,y-27632,ha1100,ha1077和gsk429286等,這些都是商品化的常用試劑。此外，rock抑制劑還包括在pct申請(wo03/059913,wo03/064397,wo05/003101,wo04/112719,wo03/062225和wo03/062227)中公開的、或者在美國授權(quán)專利(7,217,722和7,199,147)和美國申請專利(2003/0220357,2006/0241127,2005/0182040和2005/0197328)中公開的小分子rock抑制劑。對于本發(fā)明的培養(yǎng)基中rock抑制劑的含量沒有特殊限制，只要是有效量即可。所述有效量是指能夠抑制rock的量，確定有效量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所培養(yǎng)的細(xì)胞的種類、所使用的rock抑制劑的種類等條件適宜地確定有效量。例如，雖然可能因細(xì)胞的種類、rock抑制劑的種類、細(xì)胞培養(yǎng)條件等而異，但一般而言，rock抑制劑含量可以在0.1μm～1mm之間。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中還可以包含飼養(yǎng)細(xì)胞。本說明書中，飼養(yǎng)細(xì)胞是指：與希望培養(yǎng)的細(xì)胞共同培養(yǎng)的細(xì)胞，其中，所述希望培養(yǎng)的細(xì)胞優(yōu)選是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞一般是經(jīng)過gamma射線照射和/或絲裂霉素處理的，其有絲分裂受到抑制，但仍可維持代謝活性。因此，飼養(yǎng)細(xì)胞是具有代謝能力但不能分裂的非增殖細(xì)胞。處理和阻斷細(xì)胞有絲分裂并維持細(xì)胞代謝活性的方法可以是細(xì)胞生物學(xué)的常規(guī)方法。飼養(yǎng)細(xì)胞可以來源于任何哺乳動(dòng)物，但其來源要與希望培養(yǎng)的細(xì)胞(優(yōu)選非角質(zhì)上皮細(xì)胞)來源的種屬不同。飼養(yǎng)細(xì)胞可以是但不限定于以下來源，如小鼠、大鼠、狗、貓、牛、馬、豬、靈長類以及人類的飼養(yǎng)細(xì)胞。典型的飼養(yǎng)細(xì)胞類型包括脾細(xì)胞、巨噬胸腺細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞，它們經(jīng)處理后成為非增殖細(xì)胞。另外，本發(fā)明中也可以利用j2作為飼養(yǎng)細(xì)胞，j2細(xì)胞是建系的鼠成纖維細(xì)胞swiss3t3細(xì)胞系的亞克隆，經(jīng)gamma射線照射和/或絲裂霉素處理。對于本發(fā)明的培養(yǎng)基中所包含的飼養(yǎng)細(xì)胞的量沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要適宜確定，通常飼養(yǎng)細(xì)胞與希望培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的比例可以是1：9～9：1，優(yōu)選2：8～8：2。

此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基中可以包含條件培養(yǎng)基。本說明書中，條件培養(yǎng)基是指包含飼養(yǎng)細(xì)胞分泌物和/或提取物的培養(yǎng)基。典型的條件培養(yǎng)基是用培養(yǎng)基培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間后，再除去飼養(yǎng)細(xì)胞而得到的培養(yǎng)基。此處，用于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基優(yōu)選是包含血清、鈣成分和rock抑制劑的培養(yǎng)基，例如本發(fā)明的培養(yǎng)基。對于培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間，沒有特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要適宜確定，通?？梢允?～300小時(shí)，優(yōu)選5～200小時(shí)，更優(yōu)選10～150小時(shí)，更優(yōu)選10～150小時(shí)，更優(yōu)選20～100小時(shí)，更優(yōu)選24～72小時(shí)，更優(yōu)選35～60小時(shí)，更優(yōu)選40～50小時(shí)。一般而言，制備條件培養(yǎng)基例如包括將細(xì)胞培養(yǎng)于一種培養(yǎng)基中(如f培養(yǎng)基)，幾天后收集這些培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基可以是，用新鮮培養(yǎng)基按一定比例稀釋后的條件培養(yǎng)基，也可以是不經(jīng)稀釋的收集后的條件培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基：條件培養(yǎng)基的稀釋比例可以是1:99～99:1，依具體實(shí)驗(yàn)條件而定。本發(fā)明中所述的“條件培養(yǎng)基”包括經(jīng)任何比例稀釋或不稀釋的條件培養(yǎng)基。優(yōu)選地，本發(fā)明的培養(yǎng)基可以是含有血清、鈣成分和rock抑制劑的未經(jīng)稀釋的條件培養(yǎng)基。

本發(fā)明的培養(yǎng)基可以使用用于細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基來制備。常規(guī)培養(yǎng)基是指本技術(shù)領(lǐng)域公知的用于細(xì)胞培養(yǎng)(優(yōu)選用于上皮細(xì)胞培養(yǎng))的培養(yǎng)基，包括但不限于：dmem(dulbecco’smodifiedessentialmedium),ham’sf12培養(yǎng)基,ham’sf-10培養(yǎng)基,rpmi1640,eagle’sbasalmedium(ebm),eagle’sminimumessentialmedium(mem),hepes,medium199以及相關(guān)類型培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)基也可以是兩種以上培養(yǎng)基的組合，例如dmem和f12的混合培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)基的配方中一般不包含血清，因此，當(dāng)使用常規(guī)培養(yǎng)基來制備本發(fā)明的培養(yǎng)基時(shí)，可以另行添加一定量的血清，使得培養(yǎng)基中的血清含量在上述限定的范圍內(nèi)。增加或減少培養(yǎng)基中的血清的操作是本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)操作。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中應(yīng)該含有鈣成分。此處所稱的“鈣成分”是指能夠?yàn)楸景l(fā)明的培養(yǎng)基提供鈣離子(ca²⁺)的成分，包括但不限于含鈣的化合物。通常，鈣成分來源于血清或血清替代物，或者來源于培養(yǎng)基中添加的含鈣的鹽類。所述鈣成分例如可以以鈣鹽(例如氯化鈣、硫酸鈣)的形式添加至培養(yǎng)基中。鈣成分的含量范圍(以鈣離子計(jì))可以與用于細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基中的鈣成分含量相同，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。例如，以ca²⁺計(jì)，鈣成分含量的下限可以是0.1μm、優(yōu)選10μm、更優(yōu)選100μm、更優(yōu)選200μm、更優(yōu)選400μm、更優(yōu)選500μm、更優(yōu)選800μm、更優(yōu)選1mm、更優(yōu)選1.2mm、更優(yōu)選1.3mm、更優(yōu)選1.5mm；鈣成分含量的上限可以是30mm、更優(yōu)選25mm、更優(yōu)選20mm、更優(yōu)選15mm、更優(yōu)選12mm、更優(yōu)選10mm、更優(yōu)選8mm、更優(yōu)選7mm、更優(yōu)選6mm、更優(yōu)選5mm、更優(yōu)選4mm、更優(yōu)選3mm、更優(yōu)選2.8mm、更優(yōu)選2.5mm。

當(dāng)使用常規(guī)培養(yǎng)基來制備本發(fā)明的培養(yǎng)基時(shí)，優(yōu)選進(jìn)行調(diào)整使得鈣成分含量在上述限定的范圍內(nèi)。如果常規(guī)培養(yǎng)基的經(jīng)典配方中包含鈣且鈣成分含量在上述限定的范圍內(nèi)，則就鈣成分含量而言，該常規(guī)培養(yǎng)基無需進(jìn)行調(diào)整；如果常規(guī)培養(yǎng)基的經(jīng)典配方中包含鈣但鈣成分含量不在上述限定的范圍內(nèi)，則應(yīng)該相應(yīng)地增加或減少配方中的鈣，使得培養(yǎng)基的鈣成分含量在上述限定的范圍內(nèi)；如果常規(guī)培養(yǎng)基的經(jīng)典配方中不包含鈣，則應(yīng)該在配方中增加鈣，使得培養(yǎng)基的鈣成分含量在上述限定的范圍內(nèi)。增加或減少培養(yǎng)基中的鈣成分含量的操作是本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)操作。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中可以添加其它常規(guī)成分，包括但不限定于：氨基酸類、維生素類、無機(jī)鹽類、腺嘌呤、乙醇胺(ethanolamine)、d-葡萄糖、肝素(heparin)、n-[2-羥乙基(hydroxyethylpiperazine)-n'-[2-乙磺酸(ethanesulfonicacid)](hepes)、皮質(zhì)醇(hydrocortisone)、insulin(胰島素)、表皮生長因子(egf)、腎上腺素(epinephrine)、硫辛酸(lipoicacid)、酚紅、磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine)、腐胺(putrescine)、霍亂毒素(choleratoxin)、丙酮酸鈉(sodiumpyruvate)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine，t3)、胸腺嘧啶和運(yùn)鐵蛋白(transferrin)。其中，肝素和運(yùn)鐵蛋白可以用檸檬酸鐵(ferriccitrate)或螯合硫酸鐵(ferroussulfatechelates)替代。上述添加成分均可以商品化購買。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中的氨基酸類包括但不限定于：l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺(l-asparagine)、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-組氨酸、l-異亮氨酸、l-亮氨酸、l-賴氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、l-蘇氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和l-纈氨酸。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中的維生素類包括但不限定于：生物素、氯化膽堿(cholinechloride)、d-ca⁺²-泛酸(pantothenate)、葉酸(folicacid)、i-肌醇(i-inositol)、煙酰胺(niacinamide)、多醇(pyridoxine)、核黃素(riboflavin)、維生素b1(thiamine)和維生素b12。

無機(jī)鹽類成分包括但不限定于：鈣鹽(如cacl2)、cuso4、feso4、kcl、鎂鹽(如mgcl2)、錳鹽(如mncl2)、醋酸鈉、nacl、nahco3、na2hpo4、na2so4，以及痕量的其它元素如硒(selenium)、硅、鉬(molybdenum)、釩(vanadium)、鎳、錫、鋅，這些痕量元素可以以多種形式出現(xiàn)，但最好是鹽類的形式，如na2seo3,na2sio3,(nh4)6mo7o24,nh4vo3,niso4,sncl和znso4.

本發(fā)明的培養(yǎng)基的其它添加成分包括但不限定于：肝素、表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，egf)、至少一種可以增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷一磷酸(cyclicadenosinemonophosphate，camp)水平的因子、至少一種成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)。上述添加成分可以直接加入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，也可以用dpbs(dulbecco'sphosphatebufferedsaline)緩沖液配制成混合液，冷凍保存直至配制培養(yǎng)基時(shí)再行添加。本發(fā)明的培養(yǎng)基中的肝素可以商業(yè)化購買。肝素的主要作用是穩(wěn)定生長因子的活性，如fgf。肝素在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加濃度為1-500u.s.p.units/l。egf也可以商業(yè)化購買，egf在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加濃度為0.00001-10mg/l。

本發(fā)明的培養(yǎng)基中可以包含多種種類的能增加細(xì)胞內(nèi)camp水平的因子，可以是直接增加camp水平的[如二丁酰(dibutyryl)camp]，也可以是通過與細(xì)胞g蛋白相互作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)camp水平升高[如霍亂毒素和毛喉素(forskolin)]，或者作為β-腎上腺素受體(β-adrenergicreceptors)的拮抗劑(如異丙腎上腺素)增加細(xì)胞內(nèi)camp水平、或者通過抑制camp磷酸二酯酶的活性而使細(xì)胞內(nèi)camp水平增加[如isobutylmethylxanthine(ibmx)和茶堿(theophylline)]。上述這些化合物都可以商業(yè)化購買。

本發(fā)明的試劑盒

本發(fā)明的第二方面涉及一種試劑盒(本發(fā)明的試劑盒)，其包含培養(yǎng)基、血清、鈣成分和rock抑制劑。

本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選用于培養(yǎng)細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選是上皮細(xì)胞，更優(yōu)選是非角質(zhì)上皮細(xì)胞。

所述培養(yǎng)基可以是任何用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如上述的常規(guī)培養(yǎng)基，優(yōu)選可以是上述的條件培養(yǎng)基。所述血清、鈣成分和rock抑制劑同上述。本發(fā)明的試劑盒可以用于配制上述本發(fā)明的培養(yǎng)基。本發(fā)明的試劑盒中，培養(yǎng)基、血清和rock抑制劑三者的比例優(yōu)選滿足將三者混合后能夠形成上述本發(fā)明的培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含鈣成分，此時(shí)，培養(yǎng)基、血清、鈣成分和rock抑制劑四者的比例優(yōu)選滿足將四者混合后能夠形成上述本發(fā)明的培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含飼養(yǎng)細(xì)胞。所述飼養(yǎng)細(xì)胞同上述。所述飼養(yǎng)細(xì)胞可以是常規(guī)貼壁的，常溫下可存活3-5天；所述飼養(yǎng)細(xì)胞也可以是低溫凍存的，低溫凍存是指在-80℃以下長期儲存，一般可以儲存幾天至幾年。所述飼養(yǎng)細(xì)胞還可以是低溫儲存的，低溫儲存是指在4℃下儲存，一般可以儲存1～7天。

優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含用于在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)單獨(dú)盛放所述飼養(yǎng)細(xì)胞的容器，該容器具有可通透性膜結(jié)構(gòu)。特別是，在本發(fā)明的試劑盒包含飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下，優(yōu)選其還包含所述容器。所述容器的作用是，在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，將飼養(yǎng)細(xì)胞與需要培養(yǎng)的細(xì)胞隔離開來進(jìn)行培養(yǎng)，并使得飼養(yǎng)細(xì)胞的分泌物通過上述可通透性膜結(jié)構(gòu)進(jìn)入到培養(yǎng)需要培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)基中。對于所述容器的形狀、材質(zhì)、規(guī)格等均無特殊限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要適宜選擇。例如，可以使用transwell筐(corning公司產(chǎn)品)。

優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含本發(fā)明的培養(yǎng)基和飼養(yǎng)細(xì)胞，更優(yōu)選還包含所述容器。

本發(fā)明的試劑盒中還可以包含用于添加到培養(yǎng)基中的其它成分，包括但不限于在前述的“本發(fā)明的培養(yǎng)基”一節(jié)中描述的添加成分。

本發(fā)明的試劑盒中還可以包含用于細(xì)胞培養(yǎng)的其它成分或組件，例如指示劑、胰酶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、使用說明書等。

本發(fā)明的試劑盒中，優(yōu)選所述各成分分開放置，更優(yōu)選分別置于獨(dú)立的容器中。

本發(fā)明的培養(yǎng)方法

本發(fā)明的第三方面涉及一種培養(yǎng)上皮細(xì)胞的方法(也稱本發(fā)明的培養(yǎng)方法)，該方法包括

步驟a：使用上述本發(fā)明的培養(yǎng)基將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)；或

步驟b：使用上述的包含飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基的本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)上皮細(xì)胞(見圖2)。

本發(fā)明的培養(yǎng)方法可以是上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)方法，也可以是原代上皮細(xì)胞增殖培養(yǎng)方法。

這里，所述上皮細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞均同前述。

步驟a中可以將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞直接共培養(yǎng)，也可以將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)。所述直接共培養(yǎng)是指將上皮細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞置于同一培養(yǎng)器皿中，進(jìn)行培養(yǎng)(見圖4)；所述間接共培養(yǎng)是指將飼養(yǎng)細(xì)胞單獨(dú)置于上述的具有可通透性膜結(jié)構(gòu)的容器(例如transwell筐)中，然后，可以例如再將該裝有飼養(yǎng)細(xì)胞的容器置于培養(yǎng)上皮細(xì)胞的培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)(見圖3)。

本發(fā)明的培養(yǎng)方法中的其它步驟可以按照本技術(shù)領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行。

細(xì)胞的接種密度可以根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。常規(guī)的一次性塑料培養(yǎng)器皿中，一般接種細(xì)胞數(shù)為1x10⁴～10x10⁵細(xì)胞/cm²，即75cm²培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞數(shù)例如為1x10⁶。每一次傳代都要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求對細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)整。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞通常培養(yǎng)于37℃、適當(dāng)co2濃度(3～10％)、一定濕度的培養(yǎng)箱中，溫度、co2濃度和濕度可以根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整。培養(yǎng)基的ph的范圍可以根據(jù)需要調(diào)整，通常為ph7.1～7.6,優(yōu)選為ph7.1～7.3

細(xì)胞培養(yǎng)基通常1-2天更換一次，也可根據(jù)具體培養(yǎng)的細(xì)胞類型進(jìn)行調(diào)整。只要細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長至滿豐度，就可以進(jìn)行傳代了。本說明書中，細(xì)胞傳代是指將細(xì)胞分種一部分至新的培養(yǎng)器皿中。

實(shí)施例

以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。此外，實(shí)施例中未經(jīng)特別標(biāo)注的試劑，均購自gibco公司。

實(shí)施例1swiss3t3細(xì)胞的培養(yǎng)傳代

swiss3t3細(xì)胞從harvarduniversity的howardgreen教授實(shí)驗(yàn)室獲得。所需試劑：

完全的dmem培養(yǎng)基：dmem(gibco#11965-092),10％胎牛血清(fbs),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)

胰酶消化液:0.05％胰酶/edta(gibco#25300-062)

無鈣鎂磷酸緩沖液：ca²⁺,mg²⁺freepbs

傳代培養(yǎng)操作步驟：

接種1x10⁵swiss3t3細(xì)胞于t75細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入10ml上述的完全dmem培養(yǎng)基，置于co2培養(yǎng)箱在5％co2，37℃培養(yǎng)2－5天。當(dāng)細(xì)胞單層豐度為80－90％時(shí)，移去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，以10ml無鈣鎂磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞單層2次，加入2ml胰酶消化液，在37℃孵育1分鐘。輕拍培養(yǎng)皿以充分釋放貼壁的細(xì)胞，以10ml完全的dmem培養(yǎng)基中和消化反應(yīng)。4℃離心5分鐘(1000轉(zhuǎn)/分鐘)沉淀細(xì)胞，移去上清，重懸細(xì)胞沉淀于10ml完全的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)需要可以1：10，1：20或1：50比例傳代于新的t75(10－15ml完全的dmem培養(yǎng)基)或t175(25-30ml完全的dmem培養(yǎng)基)的培養(yǎng)皿中，根據(jù)需要每周更換新鮮完全的dmem培養(yǎng)基2－3次。必要時(shí)可將1x10⁶細(xì)胞重懸于1－2ml的細(xì)胞凍存液(60％dmem,30％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

實(shí)施例2hl培養(yǎng)基

hl培養(yǎng)基1為dmem(gibco#11965-092)與ham’sf-12nutrientmix(gibco#11765-054)的混合培養(yǎng)基，體積配比為3:1，同時(shí)添加5％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質(zhì)醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10umgsk429286),上述培養(yǎng)基需經(jīng)0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養(yǎng)基2為在dmem(lowglucose，noglutamine，gibco#11054-020)中添加10％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質(zhì)醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養(yǎng)基需經(jīng)0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養(yǎng)基3為rpmi培養(yǎng)基1640(gibco#22400-121)含5mmhepes,添加8％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質(zhì)醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養(yǎng)基需經(jīng)0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養(yǎng)基4為在l-15(leibovitz)培養(yǎng)基(l-glutamine,nohepes,gibco#11415064)中添加5％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質(zhì)醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養(yǎng)基需經(jīng)0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養(yǎng)基5為在培養(yǎng)基199(withearle'ssaltsbutnol-glutamine，nosodiumbicarbonate，gibco#11825015)中添加10％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質(zhì)醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養(yǎng)基需經(jīng)0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養(yǎng)基6為dmem(gibco#11965-092)與無血清培養(yǎng)基sfm(gibco#10744-019的混合培養(yǎng)基，體積配比為1:3，同時(shí)添加5％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質(zhì)醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養(yǎng)基需經(jīng)0.22μ孔徑濾膜過濾。

實(shí)施例3飼養(yǎng)細(xì)胞(失去分裂能力的swiss3t3細(xì)胞)的制備(絲裂酶素c處理swiss3t3細(xì)胞)

1)作為飼養(yǎng)細(xì)胞的swiss3t3細(xì)胞，宜采用傳代培養(yǎng)早期的細(xì)胞。當(dāng)swiss3t3細(xì)胞生長至滿豐度時(shí),培養(yǎng)基中加入終濃度為10μg/ml的絲裂酶素c(溶于水,儲存液濃度為0.5mg/ml),37℃處理2小時(shí)；

2)再加入溫浴的1xpbs或無血清的培養(yǎng)基(dmem)洗3次，棄洗液；

3)加入0.05％胰酶/edta預(yù)消化細(xì)胞30-40秒后棄去，再次加入0.05％胰酶/edta消化30秒，輕拍培養(yǎng)皿使細(xì)胞分散，然后加入完全培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的dmem)中和反應(yīng)；

4)低速離心(1000rpm)去上清，獲得細(xì)胞沉淀；

5)沉淀下來的細(xì)胞可以直接用作飼養(yǎng)細(xì)胞，或者貯存?zhèn)溆茫?/p>

a)直接用作飼養(yǎng)細(xì)胞的情況，操作步驟如下:

-加入溫浴的1xpbs洗細(xì)胞沉淀1次，再次離心

-將細(xì)胞懸于hl培養(yǎng)基中

-以適當(dāng)?shù)谋壤?如1：3)將飼養(yǎng)細(xì)胞與一定數(shù)量的上皮細(xì)胞混懸于hl培養(yǎng)基中，上皮細(xì)胞最適接種濃度為2.5x10⁵個(gè)/100mm的培養(yǎng)皿；

b)飼養(yǎng)細(xì)胞是第二天備用的情況，操作步驟如下:

-加入溫浴的1xpbs洗細(xì)胞沉淀1次，再次離心

-將細(xì)胞懸于完全dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的dmem)

-以1:3的比例接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜

-第二天用溫浴的1xpbs洗細(xì)胞2次,換成hl培養(yǎng)基

-再將上皮細(xì)胞接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿中,上皮細(xì)胞最適接種濃度為2.5x10⁵個(gè)/100mm的培養(yǎng)皿；

c)飼養(yǎng)細(xì)胞是貯存?zhèn)溆玫那闆r，操作步驟如下:

-加入溫浴的1xpbs洗細(xì)胞沉淀1次

-將飼養(yǎng)細(xì)胞重懸于6ml的凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中，分于3支凍存管中

-凍存于液氮或–150℃條件下

-臨用時(shí)取1支復(fù)蘇，加入完全dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的dmem)接種于100mm培養(yǎng)皿

備注：被用作飼養(yǎng)細(xì)胞的3t3細(xì)胞經(jīng)絲裂酶素c處理后，需在3-5天內(nèi)使用或者低溫凍存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4.飼養(yǎng)細(xì)胞(失去分裂能力的swiss3t3細(xì)胞)的制備(放射線處理swiss3t3細(xì)胞)

作為飼養(yǎng)細(xì)胞的swiss3t3細(xì)胞，宜采用傳代培養(yǎng)早期的細(xì)胞，這些細(xì)胞培養(yǎng)于dmem培養(yǎng)基中，生長至近滿豐度，用不含ca²⁺/mg²⁺的1xpbs洗細(xì)胞1次，加入1ml0.05％胰酶消化細(xì)胞20-40秒，然后加入9ml完全dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的dmem)中和消化反應(yīng)，于4℃低速離心1000rmp收集細(xì)胞沉淀，加入10mldmem重懸細(xì)胞，放射線照射細(xì)胞懸液，即cesium-137射線儀(jlshepherdmark)處理3000rad(30grey)。這些經(jīng)放射線處理的swiss3t3細(xì)胞，接種于hl培養(yǎng)基中直接用作飼養(yǎng)細(xì)胞；或者培養(yǎng)于完全dmem培養(yǎng)基或置于4℃儲存并于1-7天之內(nèi)使用；或者長期凍存于-80℃或液氮中備用。

實(shí)施例5.新鮮組織中分離培養(yǎng)原代上皮細(xì)胞

在病人或病人監(jiān)護(hù)人知情同意的情況下，收集人的正?；蚰[瘤組織樣品。

具體操作步驟如下:

1.消化液的配制：含膠原酶/透明質(zhì)酸酶(終濃度為1x的混合液)的hl培養(yǎng)基(即dmem:f12體積比3：1的混合培養(yǎng)基)，添加5％fbs。根據(jù)新鮮組織的大小決定消化液的用量，通常需要10倍于樣品體積的消化液的用量，例如2-3個(gè)小鼠前列腺需2-5ml消化液；

2.用95-100％的乙醇洗分離的新鮮組織1次，再用pbs洗2次，然后將組織放入含預(yù)冷pbs的無菌培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下，用解剖鑷子和剪刀去除組織中殘留的脂肪。

3.將組織樣品放入含上述消化液的14ml或50ml離心管中，37℃消化1-3小時(shí)。

4.將消化后的組織低速離心(1000rpm)5分鐘，去除上清。

5.將細(xì)胞沉淀重懸于2-5ml的0.25％胰酶/edta中，置于冰上1小時(shí)或室溫10分鐘。

6.然后加入10ml含10％fbs的dmem培養(yǎng)基，低速1000rmp離心5分鐘。

7.盡量將上清去除干凈。

8.加入2ml溫浴的5mg/ml分散酶和200μl的1mg/mldnasei，用無菌的p1000一次性塑料槍頭反復(fù)吹打樣品1分鐘。

9.加入10ml含10％fbs的dmem，用40-70μm孔徑的過濾器過濾細(xì)胞懸液，收集過濾后的細(xì)胞懸液，低速1000rmp離心5分鐘，去除上清。

10.重懸細(xì)胞沉淀于hl培養(yǎng)基中，接種于t25或t75的培養(yǎng)瓶中按本發(fā)明的任一方案(見圖1－4)培養(yǎng)。

實(shí)施例6.飼養(yǎng)細(xì)胞/上皮細(xì)胞的直接共培養(yǎng)(見圖4和圖6)

上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞(失去分裂能力的swiss3t3細(xì)胞)作為飼養(yǎng)層與上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)按以下三種方式進(jìn)行：

1.直接飼養(yǎng)細(xì)胞/上皮細(xì)胞共培養(yǎng)。加入溫浴的1xpbs洗飼養(yǎng)細(xì)胞沉淀1次，再次離心,將細(xì)胞懸于hl培養(yǎng)基中,以1:3比例將飼養(yǎng)細(xì)胞與一定數(shù)量的上皮細(xì)胞混懸于hl培養(yǎng)基中，上皮細(xì)胞最適接種濃度為2.5x10⁵個(gè)/100mm的培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)瓶置于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)。

2.飼養(yǎng)細(xì)胞先行貼壁，再加入上皮細(xì)胞共培養(yǎng)。將上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞懸于完全dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的dmem)，以1:3的比例接種于培養(yǎng)皿中,37℃培養(yǎng)2－3小時(shí)或過夜,用溫浴的1xpbs洗細(xì)胞2次,換成hl培養(yǎng)基,再將上皮細(xì)胞接種于含飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿中,上皮細(xì)胞最適接種濃度為2.5x10⁵個(gè)/100mm的培養(yǎng)皿,貼壁的飼養(yǎng)細(xì)胞可于3-5天任何時(shí)間內(nèi)使用。將培養(yǎng)瓶置于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)。

3.飼養(yǎng)細(xì)胞在4℃或液氮貯存?zhèn)溆?。將上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞懸于完全dmem培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的dmem)存于4℃(1－7天)或長期儲存于液氮，復(fù)蘇后按上述方法2進(jìn)行與上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)(hl培養(yǎng)基中)。上皮細(xì)胞最適接種濃度為2.5x10⁵個(gè)/100mm的培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)瓶置于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)。

不論以上述哪種方式的共培養(yǎng),第二天應(yīng)更換新鮮的hl培養(yǎng)基。當(dāng)多于50％的飼養(yǎng)細(xì)胞脫落時(shí)，應(yīng)補(bǔ)充新鮮的上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞，直到上皮細(xì)胞生長至70－90％豐度需要傳代時(shí)。

實(shí)施例7.飼養(yǎng)細(xì)胞/上皮細(xì)胞的分離傳代

1.上皮細(xì)胞生長至70-90％豐度，吸出培養(yǎng)基，用溫浴的pbs洗1次，

2.吸出pbs，加入10-12ml溫浴的含0.02％edta(0.68mm)的pbs洗滌細(xì)胞，以去除飼養(yǎng)細(xì)胞swiss3t3；特別注意，洗滌細(xì)胞需盡量快速，先將edta溶液加到培養(yǎng)皿外周的細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng)皿，然后再使edta溶液回旋至培養(yǎng)皿內(nèi)周的細(xì)胞，重復(fù)回旋洗滌細(xì)胞10次。

3.吸出edta洗液，再次加入0.02％edta至培養(yǎng)皿內(nèi)側(cè)的細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)培養(yǎng)皿，然后使edta溶液回旋至培養(yǎng)皿外側(cè)的細(xì)胞，重復(fù)回旋洗滌細(xì)胞30次。通常人的角質(zhì)上皮細(xì)胞需要40次edta洗滌，其它細(xì)胞根據(jù)貼壁緊密程度不同，可適當(dāng)調(diào)整洗滌次數(shù)。

4.吸出edta洗液，加入溫浴的pbs洗3次，始終保持培養(yǎng)皿傾斜。最后一次洗滌液吸出之前，在顯微鏡下觀察，確認(rèn)所有飼養(yǎng)細(xì)胞swiss3t3已經(jīng)被完全洗掉，否則，需再次增加edta洗滌次數(shù)。

5.采用常規(guī)胰酶方法消化上皮細(xì)胞，對于角質(zhì)上皮細(xì)胞而言，胰酶常溫消化2分鐘，吸出消化液，再次于37℃胰酶消化5分鐘，輕拍培養(yǎng)皿使細(xì)胞分散，重懸細(xì)胞于hl培養(yǎng)基中。然后接種上皮細(xì)胞于絲裂霉素c或放射線處理過的飼養(yǎng)細(xì)胞上，最適細(xì)胞接種密度為2.5x10⁵個(gè)/100mm的培養(yǎng)皿；

7.必要時(shí)可將1x10⁶上皮細(xì)胞重懸于1－2ml的細(xì)胞凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

實(shí)施例8.飼養(yǎng)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備和上皮細(xì)胞的培養(yǎng)傳代(見圖2和圖6)

按照圖2,將上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)于hl培養(yǎng)基中(t75培養(yǎng)瓶：2x10⁶細(xì)胞，15mlhl培養(yǎng)基；t175:5x10⁶細(xì)胞，35mlhl培養(yǎng)基)在37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。收集培養(yǎng)基，2000rpm離心15分鐘，經(jīng)0.22μ濾膜過濾，按1：5比例(可按1：99－99：1優(yōu)化)與新鮮配制的hl培養(yǎng)基混合即得到hl條件培養(yǎng)基。將分離制備的原代細(xì)胞懸液或者傳代細(xì)胞直接于hl條件培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37℃、5％co2。當(dāng)細(xì)胞增殖至70－90％豐度時(shí)，1xpbs洗滌細(xì)胞兩次，0.05％胰酶/edta消化單層細(xì)胞2－5分鐘，10ml完全的dmem中和消化反應(yīng)，1000rmp離心5分鐘，去上清，以一定比例(1:2,1:3,1:4,1:5均可，只要可以維持細(xì)胞貼壁和正常生長)重懸細(xì)胞沉淀于10mlhl條件培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)。必要時(shí)可將1x10⁶上皮細(xì)胞重懸于1－2ml的細(xì)胞凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

實(shí)施例9.上皮細(xì)胞/飼養(yǎng)細(xì)胞間接共培養(yǎng)(transwell培養(yǎng)系統(tǒng))及傳代(見圖3和圖6)

按照圖3，將上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養(yǎng)細(xì)胞置于transwell筐(transwellinsert，corning公司)中，分離制備的原代細(xì)胞懸液或者傳代細(xì)胞可直接于hl培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37℃、5％co2。當(dāng)細(xì)胞增殖至70－90％豐度時(shí)，先移去transwell筐，1xpbs洗滌上皮細(xì)胞兩次，0.05％胰酶/edta消化單層細(xì)胞2－5分鐘，10ml完全的dmem中和消化反應(yīng)，1000rpm離心5分鐘，去上清，以一定比例(1:2,1:3,1:4,1:5均可，只要可以維持細(xì)胞貼壁和正常生長)重懸細(xì)胞沉淀于10mlhl培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)。必要時(shí)可將1x10⁶上皮細(xì)胞重懸于1－2ml的細(xì)胞凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

實(shí)施例10.含血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基用于上皮細(xì)胞的培養(yǎng)(見圖5)

完全的dmem培養(yǎng)基：dmem,10％胎牛血清(fbs),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)

無血清培養(yǎng)基：無血清的上皮細(xì)胞培養(yǎng)基sfm(gibco#10744-019)，慶大霉素(10μg/ml)

胰酶消化液:0.05％胰酶/edta

無鈣鎂磷酸緩沖液：ca²⁺,mg²⁺freepbs

分離制備的原代細(xì)胞懸液或者傳代細(xì)胞直接于上述完全dmem培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是37℃、5％co2。當(dāng)細(xì)胞增殖至70－90％豐度時(shí)，1xpbs洗滌細(xì)胞兩次，0.05％胰酶/edta消化單層細(xì)胞2－5分鐘，10ml完全的dmem培養(yǎng)基中和消化反應(yīng)，1000rmp離心5分鐘，去上清，以一定比例(通常是1:2或1:3)重懸細(xì)胞沉淀于10ml完全dmem或無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。必要時(shí)可將1x10⁶細(xì)胞重懸于1－2ml的細(xì)胞凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

還需要說明的是，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的任一技術(shù)特征或技術(shù)特征的組合同樣也可以適用于其它技術(shù)方案；并且，在可實(shí)施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下，作為不同技術(shù)方案的構(gòu)成部分所描述的技術(shù)特征之間也可以以任意方式進(jìn)行組合，來構(gòu)成其它技術(shù)方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術(shù)方案，并且這些技術(shù)方案相當(dāng)于記載在本說明書中。

以上通過具體實(shí)施方式和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，這些并非意圖對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，本發(fā)明的范圍應(yīng)由權(quán)利要求書確定。

工業(yè)實(shí)用性

本發(fā)明的培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用試劑盒、上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法以及通過該方法獲得的上皮細(xì)胞可以廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)研究、腫瘤研究、衰老研究、新藥研發(fā)、基因治療、體外轉(zhuǎn)基因和基因敲除研究、組織再生、臨床再生醫(yī)學(xué)、臨床個(gè)性化治療、分子及遺傳流行病學(xué)研究等各個(gè)領(lǐng)域。